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CN102639556A - 多肽及其用途 - Google Patents

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CN102639556A
CN102639556A CN2010800527096A CN201080052709A CN102639556A CN 102639556 A CN102639556 A CN 102639556A CN 2010800527096 A CN2010800527096 A CN 2010800527096A CN 201080052709 A CN201080052709 A CN 201080052709A CN 102639556 A CN102639556 A CN 102639556A
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CN
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polypeptide
fragment
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CN2010800527096A
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M.卡勒
N.M.马尔姆斯腾
P.帕帕雷帝
V.赖登嘉德
A.施密特肯
B.U.沃尔斯
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Ximmune AB
Original Assignee
Ximmune AB
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Publication date
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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防炎症和/或血液过度凝固的多肽，所述多肽包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物，或由该氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成。本发明的相关方面提供了包含SEQ ID NOS:1至11的氨基酸序列、或展现出抗炎和/或抗凝活性的其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由SEQ ID NOS:1至11的氨基酸序列、或展现出抗炎活性和/或抗凝血的其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成的分离的多肽，以及用于制备所述分离的多肽的分离的核酸分子、载体和宿主细胞。另外，提供了包含本发明的多肽的药物组合物，及使用其治疗和/或预防炎性和/或过度凝固的方法。

Description

多肽及其用途
发明领域
本发明涉及源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的新型多肽及其在治疗和预防炎症和/或过度凝固中的用途。具体而言，本发明提供了用于医学，例如用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1至11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由SEQ ID NO:1至11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成。
发明背景
先天性免疫系统很大程度上基于抗微生物肽，提供针对侵入性微生物的第一线防御(Lehrer,R.I.和T.Ganz,Curr Opin Hematol,2002.9(1):p.18-22;Harder,J.,R.Glaser和J.M.
Figure BDA00001667053000011
J Endotoxin Res,2007.13(6):p.317-38;Zasloff，M.,Nature,2002.415(6870):p.389-95;Tossi,A.,L.Sandri和A.Giangaspero,Biopolymers,2000.55(1):p.4-30;Yount,N.Y.等,Biopolymers,2006)。在最近数年期间，变得越来越明显的是，许多阳离子和两亲性抗微生物肽，诸如防御素和cathelicidin是多功能的，也介导免疫调控作用和血管发生(Zanetti,M.,J Leukoc Biol,2004.75(1):p.39-48;Elsbach,P.,J Clin Invest,2003.111(11):p.1643-5;Ganz,T.,Defensins:antimicrobial peptides of innateimmunity.Nat Rev Immunol,2003.3(9):p.710-20)，如此为先天性免疫系统的这些成员促成最近的且更宽的定义宿主防御肽(HDP)。最近已经显示了HDP家族涵盖各种具有抗微生物活性的生物活性肽，包括促炎性和趋化性细胞因子(Cole,A.M.等J Immunol,2001.167(2):p.623-7)、神经肽(Brogden,K.A.,Nat Rev Microbiol,2005.3(3):p.238-50)、肽激素(Kowalska,K.,D.B.Carr和A.W.Lipkowski,Life Sci,2002.71(7):p.747-50;Mor,A.,M.Amiche,and P.Nicolas,Biochemistry,1994.33(21):p.6642-50)、生长因子(Malmsten,M.等,Growth Factors,2007.25(1):p.60-70)、过敏毒素肽C3a(Nordahl,E.A.等,NatlAcad Sci U S A,2004.101(48):p.16879-84;Pasupuleti,M.等,J Biol Chem,2007.282(4):p.2520-8)、和激肽原衍生的肽(Frick,I.M.等,Embo J,2006.25(23):p.5569-78;Nordahl,E.A.等,Domain 5 of high molecular weightkininogen is antibacterial.J Biol Chem,2005.280(41):p.34832-9;Rydengard,V.,E.Andersson Nordahl和A.Schmidtchen,Zinc potentiates the antibacterialeffects of histidine-rich peptides against Enterococcus faecalis.Febs J,2006.273(11):p.2399-406)。
凝固级联也代表响应损伤和感染而激活的基础系统(Davie,E.W.和J.D.Kulman,Semin Thromb Hemost,2006.32增刊1:p.3-15;Bode,W.,SeminThromb Hemost,2006.32增刊1:p.16-31)。经由一系列级联样蛋白酶激活步骤，形成凝血酶，导致血纤蛋白原降解和凝块形成。凝固级联受多种调节蛋白，诸如丝氨酸蛋白酶抑制剂(或“serpins”)、肝素辅因子II(HCII)、抗凝血酶III(ATIII)、和蛋白C抑制剂及组织因子蛋白酶抑制剂(TFPI)控制。此外，富含组氨酸的糖蛋白可以通过与血纤蛋白原及血纤蛋白溶酶原相互作用而调控凝固。
本发明寻求提供用于医学，例如用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的源自牵涉止血的分子的新型多肽药剂。
发明概述
本发明的第一方面提供了用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的多肽，所述多肽包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质(与肝素辅因子II或凝血酶不同)的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由该氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，其中所述片段、变体、融合物或衍生物展现出抗炎和/或抗凝活性。
本发明源自发明人意想不到的发现，即调控血液凝固的天然存在的蛋白质在其C端和/或其它内部区域内包含展现出抗炎活性的“隐蔽肽”。认为此类肽可以通过响应伤口和其它生理学考验而切割亲本肽酶全蛋白质来“释放”。如此，本发明的多肽构成一种新颖的且先前未披露的HDP类别，其具有针对与炎症有关的病症和状况的治疗潜力。
“调控血液凝固的天然存在的蛋白质”包括所有调控血液凝固的天然存在的蛋白质，其或是正向或是负向调控血液凝固过程。此类调控活性可以通过本领域中公知的方法，例如使用活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、凝血酶原时间(PT)测试、或凝血酶凝结时间(TCT)测试来测定。此外，可以实施前激肽释放酶活化或因子X和其它凝固因子活性的具体测量。本领域技术人员应当领会，天然存在的蛋白质可以直接或间接调控血液凝固。
有利地，调控血液凝固的天然存在的蛋白质是人蛋白质。
“源自”调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列意指氨基酸序列存在于天然存在的蛋白质的氨基酸序列内。例如，在一个实施方案中，氨基酸序列可以来自天然存在的蛋白质中调控血液凝固的C端区域。“C端区域”意指天然存在的蛋白质的C端附近的100个氨基酸。在另一个实施方案中，氨基酸序列可以来自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的多至100个氨基酸的内部区域。
“抗炎活性”意指降低或预防与炎性事件有关的一种或多种生物学过程的能力。可以使用本领域中公知的方法，例如通过测量LPS诱导的促炎性细胞因子自巨噬细胞的释放(例如TNFα、IL-6、IF-γ)，或嗜中性粒细胞的释放来测定多肽的此类抗炎活性(见下文实施例)。其它相关测定法包括脂磷壁酸质、酵母聚糖、DNA、RNA、鞭毛蛋白或肽聚糖在上述系统中的效果及在转录水平测定调节(例如基因阵列、qPCR等)。此外，也可以使用树突细胞活化或凝血细胞活化作为抗炎活性的量度。
“抗凝活性”意指延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶凝结时间(TCT)和/或活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的能力。或者，可以通过与或不与肽和组织因子一起的大肠杆菌(E.coli)LPS刺激外周血单个核细胞(PBMNC)，并且可以测量在添加人血浆后接着的凝块形成，或者全血的凝结时间。
本领域技术人员应当领会，本发明涵盖包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列及保留抗炎活性的此类氨基酸序列的片段、变体、融合物和衍生物，或由该氨基酸序列及保留抗炎活性的此类氨基酸序列的片段、变体、融合物和衍生物组成的多肽。然而，优选地，多肽不是天然存在的蛋白质，例如全蛋白质(尽管当然应当领会，多肽可以构成天然存在的蛋白质的不完全部分或片段)。
在本发明的多肽的一个实施方案中，多肽包含肝素结合域。“肝素结合域”意指多肽内能够在生理学条件下结合肝素的氨基酸序列。此类序列经常包含XBBXB和XBBBXXB (其中B=碱性残基，且X=亲水性或不带电荷的残基)，或碱性氨基酸的簇(XBX,XBBX,XBBBX)。以非碱性残基间隔此类簇(BXB,BXXB)也可以存在。另外，碱性氨基酸间约
Figure BDA00001667053000041
的距离构成肝素结合的前提。
本领域技术人员应当领会，调控血液凝固的天然存在的蛋白质可以来自人或非人来源。例如，调控血液凝固的天然存在的蛋白质可以源自(直接或间接)非人哺乳动物，诸如猿(例如，黑猩猩、倭黑猩猩(bonobo)、大猩猩、长臂猿和猩猩)、猴(例如，猕猴、狒狒和疣猴)、啮齿类(例如小鼠、大鼠)或有蹄动物(例如，猪、马和母牛)。
在本发明多肽的优选实施方案中，调控血液凝固的天然存在的蛋白质是人蛋白质。
如此，调控血液凝固的天然存在的蛋白质可以选自下组：丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)、组织因子途径抑制剂(诸如TFPI-1和TFPI-2)和富含组氨酸的糖蛋白(HRG)。
在一个实施方案中，调控血液凝固的天然存在的蛋白质是serpin。
例如，serpin可以是抗凝血酶III(ATIII；例如见Swiss Port登录号P01008)。
如此，所述多肽可以包含如下SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQID NO:1或2的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“FFF21”：FFFAKLNCRLYRKANKSSKLV    [SEQ ID NO:1]
“AKL22”：AKLNCRLYRKANKSSKLVSANR    [SEQ ID NO:2]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:1或2的抗炎活性和/或抗凝。
在一个备选的实施方案中，serpin可以是蛋白C抑制剂(PCI；例如见SwissPort登录号P05154)。
例如，所述多肽可以包含如下SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQID NO:3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“SEK20”：SEKTLRKWLKMFKKRQLELY    [SEQ ID NO:3]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:3的抗炎和/或抗凝活性。
在又一个实施方案中，所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是组织因子途径抑制剂-1(TFPI-1；例如见Swiss Port登录号P10646)。
例如，所述多肽可以包含如下SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“GGL27”：GGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM[SEQ ID NO:4]
“LIK17”：LIKTKRKRKKQRVKIAY    [SEQ ID NO:5]
“TKR22”：TKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM    [SEQ ID NO:6]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NOS:4至6中任一项的抗炎和/或抗凝活性。
在又一个备选的实施方案中，所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是组织因子途径抑制剂2(TFPI-2；例如见Swiss Port登录号P48307)。
例如，所述多肽可以包含如下SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“ALK25”：ALKKKKKMPKLRFASRIRKIRKKQF    [SEQ ID NO:7]
“EDC34”：EDCKRACAKALKKKKKMPKLRFASRIRKIRKKQF  [SEQID NO:8]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:7或8的抗炎和/或抗凝活性。
在又一个备选的实施方案中，所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是富含组氨酸的糖蛋白(HRG；例如见Swiss Port登录号P04196)。
例如，所述多肽可以包含如下SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQID NO:9的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
(X1X2X3X4X5)n[SEQ ID NO:9]，
其中
X1和X4独立代表G，P，L,I,F,T,V，Y或W；
X2、X3和X5独立代表H,R或K；且
“n”是2-6的整数，
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:9的抗炎和/或抗凝活性。
如此，所述多肽可以包含如下SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQID NO:10的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
(GHHPH)n[SEQ ID NO:10]，其中“n”是2-6的整数，
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:10的抗炎和/或抗凝活性。
例如，所述多肽可以包含如下SEQ ID NO:11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQID NO:11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“GHH25”：GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPH  [SEQ   IDNO:11]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:11的抗炎和/或抗凝活性。
本领域技术人员应当领会，如本文中所使用的，术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码的氨基酸及其相应的“D”形式的立体异构体(与天然的“L”形式相比)、Ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规的氨基酸(例如，α,α-双取代氨基酸、N-烃基氨基酸等)和经化学衍生化的氨基酸(见下文)。
在明确列举氨基酸，诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，术语指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非另有明确规定。其它非常规的氨基酸也可以是适合于本发明多肽的组分，只要多肽保留期望的功能性特性。对于显示的肽，每个编码的氨基酸残基(在适当的情况中)由对应于常规氨基酸俗名的单字母名称代表。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
在多肽包含依照参照序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1至11)情况中，它可以包含超出参照序列的在其N和/或C端的额外氨基酸，例如多肽可以包含在其N端的额外氨基酸。同样地，在多肽包含依照参照序列的氨基酸序列的片段、变体或衍生物的情况中，它可以包含在其N和/或C端的额外氨基酸。
在又一个实施方案中，多肽包含依照参照序列的氨基酸序列(例如SEQID NO:1至11)的片段或由该片段组成。如此，所述多肽可以包含参照序列的至少5个连续氨基酸或由参照序列的至少5个连续氨基酸组成，例如，例如SEQ ID NO:1至11的至少6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或21个连续氨基酸。
在一个实施方案中，多肽片段以选自下组的氨基酸残基开始：SEQ IDNO:1的氨基酸残基1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15和16。或者/另外，所述多肽片段可以以选自下组的氨基酸残基终止：SEQ ID NO:1的氨基酸残基5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。
本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以包含依照参照序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)的变体或所述变体的片段或由所述变体或所述变体的片段组成。此类变体可以是非天然存在的。
多肽的“变体”包括插入、缺失和取代，其或是保守的或是非保守的。例如，保守取代指将相同通用类别(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)内的氨基酸用相同类别内的另一种氨基酸的取代。如此，保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的意义是本领域中公知的。特别地，包括展现出抗炎活性的多肽的变体。
在又一个实施方案中，变体具有与依照参照序列的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1)或其片段具有至少50%同一性，例如至少55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或至少99%同一性的氨基酸序列。
可以使用合适的计算机程序，例如威斯康辛大学(University of Wisconsin)Genetic Computing Group的GAP程序来测定两种多肽间的百分比序列同一性，并且应当领会，相对于其序列已经得到最佳比对的多肽计算百分比同一性。
或者，可以使用Clustal W程序来实施比对(如记载于Thompson等,1994,Nuc.Acid Res.22:4673-4680的，通过提及而将其收入本文)。
所使用的参数可以如下：
快速成对比对参数：K-元组(字)大小：1，窗大小：5，缺口罚分：3，顶部对角线的数目：5。得分方法：x百分比。
多比对参数：缺口打开罚分：10，缺口延伸罚分：0.05。
得分矩阵：BLOSUM。
或者，可以使用BESTFIT程序来测定局部序列比对。
在一个实施方案中，可以将来自上述参照序列的氨基酸突变以降低对多肽的蛋白水解降解，例如通过I，F至W修饰来进行(见
Figure BDA00001667053000081
等，Antimicrobial Agents Chemother 2009，53，593)。
在又一个实施方案中，所述多肽包含来自与ATIII不同的serpin的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于ATIII的SEQ ID NO：1(“FFF21”)的序列。下文表1中显示了此类序列的例子。
表1：人serpin家族序列比对的选定区域。
抗凝血酶III(P01008)的SEQ ID NO：1(“FFF21”)的突出显示区域对应于氨基酸153-173
Figure BDA00001667053000082
Figure BDA00001667053000091
Figure BDA00001667053000101
在一个备选的实施方案中，所述多肽包含来自与PCI不同的serpin的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于PCI的SEQ ID NO:3(“SEK20”)的序列。下文表2中显示了此类序列的例子。
表2：人serpin家族序列比对的选定区域。
抗凝血酶III(P015154)的SEQ ID NO:3(“SEK20”)的突出显示区域对应于氨基酸283-302
Figure BDA00001667053000102
Figure BDA00001667053000111
