CN102605076B

CN102605076B - 指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102605076B
Application number: CN201210082350.8A
Authority: CN
Inventors: 汪道文; 崔广林; 丁虎
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhuhai Saileqi Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: CN102605076A

Abstract

本发明公开了指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法和试剂盒，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。一种快速基因分型的方法，通过提取宿主细胞基因组DNA，测定受试者的CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)的基因型。本发明中CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)基因的具有SEQ ID 1所示的核酸序列位点，是与华法林代谢相关的最主要的两个位点之一。本发明的优点是：提供了一种能快速准确的基因分型方法及相关试剂盒，该方法快速，操作简单，成本低廉可用于血栓性相关疾病的预防、辅助诊断和治疗，便于基层医疗机构的开展及普及应用。

Description

指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种能实现指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法，具体说是通过抽取人外周血DNA，通过PCR扩增后再进行高分辨率熔解曲线分析，对CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)两个多态性位点进行快速基因分型。该方法可以用于临床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、治疗，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。

背景技术

华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病如：人工瓣膜置换、静脉血栓形成(肺栓塞)、房颤等的口服抗凝治疗，以及降低心肌梗死复发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险。但是华法林的剂量很难掌握，因为不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林代谢的影响逐渐被认识，其中CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)与华法林关系最为密切，都与代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。因此，临床上一种快速准确的基因分型方法的应用将对需华法林治疗的患者提供个体化的医疗方案。

现在已经证实有30多种基因相互作用决定华法林代谢、转运和药理作用。患者不同的药物基因组学信息是导致华法林剂量差异的重要因素。与遗传因素相关的低凝血酶原患者最常见的原因是CYP2C9代谢活性降低和药物靶标VKORC1(vitamin K epoxide reductase complex 1)低表达。这两种基因的遗传多态性在全世界范围内可解释15％和25％的华法林剂量变异。因此美国FDA在2007年修改了华法林的使用说明，建议在使用华法林前进行基因分型。而且CYP2C9、VKORC1基因多态性分析已经成为国内外有条件的临床实验室重要检测项目。

目前检测CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。探针法操作过程简单，PCR扩增的特异性高但订购探针的成本太高，并且探针在反复冻融后容易失效，临床应用的可行性低。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。因此，急需要寻找简单易行的基因分型方法。

通过实验我们证实了高分辨率熔解曲线的方法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，并且我们通过对其敏感性和特异性的检测发现均在98％以上，结果可靠性高。有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用。

发明内容

本发明要解决的首要技术问题是提供一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的方法，该方法通过提取人的外周血白细胞基因组DNA，采用快速准确的基因分型方法测定受试者的CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)两个位点的基因型。

一组能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的引物和高分辨率熔解曲线，能特异性的扩增出CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)位点的扩增产物，随着温度逐渐升高，使扩增产物的DNA解链，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，通过检测荧光信号随温度的变化即可得到扩增产物的熔解曲线，根据熔解曲线的形状从而可以判断是否存在突变位点以及突变位点的基因型。

具有序列表SEQ ID 2和5所示的碱基序列：其中SEQ ID 2和3所示序列为CYP2C9*3(1061 A/C)位点F和R引物序列，SEQ ID 4和5所示序列为VKORC1(-1639 G/A)位点F和R引物序列。

一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的试剂盒(10人份)，由以下试剂组成：

125μl 2×GC Buffer I缓冲液(TaKaRa)，40μl dNTP混合液，50μl超纯水，各10μl 10μM/L的正向引物和反向引物，5μl的热启动酶，5μl饱和荧光染料SYTO9(美国Invitrogen公司)。F和R引物是序列表SEQ ID 2-5所示的碱基序列。试剂盒保存温度为-20度。

本发明具有以下优点：使用了目前国际上流行的高分辨率熔解曲线技术对CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)进行基因分型，其原理主要是，其原理是在PCR扩增体系中加入可与双链DNA结合产生荧光的特殊饱和染料，随着温度逐渐升高，使扩增产物的DNA解链，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，通过检测荧光信号随温度的变化即可得到扩增产物的熔解曲线，从而可以判断是否存在突变位点。该方法操作简便，成本低廉，灵敏度和特异度非常高，适合于基层医疗或研究单位。

附图说明

图1CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)各基因型HRM基因分型结果和各基因型的测序验证结果。

a图为VKORC1(-1639 G/A)位点的熔解曲线图，b图为以VKORC1(-1639 G/A)为基准的熔解曲线转换图；c图为CYP2C9*1/*3熔解曲线图，d图为以CYP2C9*1/*3为基准的熔解曲线转换图。

A，B，C分别为以上各基因型的碱基序列图，灰色所框碱基为测序证实的单核苷酸多态性位点。A：VKORC1(-1639 A/A)；B：VKORC1(-1639 G/G)；C：VKORC1(-1639 G/A).

