CN102597234A

CN102597234A - 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体

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Publication number: CN102597234A
Application number: CN2010800350518A
Authority: CN
Inventors: 久保田丽夫; 铃木伸之
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2009-08-07
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: HUE036392T2; AU2010279892A1; US9181332B2; BR112012002819B1; MX2012001708A; EP2463368B1; BR112012002819A2; AU2010279892A8; JPWO2011016567A1; DK2463368T3; US20130095526A1; RU2012108610A; AU2010279892B2; KR101787118B1; PT2463368T; KR20120038474A; WO2011016567A1; EP2463368A1; EP2463368A4; US8333967B2

Abstract

本发明提供了一种人源化抗体，其不与Aβ单体结合而仅与Aβ寡聚体特异性结合；抗认知功能障碍剂、阿尔茨海默病治疗剂、神经炎性斑形成抑制剂或Aβ淀粉样纤维形成抑制剂，各含有该抗体作为活性成分；预防和/或治疗认知功能障碍或阿尔茨海默病的方法，其包括施用该抗体的步骤；和抑制阿尔茨海默病进展的方法，其包括施用该抗体的步骤。

Description

人源化抗淀粉样-B寡聚体抗体

技术领域

本发明涉及特异性地与淀粉样-β(以下也称为Aβ)蛋白寡聚体结合的抗体及其用途。

背景技术

基于多项证据，认为阿尔茨海默病(以下称为AD)中记忆衰退是由于淀粉样-β蛋白的可溶性寡聚体(以下，淀粉样-β蛋白也称为Aβ，并且淀粉样-β蛋白寡聚体也称为Aβ寡聚体)所引起的突触功能障碍(非专利文献1和2)。

因此，有可能Aβ寡聚体在脑内的过度蓄积或沉积引发可能导致AD的一系列病理级联。这表明有可能靶向Aβ寡聚体的医学治疗可以有效地延缓或预防AD疾病阶段的发作和进展。

但是，中由分子、特别是Aβ寡聚体引起神经退行性变作为负责该淀粉样-级联假说核心因素的知识主要在体外实验中被证明(非专利文献3)，而在体内没有被直接证明。

由于在以前已经报道的体内实验中没有研究Aβ寡聚体的特异性结构(非专利文献4)，所以尚未阐明由内源性Aβ寡聚体所导致的突触毒性。

另外，虽然已经对多种AD模式小鼠进行了研究，但是尚未揭示Aβ寡聚体在AD患者脑内的神经毒性。

此外，尚未查明为什么在人类内嗅皮质中的神经炎性斑发病之前发生神经原纤维缠结(以下简称为NFT)的形成和神经细胞的损失，以及Aβ寡聚体如何与这些组织变性和功能障碍相关。

作为抗Aβ寡聚体的抗体，已知抗Aβ寡聚体鼠单克隆抗体NAB61(非专利文献4)、1A9、2C3、E12、1C10和4D3(专利文献1)。

已知当向人施用诸如小鼠抗体的非人抗体时，其通常被识别为外来物质，使得在人体内诱发针对小鼠抗体的人抗体(人抗鼠抗体：HAMA)。已知HAMA与被施用的鼠抗体反应从而引起副作用(非专利文献5至8)，加速小鼠抗体从人体消失(非专利文献6，9和10)并且降低小鼠抗体的疗效(非专利文献11和12)。

为了解决这些问题，已经尝试用基因重组技术从非人抗体制备重组抗体，如人嵌合抗体和人源化抗体。

与诸如小鼠抗体的非人抗体相比，人嵌合抗体、人源化抗体等在对于人的临床应用方面具有多种优势，例如，已经报道，在使用猴子的实验中，与鼠抗体相比，其免疫原性降低并且其血液半衰期延长(非专利文献13)。

也就是说，由于人嵌合抗体、人源化抗体等对人产生的副作少于非人抗体，预期其疗效维持更长时间。

此外，由于使用重组技术制备重组抗体，如人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，所以可以将其制备为多种分子形式。

例如，可以用γ1亚类作为人抗体的重链(以下称为“H链”)恒定区(以下称为“C区”)(H链C区称为“CH”)，从而产生效应子功能、如抗体依赖性细胞毒作用(以下称为“ADCC”活性)高的重组抗体。此外，可以用γ2或γ4亚类作为重链，从而产生效应子功能降低、并且预期与小鼠抗体相比其血液半衰期延长的重组抗体。