Figure BDA00001667053000121
与上述表1和2相关的“对应”于SEQ ID NO:1或3的序列包括所述多肽对应于不同人serpin内的等同氨基酸序列，即该多肽与SEQ ID NO:1或3展现出最大的序列同一性(例如，如通过GAP或BLAST序列比较所测量的)。通常，相应的多肽会与参照序列(例如，SEQ ID NO:1或3)具有相同长度。
可以使用重组多核苷酸使用本领域中公知的蛋白质工程和定点诱变的方法来生成变体(见例如，见Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第3版,Sambrook & Russell,2000,Cold Spring Harbor Laboratory Press，通过提及而将其收入本文)。
在一个实施方案中，多肽包含作为上述氨基酸序列(例如SEQ ID NOS:1至11)之任一的物种同源物的氨基酸或由该氨基酸组成。“物种同源物”包括多肽对应于来自非人物种的等同蛋白质内的相同氨基酸序列，即所述多肽与SEQ ID NOS:1至11之任一展现出最大序列同一性(例如，如通过GAP或BLAST序列比较所测量的)。通常，物种同源物多肽会与人参照序列(即，SEQID NOS:1至11)具有相同长度。
在又一个实施方案中，多肽包含融合蛋白或由融合蛋白组成。
多肽的“融合物”包括对应于与任何其它多肽融合的参照序列(例如SEQID NO:1，或其片段或变体)的氨基酸序列。例如，所述多肽可以与多肽诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A融合以便于纯化所述多肽。此类融合物的例子是本领域技术人员公知的。类似地，所述多肽可以与寡组氨酸标签诸如His6或被抗体识别的表位诸如公知的Myc标签表位融合。另外，可以使用包含疏水性寡肽末端标签的融合物。本发明的范围中还包括与所述多肽的任何变体或衍生物的融合物。应当领会，保留期望特征，诸如抗炎活性的融合物(或其变体或衍生物)是优选的。
融合物可以包含对本发明的所述多肽赋予期望特征的别的部分；例如，所述部分可用于检测或分离多肽，或促进多肽的细胞摄取。所述部分可以例如是生物素模块、链霉亲合素模块、放射性模块、荧光模块，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团，如本领域技术人员公知的。模块可以是免疫原性标签，例如Myc标签，如本领域技术人员已知的，或者可以是能够促进多肽的细胞摄取的亲脂性分子或多肽域，如本领域技术人员已知的。
本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以包含一个或多个例如通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的氨基酸。
如本领域中领会的，PEG化的蛋白质可以展现出降低的肾清除和蛋白水解、降低的毒性、降低的免疫原性和升高的溶解度[21,22]。已经对几种基于蛋白质的药物，包括第一种PEG化的分子天冬酰胺酶和腺苷脱氨酶采用PEG化[22,23]。
为了获得具有最大延长的半衰期和保留的生物学活性的成功PEG化的蛋白质，可以影响后果的几项参数是重要的，并且应当进行考虑。PEG分子可以存在不同，并且已经用于蛋白质PEG化的PEG变体包括PEG及单甲氧基-PEG。另外，它们可以或是线性的或是分支的[24]。所使用PEG分子的大小可以存在变化，并且已经将大小范围为1-40kDa的PEG模块与蛋白质连接[24-27]。另外，附接于蛋白质的PEG模块的数目可以存在变化，并且已经报告了1-6个PEG单元附接于蛋白质的例子[24,26]。此外，已经利用了供缀合用的各种反应基团以及PEG间接头的存在或缺乏。如此，PEG可以与N端氨基连接，或者与具有反应性氨基或羟基基团的氨基酸残基(Lys,His,Ser,Thr和Tyr)直接连接或者通过使用γ-氨基丁酸作为接头来连接。另外，PEG可以与羧基(Asp,Glu,C端)或巯基(Cys)基团偶联。最后，可以使用酶转谷氨酰胺酶来特异地将Gln残基PEG化，并且已经描述了PEG的烃基胺衍生物[25]。
已经显示了提高PEG化的程度导致体内半衰期延长。然而，本领域技术人员应当领会，PEG化过程会需要以个体为基础对特定蛋白质进行优化。
PEG可以在天然存在的二硫键处偶联，如记载于WO 2005/007197的。可以经由添加不损害蛋白质的三级结构的化学桥来稳定二硫键。这允许利用构成二硫键的两个硫的缀合硫醇选择性来创建用于对PEG进行位点特异性附接的桥。由此，避开了需要将残基工程化改造到肽中以附接于靶分子。
也可以共价缀合多种备选的嵌段共聚物，如记载于WO 2003/059973的。治疗性聚合缀合物可以展现出改善的热特性、结晶、粘着、膨胀、涂层、pH依赖性构象和生物分布。此外，它们可以实现延长的循环、在通过胞饮对缀合物细胞摄取后在次级溶酶体的蛋白水解和酸性环境中释放生物活性物及由于大分子的特征所致的更有利的物理化学特性(例如在生物学流体中药物溶解度增加)。嵌段共聚物(包括亲水性和疏水性嵌段物)在溶液中形成聚合微团。在微团解离后，个别的嵌段共聚物分子被安全地排泄。
也可以通过与功能性侧基的反应来实现一种或多种氨基酸的化学衍生物。此类衍生化的分子包括例如那些其中的游离氨基基团已经被衍生化以形成胺氢氯化物、对甲苯磺酰基基团、羧基苯甲酸基基团、叔-丁基氧羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的分子。可以将游离的羧基基团衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯和酰肼。可以将游离的羟基基团衍生化以形成O-酰基或O-烃基衍生物。作为化学衍生物还包括那些含有20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：可以用4-羟基脯氨酸取代脯氨酸；可以用5-羟基赖氨酸取代赖氨酸；可以用3-甲基组氨酸取代组氨酸；可以用高丝氨酸取代丝氨酸，及用鸟氨酸取代赖氨酸。衍生物还包括含有一处或多处添加或缺失的肽，只要必需的活性得到保留。其它包括的修饰是酰胺化、氨基端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨水或甲胺进行)等末端修饰。
本领域技术人员应当进一步领会，肽模拟化合物也可以是有用的。如此，“多肽”包括具有抗炎活性的肽模拟化合物。术语“肽模拟物”指模拟作为治疗剂的特定肽的构象和期望的特征的化合物。
例如，本发明的多肽不仅包括其中的氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)连接相连的分子，而且还包括其中的肽键反转的分子。此类反-逆(retro-inverso)肽模拟物可以使用本领域中已知的方法，例如诸如那些记载于Meziere等(1997)J.Immunol.159,3230-3237(通过提及而将其收入本文)的方法来生成。此方法牵涉生成含有涉及主链而非侧链取向的变化的假肽。反-逆肽(其含有NH-CO键代替CO-NH肽键)对蛋白水解的抗性多得多。或者，本发明的多肽可以是肽模拟化合物，其中一个或多个氨基酸残基通过-y(CH2NH)-键代替常规酰胺连接来连接。
在又一个备选中，可以将肽键一起分配，只要使用保留氨基酸残基的碳原子间的间隔的合适接头模块；接头模块与肽键具有基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性可能是有利的。
应当领会，多肽可以在其N或C端区处方便地封闭，从而帮助降低对外切蛋白水解消化的易感性。
也已经使用多种未编码的或经修饰的氨基酸诸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸来修饰哺乳动物肽。另外，可以通过共价修饰，诸如环化或者通过掺入内酰胺或其它类型的桥来稳定假设的生物活性构象，例如见Veber等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636和Thursell等,1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166，通过提及而将其收入本文。
许多合成策略间的共同主题是将一些环形模块导入基于肽的框架中。环形模块限制肽结构的构型空间，并且这经常导致肽对特定生物学受体的特异性升高。此策略的附加优点在于对肽导入环形模块也可以生成具有对细胞肽酶的敏感性降低的肽。
如此，本发明的例示性多肽包含末端半胱氨酸氨基酸。此类多肽可以以通过末端半胱氨酸氨基酸中的硫醇(mercaptide)基团的二硫键形成得到的杂环形式(heterodetic cyclic form)或者以通过末端氨基酸间的酰胺肽键形成得到的纯形式(homodetic form)存在。如上文所指示的，经由N和C端区半胱氨酸间的二硫键或酰胺键环化小肽可以通过降低蛋白水解，而且还提高结构的刚性(这可以产生特异性更高的化合物)来避开有时在线性肽情况下观察到的特异性和半衰期的问题。通过二硫键环化的多肽具有游离的氨基和羧基端，其仍可能易感蛋白水解降解，而通过N端胺和C端羧基间的酰胺键形成环化的肽因此不再含有游离的氨基或羧基端。如此，本发明的肽可以或是通过C-N连接或是通过二硫化物连接相连。
本发明不以任何方式受限于肽环化方法，而是涵盖可以通过任何合适的合成方法实现其环形结构的肽。如此，杂连接可以包括但不限于经由二硫化物、亚烃基(alkylene)或硫化物桥的形成。合成纯环肽和杂环肽(包括二硫化物、硫化物和亚烃基桥)的方法披露于US 5,643,872，通过提及而将其收入本文。环化方法的其它例子包括经由点击化学(click chemistry)、环氧化物、醛-胺反应的环化，以及US 6,008,058(通过提及而将其收入本文)中披露的方法。
合成环形稳定化肽模拟化合物的别的方法是闭环复分解(ring-closingmetathesis,RCM)。此方法牵涉如下的步骤，即合成肽前体，并使其接触RCM催化剂以生成构象约束肽(conformationally restricted peptide)。合适的肽前体可以含有两个或更多个不饱和C-C键。可以使用固相-肽-合成技术来实施所述方法。在此实施方案中，使锚定于固体支持物的前体接触RCM催化剂，然后，自固体支持物切割产物以生成构象约束肽。
由D.H.Rich于Protease Inhibitors,Barrett和Selveson编,Elsevier(1986)(通过提及而将其收入本文)披露的另一种方法已经经由应用酶抑制剂设计中的过渡态类似物概念来设计肽模拟物。例如，已知staline的仲醇模拟胃蛋白酶底物的易切断酰胺键的四面体过渡态。
总之，如公知的，末端修饰可用于降低蛋白酶消化的易感性，并且因此延长肽在溶液中，特别在可存在蛋白酶的生物学流体中的半衰期。由于通过环化形成的稳定结构及考虑到对环肽观察到的生物学活性，多肽环化也是一种有用的修饰。
如此，在一个实施方案中，本发明的第一方面的多肽是线性的。然而，在一个备选的实施方案中，多肽是环形的。
本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以具有各种长度。然而，通常，多肽的长度为10-200个氨基酸，例如长度为10-150、15-100、15-50、15-30、17-30、或17-28个氨基酸。例如，多肽的长度可以是至少17个氨基酸。
如开始时所述，抗炎活性是本发明多肽共同的特征。在一个实施方案中，多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞，诸如单核细胞衍生的巨噬细胞的释放，包括巨噬细胞抑制因子、TNF-α、HMGB1、C5a、IL-17、IL-8、MCP-1、IFN-γ、Il-6、IL-1b、IL-12。抗炎性IL-10可以不受影响或者瞬时升高。
其它标志物也可能受到影响：这些包括单核细胞和内皮细胞上的组织因子、原降钙素、CRP、活性氧类别、缓激肽、一氧化氮、PGE1、血小板活化因子、花生四烯酸代谢物、MAP激酶活化。
特别地，所述多肽在下列一种或多种模型中可以展现出抗炎活性：
(i)使用LPS、LTA、酵母聚糖、鞭毛蛋白、尘螨、病毒或细菌DNA或RNA、或肽聚糖作为刺激物的体外巨噬细胞模型；
(ii)内毒素休克的体内小鼠模型；
(iii)或是与抗微生物疗法组合或是单独给予的体内感染模型。
在本发明的又一个实施方案中，多肽展现出抗凝活性。
“抗凝活性”意指降低或预防凝固(即血液凝结)或相关信号或效应的能力。此类活性可以通过本领域中公知的方法，例如使用活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、凝血酶原时间(PT)测试、或凝血酶凝结时间(TCT)测试来测定。此外，可以实施前激肽释放酶活化或因子X和其它凝固因子活性的具体测量。本领域技术人员应当领会，多肽可以抑制外因性凝血途径和/或内因性凝血途径。然而，在一个优选的实施方案中，多肽(至少部分)抑制内因性凝血途径。
在本发明的又一个实施方案中，多肽展现出Toll样受体(TLR)阻断活性。此类受体阻断活性可以使用本领域中公知的方法，例如通过分析合适的下游效应物，诸如iNOS、核因子κB和细胞因子来测量。
由于拥有抗炎活性，本发明的第一方面的多肽意图用于治疗或预防炎症。
“治疗或预防炎症”意指本发明的多肽能够(至少部分)预防或抑制一种或多种构成炎症或与炎症有关的症状、信号或效应。
本领域技术人员应当领会，对炎症的抑制可以为全部或部分。在一个优选的实施方案中，与尚未暴露于多肽的细胞或个体相比，多肽能够将一种或多种炎症标志物抑制20%或更多，例如至少30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更多。
有利地，本发明的多肽能够选择性治疗或预防炎症。
“选择性”意指多肽以比其调控其它生物学功能更大的程度抑制或预防炎症。优选地，多肽或其片段、变体、融合物或衍生物仅抑制或预防炎症。
然而，在又一个实施方案中，多肽还(或备选地)抑制或预防血液凝固。如上文，本领域技术人员应当领会，对凝固的抑制可以为全部或部分。在一个优选的实施方案中，与尚未暴露于多肽的细胞或个体相比，多肽能够将一种或多种凝固的量度和或标志物抑制20%或更多，例如至少30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更多。
在一个实施方案中，多肽用于治疗或预防与感染有关的炎症(即由感染引起的或仅与感染共呈现的)。
在本发明的优选的但非限制性的实施方案中，多肽用于治疗或预防选自下列的疾病、状况或适应症：
i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克。其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎；
ii)慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、COPD和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症。
iii)术后炎症，炎性和凝固性病症，包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用。此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘。
iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固。
v)与抗微生物治疗组合的过度炎症。使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内(intratechal)、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。
例如，多肽可以用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、创伤、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和/或弥散性血管内凝固(DIC)。
在一个实施方案中，多肽展现出抗炎和抗凝活性两者，并且可以在伴随治疗或预防炎症和凝血中使用。此类多肽可特别适合于治疗和预防期望炎性和促凝过程两者受到组合抑制的状况，诸如败血症、慢性阻塞性肺病症(COPD)、血栓形成、DIC和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。此外，其它与过度炎症和凝固变化有关的疾病可以受益于通过多肽的治疗，诸如囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎。
在又一个实施方案中，本发明的多肽与一种或多种别的治疗剂组合使用。例如，本发明的多肽可以与抗生剂(antibiotic agent)、抗炎剂、免疫抑制剂和/或防腐剂以及血管活性剂和/或受体阻断剂或受体激动剂组合施用。使用的抗微生物剂可以iv、sc、im、鞘内、口服、或表面(topically)应用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。例如，本发明的肽可以充当防腐处理的佐剂，例如对伤口的银/PHMB处理以淬灭LPS效应。
如此，本发明的肽可以充当佐剂(用于阻断炎症)以补充对内部或外部感染(诸如丹毒、肺感染，包括真菌性感染、败血症、COPD、伤口、和其它上皮感染)的抗生素、防腐剂和/或抗真菌处理。同样地，本发明的肽可以充当防腐处理的佐剂，例如对伤口的银/PHMB处理以淬灭LPS效应。
在一个实施方案中，本发明的多肽与类固醇，例如糖皮质激素(诸如地塞米松(dexamethasone))组合使用。
本发明的第二个相关方面提供了一种分离的多肽，其包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物(该多肽展现出抗炎和/或抗凝活性)或由源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质选自下组：serpins(与肝素辅因子II不同)、富含组氨酸的糖蛋白(HRG)和组织因子途径抑制剂(诸如TFPI-1和TFPI-2)，但须所述多肽不是天然存在的蛋白质(例如全蛋白质)。
“天然存在的蛋白质”在此上下文中指从头(de novo)合成的多肽。然而，不排除体内生成的此类天然存在的全蛋白质的片段。
本领域技术人员应当领会，术语诸如片段、变体、融合物或衍生物应当如上文所讨论的涉及本发明的第一方面解释。
在一个实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NOS:1至11的氨基酸序列，或所述序列的片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由选自SEQ ID NOS:1至11的氨基酸序列，或所述序列片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成。例如，多肽可以包括选自SEQ ID NOS:1至11的氨基酸序列或由选自SEQ ID NOS:1至11的氨基酸序列组成。
本领域技术人员应当领会，与本发明的第一方面的多肽有关的上文所讨论的任选特征也与本发明的第二方面的相关多肽相关。
例如，在一个优选的实施方案中，多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞的释放(诸如IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-12,IL-1和/或IL-18)。
在另一个优选的实施方案中，多肽展现出抗凝活性。
本发明还包括上文所描述的多肽的药学可接受酸或碱加成盐。用于制备可用于本发明的上述碱化合物的药学可接受酸加成盐的酸是形成无毒性酸加成盐，即含有药理学可接受阴离子的盐的酸，诸如氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、蔗糖盐(saccharate)、苯甲酸盐(benzoate)、甲磺酸盐(methanesulphonate)、乙磺酸盐(ethanesulphonate)、苯磺酸盐(benzenesulphonate)、对甲苯磺酸盐(p-toluenesulphonate)和扑酸盐(pamoate)[即，1,1’-亚甲基-二-(2-羟基-3萘甲酸盐)]盐等。
也可以使用药学可接受碱加成盐来生成多肽的药学可接受盐形式。可以作为试剂用于制备自然界中为酸性的本化合物的药学可接受碱式盐的化学碱是那些与此类化合物形成无毒碱式盐的。此类无毒碱式盐包括但不限于那些源自此类药理学可接受阳离子，诸如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的盐、铵或水溶性胺加成盐诸如N-甲基葡糖胺-(甲葡胺)、及低级烷醇铵和药学可接受有机胺的其它碱式盐等。
应当领会，可以为了贮存而冻干本发明的多肽，并在使用前在合适的载体中重建，例如经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却，或者经由使用超临界二氧化碳的颗粒形成(沉淀)来进行。可以采用任何合适的冻干方法(例如冷冻-干燥、喷雾干燥、饼干燥)和/或重建技术。本领域技术人员应当领会，冻干和重建可以导致不同程度的活性损失，而且可能必须向上调节使用水平来补偿。优选地，冻干的(冷冻干燥的)多肽在再水合时丧失不超过约1%的其活性(冻干前)，或者在再水合时丧失不超过约5%,10%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,或不超过约50%的其活性(冻干前)。
用于生成本发明的多肽的方法是本领域中公知的。
便利地，多肽是或包含重组多肽。适合于生成此类重组多肽的方法是本领域中公知的，诸如在原核或真核宿主细胞中表达(例如见Sambrook和Russell,2000,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第三版,Cold SpringHarbor,New York,在此通过提及而收录该文件的相关公开内容)。
也可以使用商品化的体外翻译系统，诸如兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽裂解物(获自Promega)来生成本发明的多肽。优选地，翻译系统是兔网织红细胞裂解物。便利地，翻译系统可以与转录系统偶联，诸如TNT转录-翻译系统(Promega)。此系统具有在与翻译相同的反应中自编码DNA多核苷酸生成合适的mRNA转录物的优点。
本领域技术人员应当领会，可以例如替代性地使用公知的液相或固相合成技术(诸如t-Boc或Fmoc固相肽合成)来人工合成本发明的多肽。
如此，本发明范围内包括下列各项：
(a)本发明的第三方面提供了编码依照本发明的第二方面的多肽的分离的核酸分子；
(b)本发明的第四方面提供了包含依照本发明的第三方面的核酸分子的载体(诸如表达载体)；
(c)本发明的第五方面提供了包含依照本发明的第三方面的核酸分子或依照本发明的第四方面的载体的宿主细胞；及
(d)本发明的第六方面提供了生成依照本发明的第二方面的多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养依照本发明的第五方面的宿主细胞群体，并自其分离所述多肽。
本发明的第七方面提供了包含依照本发明的第一方面的多肽及药学可接受赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。
如本文中所使用的，“药物组合物”意指用于治疗或预防与炎症有关的病症和状况的治疗有效的配制剂。
如本文中所使用的，“药物组合物”意指用于治疗或预防与炎症有关的病症和状况的治疗有效的配制剂。
药物组合物中也可以包含其它化合物，诸如其它肽、低分子量免疫调节剂、受体激动剂和拮抗剂、和抗微生物剂。其它例子包括螯合剂诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。
可以以本领域中已知的方式来制备药物组合物，其是贮存时足够稳定的，并且适合于对人和动物施用。可以例如经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却，或者经由使用来自超临界颗粒形成的颗粒形成来冻干药物组合物。
