CN102630566B - 一种南方红豆杉腋芽离体诱导培养生产紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种在离体条件下诱导南方红豆杉腋芽萌发然后进行培养生产提取紫杉醇的方法，是在WPM基本培养基的基础上，将990mg/L的K2SO4用（800-1000）mg/L的(NH4)2SO4替换，得到改良的WPM基本培养基，并附加0.01-4.5mg/L的TIBA。然后从南方红豆杉数木上剪取当年生嫩梢，剪切成2.5cm的小茎段，消毒灭菌后接种于改良的WPM基本培养基上，于人工气候箱中光培养和暗培养交替培养，培养温度：白天为（25±1）℃，晚上(20±1)℃，光照强度：1500lx，相对湿度80%。在WPM+(0.01-4.5)mg/LTIBA快速成功诱导出了腋芽。利用此方法,可实现南方红豆杉腋芽的大规模、短周期、高繁殖率、低成本的工厂化生产。可在15天左右诱导出芽，诱导率为100%；用本方法诱导产生的南方红豆杉腋芽芽体粗而短，颜色鲜绿。采用本方法获得的芽中紫杉醇的含量50天可达0.0042%，较天然芽中含量高。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的说，一种南方红豆杉腋芽离体诱导培养生产紫杉醇的方法。
背景技术
红豆杉，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，是第四纪冰川遗留下来的古老树种，已有250万年的历史。红豆杉属植物分布在北半球,为高大乔木,种群分布稀少，生长速度缓慢，再生能力差，所以很长时间以来，世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。我国已将其列为一级珍稀濒危保护植物，联合国也明令禁止采伐。红豆杉属植物在全世界共有十一种，南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)是红豆杉在中国的一个变种。
Amos等（1981）发现在WPM培养基中加入低浓度6-BA有利于芽产生；高浓度6-BA则抑制芽伸长生长。Barnes（1983）发现在含1mg/LBA的WPM 培养基上，加拿大红豆杉的茎尖腋芽生长较好。Chee（1995）在短叶红豆杉离体胚诱导不定芽的研究中，将其接种在1/2B5+10μM6-BA培养基上，14d后离体胚上诱导出了芽原基。杨振国等（1997）利用东北红豆杉幼枝顶芽作外植体，以MS为基本培养基，诱导出了丛生芽。程广有等（1997）发现6-BA/IBA比值与东北红豆杉茎尖诱导侧芽的生长量和愈伤组织生长量有很大关系，比值大时可产生不定芽。浩仁塔本等（2004）研究发现，东北红豆杉茎尖的芽分化与生长对不同质量浓度的激素不太敏感，6-BA比较有利于芽的分化，而KT有利于愈伤组织的产生。马均等（2007）以曼地亚红豆杉带芽茎段为外植体，在MS+0.05 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA培养基中的启动率最高，达到了89.55%，且发现低浓度的6-BA更有利于芽的启动。唐道方等（2008）采用南方红豆杉带芽茎段为外植体，研究南方红豆杉组织培养芽增殖和植株再生的条件，结果表明：春季生长旺盛期的嫩枝最适合腋芽增殖诱导培养，其最佳培养基为DCR+0.1mg/L IBA+0.05mg/L6-BA。张圣喜等（2010）研究发现DCR+ 0.5 mg/L6-BA+0.8 mg/LNAA也比较适合南方红豆杉外植体直接诱导出芽。但应用TIBA进行红豆杉属植物腋芽增殖诱导方面还未见有报道。
经对现有技术文献的检索发现，专利申请号：CN200610000193.6，公开号：CN100999719，发明名称：北美红杉叶片不定芽和体细胞胚胎的诱导与植株再生方法，该方法是以北美红杉茎尖为外植体，在 BA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L和 BA0.5mg/L+IBA 0.5mg/L的SH培养基上诱导出了不定芽和体细胞胚胎。该方法为所用之培养基与本技术所用之培养基配方完全不同，该技术可实现北美红杉苗木的大规模、短周期、高繁殖率、低成本的工厂化生产,并对于揭示细胞分化、发育、形态发生及合子胚产生的机制具有重要意义。专利申请号：CN200610136929.2，公开号：CN101209028，发明名称：红豆杉电磁脉冲快繁及产业化种植方法，该方法采用计算机环境控制技术和电磁脉冲技术与开放式快速繁育技术相结合,利用植物的“全能性”和“全息性”,运用对植物生长环境因子专家分析系统功能,自适应调节苗床的温度、湿度、氧气、二氧化碳气体浓度、养分等植物繁育条件,为不同植物的离体材料创造最适合生根壮苗的环境条件,实现植物以苗繁苗的快速增殖,在较短时间内得到工厂化大批量优质的红豆杉栽种苗。虽然这些方法均对红豆杉快繁有较好的效果，但是均没有提及到采用TIBA诱导南方红豆杉腋芽增殖。且以上技术均以红豆杉大量快繁为培养目的，而本发明还在于通过试管微芽诱导培养生产抗癌药物紫杉醇。
