CN102603872A

CN102603872A - 单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用

Info

Publication number: CN102603872A
Application number: CN2012101035973A
Authority: CN
Inventors: 江必旺; 陈荣姬; 吴俊成; 林生跃; 肖书霞
Original assignee: Suzhou Nano-Micro Bio-Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Nano-Micro Bio-Technology Co Ltd
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开了单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用，采用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。本发明不但利于以水溶液做流动相分离纯化万古霉素粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量，同时可使用低盐浓度将吸附在层析柱上的万古霉素洗脱下来。

Description

单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用

技术领域

本发明涉及抗生素纯化领域，具体涉及万古霉素的柱层析纯化领域。

背景技术

万古霉素是由放线菌属微生物菌株产生的一种糖肽类抗生素，其可抑制细菌细胞壁合成以及改变细胞膜的渗透性，对抑制革兰氏阳性菌如葡萄球菌、链球菌、梭状芽胞杆菌感染引起的疾病有明显疗效，同时可用于治疗对青霉素过敏或使用青霉素或头孢菌素没有效果的患者。

离子交换层析介质是是生物大分子分离纯化中最常用的方法之一，广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、抗生素以及天然产物的分离纯化。其主要由三部分组成，第一部分是母体结构，即载体；第二部分是固定在母体结构上的带电功能基团；第三部分是与功能基团带相反电荷的离子对。与传统的离子交换树脂相比，用于生物大分子分离的离子交换层析介质除了具备高的离子密度、具有一定的耐压、耐酸碱性能外，还要求母体结构足够亲水，使其具有良好的生物相容性，并且要具有均匀的粒径。目前用于生物大分子分离的介质大多数不具备所有的以上特点，在实际应用中具有缺陷。

Aya Ohkubo等(Journal of Chromatography A, 1997,779 113-122)使用硅胶为基质，键合强阳离子基团，合成强阳离子层析介质用于小分子的分离纯化能达到很好的分离效果。但是硅胶基质不能耐碱性，这限制了它的应用范围。

美国专利7018814公开了一种盐酸万古霉素的纯化方法，该方法以强阳离子交换树脂为分离介质，以氢氧化铵水溶液为流动相对万古霉素进行粗提，回收率为88%。该方法使用的离子交换树脂基质粒径为50-200μM的不均匀微球，不能满足精细纯化要求。

中国专利200710187300.5公开了一种用葡聚糖基质的Sephadex CM-25(GE Healthcare)分离纯化万古霉素的方法，该方法以碳酸氢铵水溶液为流动相，能得到95%以上的纯度，70%以上的回收率。但是该方法中使用的分离介质为葡聚糖基质，其在不同盐浓度下床体积会发生非常明显的变化，同时葡聚糖基质较软，不耐高压，这在快速的分离上有很大的局限。

Capto MMC(GE Healthcare)是一种复合型阳离子交换层析介质，由于其表面键合了包含疏水基团、离子交换基团以及氢键的复合配基，因此其具有不同于传统生物分离离子交换层析介质的选择性，以及更高的动态载量。但是，该介质使用的基质为琼脂糖，其耐高压性能较低，在高流速的操作下有一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种能达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量的层析介质。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用，采用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。

优选的，用所述单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质作为色谱柱的固定相，将含万古霉素的样品上样在该色谱柱上，用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在填料上的万古霉素。

优选的，所述盐的水溶液是NH₄HCO₃的水溶液。

优选的，所述单分散聚甲基丙烯酸酯基质混合型阳离子交换层析介质是由苏州纳微生物科技有限公司生产，产品型号为Uni MSP-50S。

Uni MSP-50S是在亲水性的聚甲基丙烯酸基质表面键合上疏水基团和离子交换基团，其具备疏水和离子交换的双重作用，因此做为柱层析填料时相比传统离子交换层析介质具有更好的选择性，而且填料床的体积不会随流动相浓度发生变化，在纯化万古霉素时，只需要低盐浓度盐水溶液就可将吸附在填料上的万古霉素洗脱下来，达到高纯度及高回收率，同时，强耐反压性能使其能够在高流速下操作。

本发明的有益效果是：单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质Uni MSP-50S不但利于以水溶液做流动相分离纯化万古霉素粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量，同时可使用低盐浓度将吸附在层析柱上的万古霉素洗脱下来。

附图说明

图1是实施例1中使用的苏州纳微生物科技有限公司单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质Uni MSP-50S扫描电镜照片。

图2是实施例1中提纯前的万古霉素粗品的HPLC分析图谱。

图3是实施例1中提纯后的万古霉素的HPLC分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。

实施例1,

采用10×220mm、一端可调节的玻璃色谱柱，苏州纳微生物科技有限公司生产的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质Uni MSP-50S为层析填料装填层析柱，装柱高度19cm，装柱体积14.9mL，先用3.0CV超纯水以1.5mL/min的流速平衡色谱柱。万古霉素粗品（纯度89%）用超纯水溶解，调节pH为3.2，粗品浓度37.5mg/mL，上样体积15mL，色谱柱载量为37.8mg/mL。上样后，先用超纯水冲洗3.0BV，然后用0.33% NH₄HCO₃洗脱4.0CV以除去杂质，最后用0.45% NH₄HCO₃洗脱7.0CV并分管收集洗脱液。收集液经检测，得到色谱纯度在95%以上的回收率约78%，色谱纯度在97%以上的回收率约61.5%。