“药学可接受的”意指不降低活性成分，即抗炎多肽的生物学活性的效率的无毒性材料。此类药学可接受缓冲液、载体或赋形剂是本领域中公知的(见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R Gennaro编,MackPublishing Company(1990)及handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press(2000)。
术语“缓冲液”意图指以稳定pH为目的的含有酸-碱混合物的水溶液。缓冲液的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
术语“稀释剂”意图指以在药用制剂中稀释肽为目的的水或非水溶液。稀释剂可以是下列一种或多种：盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花籽油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)。
术语“佐剂”意图指对配制剂添加以提高肽的生物学效果的任何化合物。佐剂可以是一种或多种胶体银或金、或具有不同阴离子的锌、铜或银盐，例如但不限于不同酰基组成的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、和乙酸盐。佐剂也可以是阳离子聚合物诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物诸如聚(乙烯基咪唑)、和阳离子多肽诸如多组氨酸、多赖氨酸、多精氨酸、和含有这些氨基酸的肽。
赋形剂可以是下列一种或多种：碳水化合物、聚合物、脂质和矿物。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇、和环状糊精，其被添加至组合物，例如以便于冻干。聚合物的例子是不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐(alginates)、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或具有各种组成的其共聚物、及聚乙烯吡咯烷酮(它们都具有不同分子量)，其被添加至组合物，例如以控制粘性，实现生物粘着，或保护活性成分(也适用于A-C)免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单、二和三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同酰基链长度和饱和度)、卵卵磷脂(egg lecithin)、大豆卵磷脂、氢化的卵和大豆卵磷脂，其出于与聚合物相似的原因被添加至组合物。矿物的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加至组合物以获得诸如降低液体积累或有利的色素特性等益处。
药物组合物也可以含有一种或多种单糖或二糖，诸如木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、麦芽糖醇或木糖苷、和/或单酰甘油，诸如甘油一月桂酸酯(monolaurin)。载体的特征取决于施用路径。一种施用路径是表面施用。例如，对于表面施用，一种优选的载体是含有活性肽的乳化乳剂，但是可以使用其它常见的载体诸如某些基于矿脂(petrolatum)/矿物的和基于植物的软膏剂，以及聚合物凝胶、液体晶相和微乳。
应当领会，药物组合物可以含有本发明的一种或多种多肽，例如1、2、3、或4种不同肽。通过使用不同肽的组合，可以提高抗炎效果。
如上文所讨论的，多肽可以以盐，例如与无机酸，诸如氢氯酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等，或与有机酸诸如甲酸、乙酸、卤代乙酸、丙酸、乙醇酸(glycolic acid)、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、丙二酸、延胡索酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)等的酸加合物提供。可以添加无机盐诸如单价钠、钾或二价锌、镁、铜、钙(都具有相应的阴离子)以改善抗微生物组合物的生物学活性。
本发明的药物组合物也可以为脂质体形式，其中在其它药学可接受载体外，组合多肽与以聚集形式作为微团、不溶性单层和液态晶体存在的两亲剂(amphipathic agent)诸如脂质。适合于脂质体配制剂的脂质包括但不限于甘油一酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质还包括为了延长血流循环时间而在极性首基中通过聚(乙二醇)修饰的上述脂质。此类脂质体配制剂的制备可参见例如US4,235,871。
本发明的药物组合物也可以为生物可降解微球形式。已经在微球的生成中广泛使用脂肪族聚酯诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯(carprolactone))(PCL)、和聚酸酐作为生物可降解聚合物。此类微球的制备可参见US 5,851,451和EP 213 303。
也可以用通过表面活性剂和嵌段共聚物，优选地那些含有用于延长血流循环时间的聚(氧化乙烯)模块的嵌段共聚物形成的微团系统配制本发明的药物组合物。
本发明的药物组合物也可以为聚合物凝胶形式，其中使用聚合物诸如不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯和聚乙烯吡咯烷酮来增稠含有肽的溶液。聚合物也可以包含明胶或胶原。
或者，可以将本发明的多肽在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花籽油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中溶解。
药物组合物还可以包含用于增强抗炎多肽作用的离子和限定的pH。
本发明的组合物可以进行常规的药学操作诸如灭菌和/或可以含有常规的佐剂诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等，例如如本文中别处公开的。
本领域技术人员应当领会，可以局部或系统施用本发明的药物组合物。施用路径包括表面、眼、鼻、肺、含服、胃肠外(静脉内、皮下、和肌肉内)、口服、阴道和直肠。自植入物的施用也是有可能的。合适的制剂形式是例如颗粒剂、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、微乳(其定义为由水、油和表面活性剂组成的光学上各向同性的热力学稳定性体系)、液晶相(其定义为以长程有序但短程无序为特征的体系(例子包括薄片状、六边形和立方体相，或是水或是油连续的)、或其分散的对应物、凝胶、软膏剂、分散体、悬浮液、乳膏、气雾剂、微滴或安瓿形式的可注射溶液，而且还有具有活性化合物的延长释放的制剂，在该制剂中，通常使用赋形剂、稀释剂、佐剂或载体，如上文所描述的。药物组合物也可以在绷带、石膏或缝合线等中提供。
在优选的实施方案中，药物组合物适合于胃肠外施用或表面施用。
在备选的优选实施方案中，药物组合物适合于肺施用或鼻施用。
例如，可以鼻内或通过吸入来施用本发明的药物组合物，并且方便地以干粉末吸入剂或气雾剂喷雾形式投递，所述气雾剂喷雾通过使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟-甲烷、二氯四氟-乙烷、氢氟代烷诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其它合适的气体自加压容器、泵、喷雾或喷雾器提供。在加压气雾剂的情况中，可以通过提供阀来决定剂量单位以投递计量的剂量。加压容器、泵、喷雾或喷雾器可以含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂混合物作为溶剂，其可以另外含有滑润剂，例如，山梨聚糖三油酸酯。吸入器或吹入器中使用的胶囊和筒(例如由明胶制成)可以配制成含有本发明多肽和合适的粉末基底诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
优选地，气雾剂或干粉末配制剂排布为使得每个计量的剂量或每“喷(puff)”含有对患者投递的至少0.1mg本发明的多肽。应当领会，用气雾剂的总体每日剂量会在患者间存在变化，并且可以以单剂或者更通常，在一整天中以分开的剂量施用。
药物组合物会以药学有效剂量对患者施用。“药学有效剂量”意指就其施用所针对的状况而言足以产生期望的效果的剂量。精确的剂量取决于化合物的活性、施用方式、病症的性质和严重性、患者的年龄和体重，可能需要不同剂量。可以通过以个别剂量单位(否则，几个更小的剂量单位)形式的单次施用和还通过特定时间间隔的细分剂量的多次施用来实施剂量施用。
本发明的药物组合物可以单独地或与其它治疗剂组合施用，所述其它治疗剂诸如别的抗生素、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂和/或防腐剂(诸如抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂、和抗寄生物剂)。合适的抗生剂的例子包括青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。同样地，药物组合物也可以含有其它抗炎药，诸如类固醇和大环内酰胺(macrolactam)衍生物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物与类固醇，例如糖皮质激素(诸如地塞米松(dexamethasone))组合施用。
本领域技术人员应当领会，其它治疗剂可以作为相同药物组合物的一部分掺入或者可以分开施用。
在本发明的第七方面的一个实施方案中，药物组合物与要在医学中使用(或是外部或是内部)的装置或材料“结合”。“与…结合”包括用/与本发明的药物组合物(或其多肽)包被、充满、共价结合或以其它方式混合的装置或材料。
例如，可以将组合物包被于装置表面，所述装置接触人体或其组分(例如血液)，诸如旁路手术、体外循环、伤口护理和/或透析中使用的装置。如此，可以将组合物包被(coat)、涂刷(paint)、喷雾或以其它方式应用于或混合缝合线、假体、植入物、伤口敷料、导管、镜片、皮肤移植物、皮肤替代物、血纤蛋白胶或绷带等。这样做时，组合物可以对装置或材料赋予改善的抗炎和/或抗凝特性。
优选地，用本发明的药物组合物(或其多肽组分)包被装置或材料。“包被”意指将药物组合物应用于装置或材料的表面。如此，可以用包含本发明的药物组合物(或其多肽)的溶液涂刷或喷雾装置或材料。或者，可以将装置或材料浸入包含本发明多肽的溶液的贮液器中。
有利地，将装置或材料充满本发明的药物组合物(或其多肽)。“充满”意指将药物组合物掺入装置或材料或以其它方式与装置或材料混合，从而使其遍及分布。
例如，可以将装置或材料在包含本发明多肽的溶液中于4°C温育过夜。或者，可以通过蒸发或者通过于室温温育来将本发明的药物组合物(或其多肽)在装置或材料表面上固定化。
在一个备选的实施方案中，本发明的多肽与装置或材料(例如在装置或材料的外部表面上)共价连接。如此，多肽上合适的官能团与装置或材料上的官能团间形成共价键。例如，用于将多肽与聚合物支持物的共价键合的方法包括经由重氮中间体的共价连接、通过肽连接的形成、通过结合蛋白上的酚、胺和巯基基团的烷基化、通过使用多官能性中间体来进行，例如戊二醛，及其它各种各样的方法，例如使用硅烷基化玻璃或石英进行，其中玻璃表面的二和三烷氧基硅烷的反应容许具有许多不同官能团的玻璃表面的衍生化。关于详情，见Enzyme immobilisation by Griffin,M.,Hammonds,E.J.and Leach,C.K.(1993)In Technological Applications of Biocatalysts(BIOTOL SERIES),pp.75-118,Butterworth-Heinemann。还可见综述文章，题目为‘Biomaterials inTissue Engineering’，Hubbell,J.A.(1995)Science 13:565-576。
在一个优选的实施方案中，装置或材料包含聚合物或由聚合物组成。聚合物可以选自下组：聚酯(例如聚乳酸、聚乙醇酸或各种组成的聚乳酸-乙醇酸共聚物)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚缩醛(polyacetal)、聚脲、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚酰胺)和多糖材料(例如，交联的藻酸盐、透明质酸、角叉菜胶、明胶、淀粉、纤维素衍生物)。
或者/另外，装置或材料可以包含金属(例如，钛、不锈钢、金、钛)、金属氧化物(二氧化硅、氧化钛)和/或陶瓷(磷灰石、羟磷灰石)或者由金属(例如，钛、不锈钢、金、钛)、金属氧化物(二氧化硅、氧化钛)和/或陶瓷(磷灰石、羟磷灰石)组成。
此类材料可以为宏观的固体/整料(monolith)形式，作为化学或物理化学交联的凝胶，作为多孔材料，或作为颗粒。
如此，本发明另外提供了要在医学中使用的装置和材料，已经对所述装置和材料应用了本发明的多肽或包含本发明的多肽的药物组合物。
可以使用本领域中公知的方法来生成此类装置和材料。
本发明的第八方面提供了医学中使用的依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物。
在优选的实施方案中，依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物用于：
(a)治疗和/预防急性和/或慢性炎症；
(b)治疗和/预防微生物感染(例如细菌性感染)；
(c)调控血液凝固；和/或
(d)治疗伤口。
例如，依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物可以用于治疗和/预防选自下列的疾病、状况或适应症：
i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克。其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎。
ii)慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、COPD和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症。
iii)术后炎症，炎性和凝固性病症，包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用。此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘。
iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固。
v)与抗微生物治疗组合的过度炎症。使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内(intratechal)、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。
如此，多肽可以用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、创伤、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和/或弥散性血管内凝固(DIC)。
本发明的相关第九方面提供了依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物在制备供治疗或预防炎症和/或过度凝固用的药物中的用途(如上文所描述的)。
本发明的第十方面提供了用于治疗或预防患者中的炎症和/或凝固的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物(如上文所描述的)。在优选的但非限制性的实施方案中，所述方法用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和/或弥散性血管内凝固(DIC)。
本领域技术人员应当进一步领会，本发明的用途和方法在医学和兽医领域两者中具有效用。如此，可以在治疗人和非人动物(诸如马、犬和猫)两者中使用多肽药物。然而，有利地，患者是人。
本发明的优选方面参照附图在以下非限制性例子中描述：
图1：TFPI的C端肽的NO阻断效果。
用10ng/ml大肠杆菌LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞，并且添加10μM肽GGL27、LIK17和TKR22。使用格里斯(Griess)试剂来测量NO。
图2：肝素辅因子II的肽的NO阻断效果。
用10ng/ml大肠杆菌LPS刺激RAW巨噬细胞，并且以指示的剂量添加肽KYE28、NLF20、和KYE21。LL-37呈现为阳性对照。使用格里斯试剂来测量NO。
图3：肝素辅因子II的肽的抗炎效果。
KYE28、KYE21和NLF20阻断用各种微生物产物刺激的RAW264.7巨噬细胞的NO生成。使细胞受到指定浓度的大肠杆菌LPS、脂磷壁酸质(LTA)和肽聚糖(PGN)(来自金黄色葡萄球菌(S.aureus))及来自酿酒酵母(Saccharosmyces cerevisiae)的酵母聚糖A处理。通过使用格里斯试剂来测定具有或没有10μM GKY25情况中的NO生成。
图4：HRG是结合LPS的。
将2和5μg HRG应用于硝酸纤维素膜上，接着在具有或没有0.15M NaCl的情况中与10mM Tris,pH 7.4或10mM MES,pH 5.5中的碘化LPS一起温育。使用磷成像仪(phosphorimager)系统来显现放射性。
图5：HRG提高LPS介导的自鼠巨噬细胞的NO释放。
将RAW巨噬细胞在有或没有LL-37和HRG(2和10μM)的情况中与100ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并使用格里斯方法来测量NO。HRG以剂量依赖性方式显著提高LPS介导的NO释放(n=6,p=0.001)。
图6：针对TLR4的抗体阻断NO释放。
将RAW巨噬细胞在有或没有HRG(2μM)和多克隆抗小鼠TRL4(5μg/ml)的情况中与100ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并使用格里斯方法来测量NO。抗小鼠TLR4能够显著阻断LPS和HRG介导的NO释放。(n=6,p=0.001)。
图7：Hrg-/-小鼠的LPS诱导的败血症中的存活延长。
在LPS考验后Hrg-/-小鼠的存活延长。给野生型(虚线)和Hrg-/-(实线)小鼠i.p.注射大肠杆菌LPS，并对动物的存活追踪7天。与野生型动物相比(n=9,p=0.002)，缺乏HRG的小鼠(n=8)显示存活的显著延长。
图8：在LPS考验后18小时的视觉观察得分。
在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮、隆起的(hunched)、死前的(premortal))。野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的(sicker)。在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮[黑色]、隆起的[浅灰色]和死前的[暗灰色])。与Hrg-/-小鼠相比(p=0.001,n=10)，野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。
图9：与野生型动物相比，血管泄漏在LPS考验后在Hrg-/-小鼠的肺中是降低的。
在LPS i.p.注射后通过扫描电子显微术分析wt和Hrg-/-小鼠的肺。A)野生型，B)Hrg-/-C)wt，LPS处理后24小时，D)Hrg-/-，LPS处理后24小时。比例尺代表50μm。显示了代表性的肺切片。
图10：GHH25抑制鼠巨噬细胞中的HRG和LPS诱导的应答。
将RAW巨噬细胞在有或没有HRG(2μM)和GHH25(10和100μM)的情况中与100ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并使用格里斯方法来测量NO。GHH25以剂量依赖性方式显著降低LPS和HRG介导的NO释放(n=6,p=0.001)。
图11：GHH25抑制人巨噬细胞中的HRG和LPS诱导的应答。
将人巨噬细胞在有或没有HRG(2μM)和GHH25(10和100μM)的情况中与10ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并测量TNF-α。
图12：用GHH25处理后在LPS诱导的败血症中改善的健康状态和延长的存活。
用GHH25处理后野生型小鼠的存活延长。给野生型动物i.p.注射大肠杆菌LPS，并在之后30分钟注射1mg GHH25(虚线)或仅缓冲液(实线)。对动物的存活追踪7天。在与未处理的动物(n=12,p=0.03)相比时，用GHH25处理的动物(n=13)显示显著延长的存活。
图13：在LPS考验后18小时的视觉观察得分。
在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮、隆起的和)。野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮[黑色]、隆起的[浅灰色]和死前的[暗灰色])。与Hrg-/-小鼠(p=0.004，n=12)相比，野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。
图14：TFPI的C端肽阻断凝固。(A)
TFPI的C端肽：GGL27、LIK17、及TKR22损害正常人血浆中的固有凝固途径。这通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)来测定。GGL27和LIK17也影响监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)。凝血酶凝结时间(TCT)(其测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成)未受到肽显著影响，(B)GGL-27以剂量依赖性方式损害凝固，其通过测量正常人血浆中的aPTT、PT和TCT来监测。
图15：肝素辅因子II的肽阻断凝固。
KYE28和NLF20损害正常人血浆中的固有凝固途径，其通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)来测定。KYE21仅显示对aPTT的微小阻断。凝固系统的其它部分未受显著影响，如通过监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)和测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成的凝血酶凝结时间(TCT)来判断的。
图16：例示TFPI结构的草图。
标示了酶的切割点。
图17：TFPI衍生肽的抗微生物活性。
选定肽(为RDA中的100μM)针对指定微生物的抗微生物活性。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213隔离群(4x106个cfu)或近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)ATCC 90018(1x105个cfu)接种在0.1% TSB琼脂糖凝胶中。用6μl肽加载每个4mm直径的孔。干净区域对应于于37°C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，n=3)。
图18：TFPI衍生肽的抗细菌效果。
活菌计数测定法中TFPI衍生肽和LL-37针对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的效果。将2x106个cfu/ml细菌在50μl中与在10mM Tris(pH7.4)缓冲液(Tris)中，或在0.15m NaCl，10mM Tris(pH 7.4)(其含有正常的或热灭活的20%人血浆)中指定浓度的肽一起温育(n=3，标示出SD)。
