CN102607907A - 一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法，包括取材与固定、冲洗、染色与蓝化、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片、贴片、脱蜡与封片、镜检及照相，其中固定中采用改良的FAA固定液体，其组成为福尔马林∶冰醋酸∶30％乙醇＝1∶1∶18。采用本发明提供的方法，能有效克服蕨类植物配子体非常幼嫩的特点，可以良好的固定细胞分裂各时期，从后期的石蜡切片中，我们可以观察到大量的有丝分裂的切片，能够详细的反映整个发育过程，具有很好的开发应用价值。

Description

一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法

技术领域

本发明涉及一种植物石蜡切片的方法，尤其是一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法。

技术背景

至今为止没有专门应用于制备蕨类植物切片的技术，通常使用常规的石蜡切片技术来制备蕨类植物的解剖切片。然而常规的石蜡切片技术会导致蕨类植物配子体流失水分，严重变形从而改变了细胞内部形状，无法正常通过常规的石蜡切片技术观察到配子体的解剖结构。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法，包括取材与固定、冲洗、染色与蓝化、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片、贴片、脱蜡与封片、镜检及照相，其中固定中采用改良的FAA固定液体，其组成为福尔马林∶冰醋酸∶30％乙醇＝1∶1∶18，以解决蕨类植物配子体非常幼嫩的问题。

所述脱水和透明过程中，纯酒精和纯二甲苯处理阶段时间为5min，其它各阶段时间均为10分钟。

染色采用苏木精整体染色法。

在石蜡切片法中，经常使用的是FAA固定液(福尔马林∶冰醋酸∶70％乙醇＝1∶1∶18)和卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，幼嫩材料使用50％酒精配置的FAA固定液。蕨类植物配子体个体较小，配子体大部分仅有一层细胞构成且含水量丰富，在高浓度酒精的固定液和长时间的脱水、透明过程中容易脱水过度而收缩。

本发明针对蕨类植物配子体非常幼嫩的特点，探讨了FAA固定液和卡诺固定液中的酒精浓度，最后选择改良的FAA(福尔马林∶冰醋酸∶30％乙醇＝1∶1∶18)作为固定液。缩短脱水和透明时间间隔，即30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→95％乙醇→无水乙醇I→无水乙醇II→2/3乙醇+1/3二甲苯→1/2乙醇+1/2二甲苯→1/3无水乙醇+2/3二甲苯→纯二甲苯I→纯二甲苯II，每级10min，其中纯酒精和纯二甲苯5min。

改良FAA固定液中，可以良好的固定细胞分裂各时期，从后期的石蜡切片中，我们可以观察到大量的有丝分裂的切片，能够详细的反映整个发育过程。本实验中采用改良的石蜡切片法，染色采用苏木精整体染色法，大大缩短了试验时间和后期染色时间，并获得了良好的实验结果，为幼嫩材料特别是蕨类植物配子体的固定和石蜡切片提供了更快更好的切片方法。

附图说明

图1采用本方法制备的石蜡切片

A  胚胎发育    B颈卵器发育

图2采用传统方法制备的石蜡切片

A  胚胎发育    B颈卵器发育

具体实施方式

以下详细介绍本发明采用的方法。

1、取材与固定

第一次培养材料时，根据发育时间确定精子器、颈卵器、胚胎发育各个时期的时间范围，经过多次重复培养，大量取材；在显微镜下观察并取材，尽快将材料快速置于改良的FAA固定液中，并在4℃冰箱中保存，在改良FAA固定液中固定24h。

2、冲洗

将固定好的材料，在小流量流水冲洗1～2h，冲后30％酒精，50％酒精，70％酒精各30min。

3、染色与蓝化

爱氏苏木精染色2～5d，细胞核成红紫色，再利用自来水冲洗，使细胞核成深蓝色，细胞质染成浅蓝色，蓝化时间为3～5h即可；蓝化合适的材料放入30％的酒精中进行梯度脱水。

4、脱水与透明

采用乙醇逐级脱水法，即30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→95％乙醇→无水乙醇I→无水乙醇II，每级10min，其中无水乙醇5min；脱水后经过二甲苯以过渡，当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态；2/3乙醇+1/3二甲苯→1/2乙醇+1/2二甲苯→1/3无水乙醇+2/3二甲苯→纯二甲苯I→纯二甲苯II，每级10min，其中纯二甲苯5min。

5、浸蜡与包埋

用石蜡逐渐取代二甲苯，具体过程是：常温下将削好的蜡屑，逐渐投入盛有材料的二甲苯小瓶中至饱和→37℃温箱中加蜡屑，置于恒温箱过夜→将小瓶中原液倒去1/2后补入1/2已熔化的纯蜡，此过程重复2～3次→全部换纯蜡2次，每步骤0.5～1h；