实施例2，

采用10×220mm、一端可调节的玻璃色谱柱，苏州纳微生物科技有限公司生产的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质Uni MSP-50S为层析填料装填层析柱，装柱高度19cm，装柱体积14.9mL，先用3.0CV超纯水以1.5mL/min的流速平衡色谱柱。万古霉素粗品（纯度89%）用超纯水溶解，调节pH为3.2，粗品浓度37.5mg/mL，上样体积22.0mL，色谱柱载量为55.4mg/mL。上样后，先用超纯水冲洗3.0BV，然后用0.33% NH₄HCO₃洗脱4.0CV以除去杂质，最后用0.45% NH₄HCO₃洗脱7.0CV并分管收集洗脱液。收集液经检测，得到色谱纯度95%以上的回收率约76%，色谱纯度在97%以上的回收率约60.1%。

实施例3，

采用10×220mm、一端可调节的玻璃色谱柱，GE CM-Sephadex C-25(GE Healthcare，粒径范围 40-120微米)为层析填料装填层析柱，装柱高度20.0cm，装柱体积15.7mL，先用5.0CV超纯水以1.0mL/min的流速平衡色谱柱。万古霉素粗品（纯度89%）用超纯水溶解，调节pH为3.2，粗品浓度37.5mg/mL，上样体积23.2mL，色谱柱载量为55.4mg/mL。上样后，先用超纯水冲洗5.0BV，然后用0.4% NH₄HCO₃洗脱4.0CV以除去杂质，最后用4.0% NH₄HCO₃洗脱6.0CV并分管收集洗脱液。收集液经检测，得到色谱纯度95%以上的回收率约75%，色谱纯度在97%以上的回收率约62.5%。

实施例4,

测试盐溶液对填料体积的影响：

采用10×250mm、一端可调玻璃柱，Uni MSP-50S (苏州纳微生物科技有限公司) 为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以2mL/min流速平衡色谱柱，测量柱床高度为21.0cm，体积为16.5mL，用3CV 3% NaCl溶液以2mL/min流速冲洗色谱柱，冲洗结束后测量柱床高度为21.0cm，体积为16.5mL，体积与原体积相比无变化。

实施例5,

测试盐溶液对填料体积的影响：

采用10×250mm一端可调玻璃柱，CM Sephadex C-25(GE Healthcare，粒径范围 40-120微米)为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以2mL/min流速平衡色谱柱，测量柱床高度为22.0cm，体积为17.3mL，用3CV 1% NaCl溶液以2mL/min流速冲洗色谱柱，冲洗结束后测量柱床高度为18.8cm，体积为14.8mL，体积比原体积缩小14.5%；继续用3CV 2% NaCl溶液以2mL/min流速冲洗色谱柱，冲洗结束后测量柱床高度为17.3cm，体积为13.6mL，体积比原体积缩小21.4%；继续用3CV 3% NaCl溶液以2mL/min流速冲洗色谱柱，冲洗结束后测量柱床高度为16.2cm，体积为12.7mL，体积比原体积缩小26.4%。

实施例6，

测试压力对填料的影响：

采用10×250mm一端可调玻璃柱，Uni MSP-50S (苏州纳微生物科技有限公司) 为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以2mL/min流速平衡色谱柱，测量柱床高度为21.0cm，体积为16.5mL，调节流速使压力增高至0.3MPa，继续冲洗3CV超纯水，测量柱床高度为21.0cm，体积为16.5mL，体积与原体积相比无变化。

实施例7，

测试压力对填料影响：

采用10×250mm一端可调玻璃柱，CM Sephadex C-25(GE Healthcare，粒径范围 40-120微米)为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以2mL/min流速平衡色谱柱，测量柱床高度为21.0cm，体积为16.5mL，调节流速使压力增高至0.3MPa,继续冲洗3CV超纯水，测量柱床高度为18.6cm，体积为16.5mL，体积减小11.4%。

将实施例一、二、四、六和实施例三、五、七性能进行对比，比较结果见表1。

表1 介质Uni MPS-50S与介质CM Sephadex C-25比较结果表

结果及性能	实施例一、二、四、六层析介质Uni MPS-50S	实施例三、五、七层析介质CM Sephadex C-25
			粒径均一	○	×
耐高压	○	×
			盐溶液中体积无变化	○	×
低盐浓度洗脱样品	○	×

注：其中“○”表示是，“×”表示否。

从图1可见，单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质Uni MSP-50S粒径非常均一。

图2是提纯前的万古霉素，可见杂峰多且高，说明杂质多且浓度高，图3是提纯后的万古霉素，杂峰非常少且低，说明杂质已经非常少且浓度低，万古霉素纯化效果很好。

本发明采用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质Uni MSP-50S不但利于以水溶液做流动相分离纯化万古霉素粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量，同时可使用低盐浓度将吸附在层析柱上的万古霉素洗脱下来。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用，其特征在于，采用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。

2.如权利要求1所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用，其特征在于，用所述单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质作为色谱柱的固定相，将含万古霉素的样品上样在该色谱柱上，用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在填料上的万古霉素。

3.如权利要求2所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质在万古霉素柱层析纯化中的应用，其特征在于，所述盐的水溶液是NH₄HCO₃的水溶液。