尤其是，由于细胞毒活性、如补体依赖性细胞毒作用(以下称为“CDC活性”)和抗体Fc区(在抗体重链铰链区之后的区域)引介的ADCC活性对于疗效是重要的，所以与诸如小鼠抗体的非人动物抗体相比，优选人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体(非专利文献15和16)。

此外，随着在蛋白质工程和基因工程方面的近期进展，也可以将重组抗体制备为分子量小的抗体片段，如Fab、Fab’、F(ab’)₂、单链抗体(以下称为“scFv”)(非专利文献17)、二聚化V区片段(以下称为“双价抗体”)(非专利文献18)、二硫键稳定的V区片段(以下称为“dsFv”)(非专利文献19)和含有CDR的肽(非专利文献20)。这些抗体片段与整个抗体分子相比在向靶组织转移方面具有更强的优势(非专利文献21)。

上述事实表明，作为准备用于对人的临床应用的抗体，与诸如小鼠抗体的非人抗体相比，更优选人嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其抗体片段。

引文列表

专利文献

专利文献1：WO2009/051220

非专利文献

非专利文献1：Klein WL，Trends Neuwsci 24：219-224，2001

非专利文献2：Selkoe DJ，Science 298：789-791，2002

非专利文献3：Hass C et al，Nature Review 8：101-12，2007

非专利文献4：Lee EB，et al，J.Biol.Chem.281：4292-4299，2006

非专利文献5：J.Clin.Oncol.，2，881(1984)

非专利文献6：Blood，65，1349(1985)

非专利文献7：J.Natl.Cancer Inst.，80，932(1988)

非专利文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，1242(1985)

非专利文献9：J.Nucl.Med，26，1011(1985)

非专利文献10：J.Natl.Cancer Inst.，80，937(1988)

非专利文献11：J.Immunol，135，1530(1985)

非专利文献12：Cancer Res.，46，6489(1986)

非专利文献13：Cancer Res.，56，1118(1996)

非专利文献14：Immunol，85，668(1995)

非专利文献15：J Immunol，144，1382(1990)

非专利文献16：Nature，322，323(1988)

非专利文献17：Science，242，423(1988)

非专利文献18：Nature Biotechnol，15，629(1997)

非专利文献19：Molecular Immunol，32，249(1995)

非专利文献20：J.Biol.Chem.，271，2966(1996)

非专利文献21：Cancer Res.，52，3402(1992)

发明概述

技术问题

以上非专利文献4和专利文献1公开了抗Aβ寡聚体的抗体。但是这些抗体不仅与Aβ寡聚体结合，也与Aβ单体结合，因此对在AD的抗体治疗期间，靶向脑内病变的抗体的中枢副作用存在顾虑。

因此，本发明的目的是提供不与Aβ单体结合而仅与Aβ寡聚体特异性结合的人源化抗体，及其用途。更具体地，目的是提供与Aβ寡聚体特异性结合的抗体、使用该抗体测定Aβ寡聚体的方法、使用该抗体诊断AD的方法和含有该抗体的药物。

问题的解决方案

由于对以上问题的深入研究，本发明人已经发现了不与Aβ单体结合而仅与Aβ寡聚体特异性结合的人源化抗体，并且完成了本发明。即，本发明涉及以下内容。

1.人源化抗体，其不与Aβ蛋白单体结合而与Aβ寡聚体结合，并且其含有以下(a)抗体重链可变区和(b)抗体轻链可变区：

(a)抗体重链可变区，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或者对SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列进行了以下氨基酸修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr，和以Thr取代第97位的Ala。

(b)抗体轻链可变区，其含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或者对SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列进行了以下氨基酸修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：以Val取代第2位的Ile，以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln，和以Phe取代第92位的Tyr。

2.以上1的人源化抗体，其中抗体重链可变区含有SEQ ID NO：12或15所示的氨基酸序列，并且抗体轻链可变区含有由SEQ ID NO：14、16或17所示的氨基酸序列。