先叠成小的纸盒，再将熔化的石蜡倒入其中，迅速将材料移至盛石蜡的纸盒中，用镊子或解剖针将材料摆正位置后，盒中石蜡逐渐凝固。为加速凝固，当石蜡表面凝结成乳白色时，将盒移入冷台上即可迅速变成硬块。

6、切片

将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8μm，切片时，右手摇动旋转轮手柄，左手持毛笔将蜡带提起，移至一张纸板上，准备粘片。

7、贴片

在一清洁的载玻片上涂一薄层粘贴剂(由蛋清、甘油调制)，再滴加1～2滴蒸馏水，用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，摆好位置，注意蜡片光亮平整的一面贴于载玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签，然后将载片在酒精灯上微热或置于预先加热的展片台(温度保持在40～45℃)上，使蜡片展开，然后把载玻片放在展片夹上编好记号置于37℃温箱烘干12h。

8、脱蜡与封片

将干燥好的切片泡在二甲苯中1～2h进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中。

9、镜检及照相

光学显微镜下观察并记录，显微摄影装置(Olympus BH2～C5060WZ)下显微拍照，采用本方法获得的结果如图1所示，采用常规方法获得的结果如图2所示。。

Claims (4)

1.一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法，包括取材与固定、冲洗、染色与蓝化、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片、贴片、脱蜡与封片、镜检及照相，其特征在于固定采用改良的FAA固定液体，其组成为福尔马林∶冰醋酸∶30％乙醇＝1∶1∶18。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述脱水和透明过程中，纯酒精和纯二甲苯处理阶段时间为5min，其它各阶段时间均为10分钟。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于染色采用苏木精整体染色法。

4.权利要求1或2所述的片法，其特征在于具体步骤如下：

1)取材与固定

第一次培养材料时，根据发育时间确定精子器、颈卵器、胚胎发育和孢子囊发育各个时期的时间范围，然后经过多次重复培养，大量取材；在显微镜下观察并取材，尽快将材料快速置于改良的FAA固定液中，并在4℃冰箱中保存，在改良FAA固定液中固定24h；

2)冲洗

将固定好的材料，在小流量流水冲洗1～2h，冲后30％酒精，50％酒精，70％酒精各30min；

3)染色与蓝化

爱氏苏木精染色2～5d，细胞核成红紫色，再利用自来水冲洗，使细胞核成深蓝色，细胞质染成浅蓝色，蓝化时间为3～5h即可；蓝化合适的材料放入30％的酒精中进行梯度脱水；

4)脱水与透明

采用乙醇逐级脱水法，即30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→95％乙醇→无水乙醇I→无水乙醇II，每级10min，其中无水乙醇5min；脱水后经过二甲苯以过渡，当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态；2/3乙醇+1/3二甲苯→1/2乙醇+1/2二甲苯→1/3无水乙醇+2/3二甲苯→纯二甲苯I→纯二甲苯II，每级10min，其中纯二甲苯5min；

5)浸蜡与包埋

用石蜡逐渐取代二甲苯，具体过程是：常温下将削好的蜡屑，逐渐投入盛有材料的二甲苯小瓶中至饱和→37℃温箱中加蜡屑，置于恒温箱过夜→将小瓶中原液倒去1/2后补入1/2已熔化的纯蜡，此过程重复2～3次→全部换纯蜡2次，每步骤0.5～1h；

先叠成小的纸盒，再将熔化的石蜡倒入其中，迅速将材料移至盛石蜡的纸盒中，用镊子或解剖针将材料摆正位置后，盒中石蜡逐渐凝固。为加速凝固，当石蜡表面凝结成乳白色时，将盒移入冷台上即可迅速变成硬块；

6)切片

将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8μm，切片时，右手摇动旋转轮手柄，左手持毛笔将蜡带提起，移至一张纸板上，准备粘片；

7)贴片

在一清洁的载玻片上涂一薄层粘贴剂(由蛋清、甘油调制)，再滴加1～2滴蒸馏水，用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，摆好位置，注意蜡片光亮平整的一面贴于载玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签，然后将载片在酒精灯上微热或置于预先加热的展片台(温度保持在40～45℃)上，使蜡片展开，然后把载玻片放在展片夹上编好记号置于37℃温箱烘干12h；

8)脱蜡与封片

将干燥好的切片泡在二甲苯中1～2h进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中；

9)镜检及照相

光学显微镜下观察并记录，显微摄影装置下显微拍照。

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