图19：动力学分析。
通过使用大肠杆菌的活菌计数测定法来分析0.15m NaCl，10mM Tris(pH7.4)(其含有20％血浆)中的TFPI衍生肽(为6(左侧小图)和30μM(右侧小图))的细菌杀伤的时间依赖性。
图20：对细菌膜的影响。
(A)肽对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌的透化效果。(A)将细菌与指定的肽一起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。(B)电子显微术分析。将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细菌于37℃与30μM GKY25和LL-37一起温育2小时，并用电子显微术分析。比例尺条代表1μm。对照：缓冲液对照。
图21：TFPI肽LIK17的结构。
在存在带负电荷的脂质体(DOPE/DOPG)的情况中的TFPI衍生的C端肽的螺旋含量。LIK17结构很大程度上不受脂质体添加的影响。
图22：Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中的LIK17的CD谱。对于对照，还呈现了仅缓冲液和LPS的CD谱。
图23：指定肽对脂质体泄漏的影响。
通过测量羧基荧光素自DOPE/DOPG(带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。在10mM Tris缓冲液(pH 7.4)中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。
图24：对真核细胞的活性
指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2％ Triton X-100(Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ540nm测量，并且表示为％ Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了LL-37的效果以进行比较。
图25：将HaCaT角质形成细胞受到指定的TFPI肽以及LL-37。通过基于LDH的TOX-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为％总LDH释放。
图26：使用MTT测定法来测量存在指定肽(为60μM)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲
Figure BDA00001667053000321
(formazan)。于λ550nm测量染料的吸光度。
图27：肝素辅因子II衍生肽的抗微生物活性。针对指定微生物的RDA中选定肽(为100μM)的抗微生物活性。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213隔离群(4x106个cfu)或近平滑假丝酵母ATCC 90018(1x105个cfu)接种在0.1% TSB琼脂糖凝胶中。用6μl肽加载每个4mm直径孔。干净区域对应于于37°C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，n=3)。
图28：(上部)在活菌计数测定法中肝素辅因子II衍生肽和LL-37针对大肠杆菌的抗细菌效果。将2x106个cfu/ml细菌在50μl中与在10mM Tris(pH 7.4)缓冲液(Tris)中，或在0.15m NaCl，10mM Tris(pH 7.4)(其含有20%人血浆)中指定浓度的肽一起温育(n=3，标示了SD)。(下部)通过使用大肠杆菌的活菌计数测定法来分析0.15m NaCl，10mM Tris(pH 7.4)(其含有20%血浆)中的肝素辅因子II衍生的肽(为6和30μM)的细菌杀伤的时间依赖性。使用LL-37(30μM)来比较。
图29：对细菌膜的影响。
(A)肽对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的透化效果。(A)将细菌与指定的肽一起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。(B)电子显微术分析。将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细菌于37°C与30μM NLF20和LL-37一起温育2小时，并用电子显微术分析。比例尺条代表1μm。对照：缓冲液对照。
图30：结构和对脂质体的影响。
(A)在存在带负电荷的脂质体(DOPE/DOPG)的情况中的肝素辅因子II衍生的C端肽的螺旋含量。(B)NLF20对脂质体泄漏的影响。通过测量羧基荧光素自DOPE/DOPG(带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。(C)Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中的NLF20的CD谱。对于对照，还呈现了仅缓冲液和LPS的CD谱。在10mM Tris缓冲液(pH 7.4)中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。
图31：NLF20在铜绿假单胞菌败血症的动物模型中的效果。
凝血酶HCII肽NLF20显著提高存活。给小鼠i.p.注射铜绿假单胞菌细菌，1小时后接着皮下注射NLF20或仅缓冲液，然后接下去三天以24小时的时间间隔注射。用肽的处理显著提高存活。
图32：对真核细胞的活性
(A)指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2% TritonX-100(Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ540nm测量，并且表示为% Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了LL-37的效果以进行比较。(B)将HaCaT角质形成细胞受到指定的HCII肽以及LL-37。通过基于LDH的TOX-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为%总LDH释放。(C)使用MTT测定法来测量存在指定肽(为60μM)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲(formazan)。于λ550nm测量染料的吸光度。右侧小图显示了在存在20%血浆(溶血)或20%血清(LDH和MTT)情况中的结果。
图33：抗凝血酶III衍生肽FFF21阻断凝固。
FFF21损害正常人血浆中的固有凝固途径，其通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)来测定。凝固系统的其它部分未受显著影响，如通过监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)和测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成的凝血酶凝结时间(TCT)判断的。
图34：TFPI衍生肽的抗微生物活性。
(A)显示了TFPI结构的草图。标示了酶切割位点。(B)选定肽针对指定微生物的抗微生物活性(使用RDA进行)。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213或枯草芽孢杆菌ATCC 6633隔离群(4x106个cfu)或白念珠菌(C.albicans)ATCC90028和近平滑假丝酵母ATCC 90018(1x105个cfu)接种在0.1% TSB琼脂糖凝胶中。用6μl肽(为100μM)加载每个4mm直径孔。干净区域对应于于37°C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，n=3)。(C)活菌计数测定法中TFPI衍生肽和LL-37针对大肠杆菌ATCC 25922的抗细菌效果。将2x106cfu/ml细菌在50μl中与在10mM Tris(pH 7.4)缓冲液中指定浓度的肽一起温育，并测定cfu。
图35：对细菌膜的影响
(A)TFPI对细菌表面的结合。将指定的细菌(1-2x109cfu/ml)与500μl人血浆中的3μM经TAMRA标记的GGL27肽一起温育，并通过FACS分析样品。(B)肽对大肠杆菌的透化效果。将细菌与指定的肽一起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。(C)电子显微术分析。将铜绿假单胞菌细菌于37°C与30μM LIK17和LL-37一起温育2小时，并通过负染色显现。比例尺条代表1μm。对照：缓冲液对照。
图36：结构和对脂质体的影响。
(A)指定肽对脂质体泄漏的影响。通过测量羧基荧光素自DOPE/DOPG(带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。在10mM Tris缓冲液中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。(B)自脂质体的CF释放的动力学。使用1μM肽。(C)在存在带负电荷的脂质体(DOPE/DOPG)的情况中TFPI衍生的C端LIK16和GGL27肽的螺旋含量。LIK17和GGL27结构很大程度上不受脂质体添加影响。(D)在Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中LIK17和GGL27的CD谱。对于对照，还呈现了缓冲液和仅LPS的CD谱。
图37：对真核细胞的活性
(A)指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2％ TritonX-100(Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ540nm测量，并且表示为％ Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了LL-37的效果以进行比较。(B)上方小图：使HaCaT角质形成细胞受到指定的TFPI肽及LL-37处理。通过基于LDH的TOX-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为％总LDH释放。下方小图：使用MTT测定法来测量在存在指定肽(为60μM)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲
Figure BDA00001667053000351
于λ550nm测量染料的吸光度。
图38：C端TFPI衍生肽的活性
(A)在活菌计数测定法中TFPI衍生肽和LL-37针对大肠杆菌或铜绿假单胞菌的抗细菌效果。将2x106个cfu/ml细菌在50μl中与在10mM Tris，0.15MNaCl，pH 7.4(缓冲液)中，或在0.15m NaCl，10mM Tris(pH 7.4)(其含有20％人柠檬酸盐血浆(CP))中或在相同缓冲液，但具有热灭活的人柠檬酸盐血浆(HCP)中指定浓度的肽一起温育(n＝3，标示了SD)。(B)使指定的细菌隔离群受到缓冲液、天然血浆(CP)或热灭活的血浆(HCP)中的3μM GGL27和LIK17处理2小时，并测定cfu的数目。
图39：C端TFPI肽GGL27增强C1q、C3a和MAC对大肠杆菌的结合。
(A)将大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌15159细菌清洗，重悬，并与单独的或补充有GGL27(为3μM)的柠檬酸盐血浆于37℃一起温育30分钟或1小时。将细菌细胞收集，用PBS清洗，并使结合的蛋白质和相应的上清液在还原性条件下进行Tris-Tricine SDS-PAGE，接着用识别C1q或C5b-9的抗体进行免疫印迹。CP：柠檬酸盐血浆，S：上清液或未结合的细菌，P：结合细菌细胞的物质或团粒。(B)如在(A)中的那样，但是使用针对C3a的抗体(25)。(C)(左侧小图)在柠檬酸盐血浆(对照；黑色柱形)和补充有GGL27的血浆(灰色柱形)中在C1q/C3a结合方面呈阳性的细菌的均值比例的比较。(右侧小图)结合大肠杆菌和铜绿假单胞菌菌株的C1q和C3a的比较程度，其表示为荧光系数的均值(FI；在C1q/C3a方面呈阳性的细菌比例乘以C1q/C3a结合的均值强度)。(*;p<0.05;**;p<0.01,***;p<0.001,t-检验)。(D)在柠檬酸盐血浆和补充有GGL27的血浆中C1q/C3a对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的结合的流式细胞术柱状图的例子。
图40：人皮肤和伤口中的TFPI的鉴定。
(A)在正常皮肤、急性伤口(AW)和慢性静脉性腿溃疡组织(慢性伤口；CW)中的TFPI的免疫组织化学鉴定。自正常皮肤(正常皮肤；n=3)、急性伤口(AW-1和AW-2；分别在受伤后5和8天)及慢性静脉性溃疡患者的伤口边缘(CW;n=3)采集皮肤活组织检查样品。显示了代表性的切片。在正常皮肤中，主要在表皮的基底层中检出TFPI。AW和CW中的TFPI普遍存在于所有上皮层中。比例尺是100μm。(B)TFPI衍生肽存在于人伤口中。显现了C端TFPI肽对存在于来自铜绿假单胞菌感染的慢性伤口表面的血纤蛋白死肉的细菌的结合。肽结合血纤蛋白(A)、细菌(B,C)、和在巨噬细胞内部的细菌(D)。在(E)和(F)中，使用分别对C3a(10nm)和TFPI C端(20nm)特异性的具有不同大小的经金标记的抗体通过免疫金来显现TFPI和C3a肽。对50个细菌概况的评估显示了约70%的TFPI分子与C3a关联。关于例示，见插图。
图41：GGL27的体外和体内效果
(A)将2x106cfu/ml大肠杆菌在50μl中与在10mM Tris(pH 7.4)缓冲液(缓冲液)中，或在0.15m NaCl，10mM Tris(pH 7.4)(其含有20%人柠檬酸盐血浆(CP))中或在相同缓冲液，但具有小鼠柠檬酸盐血浆(Balb/c或C57B/6)中指定浓度的GGL27肽一起温育(n=3，标示了SD)。(B)GGL27肽延长经大肠杆菌和铜绿假单胞菌感染的小鼠中的存活。给小鼠i.p.注射大肠杆菌或铜绿假单胞菌细菌。在大肠杆菌感染模型中，在30分钟后i.p.注射GGL27(200μg)或仅缓冲液。(在每组中n=10，P<0.001，Kaplan-Meier存活分析时序检验)。在铜绿假单胞菌感染模型中，在1小时后s.c.注射GGL27(500μg)或仅缓冲液(在每组中n=8，P<0.001，Kaplan-Meier存活分析时序检验)。(C)GGL27抑制NO生成。在存在指定浓度的GGL27或两种对照肽GGL27(S)和DSE25的情况中用来自大肠杆菌(左侧小图)或铜绿假单胞菌(右侧小图)的LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞。GGL27与对照肽间的差异是统计学显著的(P<0.01)。(D)GGL27显著延长LPS诱导的休克中的存活。给小鼠注射大肠杆菌LPS，接着腹膜内施用GGL27(500μg)。缓冲液及肽GGL27(S)和DSE25(500μg)充当对照。对存活追踪7天。(GGL27；n=16，缓冲液；n=15，GGL27(S)；n=8，DSE25；n=8，GGL27与缓冲液或对照肽间的差异是显著的，P<0.01，Kaplan-Meier存活分析时序检验)。*指示关于GGL27(S)、DSE25和缓冲液的线是重叠的。(E)GGL27减弱促炎性细胞因子。在不同实验中，在i.p.注射LPS后20小时处死小鼠，接着如上文那样用GGL27(500μg)、缓冲液或对照肽GGL27(S)或DSE25处理，并在血液中分析指定的细胞因子(对照；n=8；GGL27，n=12；GGL27(S)，n=7；DSE25；n=8)。在所有情况中，经GGL27处理的动物与缓冲液间的差异是显著的。关于相应细胞因子的P值是IL-6;0.0023,TNF-α;0.0018,IFN-γ;0.0002,MCP-1;0.0002,IL-10;0.0023。就IFN-γ而言对照与GGL27(S)间存在着显著的差异。(F)在i.p.注射LPS，接着用GGL27(500μg)或缓冲液处理后20小时分析肺。组织化学分析显示了在经GGL27处理的肺中炎性变化的明显减弱(显示了代表性的肺切片)。
图42：TFPI的进化
系统树和序列相似性显示了人(Homo sapiens)、类人猿(Pongo abelii)和野猪(Sus scrofa)中的TFPI是紧密相关的。
图43
对肽GGL27和对照肽GGL27(S)(其具有被S替换的中间K/R残基)以及肽DSE25(来自TFPI的N端)分析针对指定的细菌和真菌的抗微生物活性。标示了肽的抑制区。对于测定抗微生物活性，将细菌(4x106cfu)或真菌(1x105cfu)接种在0.1% TSB琼脂糖凝胶中。用6μl肽(为100μM)加载每个4mm直径孔。清楚的区域对应于于37°C温育18-24小时后每种肽的抑制效果(呈现了均值数值，n=3)。*标示0值。
图44
将细菌与GGL27一起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。
图45
使用大肠杆菌和铜绿假单胞菌通过活菌计数测定法来分析0.15M NaCl,10mM Tris,pH 7.4(其含有20%血浆)中指定的TFPI衍生肽(为30μM)的细菌杀伤的时间依赖性。
图46：HRG是结合LPS的
将2和5μg HRG应用于硝酸纤维素膜上，接着在具有或没有0.15M NaCl的情况中与10mM Tris,pH 7.4或10mM MES,pH 5.5中的碘化LPS一起温育。使用磷成像仪系统来显现放射性。
图47：HRG提高LPS介导的自鼠巨噬细胞的NO释放。将RAW巨噬细胞在有或没有LL-37和HRG(2和10μM)的情况中与100ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并使用格里斯方法来测量NO。HRG以剂量依赖性方式显著提高LPS介导的NO释放(n=6,p=0.001)。
图48：针对TLR4的抗体阻断NO释放。
将RAW巨噬细胞在有或没有HRG(2μM)和多克隆抗小鼠TRL4(5μg/ml)的情况中与100ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并使用格里斯方法来测量NO。抗小鼠TLR4能够显著阻断LPS和HRG介导的NO释放。(n=6,p=0.001)。
图49：Hrg-/-小鼠的LPS诱导的败血症中的存活延长。
在LPS考验后Hrg-/-小鼠的存活延长。给野生型(虚线)和Hrg-/-(实线)小鼠i.p.注射大肠杆菌LPS，并对动物的存活追踪7天。与野生型动物(n=9,p=0.002)相比，缺乏HRG的小鼠(n=8)显示存活的显著延长。
图50：在LPS考验后18小时的视觉观察得分。
在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮、隆起的和)。野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮[黑色]、隆起的[浅灰色]和死前的[暗灰色])。与Hrg-/-小鼠(p=0.001,n=10)相比，野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。
图51：与野生型动物相比，血管泄漏在LPS考验后在Hrg-/-小鼠的肺中是降低的。
在LPS i.p.注射后通过扫描电子显微术分析wt和Hrg-/-小鼠的肺。A)野生型，B)Hrg-/-C)wt，LPS处理后24小时，D)Hrg-/-，LPS处理后24小时。比例尺代表50μm。显示了代表性的肺切片。
图52：GHH25抑制鼠巨噬细胞中的HRG和LPS诱导的应答。
将RAW巨噬细胞在有或没有HRG(2μM)和GHH25(10和100μM)的情况中与100ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并使用格里斯方法来测量NO。GHH25以剂量依赖性方式显著降低LPS和HRG介导的NO释放(n=6,p=0.001)。
图53：GHH25抑制人巨噬细胞中的HRG和LPS诱导的应答。
将人巨噬细胞在有或没有HRG(2μM)和GHH25(10和100μM)的情况中与10ng/ml LPS一起温育24小时。吸出上清液，并测量TNF-α。
图54：用GHH25处理后在LPS诱导的败血症中改善的健康状态和延长的存活。
用GHH25处理后野生型小鼠的存活延长。给野生型动物i.p.注射大肠杆菌LPS，并在之后30分钟注射1mg GHH25(虚线)或仅缓冲液(实线)。对动物的存活追踪7天。在与未处理的动物(n=12,p=0.03)相比时，用GHH25处理的小鼠(n=13)显示显著延长的存活。
图55：在LPS考验后18小时的视觉观察得分。
在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮、隆起的和)。野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。在LPS考验后18小时视觉观察wt和Hrg-/-小鼠的状态(起皱的毛皮[黑色]、隆起的[浅灰色]和死前的[暗灰色])。与Hrg-/-小鼠(p=0.004，n=12)相比，野生型小鼠在视觉上是显著更具病态的。
图56：抗凝血酶III衍生肽FFF21阻断凝固
FFF21损害正常人血浆中的固有凝固途径，其通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定。凝固系统的其它部分未受显著影响，如通过监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)和测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成的凝血酶凝结时间(TCT)判断的。
实施例
实施例A
导言
肝素辅因子II
Serpins是一组具有相似结构的蛋白质，其第一次被鉴定为一组能够抑制蛋白酶的蛋白质。因为许多serpins抑制胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)，所以最初造出首字母缩写词serpin。要专门研究的serpin超家族的第一个成员是人血浆蛋白质抗凝血酶和抗胰蛋白酶，它们分别在控制血液凝固和炎症中发挥关键作用。
关于serpins的结构研究已经揭示了，家族的抑制性成员经历罕见的构象变化，称作压缩至松弛(S至R)转变。serpins的此构象活动性提供了与静态锁匙式(lock-and-key)蛋白酶抑制剂相比的关键优点。特别地，可以容易地通过特异性辅因子如肝素来控制抑制性serpins的功能。此情况的原型例子是抗凝血酶，其在血浆中以相对无活性的状态循环。结合长链肝素内的高亲和力肝素戊糖序列后，抗凝血酶经历构象变化，暴露对于机制重要的关键残基。如此，抗凝血酶的肝素戊糖结合形式是凝血酶和因子Xa的一种更有效的抑制剂。此外，这两种凝固蛋白酶都含有肝素结合位点(称作外位点(exosite))。因此，肝素也充当结合蛋白酶和serpin两者的模板，这进一步显著加速两方间的相互作用。初始相互作用后，形成最终的serpin复合物，并且释放肝素模块。
与这些蛋白质中的肝素结合位点对应的肽拥有抗细菌、抗炎和抗凝特性。
组织因子途径抑制剂(TFPI)
组织因子途径抑制剂(或TFPI)是一种Kunitz型蛋白酶抑制剂，其以因子X(FX)依赖性方式可逆地抑制组织因子-因子VII(TF-VII)复合物，导致对FX和FIX活化两者的抑制。TFPI由高度带负电荷的氨基端、三个串联的Kunitz型域、和高度带正电荷的羧基端组成。在血浆中，TFPI以全长和可变C端截短形式两者存在[28]。第一和第二Kunitz域分别牵涉结合和抑制TF-VII复合物和因子Xa[29]。第三Kunitz域可以经由其阳离子残基(包括C端末端的氨基酸序列)与肝素相互作用[30]。此C端区域也已经牵涉与血浆脂蛋白、血小板反应蛋白-1、清除受体([31])、脂多糖[32]相互作用，并且可以抑制细胞生长[33]及血液凝固[34],[35]。因为体内存在各种C端截短形式，所以已经暗示C端的蛋白水解的潜在作用，并且数据指示可以通过多种蛋白酶诸如凝血酶[36]、纤溶酶[37]、和基质金属蛋白酶-8[38]切割TFPI，释放C端片段。TFPI表达的上调物包括内毒素、IL-1、TNF-α、血小板衍生的生长因子、肝素、和碱性成纤维细胞生长因子，所有生理学机制牵涉感染、炎症、和生长[31]。