发明内容
本发明的目的是提供一种在离体条件下通过南方红豆杉腋芽诱导培养生产紫杉醇的方法，为以南方红豆杉为原材料生产紫杉醇提供一种新的路径。
为实现本发明目的，本发明所采用的技术方案为：一种在离体条件下诱导南方红豆杉腋芽萌发然后进行培养生产提取紫杉醇的方法，包括以下步骤:
（1）从南方红豆杉树木上剪取当年生嫩梢，摘除叶片，剪切成2～3 cm长的小茎段；
（2）烧杯中加水，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，搅拌均匀，然后将剪切好的小茎段放入烧杯搅拌清洗30min，取出后用自来水冲洗2h，然后转入无菌超净工作台，用70～75%的酒精浸泡消毒30s，无菌水清洗4次，再用0.1～0.25%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，无菌水清洗6次，于超净工作台内晾干表面水后备接种用；
（3）将步骤（2）已备好外植体的形态学下端插入附加0.01～4.5mg/L TIBA的改良WPM培养基中进行腋芽诱导培养；
（4）将步骤（3）已接种培养瓶置于人工气候箱中进行培养，培养温度：白天25±1℃，晚上20±1 ℃；进行12h交替培养，光照强度：1500lx，相对湿度80±5%；
（5）培养50天后收获芽，检测芽中紫杉醇的含量，生产提取紫杉醇。
步骤（2）中所述的改良WPM基本培养基，是在WPM基本培养基的基础上，将990mg/L的K2SO4用（800～1000）mg/L的(NH4)2SO4替换。
步骤（2）中所述TIBA的浓度为0.1～4.0mg/L.
所述TIBA的最佳浓度为3.0mg/L。
本发明的有益效果：
（1）本发明首次采用TIBA对南方红豆杉茎段进行腋芽诱导，具有诱导时间短、诱导率高等优点，可在15天左右诱导出芽，诱导率为100%。
（2）采用本方法诱导产生的南方红豆杉腋芽芽体短而粗壮，颜色鲜绿。
（3）采用本方法获得的芽中紫杉醇的含量50天可达0.0042%，较天然芽中含量高。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施方式
实施例1
（1）从南方红豆杉树木上剪取当年生嫩梢，摘除叶片，剪切成2.5cm的小茎段。
（2）在烧杯中加入自来水，在水中加入少量洗衣粉，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，搅拌均匀；然后将剪切好的小茎段放入烧杯中搅拌清洗30min，取出，用自来水冲洗2h后转入无菌超净工作台，用70%的酒精浸泡消毒30s，无菌水清洗4次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，无菌水清洗6次，于超净工作台内晾干表面水后备接种用。
（3）将步骤（2）已备好外植体的形态学下端插入附加0.1mg/L的2,3,5-三碘苯甲酸（2,3,5-Triiodobenzoic acid，简称TIBA）的改良WPM培养基中，进行腋芽诱导培养。所述改良的WPM培养基，是在WPM基本培养基的基础上，将990mg/L的K2SO4用800mg/L的(NH4)2SO4替换。
（4）接种后于人工气候箱中培养，培养温度：白天（25±1）℃，晚上(20±1) ℃，进行12h交替培养，光照强度：1500lx，相对湿度80±5%。
（5）培养25天，腋芽的萌发率达到16.67%，平均芽长达1.21 cm。
（6）培养50天后，芽中紫杉醇的含量未能检测出。
实施例2
（1）从南方红豆杉树木上剪取当年生嫩梢，摘除叶片，剪切成2cm左右的小茎段。
（2）在烧杯中加入自来水水，在水中加入少量洗衣粉，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，搅拌均匀；然后将剪切好的小茎段放入烧杯中搅拌30min，取出，用自来水冲洗2h后转入无菌超净工作台中用72%的酒精浸泡消毒30s，无菌水清洗4次，再用0.2%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，无菌水清洗6次，于超净工作台内晾干表面水后备接种用。
（3）将步骤（2）已备好外植体的形态学下端插入附加3.0mg/L 2,3,5-三碘苯甲酸（2,3,5-Triiodobenzoic acid，简称TIBA）的改良WPM培养基中进行腋芽诱导培养。所述改良的WPM培养基，是在WPM基本培养基的基础上，将990mg/L的K2SO4用900mg/L的(NH4)2SO4替换。
（4）接种后于人工气候箱中培养，培养温度：白天（25±1）℃，晚上(20±1) ℃，进行12h交替培养，光照强度：1500lx，相对湿度80±5%。
（5）培养15天，腋芽的萌发率达100%，平均芽长达1.82㎝。