3.抗认知功能障碍剂，其含有以上1或2的人源化抗体作为活性成分。

4.用于治疗阿尔茨海默病的药物，其含有以上1或2的人源化抗体作为活性成分。

5.用于抑制神经炎性斑形成的药剂，其含有以上1或2的人源化抗体作为活性成分。

6.Aβ淀粉样纤维形成的抑制剂，其含有以上1或2的人源化抗体作为活性成分。

7.用于认知功能障碍的预防和治疗中的至少一种的方法，其包括施用以上1或2的人源化抗体。

8.用于阿尔茨海默病的预防和治疗中的至少一种的方法，其包括施用以上1或2的人源化抗体。

9.用于抑制阿尔茨海默病进展的方法，其包括施用以上1或2的人源化抗体。

发明的有益效果

预期本发明的抗体通过靶向AD的致病分子Aβ蛋白，可以建立预防和治疗AD的方法和早期诊断标志物。

对于靶向脑内病变的抗体在AD的抗体治疗期间的脑内转移，存在顾虑。但是，有可能本发明的抗体可以通过外周静脉给药应用于临床治疗，并且认为可以立刻加速AD的抗体治疗的发展。

附图说明

图1显示H链可变区HV0的氨基酸序列和在HV2、HV3、HV4、HV5、HV7a、HV7b、HV9和HV12中从SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列修饰的氨基酸残基。图中第一和第二行表示H链可变区的氨基酸编号，并且其它各行中的字母表示被取代的氨基酸(用单字母代码表示)。

图2显示L链可变区LV0的氨基酸序列和在LV2a、LV2b、LV2c、LV2d、LV3和LV4中从SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列修饰的氨基酸残基。图中第一和第二行表示L链可变区的氨基酸编号，并且各行中的字母表示被改变的氨基酸(用一个字母表示)。

图3显示通过使用Biocore系统测定各抗Aβ寡聚体人源化抗体对Aβ单体的结合活性而获得的传感图。

发明的实施方案

本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体(以下也称为本发明的抗体或者本发明的人源化抗体)是特征为与Aβ寡聚体结合而不与Aβ单体结合的人源化抗体。本发明的抗体优选是分离抗体、纯化抗体或者抗体组合物。

分离抗体、纯化抗体和抗体组合物是基本上含有100％的目的抗体、并且不含有任何杂质例如在抗体生产中的污染物蛋白质的抗体，其源自产抗体细胞、组织、产抗体动物等。

抗体是由两条重链(H链)和两条轻链(L链)构成的异质四聚体蛋白质。抗体被分为多克隆抗体和识别单一抗原的单克隆抗体。

多克隆抗体是识别单一抗原的抗体的混合物。多克隆抗体的实例包括用抗原免疫的宿主动物的抗血清。

单克隆抗体是由产抗体细胞的单一克隆所分泌的抗体，其仅仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并且具有氨基酸序列(一级结构)一致性。

本发明的抗体优选单克隆抗体。本发明的单克隆抗体的实例包括：抗体重链(以下称为H链)的互补决定区(以下称为CDR)1至3分别含有SEQ ID NO：1至3所示的氨基酸序列、L链的CDR 1至3分别含有SEQ ID NO：4至6所示的氨基酸序列的单克隆抗体，抗体的H链可变区(以下称为VH)含有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列且L链可变区(以下称为VL)含有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的单克隆抗体，和抗Aβ寡聚体小鼠单克隆抗体6E4。

作为表位，即被单克隆抗体识别并结合的单一氨基酸序列，可以例举含有以上氨基酸序列的构象、结合糖链的以上氨基酸序列、和含有结合糖链的以上氨基酸序列的构象。

被本发明的抗体识别的表位可以是任何蛋白质，只要其包括Aβ蛋白和其片段的至少之一、并且存在于形成复合体的Aβ寡聚体上即可。

本发明的抗体所结合的表位的实例包括含有暴露在Aβ寡聚体上的Aβ的一级氨基酸序列的表位、含有Aβ寡聚体的构象的表位等。

已知作为淀粉样蛋白的主要成分的Aβ蛋白是含有40至42个氨基酸的肽，并且是由被称为淀粉样前体蛋白质(以下称为APP)的前体蛋白质经过蛋白酶的作用而产生的。

由APP所产生的淀粉样蛋白分子包括可溶性单体和可溶性寡聚体的非纤维状聚合物以及在超离心沉淀级分中所收集的淀粉样蛋白纤维。

在本发明中，Aβ寡聚体是非纤维状聚合物，并且是含有Aβ蛋白和其片段的至少之一并且形成复合体的Aβ寡聚体。

具体地，Aβ寡聚体的实例包括Aβ40(Aβ1-40)寡聚体、Aβ42(Aβ1-42)寡聚体和含有Aβ40和Aβ42的至少之一的Aβ寡聚体。

此外，本发明的Aβ寡聚体的实例还包括含有在Aβ40和Aβ42的至少之一中Aβ的N端缺失的Aβ片段的Aβ寡聚体。

具体地，本发明的Aβ42寡聚体是用SDS-PAGE测得分子量为45至160kDa并且用蓝色非变性PAGE测得分子量为22.5至1035kDa的分子。

主要通过分子筛中＞100kDa的保持液回收Aβ42寡聚体。此外，Aβ寡聚体在原子力显微镜下显示出由高度为1.5至3.1nm的粒状分子、珠状分子和圆形分子组成的混合构象。