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

实施例1检测一种能指导华法林使用起始剂量快速基因分型的试剂盒

二、试剂盒成分

1.PCR扩增试剂

F引物5’-ACGTGTGATTGGCAGAAACCG-3’(SEQ ID 2)

R引物5’-GGCAGGCTGGTGGGGAGA-3’(SEQ ID 3)

F引物5’-CAAAATGCTAGGATTATAGGCGT-3’(SEQ ID 4)

R引物5’-CTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAG-3’(SEQ ID 5)

2.PCR反应参数：

PCR仪：Rotor-Gene 6000^TM(澳大利亚Corbett Research公司)，用Rotor-Gene Q Series Software 1.7软件进行分析。

3.试验结果

PCR反应结束后产物直接进行熔解曲线反应，用Rotor-Gene Q Series Software 1.7软件进行分析，结果如图所示：a图为熔解曲线图，b图为以VKORC1(-1639 G/A)为基准的熔解曲线转换图；c图为熔解曲线图，d图为以CYP2C9*1/*3为基准的熔解曲线转换图。A，B，C分别为以上各基因型的碱基序列图，灰色所框碱基为测序证实的单核苷酸多态性位点。(说明书附图1)

基因型的判断：

依据本发明技术高分辨率熔解曲线方法共可分辨出5种基因型：VKORC1基因3种多态性；CYP2C9基因2种多态性(CYP2C9第三种基因多态性在中国人群中不存在或频率罕见，最小等位基因频率＜1％，无临床检测意义)。具体如下：依据高分辨率熔解曲线图的标准化荧光强度图VKORC1的三种基因型各自呈现不同的曲线形状，依据曲线的形状以及本说明书附图的说明，可判断所测样本的基因型；依据高分辨率熔解曲线图的标准化差值图VKORC1的三种基因型也呈现不同的曲线形状，以VKORC1(-1639 G/A)作为基准线转换后，根据曲线形状按照说明书附图的说明也可判断所测样本的基因型。依据高分辨率熔解曲线图的标准化荧光强度图CYP2C9的二种基因型各自呈现不同的曲线形状。依据曲线的形状以及本说明书附图的说明，可判断所测样本的基因型；依据高分辨率熔解曲线图的标准化差值图CYP2C9的二种基因型也呈现不同的曲线形状，以CYP2C9*1/*3作为基准线转换后，根据曲线形状按照说明书附图的说明也可判断所测样本的基因型。

敏感性和特异性分析：

对该技术的敏感性和特异性，我们选取了100例临床标本进行测试。100例临床标本的分析结果示：VKORC1(-1639 A/A)野生型有73例；而VKORC1(-1639 G/A)和VKORC1(-1639 G/G)基因型分别有23例和4例。CYP2C9*3(1061 A/C)和CYP2C9*3(1061 A/A)基因型分别有94例和6例。敏感性和特异性分析显示敏感性和特异性都达到了95％以上，可靠性高(表 1)。

表1.HRM方法对100例临床标本进行基因分型的敏感性和特异性分析

本发明具有实用性的例证

1)本发明的检测方法可用于分析CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)两位点的多态性，应用在对需要服用华法林的患者身上，以减少不良事件的发生和利于血栓性相关疾病的早期干预和治疗。

2)本发明建立的检测CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)两位点多态性的方法，可高灵敏度、高特异性地应用于需服用华法林患者易感基因诊断用的试剂盒。

本发明叙述了与服用华法林剂量相关的多态性位点，并提供了一种快速准确低成本的测定方法，可以应用于相关疾病基因多态性的基因筛查，便于基层医疗机构相关技术的开展及应用。

Claims

1.一种指导华法林使用起始剂量快速基因分型的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：125μl2× GCBuffer I缓冲液,40μl dNTP混合液，50μl超纯水，各10μl10μM的正向引物和反向引物，5μl的热启动酶，5μl饱和荧光染料SYTO9，F和R引物是序列表SＥQ ID2-5所示的碱基序列，试剂盒保存温度为-20度。