上述报告的TFPI的多功能性及暴露的阳离子和肝素结合C端的存在使我们提出TFPI的C端区域是否可以施展直接的抗微生物活性的问题。我们在这里显示了C端TFPI肽确实可以直接杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者和真菌。此外，呈现了如下的证据，即肽也可以施展抗凝和抗炎效果。
富含组氨酸的糖蛋白和GHH25
抗微生物血浆蛋白富含组氨酸的糖蛋白(HRG)在体内保护宿主免于系统性微生物感染。在这里，我们显示了HRG是一种通过结合LPS并提高宿主细胞中LPS介导的TLR-4应答的样式识别分子。
LPS与CD14(即一种在巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上的受体)相互作用，该相互作用通过血浆蛋白LBP(LPS结合蛋白)而得到提高。LPS/CD14复合物导致toll样受体(TLR)4的激活，这继而激活依赖于或不依赖于MyD88的途径[39]。LPS应答也可以是不依赖于LBP的[40]。在LPS注射后在野生型和LBP缺陷的小鼠间在TNF-α体内释放方面没有差异，这提示了具有LBP样性能的蛋白质可能是原因(responsible)[41]。然后，TLR4的激活继而导致单核吞噬细胞的吞噬活性的增加，即释放的细胞因子和一氧化氮(NO)(其启动并支持炎性应答)的一种级联。NO是由一组称作一氧化氮合酶的酶生成的[42]，并且牵涉许多生物学过程诸如针对微生物、寄生性蠕虫和肿瘤保护宿主，而且调节血压，而高水平的NO则可能是细胞毒性的，并且破坏内源组织。
LPS诱导的应答对于宿主防御是至关重要的，但是极度的(overwhelming)应答则可以导致败血症。细胞因子和NO被鉴定为形成伴有如下症状的败血症性休克，如发热、凝血活性、败血症性休克、多器官衰竭和(在最坏的情况中)宿主死亡的主要促成因素[43]。这得到如下实情的支持，即诱导型NOS(iNOS)突变体小鼠对LPS诱导的死亡率有抗性[44]。不同动物物种对LPS毒性的易感性是高度可变的，例如与具有相当抗性的小鼠[47]相比，人是非常敏感的[45,46]。常见的误解是仅通过促炎性介导物控制败血症。败血症的早期阶段受促炎性介导物诸如TNF-α、NO、缓激肽、凝血酶和组胺支配，而抗炎性介导物，诸如IL-6、活化的蛋白C、抗凝血酶和粒细胞集落刺激因子在较晚期阶段期间最广泛存在[48]。
现在，败血症的处理包括施用静脉内流体、广谱抗生素、保护性肺通气、糖皮质激素、胰岛素疗法和重组人激活蛋白C(APC)。已经进行许多尝试来中和LPS或抑制LPS介导的宿主免疫细胞活化，诸如用抗体阻断细胞因子活性，阻断NO生成[49]及通过使用抗微生物肽作为LPS的中和剂[50]来进行。
本研究的目的是调查丰富的血浆蛋白HRG对LPS介导的应答的影响。HRG是一种在肝中合成的67kDa血浆蛋白，并且在1972年第一次描述[51,52]。HRG也可以在凝血酶活化后自凝血细胞的α-颗粒释放，并且能够覆盖血纤蛋白凝块的表面。与胎球蛋白和激肽原一起，HRG属于cystatin超家族。所述蛋白质的最有区别性的特征是蛋白质的富含组氨酸的域含有保守GHHPH重复[53]。已经显示了HRG在体外与多种多样的一组配体，如肝素、血纤维蛋白溶酶原、血纤蛋白原、血小板反应蛋白、血红素、IgG、FcgR和C1q相互作用。体内研究表明HRG是一种抗凝血和抗血纤蛋白溶解改性剂(modifier)[54]，对肿瘤血管化具有抑制效果[55]，而且作为抗微生物蛋白质在先天性免疫中发挥重要的作用[56]。
在本文中，我们证明了HRG是一种有力的促炎性蛋白质，其通过在体外增强LPS诱导的NO和细胞因子来实现。体内实验显示了Hrg-/-小鼠针对LPS诱导的败血症具有显著的抗性。我们的数据清楚地表明HRG促成实验性内毒素血症中的LPS毒性。然而，数据还表明HRG的肽片段诸如“GHH25”的抗炎性效果。
材料和方法
富含组氨酸的糖蛋白
合成肽GHH25(GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPH[SEQ IDNO:11])来自Biopeptide(San Diego,CA,USA)。多克隆兔抗小鼠TRL4购自GeneTex(Irvine,CA,USA)。细胞计量珠阵列，即小鼠炎症试剂盒来自BDBiosciences(Stockholm,Sweden)。大肠杆菌LPS(0111:B4)购自Sigma(St Lois,MO)。
人HRG的纯化。将血清HRG纯化，如先前所描述的[57]。简言之，将人血清于4°C在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖的情况中温和摇动过夜，用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)清洗。首先，用含有80mM咪唑的PBS实施洗脱以洗脱非特异性结合的蛋白质，然后，用含有500mM咪唑的PBS洗脱以洗脱纯化的HRG。将蛋白质透析、冷冻-干燥，并使用Bradford法[58]来测定浓度。
肝素和LPS的放射性碘化。实施肝素(来自猪肠粘膜,Sigma-Aldrich)的放射性碘化，如先前所描述的[59]。实施LPS碘化，如由Ulevitch[60]所描述的。将1mg大肠杆菌0111:B4 LPS在硼酸盐缓冲液，pH 8中的50mM对-OH苯甲亚胺酸酯中于4°C温育过夜，然后针对PBS,pH 7.4透析。然后，使用氯胺T法用125I放射性标记LPS，然后通过透析除去未标记的125I。
肝素和LPS结合测定法。使用狭缝印迹(slot-blot)装置来将100μl PBS pH7.4中的1、2和5μg合成肽应用于硝酸纤维素膜(Hybond-C,AmershamBiosciences)上。用PBS pH 7.4中的2%牛血清清蛋白将膜于室温封闭1小时，然后于室温在PBS,pH 7.4中与放射性标记的LPS(约40μg·mL-1,0.13×106cpm·μg-1)或放射性标记的肝素(约10μg·mL-1,0.4×106cpm·μg-1)一起温育1小时。添加未标记的肝素(6mg/ml)以竞争结合。将膜在PBS,pH 7.4中清洗三次。使用Bas 2000放射性成像系统(Fuji Film,Tokyo,Japan)来显现放射性。
细胞培养。将鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7(由H博士友情提供)在补充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbeccos改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco)中培养。在无血清条件下实施所有实验。
RAW巨噬细胞中的一氧化氮诱导。将汇合细胞收获，并转移至96孔板(3.5x105/孔)。在用无酚红DMEM(Gibco)清洗粘着细胞后，将大肠杆菌LPS(100ng/ml)、LL-37(2或10μM)或HRG(2 or 10μM)于37°C预温育30分钟，然后转移至细胞。对于抑制NO诱导，使用5μg/ml抗小鼠TLR4抗体、10或100μMGHH25或100μg/ml肝素。将细胞刺激24小时，并使用格里斯化学方法[61]来测定一氧化氮。
自人巨噬细胞的TNF-α释放。使用Lymphoprep(Axis-Shield PoC AS)密度梯度自获自健康供体血液的外周血单个核细胞(PBMC)获得人单核细胞衍生的巨噬细胞(hMDM)。将PBMC以3×106个细胞/孔的浓度接种入24孔板中，并在补充有10%热灭活的自体人血浆、2mM L-谷氨酰胺、和50μl/ml抗生素-杀真菌药(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)的RPMI1640培养基中在5% CO2的湿润气氛中培养。在24小时后，除去非粘着细胞，并将粘着的单核细胞分化成巨噬细胞达10天，其中每两天换成新鲜培养基。在无血清条件下在具有或没有HRG(2μM)和GHH25(100μM)的情况中用10ng/ml LPS刺激细胞达24小时。在刺激后，吸出上清液，并使用TNF-α人ELISA试剂盒(Invitrogen)来测量TNF-α。
动物实验。将最初的敲除小鼠129/B6-HRGtm1wjal与C57BL/6小鼠(Taconic)杂交14代以获得一致的遗传背景。遵循ILAR(实验室动物来源研究所(Instituteof Laboratory Animal Resources))规则，这些HRG缺陷型小鼠系称作B6-HRGtm1wjal。将野生型C57BL/6对照小鼠和C57BL/6Hrg-/-小鼠(8-12周，27+/-4g)在兰德大学(Lund University)的动物房中培育。C57BL/6 Hrg-/-缺乏Hrg基因的外显子1的翻译起始点[54]。将动物在光照和温度的标准条件下收容，并且自由获得标准的实验室食物和水。为了诱导败血症，将18μg/g大肠杆菌0111:B4 LPS腹膜内注射C57BL/6或C57BL/6 Hrg-/-小鼠中，分成重量和性别匹配组。在7天期间追踪存活和状态。
对于用GHH25肽处理，在LPS考验后30分钟腹膜内注射1mg肽(在10mMTris,pH 7.4中稀释)或仅缓冲液，然后追踪存活和状态。
TFPI和肝素辅因子II
肽。除了LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES[SEQ ID NO:101])(其也获自Innovagen AB,Lund,Sweden)外，TFPI和HCII衍生肽由Biopeptide Co.,San Diego,USA合成。通过质谱分析(MALDI-ToFVoyager)来确认这些肽的纯度(>95%)。
微生物。细菌隔离群大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、枯草芽孢杆菌ATCC 6633、白念珠菌ATCC90028和近平滑念珠菌ATCC 90018获自兰德大学医院细菌学部门。
活菌计数分析。将大肠杆菌ATCC 25922细菌在Todd-Hewitt(TH)培养基中培养至中间对数生长期。将细菌清洗，并在含有5mM葡萄糖的10mM Tris,pH 7.4中稀释。将大肠杆菌ATCC 25922(50μl；2x106个cfu/ml)于37°C与指定浓度的肽一起温育2小时。在正常的或热灭活的20%柠檬酸盐血浆(PP)的情况中，在10mM Tris,pH 7.4(其还含有0.15M NaCl)中实施用TFPI-肽和LL-37的其它实验。将温育混合物的连续稀释液在TH琼脂上铺板，接着于37°C温育过夜并进行cfu测定。
放射状扩散测定法(Radial diffusion assay)。基本上如较早所描述的[62,63]，将细菌在10ml全强度(3%w/v)胰胨豆胨培养液(trypticase soy broth,TSB)(Becton-Dickinson)中培养至中间对数生长期。然后，用10mM Tris,pH 7.4将微生物清洗一次。随后，将4x106个cfu添加至15ml垫物琼脂糖凝胶，其由0.03%(w/v)TSB、1%(w/v)低内电渗型(EEO)琼脂糖(Sigma-Aldrich)和0.02%(v/v)Tween 20(Sigma-Aldrich)组成。将垫物倒入
Figure BDA00001667053000441
培养皿中。在琼脂糖固化后，将4mm直径孔冲孔，并将6μl需要浓度的肽溶液添加至每孔。将板于37°C温育3小时以容许肽扩散。然后，用15ml熔融的覆盖物(蒸馏水中的6%TSB和1% Low-EEO琼脂糖)覆盖垫物凝胶。肽的抗微生物活性显现为于37°C温育18-24小时后每孔周围的干净区域。
荧光显微术。使用不渗透的探针FITC(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)来监测细菌膜透化。将金黄色葡萄球菌ATCC 29213细菌在TSB培养基中培养至中间对数生长期。将细菌清洗，并在缓冲液(10mM Tris,pH 7.4,0.15M NaCl,5mM葡萄糖)中重悬以产生1x107个CFU/ml的悬浮液。将100μl细菌悬浮液于30°C与30μM相应的肽一起温育30分钟。然后，将微生物在经聚(L-赖氨酸)包被的玻璃载玻片上固定化，其通过于30°C温育45分钟，接着将缓冲液中的200μl FITC(6μg/ml)添加至载玻片上，最终于30°C温育30分钟来进行。将载玻片清洗，并通过温育(首先在冰上持续15分钟，然后于室温在4%低聚甲醛中持续45分钟)来固定细菌。随后，使用Prolong金抗褪色试剂封固介质(Goldantifade reagent mounting medium)(Invitrogen,Eugene,USA)将玻璃载玻片在载玻片上安放。使用装备有Hamamatsu C4742-95冷却型CCD照相机(Hamamatsu,Bridgewater,USA)和平场复消色差(Plan Apochromat)×100物镜(Olympus,Orangeburg,USA)的Nikon Eclipse TE300(Nikon,Melville,USA)倒置荧光显微镜来显现细菌。使用微分干涉相差(Nomarski)成像来显现微生物自身。
溶血测定法。将EDTA-血液以800g离心10分钟，此后除去血浆和暗黄覆盖层(buffy coat)。将红细胞清洗三次，并在PBS,pH 7.4中重悬以得到5%悬浮液。然后，将细胞在颠倒旋转情况下于37°C在存在肽(60μM)的情况中温育60分钟。2% Triton X-100(Sigma-Aldrich)充当阳性对照。然后，将样品以800g离心10分钟，并将上清液转移至96孔微量滴定板。于λ540nm测量血红蛋白释放的吸光度，并且在表示为% TritonX-100诱导的溶血的图中。
乳酸脱氢酶(LDH)测定法。将HaCaT角质形成细胞在96孔板(3000个细胞/孔)中在补充有牛垂体提取物和重组EGF(BPE-rEGF)(Invitrogen,Eugene,USA)的无血清角质形成细胞培养基(SFM)中培养至汇合。然后，除去培养基，并添加100μl调查的肽(为60μM，在SFM/BPE-rEGF中或在补充有20%人血清的角质形成细胞-SFM中稀释)。使用基于LDH的TOX-7试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)来量化自细胞的LDH释放。结果代表来自一式三份测量的均值，并且以与由1% Triton X-100组成的阳性对照(产生100% LDH释放)相比的分数LDH释放给出。
狭缝印迹测定法。通过狭缝印迹测定法检查肽的LPS结合能力。通过真空将肽(2和5μg)结合预先浸于PBS中的硝酸纤维素膜(Hybond-C,GEHealthcare BioSciences,UK)。然后，通过PBS,pH 7.4中的2wt％ BSA于RT将膜封闭1小时，随后，于RT在10mM Tris(pH 7.4)，0.15M NaCl、或10mM MES(pH 5.5)，0.15M NaCl中与经125I-标记的LPS(40μg/mL；0.13×106cpm/μg)或经125I-标记的肝素(Sigma)一起温育1小时。在LPS结合后，将膜在上述缓冲液中清洗3次，每次10分钟，并在Bas 2000放射性成像系统(Fuji，Japan)上显现放射性。
脂质体制备和泄漏测定法。调查的脂质体是两性离子(DOPC/胆固醇60/40mol/mol或没有胆固醇的DOPC)或阴离子(DOPE/DOPG 75/25mol/mol)。DOPG(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油，单钠盐)、DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-胆碱磷酸)和DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)均来自AvantiPolar Lipids(Alabaster,USA)，并且具有大于99%纯度，而胆固醇(>99%纯度)来自Sigma-Aldrich(St.Louis,USA)。由于这些磷脂的长的、对称的且不饱和的酰基链，实现几项方法学上的优点。特别地，膜内聚力良好，这促成非常稳定的、单层的、且很大程度上没有缺点的脂质体(自冷冻-TEM观察的)和明确限定的支持性脂双层(通过椭圆光度法和AFM观察的)，容许获得关于泄漏和吸附密度的详细数值。将脂质混合物在氯仿中溶解，此后在真空过夜下通过蒸发来除去溶剂。随后，与0.1M羧基荧光素(CF)(Sigma,St.Louis,USA)一起添加10mM Tris缓冲液，pH 7.4。在水合后，将脂质混合物进行8个冷冻-融化循环，其由液氮中的冷冻和加热至60°C组成。通过于22°C多次挤压流过在LipoFast微型挤压器(Avestin,Ottawa,Canada)中安放的聚碳酸酯滤膜(孔径100nm)来生成约
Figure BDA00001667053000461
的单层脂质体。通过于22°C用Tris缓冲液作为洗脱剂的两个随后的凝胶过滤(Sephadex G-50,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来除去未捕获的CF。通过监测来自脂质体分散体(在10mM Tris(pH 7.4)中的10mM脂质)的于520nm的发射荧光来测定来自脂质体的CF释放。在每项实验结束时经由添加0.8mM Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)通过破坏脂质体来获得绝对泄漏量表(scale)。在Tris缓冲液中在没有和存在脂质体中在上文所描述的条件下对脂质体泄漏测定法使用SPEX-Fluorolog 1650 0.22-m双分光计(SPEX Industries,Edison,USA)。于37°C一式三份实施测量。
CD-分光术。在Jasco J-810分光偏振计(Spectropolarimeter)(Jasco,U.K.)上测量溶液中的肽的CD谱。于37°C在10mm石英小杯(cuvet)中在搅拌下实施测量，并且肽浓度是10μM。在范围200-250nm中监测对100μM脂质浓度的脂质体的肽二级结构的影响。在调查的条件下观察到的唯一肽构象是α-螺旋和无规卷曲。α-螺旋构象的肽的分数Xα如下计算：
Xα＝(A-Ac)/(Aα-Ac)
其中A是于225nm记录的CD信号，且Aα和Ac是分别为100% α-螺旋和100%无规卷曲构象的参照肽的于225nm的CD信号。从分别在0.1M NaOH和0.1M HCl中的0.133mM(单体浓度)多聚-L-赖氨酸获得100% α-螺旋和100%无规卷曲参照物[64,65]。为了测定脂多糖对肽结构的影响，在Tris缓冲液中和在存在大肠杆菌脂多糖(0.02wt％)(大肠杆菌0111:B4，高度纯化的，小于1%蛋白质/RNA,Sigma,UK)的情况中在10μM的肽浓度监测肽二级结构。为了解决测量间的仪器差异，扣除背景数值(于250nm检测，其中不存在肽信号)。也校正来自本体溶液的信号。
多种微生物产物对巨噬细胞的体外影响和HCII和TFPI的多种肽的抗炎效果。将3.5×105个细胞在96孔组织培养板(Nunc,167008)中接种在补充有10% FBS和抗生素的无酚红DMEM(Gibco)中。在温育6小时以容许粘着后，在有和没有指定剂量的肽(见图例和图)的情况中用10ng/mL大肠杆菌(0111:B4)LPS(Sigma)、脂磷壁酸质、肽聚糖、或酵母聚糖刺激细胞。使用Griess反应在距离刺激24小时后测定培养上清液中的NO水平[66]。简言之，通过混合50μl培养上清液与相同体积的格里斯试剂(Sigma,G4410)，并在15分钟后于550nm读取吸光度来测量亚硝酸盐，即NO降解的一种稳定产物。使用具有FBS和抗生素的无酚红DMEM作为空白。使用ddH2O中的0-80μM亚硝酸钠溶液来制备标准曲线。
凝结测定法。使用Amelung凝血计来测量所有凝结时间。通过将指定浓度的在无菌水中稀释的肽与100μL柠檬酸化的人血浆一起温育1分钟，接着于37°C添加100μL aPTT试剂(aPTT Automate,Diagnostica Stago)达60秒来测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。通过添加100μL 25-mM CaCl2溶液来启动凝结。在凝血酶原时间测定法(PT)中，通过添加100μL具有钙的Thrombomax(PT试剂；Sigma-Aldrich)来启动凝结。对于测量凝血酶凝结时间(TCT)，通过添加100μL Accuclot凝血酶时间试剂(TCT试剂；Sigma-Aldrich)来启动凝结。
结果和结论
总之，上文报告的与serpin诸如HCII和ATIII及其它蛋白质，包括HRG和TFPI中的隐蔽肝素结合位点对应的肽拥有抗细菌、抗炎和抗凝特性(图1-18，29-33)。特别重要的是如下的发现，即HCII肽阻断TLR介导的LPS应答及内在凝固途径。此外，TFPI肽显示独特的且先前未披露的对固有及外在凝固途径两者的抑制活性。如此，结果表明所述肽不仅减弱牵涉干扰巨噬细胞活化的细菌性感染和相关炎性应答，而且重要的是，干扰凝固，并且因此显示针对败血症、COPD和其它多因子疾病(其牵涉致病性步骤，包括炎症和凝固)的显著的治疗潜力。
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实施例B：组织因子途径抑制剂的C端肽是新型宿主防御分子
摘要
组织因子途径抑制剂(TFPI)抑制组织因子诱导的凝固，但是经由其C端也可以调控细胞表面、肝素、和脂多糖相互作用及参与生长抑制。在这里，我们显示了C端TFPI肽序列针对革兰氏阴性细菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌及真菌白念珠菌和近平滑念珠菌是抗微生物的。与肽对脂质体影响的分析配对的经肽处理的细菌的荧光研究显示了肽施展与对“经典的”人抗微生物肽LL-37看到的那些效果相似的膜破裂效果。C端肽GGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM[SEQ ID NO:4](GGL27)对大肠杆菌，而非铜绿假单胞菌的杀伤在人血浆中得到加强，并且在热灭活的血浆中大幅消除，即一种与抗微生物C3a生成和经典补体激活途径的激活关联的现象。此外，GGL27在体外和在体内在LPS休克的小鼠模型中展现出抗内毒素效果。重要地，发现TFPI在正常表皮的基底层中表达，并且在急性皮肤伤口及慢性腿溃疡的伤口边缘中受到明显上调。此外，TFPI的C端片段与存在于人慢性腿溃疡中的细菌联合。这些发现提示了TFPI在针对感染的皮肤防御中的新作用。
导言
为了控制我们的微生物菌群，给人和几乎所有生命形式装备基于各种抗微生物肽的快速作用宿主防御系统(1-3)。大多数这些肽的特征在于两亲性结构，并且包含线性肽(其中许多在细菌结合后采用α-螺旋和两亲性构象)、形成半胱氨酸连接的反平行β片层的肽以及半胱氨酸约束的环结构。另外，可以在不展现出此类有序结构的肽中找到抗微生物肽，只要它们以某些氨基酸的过度呈现为特征(1,4-6)。虽然与细菌膜的相互作用对于抗微生物肽功能是基础的，但是精确的作用模式是复杂的，并且可以分成膜破坏的和非膜破坏的(1,3,7,8)。在最近数年期间，也变得越来越明显的是，许多阳离子和两亲性抗微生物肽，诸如防御素和cathelicidin是多功能的，也介导免疫调控作用和血管发生(9-11)，如此为先天性免疫系统的这些成员促成最近的且更宽的定义宿主防御肽。