此外，以上Aβ42寡聚体被用凝胶过滤法洗脱，获得空隙体积分数为8的分子量680kDa以上，以及分数为15的界于17-44kDa的分子量。

可以使用本发明的抗体，只要其是与Aβ寡聚体结合而不与Aβ单体结合的人源化抗体即可，并且不限定其来源和形状。

优选地，本发明的抗体不识别作为生理分子的可溶性淀粉样β蛋白(Aβ)单体，并且仅仅与可溶性Aβ寡聚体反应。

在本发明中，仅仅与可溶性Aβ寡聚体结合而不与可溶性Aβ单体结合的意思是：在用超滤法和分子筛分离的Aβ单体和Aβ寡聚体中，抗体不识别单体(约4.5kDa)，但是特异性地识别等于或大于Aβ二聚体的可溶性Aβ寡聚体。因此，优选地，本发明的抗体特异性地与等于或大于Aβ二聚体的可溶性Aβ寡聚体结合。

本发明的抗体优选具有下列(1)至(5)中的至少一种活性：

(1)抗神经毒活性；

(2)抑制Aβ淀粉样纤维形成的活性；

(3)仅仅识别Aβ寡聚体的特异性；

(4)在AD脑中捕获Aβ寡聚体的能力；

(5)在APPswe转基因小鼠(Tg2576)中预防AD样病变(记忆衰退、脑内的Aβ蓄积水平)的能力。

可以用WO 2009/051220中所公开的方法证实与以上(1)至(5)相关的本发明的抗体的活性。

可以将本发明的抗体制备为重组抗体。在本发明中，重组抗体包括通过重组技术产生的抗体，如人嵌合抗体、人源化抗体(或人CDR移植抗体)、人抗体及其抗体片段。

具有单克隆抗体的特征、低免疫原性和较长血液半衰期的重组抗体优选作为治疗剂。重组抗体的实例包括通过使用重组技术修饰本发明的单克隆抗体而衍生的抗体。

人嵌合抗体是含有非人动物抗体的重链可变区(以下称为“VH”)和轻链可变区(以下称为“VL”)以及人抗体的重链恒定区(以下称为“CH”)和轻链恒定区(以下称为“CL”)的抗体。

可以如下制备人嵌合抗体：从产生与Aβ寡聚体特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞获取编码以上VH和VL的cDNA，将每个cDNA插入含有编码CH和CL的DNA的动物细胞表达载体中从而构建表达人嵌合抗体的载体，并且然后将该载体引入动物细胞中表达抗体。

作为人嵌合抗体的以上CH，可以使用任何CH，只要其属于人免疫球蛋白(以下称为“hIg”)即可，并且其优选属于hIgG类，并且可以使用属于hIgG类的任一亚类，如hlgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。

作为人嵌合抗体的以上CL，可以使用任何CL，只要其属于hIg类即可，并且可以使用属于κ类或者λ类的CL。

本发明的人源化抗体是非人动物来源抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人抗体的VH和VL的适当位置中的抗体。

可以如下制备人源化抗体：设计V区的氨基酸序列，其中由非人动物杂交瘤所产生的并且与Aβ寡聚体特异性结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR氨基酸序列分别被移植到任何人抗体的VH和VL的的骨架区(以下称为“FR”)中，构建编码V区的cDNA，将每个cDNA插入含有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞表达载体中从而构建表达人源化抗体的载体，并且将其引入动物细胞从而表达且产生人源化抗体。

作为人源化抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列，可以使用任何氨基酸序列，只要它们分别是源自人抗体的VH和VL的氨基酸序列即可。

实例包括诸如蛋白质数据库(Protein Data Bank)的数据库中所登记的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列、Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991)中所述的人抗体的VH和VL的FR的每个亚组的共有氨基酸序列，等等。