（6）培养50天后，芽中紫杉醇的含量为0.0042%（芽干重）。
实施例3
（1）从南方红豆杉树木上剪取当年生嫩梢，摘除叶片，剪切成3cm左右的茎段。
（2）在烧杯中加入自来水水，在水中加入少量洗衣粉，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，搅拌均匀；然后将剪切好的茎段放入烧杯中搅拌30min，取出，用自来水冲洗2h后转入无菌超净工作台中用75%的酒精浸泡消毒30s，无菌水清洗4次，再用0.25%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，无菌水清洗6次，于超净工作台内晾干表面水后备接种用。
（3）将步骤（2）已备好外植体的形态学下端插入附加4.0mg/L的2,3,5-三碘苯甲酸（2,3,5-Triiodobenzoic acid，简称TIBA）的改良WPM培养基中进行腋芽诱导培养。所述改良的WPM培养基，是在WPM基本培养基的基础上，将990mg/L的K2SO4用1000mg/L的(NH4)2SO4替换。
（4）接种后于人工气候箱中培养，培养温度：白天（25±1）℃，晚上(20±1) ℃，进行12h交替培养，光照强度：1500lx，相对湿度80±5%。
（5）培养23天，腋芽的萌发率达到22.22%，平均芽长为1.12 cm。
（6）培养50天后，芽中紫杉醇的含量未能检测出。
除上述三个实施例外，针对不同浓度的TIBA，申请人做了多次实验，结果如下表所示：
| 试验号 | TIBA浓度(mg/L) | 萌发时间(d) | 萌发率(%) | 平均芽长(cm) | 紫杉醇含量(%) | |
| 1 | 0.01 | － | 0 | － | － | |
| 2 | 0.05 | － | 0 | － | － | |
| 3 | 0.1 | 25 | 16.67 | 1.21 | － | |
| 4 | 0.5 | 25 | 22.22 | 1.35 | － | |
| 5 | 1.0 | 25 | 22.22 | 1.42 | － | |
| 6 | 1.5 | 20 | 33.33 | 1.58 | － | |
| 7 | 2.0 | 18 | 55.56 | 1.74 | 0.0024 | |
| 8 | 2.5 | 16 | 61.11 | 1.73 | 0.0038 | |
| 9 | 3.0 | 15 | 100 | 1.82 | 0.0042 | |
| 10 | 3.5 | 15 | 83.33 | 1.67 | 0.0040 | |
| 11 | 4.0 | 23 | 22.22 | 1.12 | － | |
| 12 | 4.5 | － | 0 | － | － |
实验结果显示：TIBA浓度小于0.1 mg/L或者大于等于4.5mg/L时，腋芽的萌发率为零，即不能诱导产生芽；TIBA浓度在0.1 mg/L～2.0 mg/L之间时，腋芽的萌发率相对较低；TIBA浓度为3.0mg/L时，腋芽的萌发率达到最高，为100%，且其中紫杉醇的含量也达到最高为0.0042%（干重）。
Claims (3)
1. 一种在离体条件下诱导南方红豆杉腋芽萌发然后进行培养生产提取紫杉醇的方法，包括以下步骤:
（1）从南方红豆杉树木上剪取当年生嫩梢，摘除叶片，剪切成2～3 cm长的小茎段；
（2）烧杯中加水，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，搅拌均匀，然后将剪切好的小茎段放入烧杯搅拌清洗30min，取出后用自来水冲洗2h，然后转入无菌超净工作台，用70～75%的酒精浸泡消毒30s，无菌水清洗4次，再用0.1～0.25%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，无菌水清洗6次，于超净工作台内晾干表面水后备接种用；
（3）将步骤（2）已备好外植体的形态学下端插入附加2.0～3.5mg/L TIBA的改良WPM培养基中进行腋芽诱导培养；
（4）将步骤（3）已接种培养瓶置于人工气候箱中进行培养，培养温度：白天25±1℃，晚上20±1 ℃；进行12h交替培养，光照强度：1500lx，相对湿度80±5%；
（5）培养50天后收获芽，检测芽中紫杉醇的含量，生产提取紫杉醇；
步骤（3）中所述的改良WPM基本培养基，是在WPM基本培养基的基础上，将990mg/L的K2SO4用800～1000mg/L的(NH4)2SO4替换。
2.根据权利要求1所述的在离体条件下诱导南方红豆杉腋芽萌发然后进行培养生产提取紫杉醇的方法，其特征在于，步骤（3）中所述TIBA的浓度为3.0～3.5mg/L。
3.根据权利要求2所述的在离体条件下诱导南方红豆杉腋芽萌发然后进行培养生产提取紫杉醇的方法，其特征在于，所述TIBA的最佳浓度为3.0mg/L。
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