组织因子途径抑制剂(或TFPI)是一种Kunitz型蛋白酶抑制剂，其以因子X(FX)依赖性方式可逆地抑制组织因子-因子VII(TF-VII)复合物，导致对FX和FIX两者活化的抑制。TFPI由高度带负电荷的N端、三个串联的Kunitz型域、和高度带正电荷的C端组成。在血浆中，TFPI以全长和各种C端截短形式两者存在(12)。第一和第二Kunitz域分别牵涉结合和抑制TF-VII复合物和因子Xa(13)。第三Kunitz域继而可以经由其阳离子C端末端与肝素相互作用(14)。此C端区域也已经牵涉与血浆脂蛋白、血小板反应蛋白-1、清除受体(15)、脂多糖(16)相互作用，并且也可以抑制细胞生长(17)及血液凝固(18,19)。因为体内存在各种C端截短形式，所以已经暗示C端的蛋白水解的潜在作用，并且数据指示可以通过多种蛋白酶诸如凝血酶(20)、纤溶酶(21)、和基质金属蛋白酶-8(22)切割TFPI，由此释放C端片段。TFPI表达的上调物包括内毒素、IL-1、TNF-α、血小板衍生的生长因子、肝素、和碱性成纤维细胞生长因子，牵涉感染、炎症、和生长的所有分子(15)。
上述报告的TFPI的多功能性及暴露的阳离子和肝素结合C端的存在使我们提出TFPI的C端区域是否可以发挥抗微生物活性的问题。我们在这里显示了C端TFPI肽(发现其在皮肤伤口中表达，并且在慢性腿溃疡的血纤蛋白中检出)确实可以发挥宿主防御肽的功能。此外，对革兰氏阴性大肠杆菌，而非铜绿假单胞菌的杀伤受到肽介导的补体活化(包括膜攻击复合物(MAC)和抗微生物C3a的形成)的明显加强。
材料和方法
肽：TFPI衍生肽(见图1)和对照肽GGL27(S)(GGLISTSSSSSSQRVKIAYEEIFVKNM[SEQ ID NO:102])和DSE25(DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSF[SEQ ID NO:103])由Biopeptide Co.,San Diego,USA合成，而LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES[SEQ ID NO:101])获自Innovagen AB,Lund,Sweden。通过质谱分析(MALDI-ToF Voyager)确认了这些肽的纯度(>95%)。
微生物。细菌隔离群大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、枯草芽孢杆菌ATCC 6633、白念珠菌ATCC90028和近平滑念珠菌ATCC 90018获自细菌学部门，兰德大学医院。大肠杆菌和铜绿假单胞菌的其它临床隔离群来自皮肤感染患者。
生物学材料：用无菌刮刀自慢性静脉性腿溃疡(慢性伤口死肉/表面)收集血纤蛋白死肉，并且立即固定以进行电子显微术。分析了来自3名慢性静脉性溃疡患者(持续时间大于6个月)的组织切片。自伤口边缘和股上的对照区采集了4mm活组织检查样品。对于急性伤口，自一名个体的股采集4mm活组织检查样品，并在第5天和第8天采集来自伤口边缘的随后的活组织检查样品。也采集来自正常皮肤的活组织检查样品(n=3，股)以进行分析。研究项目得到兰德大学医院理论委员会批准。从患者获得书面同意。
放射状扩散测定法(Radial diffusion assay)。基本上如较早所描述的(23,24)，将细菌在10ml全强度(3% w/v)胰胨豆胨培养液(trypticase soy broth,TSB)(Becton-Dickinson)中培养至中间对数生长期。然后，用10mM Tris,pH 7.4将微生物清洗一次。随后，将4x106个cfu添加至15ml垫物琼脂糖凝胶，其由0.03%(w/v)TSB、1%(w/v)低内电渗型(EEO)琼脂糖(Sigma-Aldrich)和0.02%(v/v)Tween 20(Sigma-Aldrich)组成。将垫物倒入
Figure BDA00001667053000561
培养皿中。在琼脂糖固化后，将4mm直径孔冲孔，并将6μl需要浓度的肽溶液添加至每孔。将板于37°C温育3小时以容许肽扩散。然后，用15ml熔融的覆盖物(蒸馏水中的6%TSB和1% Low-EEO琼脂糖)覆盖垫物凝胶。肽的抗微生物活性显现为于37°C温育18-24小时后每孔周围的干净区域。
活菌计数分析。将大肠杆菌菌株在Todd-Hewitt(TH)培养基中培养至中间对数生长期。将铜绿假单胞菌在TH中培养过夜。将细菌清洗，并在含有5mM葡萄糖的10mM Tris,pH 7.4中稀释。将2x106个cfu/ml细菌在50μl中于37°C与指定浓度的C端TFPI衍生肽GGL27、TKR22、或LIK17一起温育2小时。在单独的或与20%正常的或热灭活的柠檬酸盐血浆一起的10mM Tris,pH 7.4(其含有0.15M NaCl)中实施额外的实验。将温育混合物的连续稀释液在TH琼脂上铺板，接着于37°C温育过夜并进行cfu测定。
流式细胞术分析：将50μl细菌(1-2x109cfu)与单独的或补充有GGL27(为3μM)的450μl人血浆一起温育。将样品于37°C温育30分钟或1小时，分成两个相等的部分，离心，用PBS清洗，并在具有针对LGE27(25)(即人C3a的C端表位)的兔多克隆抗体或针对C1q的兔多克隆抗体(两者均为1:100)的100μl PBS中重悬。随后，将混合物于室温温育1小时。将细菌沉淀，并用PBS清洗两次，在具有经FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(1:500,Sigma)的100μl PBS中于室温温育30分钟，并用PBS清洗两次。在另一个实验中，将细菌与3μM经TAMRA标记的GGL27肽一起在柠檬酸盐血浆中温育1小时，然后沉淀，并用PBS清洗两次。使用装备有调为488nm的15mW氩激光器的FACS-Calibur流式细胞术系统来实施流式细胞术分析(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。通过用正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)的适当设置门控来选择细菌群体。
荧光显微术。使用异硫氰酸荧光素(FITC;Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)来监测细菌膜透化。将大肠杆菌ATCC 25922菌在TSB培养基中培养至中间对数生长期。将细菌清洗，并在缓冲液(10mM Tris,pH 7.4,0.15M NaCl,5mM葡萄糖)中重悬以产生1x107个CFU/ml的悬浮液。将100μl细菌悬浮液于30°C与30μM相应的肽一起温育30分钟。然后，将微生物在经聚(L-赖氨酸)包被的玻璃载玻片上固定化，其通过于30°C温育45分钟，接着将缓冲液中的200μlFITC(6μg/ml)添加至载玻片上，最终于30°C温育30分钟来进行。将载玻片清洗，并通过温育(首先在冰上持续15分钟，然后于室温在4%低聚甲醛中持续45分钟)来固定细菌。随后，使用Prolong金抗褪色试剂封固介质(Gold antifadereagent mounting medium)(Invitrogen,Eugene,USA)将玻璃载玻片在载玻片上安放。使用装备有Hamamatsu C4742-95冷却型CCD照相机(Hamamatsu,Bridgewater,USA)和平场复消色差(Plan Apochromat)×100物镜(Olympus,Orangeburg,USA)的Nikon Eclipse TE300(Nikon,Melville,USA)倒置荧光显微镜来显现细菌。使用微分干涉相差(Nomarski)成像来显现微生物自身。
组织化学-对于免疫染色，将伤口活组织检查样品在10%福尔马林中固定，再水合，并在石蜡中包埋。将5μm厚度的切片在经聚赖氨酸包被的玻璃载玻片上放置，在二甲苯中脱石蜡化(deparaffinize)，并在分级酒精(gradedalcohol)中再水合。然后，用Dako抗原恢复溶液(Dako)于97°C将载玻片处理40分钟，并于室温在1:50稀释的针对TFPI的多克隆抗体(Sigma-Aldrich，在具有1%BSA、5%山羊血清、0.05% Tween 20的TBS中)中温育24小时。在具有0.05% Tween 20的TBS中的三次20分钟清洗后，将切片与在与一抗相同的缓冲液中以1:1000稀释的经碱性磷酸酶缀合的二级山羊抗兔IgG(Dako)一起温育，并再温育24小时，接着是三次20分钟清洗。用Vulcan Fast Red色原(BiocareMedical,Concord,CA)显现切片，并用Harris苏木精(EM Science,Gibbstown,NJ)对载玻片复染色。对于对源自小鼠体内LPS模型的肺的组织学评估，如上文的那样包埋组织，切片，并通过常规的规程(Histocenter,Gothenburg,Sweden)用苏木精和曙红染色。
电子显微术：对于透射电子显微术及显现肽对细菌的影响，将铜绿假单胞菌ATCC 27853(1-2x106cfu/样品)于37°C与30μM的肽GGL27一起温育2小时。包括LL-37(30μM)作为对照。将铜绿假单胞菌样品悬浮液吸附到经碳包被的铜网格上达2分钟，在两滴水上短暂清洗，并在两滴0.75%甲酸双氧铀(uranyl formate)上负染色。通过在空气中于低压辉光放电来使网格变为亲水性的。体内实验；将来自慢性静脉性溃疡(CWS)患者的血纤蛋白死肉于室温固定(0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的1.5% PFA，0.5% GA)1小时，接着用0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4清洗。随后，将经过固定和清洗的样品在乙醇中脱水，并进一步加工以进行Lowicryl包埋(26)。用LKB超薄切片机(ultratome)切出切片，并安放在金网格上。对于免疫染色，使网格浮在Parafilm层上展示的免疫试剂滴上方。用50mM甘氨酸封闭游离的醛基团，然后，将网格与温育缓冲液(在PBS(pH 7.6)中的0.2% BSA-c)中的5%(vol/vol)山羊血清一起温育15分钟。此封闭规程继之以于4°C与单独的或与针对C3a的C端部分的兔多克隆抗体(LGE27抗体)(1μg/ml)(Innovagen AB)组合的C端TFPI山羊多克隆抗体(1μg/ml)(Abcam,UK)一起温育过夜(25)。包括没有一抗的对照。将网格在大体积(200ml)温育缓冲液中清洗，浮在含有金缀合物试剂的液滴上。对于检测TFPI-肽，添加温育缓冲液中的1μg/ml EM兔抗山羊IgG 10nm Au(BBI)，并于4°C实施温育2小时。对于同时检测TFPI和C3a，使用1μg/ml EM兔抗山羊IgG 20nm Au(BBI)和1μg/ml EM山羊抗兔IgG 10nm Au(BBI)。在通过过量体积的温育缓冲液进一步清洗后，将切片在2%戊二醛中进行后固定(postfix)。最后，将切片用蒸馏水清洗，并用2%乙酸双氧铀和柠檬酸铅后染色。用于80kV加速电压操作的Jeol JEM 1230电子显微镜检查所有样品。用Gatan Multiscan 791电荷耦合装置照相机记录图像。
SDS-PAGE和免疫印迹：将人柠檬酸盐血浆(450μl)与单独的或补充有3μM肽GGL27的50μl细菌(1-2x109cfu)一起温育。将混合物于37°C温育30分钟或1小时，离心，并收集上清液和细菌。用PBS清洗细菌团粒，并用0.1M盐酸甘氨酸(pH 2.0)洗脱结合的蛋白质。用1M Tris将洗脱材料的pH提高至7.5。通过将1个体积的三氯乙酸(TCA)添加至4个体积的样品，接着在冰上温育30分钟，并以15000g离心(4°C持续20分钟)来沉淀洗脱的蛋白质。将沉淀的材料和上清液在SDS样品缓冲液中溶解，并在还原性条件下通过在16.5%Tris-Tricine凝胶(Clear PAGETM,C.B.S Scientific)上的SDS-PAGE来分析。将蛋白质和肽转移至硝酸纤维素膜(Hybond-C)。将膜通过3%(w/v)脱脂奶封闭，清洗，并与针对C3a的C端部分的兔多克隆抗体(LGE27抗体)(1:1000)、针对C1q的兔多克隆抗体(1:1000)(Dako)、识别C端TFPI序列VKIAYEEIFVKNM[SEQ ID NO:104]的山羊多克隆抗体(Abcam)、或针对C5b-9的兔多克隆抗体(1:1000)(Abcam,England)一起温育1小时。将膜清洗三次达10分钟，并与经HRP缀合的二抗(1:2000)(Dako)一起温育(1小时)，并清洗(3x10分钟)。通过增强的化学发光底物
Figure BDA00001667053000581
显影系统(Upstate cell signaling solutions)来显现蛋白质。
LPS在体外对巨噬细胞的影响：将3.5×105个细胞在96孔组织培养板(Nunc,167008)中接种在补充有10% FBS(含有1% Anti-Anti(Invitrogen))的无酚红DMEM(Gibco)中。在温育20小时以容许粘着后，将细胞清洗，并在有和没有多个剂量的肽GGL27、GGL27(S)、和DSE25的情况中用10ng/mL大肠杆菌(0111:B4)或铜绿假单胞菌LPS(Sigma)刺激。使用Griess反应在距离刺激24小时后测定培养上清液中的NO水平(27)。简言之，通过混合50μl培养上清液与相同体积的格里斯试剂(Sigma,G4410)，并在15分钟后于550nm读取吸光度来测量亚硝酸盐，即NO降解的一种稳定产物。使用具有FBS和抗生素的无酚红DMEM作为空白。使用ddH2O中的0-80μM亚硝酸钠溶液来制备标准曲线。
动物感染模型：将动物收容在光照和温度的标准条件下，并且自由获得标准的实验室食物和水。将铜绿假单胞菌15159细菌培养至对数生长期(OD620约0.5)，收获，在PBS中清洗，在相同缓冲液中稀释至2x108cfu/ml，并在冰上保持，直至注射。将100微升细菌悬浮液腹膜内(ip)注射入雌性Balb/c中。在细菌注射后60分钟，将0.5mg GGL27或仅缓冲液皮下(s.c.)注射入小鼠中。在相应的大肠杆菌感染模型中，将细菌培养至对数生长期早期(OD620约0.4)，收获，在PBS中清洗，在相同缓冲液中稀释至1x108cfu/ml，并在冰上保持，直至注射。将100微升细菌悬浮液i.p.注射入雌性Balb/c小鼠中。细菌注射后30分钟，将0.2mg GGL27肽或仅缓冲液i.p.注射。合并来自两次独立实验的数据。
LPS体内模型：给雄性C57BL/6小鼠(8-10周，22+/-5g)腹膜内注射18mg大肠杆菌0111:B4 LPS(Sigma)/kg体重。LPS注射后30分钟，将0.5mg GGL27、GGL27(S)、DSE25或仅缓冲液腹膜内注射入小鼠中。在7天期间追踪存活和状态。对于血液收集和组织化学，在LPS考验后20小时处死小鼠，并将肺取出并固定。这些实验得到马尔默
Figure BDA00001667053000591
/兰德实验室动物伦理委员会批准。
细胞因子测定法：使用细胞计量珠阵列；小鼠炎症试剂盒(BectonDickinson AB)依照制造商的指令来自受到LPS处理的小鼠(具有或没有肽处理)的血浆中测量细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、INF-γ、和TNF-α。
溶血测定法：将EDTA-血液以800g离心10分钟，此后除去血浆和暗黄覆盖层(buffy coat)。将红细胞清洗三次，并在PBS,pH 7.4中重悬以得到5%悬浮液。然后，将细胞在颠倒旋转(end-over-end rotation)情况下于37°C在存在肽(60μM)的情况中温育60分钟。2% Triton X-100(Sigma-Aldrich)充当阳性对照。此后，将样品以800g离心10分钟，并将上清液转移至96孔微量滴定板。于540nm测量血红蛋白释放的吸光度，并且表示为% TritonX-100诱导的溶血。
乳酸脱氢酶(LDH)测定法：将HaCaT角质形成细胞在96孔板(3000个细胞/孔)中在补充有牛垂体提取物和重组EGF(BPE-rEGF)(Invitrogen,Eugene,USA)的无血清角质形成细胞培养基(SFM)中培养至汇合。然后，除去培养基，并添加100μl调查的肽(为60μM，在SFM/BPE-rEGF中或在补充有20%人血清的角质形成细胞-SFM中稀释)。使用基于LDH的TOX-7试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)来量化自细胞的LDH释放。结果代表来自一式三份测量的均值，并且以与由1% Triton X-100组成的阳性对照(产生100% LDH释放)相比的分数LDH释放给出。
脂质体制备和泄漏测定法。调查的脂质体是阴离子(DOPE/DOPG 75/25mol/mol)。DOPG(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油，单钠盐)和DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)均来自Avanti Polar Lipids(Alabaster,USA)，并且具有大于99%纯度。由于这些磷脂的长的、对称的且不饱和的酰基链，实现了几项方法学上的优点。特别地，膜内聚力良好，这促成非常稳定的、单层的、且很大程度上没有缺点的脂质体(自冷冻-TEM观察的)，容许关于脂质体泄漏的详细研究。将脂质混合物在氯仿中溶解，此后在真空过夜下通过蒸发来除去溶剂。随后，与0.1M羧基荧光素(CF)(Sigma,St.Louis,USA)一起添加10mM Tris缓冲液，pH 7.4。在水合后，将脂质混合物进行8个冷冻-融化循环，其由液氮中的冷冻和加热至60°C组成。通过于22°C多次挤压流过在LipoFast微型挤压器(Avestin,Ottawa,Canada)中安放的聚碳酸酯滤膜(孔径100nm)来生成约
Figure BDA00001667053000601
的单层脂质体。通过于22°C用Tris缓冲液作为洗脱剂的两个随后的凝胶过滤(Sephadex G-50,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来除去未捕获的CF。通过监测来自脂质体分散体(在10mM Tris(pH 7.4)中的10μM脂质)的于520nm的发射荧光来测定来自脂质体的CF释放。在每项实验结束时经由添加0.8mM Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)通过破坏脂质体来获得绝对泄漏量表(scale)。对脂质体泄漏测定法使用SPEX-Fluorolog 1650 0.22-m双分光计(SPEX Industries,Edison,USA)。于37°C一式三份实施测量。
CD-分光术。在Jasco J-810分光偏振计(Spectropolarimeter)(Jasco,U.K.)上测量肽的CD谱。于37°C在10mm石英小杯(cuvet)中在搅拌下实施测量，并且肽浓度是10μM。在范围200-250nm中监测对100μM脂质浓度的脂质体的肽二级结构的影响。α-螺旋构象的肽的分数Xα如下计算：
Xα=(A-Ac)/(Aα-Ac)
其中A是于225nm记录的CD信号，且Aα和Ac是分别为100% α-螺旋和100%无规卷曲构象的参照肽的于225nm的CD信号。从分别在0.1M NaOH和0.1M HCl中的0.133mM(单体浓度)多聚-L-赖氨酸获得100% α-螺旋和100%无规卷曲参照物(28,29)。为了测定脂多糖对肽结构的影响，在Tris缓冲液中和在存在大肠杆菌脂多糖(0.02wt％)(大肠杆菌0111:B4，高度纯化的，小于1%蛋白质/RNA,Sigma,UK)的情况中在10μM的肽浓度监测肽二级结构。为了解决测量间的仪器差异，扣除背景数值(于250nm检测，其中不存在肽信号)。也校正来自本体溶液的信号。
对TFPI的系绕发生分析：自NCBI站点检索TFPI氨基酸序列。用Psi-Blast(NCBI)分析每个序列以寻找直向同系物和侧向同系物序列。选择显示结构同源性大于70%的序列。使用Blosum 69蛋白质权重矩阵设置使用ClustalW来比对这些序列。利用ClustalW界面考虑结构比对来进行内部调节。通过使用比对评估软件Tcoffee来评估比对内的每个位置的一致性水平。
绕计学分析：条形图(RDA,VCA)以来自至少三次独立实验的均值和标准偏差呈现。
结果
为了阐明TFPI的C端肽是否拥有抗微生物活性，我们调查了先前报告为通过蛋白水解作用(纤溶酶和凝血酶)生成的TFPI的限定区以及构成TFPI(关于序列，见图34A)的C端肝素结合表位的肽LIKTKRKRKKQRVKIAY[SEQID NO:5](LIK17)的效果。结果显示了所述肽在放射状扩散测定法(RDA)中针对革兰氏阴性大肠杆菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌及真菌白念珠菌和近平滑念珠菌确实是抗微生物的(图34B)。值得注意的是，所述肽与“经典的”AMP人cathelicidin LL-37展现出相当的活性(图34B)。相反，对照肽GGL27(S)(其具有被S替换的中间K/R残基)和肽DSE25(来自TFPI的N端)(关于序列，见实验规程)不产生针对上述微生物的抗微生物效果(图43)。上述抗细菌结果得到无基质活菌计数测定法进一步证实。来自利用大肠杆菌的这些剂量-响应实验的结果确认，特别是GGL27和LIK17展现出显著的抗细菌活性(图34C)。
FACS分析显示了纤溶酶生成的GGL27活跃地(avidly)结合人血浆中的大肠杆菌和铜绿假单胞菌(图35A)。采用不渗透的探针FITC的研究显示了与用LL-37处理后看到的(30,31)类似，LIK17(图35B)和GGL27(图44)透化大肠杆菌的细菌膜(图35B)。利用铜绿假单胞菌的电子显微术表明大面积的膜损伤，铜绿假单胞菌的细胞被膜缺乏其胞质内容物，而且在胞外发现胞内物质(图35C)。此外，用LL-37获得了相似的发现。这些数据指示TFPI衍生肽对细菌膜起作用，然而，它们并不表明对细菌添加肽后的精确的机械事件，因为对细菌的继发性代谢效应也可能触发细菌死亡和膜脱稳定化。因此，采用脂质体模型来研究LIK17和GGL27的膜透化。所述肽引起CF释放(图36A)，如此表明对脂质膜的直接影响。动力学分析显示了在5-10分钟里发生最大释放的约80%，这与用LL-37获得的结果相当(图36B)。值得注意的是，LIK17和GGL27没有展现出与结合脂质体有关的显著的构象变化(图36C)，而且与大肠杆菌LPS一起仅显示相对微小的构象变化(图36D)，后一种源自肽和/或LPS，与LL-37(其在脂质体结合后在螺旋性方面显示显著增加)形成对比。杀伤细菌的AMP也可以展现出针对真核细胞的溶血和膜透化活性。然而，结果显示了在3-60μM的剂量没有TFPI衍生肽的溶血活性(图37A)。这与LL-37形成对比，所述LL-37在大于6μM的剂量时容易透化红细胞。同样地，TFPI衍生肽没有透化HaCaT细胞，它们在所研究的浓度时也没有展现出任何显著毒性(图37B)。
因为许多抗微生物肽的活性由于生理学盐的存在及“生物基质”诸如血浆或血清的存在而被消除(32,33)，所以我们还调查了盐和人血浆对肽活性的影响。如图38A中表明的，所有三种TFPI衍生肽(GGL27、TKR22、和LIK17)的杀菌活性(特别地针对大肠杆菌)在存在人血浆的情况中不仅得到保留，而且得到显著增强。在本文应当注意到，最近显示了C端TFPI肽杀伤大肠杆菌是经由经典途径介导的，并且与膜攻击复合物(MAC)的形成相关联(34)。因此，血浆的热灭活消除该增强，即与证明完整补体系统的存在促进杀伤此种微生物的先前结果相符的发现。另外，应当注意到，TFPI衍生肽在热灭活血浆中也介导杀伤，尽管是在较高的浓度(图38A)，这与直接的肽介导的抗微生物效果相符，如图35和36中所表明的。令人感兴趣地，与用大肠杆菌的发现相反，在与生理学缓冲液相比时对铜绿假单胞菌的杀伤在人血浆中没有得到增强。此外，在与热灭活的血浆相比时，天然血浆的加强效果没有那么显著(值得注意的是对于GGL27和LIK17)。使用一组大肠杆菌和铜绿假单胞菌隔离群来概括上述发现(图38B)。另外，动力学研究表明在5-20分钟内发生肽对细菌的杀伤，指示与许多抗微生物肽相容的快速直接作用(图45)。
Western印迹实验(图39A和B)和FACS分析(图39C和D)显示了GGL27增强C1q对大肠杆菌的结合，导致MAC形成增加(图39A、C和D)。它还诱导C3a(即先前显示为施展通过细菌结合和膜裂解介导的在生理学条件下针对各种细菌的抗微生物效果的过敏毒素(25))的显著生成(图39B、C和D)。总之，这些观察结果提供了一种关于细菌杀灭的新机制，其基于GGL27的初始细菌结合(图35A)，接着加强抗微生物C3a的形成和细菌结合(图39B、C、和D)，因此其应当进一步添加由GGL27诱导的总体抗微生物效果(图38B)。与这些结果相反，在将铜绿假单胞菌进行GGL27处理后没有诱导显著的C1q/MAC改变(图39A、C和D)。就铜绿假单胞菌而言考虑C3a，细菌结合的肽的Western印迹鉴定出微小的C3a条带以及较高分子量的肽(其含有C3a的C端表位)。FACS分析显示了这些含有C3a的片段的生成及对细菌表面的结合升高(图39C和D)。
通常认为TFPI是一种血浆蛋白质，但是也由内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞表达(12)。免疫组织化学分析显示了TFPI在正常人皮肤中，特别地在基底表皮层中表达(图40A)。此外，该分子显示在急性创伤和慢性腿溃疡两者的伤口边缘的遍在表达。慢性腿溃疡的特征在于过度的慢性炎性状态、高水平的蛋白酶(诸如纤溶酶)和铜绿假单胞菌的频繁细菌建群(35)。因此，我们分析了来自被铜绿假单胞菌感染的此类溃疡的血纤蛋白死肉。如通过电子显微术和经免疫金标记的针对TFPI C端部分的抗体所表明的，发现这些肽表位与细菌膜及血纤蛋白纤维有关。重要地，使用双重染色，发现C3a与这些TFPI肽尤其有关(图40B)。因此，这些体内数据与关于GGL27的微生物结合及其与血浆中的抗微生物C3a的体外生成增加的关系的先前结果相符(图39)。
值得注意的是，人TFPI肽没有增强小鼠血浆中的细菌杀伤(图41A)。然而，观察到小鼠感染模型中的存活延长(图41B)。为了描绘此观察结果根本的可能性机制，并且考虑先前报告的TFPI的LPS结合特性(16)，我们调查了GGL27是否可以在体外和在体内施展抗内毒素效果。结果确实显示了，肽抑制LPS介导的自小鼠衍生的巨噬细胞(RAW 264.7细胞)的NO释放(图41C)，而且还显著延长LPS休克的小鼠模型中的存活(图41D)。在LPS注射后20小时对细胞因子的分析显示了促炎性IL-6、IFN-γ、TNF-α、和MCP-1的显著降低，而抗炎性IL-10增加(图41E)。此外，观察到经GGL27处理的动物的肺中的炎症和血管泄漏的明显降低(图41F)。相反，两种对照肽，即来自TFPI的N端区的DSE25和肽GGL27(S)(其用S替代“核心”K/R残基)既不在体外阻断NO释放，也不在体内显著改变总体细胞因子释放及存活(图41C、D、E)。这些数据表明GGL27的一种特定抗内毒素作用，其与在大肠杆菌和铜绿假单胞菌小鼠感染模型中观察到的改善相符。此外，GGL27(S)的消除的抗内毒素活性也突出显示了中间阳离子K/R残基在此分子中的重要性。总之，结果指示GGL27的差别的且宿主相关的效果；不依赖于宿主的抗内毒素效果，和宿主依赖性且基于补体的抗微生物功能，很可能是LPS和补体相互作用的不同结构前提的逻辑结果。与此推理一致，图42显示了TFPI的此区域的进化，并且突出显示了阳离子“核心”的保留，而且还有在小鼠与人之间在TFPI的此C端区中的显著序列变化。
讨论
本研究中的关键发现是基于直接的和补体介导的杀菌效果鉴定C端TFPI肽的双重抗微生物活性、表明抗内毒素效应、以及鉴定皮肤中的TFPI、其在创伤期间上调、及伤口中的存在。
目前公开的TFPI的C端肽的直接抗细菌作用与观察结果一致，指示肝素结合蛋白，诸如补体C3(25)、激肽原(36,37)、肝素结合蛋白(38)、肝素结合表皮生长因子和其它生长因子(39)、肝素/硫酸乙酰肝素相互作用蛋白(40)、β2-糖蛋白(41)、富含组氨酸的糖蛋白(42)、和人凝血酶(43)可以作为全蛋白质或在片段化后在体外及在数种情况中还在体内施展抗微生物活性(36,37,42)。另外，连同MAC形成的增强，肽介导的C3a生成代表宿主防御肽可以通过生成其它补体衍生的AMP来选择性增强微生物杀伤的机制。显示凝固和补体系统间的显著串扰(cross-talk)的最近的证据(44)进一步增加了与TFPI肽促进的C3a生成的生物学关联。
考虑TFPI的C端区，源自此区域的肽类似于低螺旋含量的其它线性肽。例如，源自生长因子的抗微生物肽在存在膜的情况中也展现出低螺旋含量，反映出它们较少含有“经典的”螺旋肽的典型特征，诸如规则散布的疏水性残基(39)。此外，关于激肽原衍生的抗微生物肽HKH20(HKHGHGHGKHKNKGKKNGKH[SEQ ID NO:105])的研究(45)显示HKH20肽在缓冲液中及在脂双层处主要展现出无规卷曲，即由静电学支配的相互作用(45)。值得注意的是，与TFPI衍生肽一样，HKH20(36)和GKR22(GKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK[SEQ ID NO:106])(39)(即一种源自肝素结合生长因子的肽)两者在生理学条件下都保留其抗细菌活性。就上文而言，感兴趣的是，最近的研究指示某些低两亲性肽主要通过强静电相互作用来展现活性，例如，导致负弯曲应变、膜变薄、或形成脂质域，有时导致影响生物学功能的细菌膜流动性变化(46)。
如先前所提及的，许多抗微生物肽(包括LL-37(31)、C3a(25)、凝血酶-和激肽原衍生的肽(36,37,43))是在蛋白水解期间释放的。考虑TFPI，酶诸如纤溶酶和凝血酶释放生理学事件诸如创伤相关的独特的C端片段。因此，通过凝血酶在血纤蛋白凝块中生成的TFPI衍生肽(20)可以在伤口愈合期间促成抗微生物活性。此外，由纤溶酶随后进行的蛋白质水解(生成GGL27)(21)可以进一步增加释放的宿主防御肽的谱。如上文所提及的，值得注意的是，在其在微血管内皮细胞中合成及随后在内皮、血浆和血小板中出现外，TFPI还由肝生成，并且存在于单核细胞和巨噬细胞(12)中。还已经在毛细管、巨核细胞、几种细胞系及赘生性细胞中表明TFPI的生成。结合人皮肤创伤期间的TFPI明显上调及其在血纤蛋白中和在细菌上的存在，此证据提示了可以在体内出现局部高水平的内源TFPI肽。鉴于铜绿假单胞菌在慢性腿溃疡中的普遍存在(与这些伤口中非常稀少的大肠杆菌建群形成对比(35,47))，发现所述肽在人血浆中针对大肠杆菌特别有活性，而且针对铜绿假单胞菌活性程度较小的发现是特别相关的且令人感兴趣。此外，基于表明细菌omptins(诸如来自大肠杆菌的OmpT)可以自TFPI释放GGL27片段，最近提出了TFPI已经进化出对omptin介导的蛋白水解灭活的敏感性以加强对某些条件中的大肠杆菌感染的促凝血应答(48)。我们的数据通过增添对大肠杆菌感染的另一种宿主应答机制：OmpT介导的宿主防御肽GGL27的生成来进一步证实此假设。
对炎症和凝固的同时控制在维持稳态中发挥至关重要的作用，并且值得注意的是，利用重组TFPI的试验指示蛋白质提供保护免于大肠杆菌诱导的重度败血症(49)，而且此外，TFPI也在牵涉重度社区获得性肺炎患者的III期临床试验的评估下。在此背景中，感兴趣的是注意，本文观察到的GGL27体外和体内抗内毒素效果可以至少部分解释先前观察到的在大肠杆菌败血症期间的TFPI的保护性效果(49)。显示TFPI的C端表位GGL27的直接和间接的、MAC和C3a介导的抗微生物效果的目前的发现对于未来尝试设计并开发抗击重度感染的基于肽的治疗剂可具有暗示。最后，TFPI肽没有显著增强离体(ex vivo)小鼠血浆中的细菌杀伤以及延长细菌性败血症期间的总体存活(虽然观察到延长的存活)的发现例示了小鼠模型在其评估人C端TFPI肽，诸如那些牵涉补体介导的细菌清除的肽的生理学作用的某些方面时可能是不利的。令人感兴趣地，虽然TFPI-α形式(具有C端阳离子序列)是人中的主要形成，但是小鼠表现为在很大程度上生成TFPI-β(即缺乏C端序列的形式)(50)，即一种与人中的独特的C端和OmpT可释放肽的上文提及的进化相符的观察结果。
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实施例C：源自HRG和ATIII的例示性肽的抗凝和抗炎效果富含组氨酸的糖蛋白(HRG)
导言
富含组氨酸的糖蛋白GHH25
抗微生物血浆蛋白富含组氨酸的糖蛋白(HRG)在体内保护宿主免于系统性微生物感染。在这里，我们显示了HRG是一种通过结合LPS并提高宿主细胞中LPS介导的TLR-4应答的样式识别分子。
LPS与CD14(即一种在巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上的受体)相互作用，该相互作用通过血浆蛋白LBP(LPS结合蛋白)而得到提高。LPS/CD14复合物导致toll样受体(TLR)4的激活，这继而激活依赖于或不依赖于MyD88的途径[1]。LPS应答也可以是不依赖于LBP的[2]。在LPS注射后在野生型和LBP缺陷的小鼠间在TNF-α体内释放方面没有差异，这提示了具有LBP样性能的蛋白质可能是负责的[3]。然后，TLR4的激活继而导致单核吞噬细胞的吞噬活性的增加，即释放的细胞因子和一氧化氮(NO)(其启动并支持炎性应答)的一种级联。NO是由一组称作一氧化氮合酶的酶生成的[4]，并且牵涉许多生物学过程诸如针对微生物、寄生性蠕虫和肿瘤保护宿主，而且调节血压，而高水平的NO则可能是细胞毒性的，并且破坏内源组织。
LPS诱导的应答对于宿主防御是至关重要的，但是极度的(overwhelming)应答则可以导致败血症。细胞因子和NO被鉴定为形成伴有如发热、凝血活性、败血症性休克、多器官衰竭和(在最坏的情况中)宿主死亡等症状的主要促成因素[5]。这得到如下实情的支持，即诱导型NOS(iNOS)突变体小鼠对LPS诱导的死亡率有抗性[6]。不同动物物种对LPS毒性的易感性是高度可变的，例如与具有相当抗性的小鼠[9]相比，人是非常敏感的[7,8]。常见的误解是仅通过促炎性介导物控制败血症。败血症的早期阶段受促炎性介导物诸如TNF-α、NO、缓激肽、凝血酶和组胺支配，而抗炎性介导物，诸如IL-6、活化的蛋白C、抗凝血酶和粒细胞集落刺激因子在较晚期阶段期间最广泛存在[10]。
现在，败血症的处理包括施用静脉内流体、广谱抗生素、保护性肺通气、糖皮质激素、胰岛素疗法和重组人激活蛋白C(APC)。已经进行许多尝试来中和LPS或抑制LPS介导的宿主免疫细胞活化，诸如用抗体阻断细胞因子活性，阻断NO生成[11]及通过使用抗微生物肽作为LPS的中和剂[12]来进行。
本研究的目的是调查丰富的血浆蛋白HRG对LPS介导的应答的影响。HRG是一种在肝中合成的67kDa血浆蛋白，并且在1972年第一次描述[13,14]。HRG也可以在凝血酶活化后自凝血细胞的α-颗粒释放，并且能够覆盖血纤蛋白凝块的表面。与胎球蛋白和激肽原一起，HRG属于cystatin超家族。所述蛋白质的最有区别性的特征是蛋白质的富含组氨酸的域含有保守GHHPH重复[15]。已经显示了HRG在体外与多种多样的一组配体，如肝素、血纤蛋白溶酶原、血纤蛋白原、血小板反应蛋白、血红素、IgG、FcgR和C1q相互作用。体内研究表明HRG是一种抗凝血和抗血纤蛋白溶解改性剂(modifier)[16]，对肿瘤血管化具有抑制效果[17]，而且作为抗微生物蛋白质在先天性免疫中发挥重要的作用[18]。
在本文中，我们证明了HRG是一种有力的促炎性蛋白质，其通过在体外增强LPS诱导的NO和细胞因子来实现。体内实验显示了Hrg-/-小鼠针对LPS诱导的败血症具有显著的抗性。我们的数据清楚地表明HRG促成实验性内毒素血症中的LPS毒性。数据还表明肽GHH25的抗炎性效果。
材料和方法
富含组氨酸的糖蛋白
合成肽GHH25(GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPH[SEQ IDNO:11])来自Biopeptide(San Diego,CA,USA)。多克隆兔抗小鼠TRL4购自GeneTex(Irvine,CA,USA)。细胞计量珠阵列，小鼠炎症试剂盒来自BDBiosciences(Stockholm,Sweden)。大肠杆菌LPS(0111:B4)购自Sigma(St Lois,MO)。
人HRG的纯化。将血清HRG纯化，如先前所描述的[19]。简言之，将人血清于4°C与镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖温和摇动过夜，用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)清洗。首先，用含有80mM咪唑的PBS实施洗脱以洗脱非特异性结合的蛋白质，然后，用含有500mM咪唑的PBS洗脱以洗脱纯化的HRG。将蛋白质透析、冷冻-干燥，并使用Bradford法[20]来测定浓度。
肝素和LPS的放射性碘化。实施肝素(来自猪肠粘膜,Sigma-Aldrich)的放射性碘化，如先前所描述的[21]。实施LPS碘化，如由Ulevitch[22]所描述的。将1mg大肠杆菌0111:B4 LPS在硼酸盐缓冲液，pH 8中的50mM对-OH苯甲亚胺酸酯中于4°C温育过夜，然后针对PBS,pH 7.4透析。然后，使用氯胺T法用125I放射性标记LPS，然后通过透析除去未标记的125I。
肝素和LPS结合测定法。使用狭缝印迹(slot-blot)装置来将100μl PBS pH7.4中的1、2和5μg合成肽应用于硝酸纤维素膜(Hybond-C,AmershamBiosciences)上。用PBS pH 7.4中的2%牛血清清蛋白将膜于室温封闭1小时，然后于室温在PBS,pH 7.4中与放射性标记的LPS(约40μg·mL-1,0.13×106cpm·μg-1)或放射性标记的肝素(约10μg·mL-1,0.4×106cpm·μg-1)一起温育1小时。添加未标记的肝素(6mg/ml)以竞争结合。将膜在PBS,pH 7.4中清洗三次。使用Bas 2000放射性成像系统(Fuji Film,Tokyo,Japan)来显现放射性。
细胞培养。将鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7(由H
Figure BDA00001667053000711
博士友情提供)在补充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbeccos改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco)中培养。在无血清条件下实施所有实验。
RAW巨噬细胞中的一氧化氮诱导。将汇合细胞收获，并转移至96孔板(3.5x105/孔)。在用无酚红DMEM(Gibco)清洗粘着细胞后，将大肠杆菌LPS(100ng/ml)、LL-37(2或10μM)或HRG(2 or 10μM)于37°C预温育30分钟，然后转移至细胞。对于抑制NO诱导，使用5g/ml抗小鼠TLR4抗体、10或100MGHH25或100g/ml肝素。将细胞刺激24小时，并使用格里斯化学方法[23]来测定一氧化氮。
自人巨噬细胞的TNF-α释放。使用Lymphoprep(Axis-Shield PoC AS)密度梯度自获自健康供体血液的外周血单个核细胞(PBMC)获得人单核细胞衍生的巨噬细胞(hMDM)。将PBMC以3×106个细胞/孔的浓度接种入24孔板中，并在补充有10%热灭活的自体人血浆、2mM L-谷氨酰胺、和50μl/ml抗生素-杀真菌药(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)的RPMI1640培养基中在5% CO2的湿润气氛中培养。在24小时后，除去非粘着细胞，并将粘着的单核细胞分化成巨噬细胞达10天，其中每两天换成新鲜培养基。在无血清条件下在具有或没有HRG(2μM)和GHH25(100μM)的情况中用10ng/ml LPS刺激细胞达24小时。在刺激后，吸出上清液，并使用TNF-α人ELISA试剂盒(Invitrogen)来测量TNF-α。
动物实验。将最初的敲除小鼠129/B6-HRGtm1wja1与C57BL/6小鼠(Taconic)杂交14代以获得一致的遗传背景。遵循ILAR(实验室动物来源研究所(Instituteof Laboratory Animal Resources))规则，这些HRG缺陷型小鼠系称作B6-HRGtm1wja1。将野生型C57BL/6对照小鼠和C57BL/6Hrg-/-小鼠(8-12周，27+/-4g)在兰德大学(Lund University)的动物房中培育。C57BL/6Hrg-/-缺乏Hrg基因的外显子1的翻译起始点[16]。将动物在光照和温度的标准条件下收容，并且自由获得标准的实验室食物和水。为了诱导败血症，将18μg/g大肠杆菌0111:B4 LPS腹膜内注射C57BL/6或C57BL/6Hrg-/-小鼠中，分成重量和性别匹配组。在7天期间追踪存活和状态。
对于用GHH25肽处理，在LPS考验后30分钟腹膜内注射1mg肽(在10mMTris,pH 7.4中稀释)或仅缓冲液，然后追踪存活和状态。
抗凝血酶III
Serpins是一组具有相似结构的蛋白质，其第一次被鉴定为一组能够抑制蛋白酶的蛋白质。因为许多serpins抑制胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)，所以最初造出首字母缩写词serpin。要专门研究的serpin超家族的第一个成员是人血浆蛋白质抗凝血酶和抗胰蛋白酶，它们分别在控制血液凝固和炎症中发挥关键作用。
关于serpins的结构研究已经揭示了，家族的抑制性成员经历罕见的构象变化，称作压缩至松弛(S至R)转变。serpins的此构象活动性提供了与静态锁匙式(lock-and-key)蛋白酶抑制剂相比的关键优点。特别地，可以容易地通过特异性辅因子如肝素来控制抑制性serpins的功能。此情况的原型例子是抗凝血酶，其在血浆中以相对无活性的状态循环。结合长链肝素内的高亲和力肝素戊糖序列后，抗凝血酶经历构象变化，暴露对于机制重要的关键残基。如此，抗凝血酶的肝素戊糖结合形式是凝血酶和因子Xa的一种更有效的抑制剂。此外，这两种凝固蛋白酶都含有肝素结合位点(称作外位点(exosite))。因此，肝素也充当结合蛋白酶和serpin两者的模板，这进一步显著加速两方间的相互作用。初始相互作用后，形成最终的serpin复合物，并且释放肝素模块。
材料和方法
(如上文)
结果
FFF21肽(FFFAKLNCRLYRKANKSSKLV[SEQ ID NO:1]，抗凝血酶III的aa 153-173，登录号P01008)展现出抗细菌和抗炎性特性(见图56)。

Claims (137)

1.用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的多肽，所述多肽包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质(与肝素辅因子II或凝血酶不同)的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质(与肝素辅因子II或凝血酶不同)的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，
其中所述片段、变体、融合物或衍生物展现出抗炎和/或抗凝活性。
2.依照前述权利要求1的多肽，其中所述多肽不是天然存在的蛋白质。
3.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是人蛋白质。
4.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质选自下组：丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)、组织因子途径抑制剂(诸如TFPI-1和TFPI-2)和富含组氨酸的糖蛋白(HRG)。
5.依照权利要求4的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是serpin。
6.依照权利要求5的多肽，其中所述serpin是抗凝血酶III。
7.依照权利要求6的多肽，其中所述抗凝血酶III是Swiss Port登录号P01008。
8.依照权利要求6或7的多肽，其包含如下SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“FFF21”：FFFAKLNCRLYRKANKSSKLV    [SEQ ID NO:1]
“AKL22”：AKLNCRLYRKANKSSKLVSANR   [SEQ ID NO:2]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:1或2的抗炎和/或抗凝活性。
9.依照权利要求8的多肽，其包含SEQ ID NOS:1或2的氨基酸序列或由SEQ ID NOS:1或2的氨基酸序列组成。
10.依照权利要求5的多肽，其中所述serpin是蛋白C抑制剂(PCI)。
11.依照权利要求5的多肽，其中所述蛋白C抑制剂是Swiss Port登录号P05154。
12.依照权利要求10或11的多肽，其包含如下SEQ ID NO:8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“SEK20”：SEKTLRKWLKMFKKRQLELY    [SEQ ID NO:3]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:3的抗炎和/或抗凝活性。
13.依照权利要求12的多肽，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
14.依照权利要求4的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是组织因子途径抑制剂(TFPI)。
15.依照权利要求14的多肽，其中所述组织因子途径抑制剂是TFPI-1。
16.依照权利要求14的多肽，其中所述TFPI-1是Swiss Port登录号P10646。
17.依照权利要求15或16的多肽，其包含如下SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“GGL27”：GGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM[SEQ ID NO:4]
“LIK17”：LIKTKRKRKKQRVKIAY          [SEQ ID NO:5]
“TKR22”：TKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM     [SEQ ID NO:6]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NOS:4至6中任一项的抗炎和/或抗凝活性。
18.依照权利要求17的多肽，其包含SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列或由SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列组成。
19.依照权利要求14的多肽，其中所述组织因子途径抑制剂是TFPI-2。
20.依照权利要求19的多肽，其中所述TFPI-2是Swiss Port登录号P48307。
21.依照权利要求19或20的多肽，其包含如下SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“ALK25”：ALKKKKKMPKLRFASRIRKIRKKQF           [SEQ ID NO:7]
“EDC34”：EDCKRACAKALKKKKKMPKLRFASRIRKIRKKQF  [SEQID NO:8]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:7或8的抗炎和/或抗凝活性。
22.依照权利要求19的多肽，其包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列组成。
23.依照权利要求4的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是富含组氨酸的糖蛋白(HRG)。
24.依照权利要求4的多肽，其中所述HRG是Swiss Port登录号P04196。
25.依照权利要求23或24的多肽，其包含如下SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
(X1X2X3X4X5)n[SEQ ID NO:9]，
其中
X1和X4独立代表G，P，L,I,F,T,V，Y或W；
X2、X3和X5独立代表H,R或K；且
“n”是2-6的整数，
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:9的抗炎和/或抗凝活性。
26.依照权利要求23至25中任一项的多肽，其包含如下SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
(GHHPH)n[SEQ ID NO:10]，其中“n”是2-6的整数，
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:10的抗炎和/或抗凝活性。
27.依照权利要求23至26中任一项的多肽，其包含如下SEQ ID NO:11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“GHH25”：GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPH[SEQ ID NO:11]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:11的抗炎和/或抗凝活性。
28.依照权利要求23至27中任一项的多肽，其包含SEQ ID NO:9,10或11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9,10或11的氨基酸序列组成。
29.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
30.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含一个或多个经修饰或衍生化的氨基酸。
31.依照权利要求30的多肽，其中所述一个或多个氨基酸是通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的。
32.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1至11的任一种氨基酸序列的片段或由SEQ ID NO:1至11的任一种氨基酸序列的片段组成。
33.依照权利要求32的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的至少5个连续氨基酸或由SEQ ID NO:3的至少5个连续氨基酸组成，例如至少6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26或27个连续氨基酸。
34.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:1至11中任一项的任一种氨基酸序列的变体或由SEQ ID NO:1至11中任一项的任一种氨基酸序列的变体组成。
35.依照权利要求34的多肽，其中所述变体与SEQ ID NOS:1至11中任一项的氨基酸序列具有至少50%同一性，例如至少55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或至少99%同一性。
36.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽的长度是10-200个氨基酸，例如长度为10-150、15-100、15-50、15-30、17-30、或17-28个氨基酸。
37.依照权利要求36的多肽，其中所述多肽的长度是至少17个氨基酸。
38.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是线性的。
39.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是重组多肽。
40.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞的释放。
41.依照权利要求33的多肽，其中所述促炎性细胞因子选自下组：巨噬细胞抑制因子、TNF-α、HMGB1、C5a、IL-17、IL-8、MCP-1、IFN-γ、Il-6、IL-1b、IL-12。
42.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽能够阻断血小板活化。
43.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽能够干扰白细胞、上皮细胞(包括角质形成细胞)和/或间充质细胞(包括成纤维细胞)中的Toll样受体(TLR)信号传导。
44.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽在下列一种或多种模型中展现出抗炎活性：
(a)使用LPS、LTA、酵母聚糖、鞭毛蛋白、尘螨、病毒或细菌DNA或RNA、或肽聚糖作为刺激物的体外巨噬细胞模型；
(b)内毒素休克的体内小鼠模型；和/或
(c)或是与抗微生物疗法组合或是单独给予的体内感染模型。
45.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽展现出抗凝活性。
46.依照权利要求45的多肽，其用于伴随治疗或预防炎症和凝固。
47.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽展现出Toll样受体(TLR)阻断活性。
48.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽用于治疗或预防与感染有关的炎症。
49.依照前述权利要求中任一项的多肽，其用于治疗或预防选自下列的疾病、状况或适应症：
i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克，其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎；
ii)慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、COPD和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症；
iii)术后炎症，炎性和凝固性病症，包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用，此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘；
iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固；
v)与抗微生物治疗组合的过度炎症，使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内(intratechal)、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用，药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。
50.依照前述权利要求中任一项的多肽，其用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和弥散性血管内凝固(DIC)。
51.依照权利要求50的多肽，其用于治疗或预防败血症。
52.依照权利要求50的多肽，其用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)。
53.依照前述权利要求中任一项的多肽，其与一种或多种别的治疗剂组合使用。
54.依照权利要求53的多肽，其中所述别的治疗剂选自下组：抗生剂、抗真菌剂、防腐剂、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂、受体阻断剂、受体激动剂和防腐剂。
55.依照权利要求54的多肽，其中所述抗生剂选自下组：抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂。
56.一种分离的多肽，其包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，所述多肽展现出抗炎和/或抗凝活性，
其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质选自下组：serpin(与肝素辅因子II不同)、富含组氨酸的糖蛋白(HRG)和组织因子途径抑制剂(诸如TFPI-1和TFPI-2)，
但须所述多肽不是天然存在的蛋白质。
57.依照权利要求56的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是人蛋白质。
58.依照权利要求56或57的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质选自下组：丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)、组织因子途径抑制剂(诸如TFPI-1和TFPI-2)和富含组氨酸的糖蛋白(HRG)。
59.依照权利要求58的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是serpin。
60.依照权利要求59的多肽，其中所述serpin是抗凝血酶III。
61.依照权利要求60的多肽，其中所述抗凝血酶III是Swiss Port登录号P01008。
62.依照权利要求60或61的多肽，其包含如下SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NOS:1或2的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“FFF21”：FFFAKLNCRLYRKANKSSKLV    [SEQ ID NO:1]
“AKL22”：AKLNCRLYRKANKSSKLVSANR   [SEQ ID NO:2]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NOS:1或2的抗炎和/或抗凝活性。
63.依照权利要求62的多肽，其包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成。
64.依照权利要求59的多肽，其中所述serpin是蛋白C抑制剂(PCI)。
65.依照权利要求64的多肽，其中所述蛋白C抑制剂是Swiss Port登录号P05154。
66.依照权利要求64或65的多肽，其包含如下SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“SEK20”：SEKTLRKWLKMFKKRQLELY    [SEQ ID NO:3]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:3的抗炎和/或抗凝活性。
67.依照权利要求66的多肽，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
68.依照权利要求58的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是组织因子途径抑制剂(TFPI)。
69.依照权利要求68的多肽，其中所述组织因子途径抑制剂是TFPI-1。
70.依照权利要求69的多肽，其中所述TFPI-1是Swiss Port登录号P10646。
71.依照权利要求68或69的多肽，其包含如下SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“GGL27”：GGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM [SEQ ID NO:4]
“LIK17”：LIKTKRKRKKQRVKIAY           [SEQ ID NO:5]
“TKR22”：TKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM      [SEQ ID NO:6]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NOS:4至6中任一项的抗炎和/或抗凝活性。
72.依照权利要求71的多肽，其包含SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列或由SEQ ID NOS:4至6中任一项的氨基酸序列组成。
73.依照权利要求68的多肽，其中所述组织因子途径抑制剂是TFPI-2。
74.依照权利要求73的多肽，其中所述TFPI-2是Swiss Port登录号P48307。
75.依照权利要求73或74的多肽，其包含如下SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“ALK25”：ALKKKKKMPKLRFASRIRKIRKKQF           [SEQ ID NO:7]
“EDC34”：EDCKRACAKALKKKKKMPKLRFASRIRKIRKKQF  [SEQID NO:8]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:7或8的抗炎和/或抗凝活性。
76.依照权利要求75的多肽，其包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列组成。
77.依照权利要求58的多肽，其中所述调控血液凝固的天然存在的蛋白质是富含组氨酸的糖蛋白(HRG)。
78.依照权利要求77的多肽，其中所述HRG是Swiss Port登录号P04196。
79.依照权利要求77或78的多肽，其包含如下SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
(X1X2X3X4X5)n[SEQ ID NO:9]，
其中
X1和X4独立代表G，P，L,I,F,T,V，Y或W；
X2、X3和X5独立代表H,R或K；且
“n”是2-6的整数，
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:9的抗炎和/或抗凝活性。
80.依照权利要求77至79中任一项的多肽，其包含如下SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
(GHHPH)n[SEQ ID NO:10]，其中“n”是2-6的整数，
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:10的抗炎和/或抗凝活性。
81.依照权利要求77至80中任一项的多肽，其包含如下SEQ ID NO:11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID NO:11的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成：
“GHH25”：GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPH[SEQ ID NO:11]
所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID NO:11的抗炎和/或抗凝活性。
82.依照权利要求77至81中任一项的多肽，其包含SEQ ID NO:9,10或11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9,10或11的氨基酸序列组成。
83.依照权利要求56至82中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
84.依照权利要求56至83中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含一个或多个经修饰或衍生化的氨基酸。
85.依照权利要求84的多肽，其中所述一个或多个氨基酸是通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的。
86.依照权利要求56至85中任一项的多肽，其中所述多肽的长度是10-200个氨基酸，例如长度为10-150、15-100、15-50、15-30、17-30、或17-28个氨基酸。
87.依照权利要求86的多肽，其中所述多肽的长度是至少17个氨基酸。
88.依照权利要求56至87中任一项的多肽，其中所述多肽是线性的。
89.依照权利要求56至88中任一项的多肽，其中所述多肽是重组多肽。
90.依照权利要求56至89中任一项的多肽，其中所述多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞的释放。
91.依照权利要求90的多肽，其中所述促炎细胞因子选自下组：巨噬细胞抑制因子、TNF-α、HMGB1、C5a、IL-17、IL-8、MCP-1、IFN-γ、Il-6、IL-1b、IL-12。
92.依照权利要求56至91中任一项的多肽，其中所述多肽能够阻断血小板活化。
93.依照权利要求56至92中任一项的多肽，其中所述多肽能够干扰白细胞、上皮细胞(包括角质形成细胞)和/或间充质细胞(包括成纤维细胞)中的Toll样受体(TLR)信号传导。
94.依照权利要求56至93中任一项的多肽，其中所述多肽在下列一种或多种模型中展现出抗炎活性：
(a)使用LPS、LTA、酵母聚糖、鞭毛蛋白、尘螨、病毒或细菌DNA或RNA、或肽聚糖作为刺激物的体外巨噬细胞模型；
(b)内毒素休克的体内小鼠模型；和/或
(c)或是与抗微生物疗法组合或是单独给予的体内感染模型。
95.依照权利要求56至94中任一项的多肽，其中所述多肽展现出抗凝活性。
96.依照权利要求56至95中任一项的多肽，其中所述多肽展现出Toll样受体(TLR)阻断活性。
97.一种分离的核酸分子，其编码依照权利要求56至96中任一项的多肽。
98.一种载体，其包含依照权利要求97的核酸分子。
99.依照权利要求98的载体，其中所述载体是表达载体。
100.一种宿主细胞，其包含依照权利要求97的核酸分子或依照权利要求98或99的载体。
101.一种生成依照权利要求56至86中任一项的多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养依照权利要求100的宿主细胞的群体，并自其分离所述多肽。
102.一种生成依照权利要求56至86中任一项的多肽的方法，包括多肽的液相或固相合成。
103.一种药物组合物，其包含依照权利要求56至86中任一项的多肽以及药学可接受赋形剂、稀释剂、载体、缓冲液或佐剂。
104.依照权利要求103的药物组合物，其适合于经由选自下组的路径施用：表面、眼、鼻、肺、含服、胃肠外(静脉内、皮下、鞘内和肌肉内)、口服、阴道和直肠。
105.依照权利要求103的药物组合物，其适合于经由植入物施用。
106.依照权利要求103至105中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物与要在医学中使用的装置或材料结合。
107.依照权利要求106的药物组合物，其中所述装置在旁路手术、体外循环、伤口护理和/或透析中使用。
108.依照权利要求106或107的药物组合物，其中所述药物组合物是包被、涂覆、喷雾或以其它方式应用于缝合线、假体、植入物、伤口敷料、导管、镜片、皮肤移植物、皮肤替代物、血纤蛋白胶或绷带的。
109.依照权利要求106至108的药物组合物，其中所述装置或材料包含聚合物、金属、金属氧化物和/或陶瓷或由聚合物、金属、金属氧化物和/或陶瓷组成。
110.依照权利要求56至86中任一项的多肽，其在医学中使用。
111.依照权利要求110的多肽，其用于治疗和/预防急性和/或慢性炎症。
112.依照权利要求110的多肽，其用于治疗和/预防微生物感染(例如细菌性感染)。
113.依照权利要求110的多肽，其用于调控血液凝固。
114.依照权利要求110的多肽。其用于治疗伤口。
115.依照权利要求110或114中任一项的多肽，其用于治疗或预防选自下列的疾病、状况或适应症：
i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克，其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎；
ii)慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、COPD和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症。
iii)术后炎症，炎性和凝固性病症，包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用，此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘；
iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固；
v)与抗微生物治疗组合的过度炎症，使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用，药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。
116.依照权利要求56至86中任一项的多肽在制备用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的药物中的用途。
117.依照权利要求116的用途，其中所述药物用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和弥散性血管内凝固(DIC)。
118.依照权利要求114的用途，其中所述药物用于治疗或预防败血症。
119.依照权利要求114的用途，其中所述药物用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)。
120.依照权利要求116至119中任一项的用途，其中所述药物与一种或多种别的治疗剂组合使用。
121.依照权利要求120的用途，其中所述别的治疗剂选自下组：抗生剂、抗真菌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂和防腐剂。
122.依照权利要求121的用途，其中所述抗生剂选自下组：抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂。
123.依照权利要求121的用途，其中所述别的治疗剂是类固醇。
124.一种用于治疗或预防患者中的炎症的方法，该方法包括对所述患者施用治疗有效量的依照权利要求1至86中任一项的多肽或依照权利要求103或109中任一项的药物组合物。
125.依照权利要求124的方法，其中所述患者是人。
126.依照权利要求124或125的方法，其用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和弥散性血管内凝固(DIC)。
127.依照权利要求126的方法，其用于治疗或预防败血症。
128.依照权利要求126的方法，其用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)。
129.依照权利要求124至128中任一项的方法，其中所述方法对所述患者进一步施用一种或多种别的治疗剂。
130.依照权利要求129的方法，其中所述别的治疗剂选自下组：抗生剂、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂、受体阻断剂、受体激动剂和防腐剂。
131.依照权利要求130的方法，其中所述抗生剂选自下组：抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂。
132.依照权利要求129的方法，其中所述别的治疗剂是类固醇。
133.基本上如本文中参照说明书和附图所描述的多肽。
134.基本上如本文中参照说明书和附图所描述的药物组合物。
135.基本上如本文中参照说明书和附图所描述的医学移植物或装置，或其中使用的生物材料。
136.基本上如本文中参照说明书和附图所描述的多肽的用途。
137.基本上如本文中参照说明书和附图所描述的用于治疗或预防炎症的方法。
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