本发明的人源化抗体的实例包括抗体的VH的CDR 1至3分别含有SEQ ID NO 1至3所示的氨基酸序列、并且抗体的VL的CDR 1至3分别含有SEQ ID NO 4至6所示的氨基酸序列的人源化抗体。

本发明的人源化抗体优选为含有至少一种以下(a)VH和(b)VL的人源化抗体。此外，在以下(a)和(b)中，不限定所引入的取代数量：

(a)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，或者SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列中选自以下氨基酸残基中至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代的氨基酸序列：第12位的Lys、第20位的Val、第38位的Arg、第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第70位的Ile、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala；

(b)VL，其含有SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列、或SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列中选自以下氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代的氨基酸序列：第2位的Ile、第15位的Pro、第50位的Gln和第92位的Tyr。

例如，本发明的人源化抗体所含VH的优选实例包括，例如，含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的VH：第12位的Lys、第20位的Val、第38位的Arg、第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第70位的Ile、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala。

此外，选自以下(1)至(9)的VH也优选作为本发明的人源化抗体所含有的VH：

(1)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第12位的Lys、第20位的Val、第38位的Arg、第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala；

(2)VH，其含有由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第12位的Lys、第38位的Arg、第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala；

(3)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第12位的Lys、第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala；

(4)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第74位的Thr和第97位的Ala；

(5)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala；

(6)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg和第97位的Ala；

(7)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg和第97位的Ala；

(8)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第45位的Leu、第48位的Met和第97位的Ala；

(9)VH，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中的以下氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：第45位的Leu和第97位的Ala。

VH的氨基酸序列的实例包括在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中引入选自以下修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：以Val取代第12位的Lys、以Leu取代第20位的Val、以Lys取代第38位的Arg、以Leu取代第39位的Gln、以Phe取代第45位的Leu、以Ile取代第48位的Met、以Lys取代第67位的Arg、以Ala取代第68位的Val、以Leu取代第70位的Ile、以Val取代第72位的Ala、以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

VH的氨基酸序列的更具体实例包括引入了以下12至1处取代的氨基酸序列。

引入了12处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括在SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列中引入以下取代的氨基酸序列：以Val取代第12位的Lys、以Leu取代第20位的Val、以Lys取代第38位的Arg、以Leu取代第39位的Gln、以Phe取代第45位的Leu、以Ile取代第48位的Met、以Lys取代第67位的Arg、以Ala取代第68位的Val、以Leu取代第70位的Ile、以Val取代第72位的Ala、以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

引入了11处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(12)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr。

引入了10处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括，例如，以下(1)至(66)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(13)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(14)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(15)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(16)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(17)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(18)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(19)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(20)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(21)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(22)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(23)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(24)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(25)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(26)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(27)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(28)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(29)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(30)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；(31)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(32)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(33)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(34)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(35)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(36)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(37)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(38)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(39)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(40)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(41)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(42)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(43)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(44)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(45)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(46)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(47)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(48)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(49)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(50)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(51)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(52)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(53)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(54)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(55)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(56)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(57)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(58)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(59)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(60)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(61)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(62)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(63)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(64)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(65)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile和以Lys取代第74位的Thr；

(66)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile和以Val取代第72位的Ala。

引入了9处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(10)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr。

引入了8处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(47)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(13)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(14)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(15)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(16)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(17)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(19)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(20)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(21)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(22)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(23)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(24)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(25)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(26)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(27)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(28)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(29)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(30)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(31)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(32)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(33)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(34)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(35)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(36)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(37)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(38)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(39)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(40)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(41)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(42)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(43)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(44)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(45)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(46)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Lys取代第74位的Thr；

(47)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Val取代第72位的Ala。

引入了7处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(22)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(13)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(14)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(15)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(16)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(17)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(18)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(19)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(20)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(21)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(22)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

引入了6处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(7)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

引入了5处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(8)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

引入了4处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(9)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

引入了3处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括，例如，以下(1)至(19)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Phe取代第45位的Leu和以Thr取代第97位的Ala；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Phe取代第45位的Leu和以Thr取代第97位的Ala；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu和以Thr取代第97位的Ala；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu和以Thr取代第97位的Ala；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Thr取代第97位的Ala；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys，以Phe取代第45位的Leu和以Ile取代第48位的Met；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val，以Phe取代第45位的Leu和以Ile取代第48位的Met；

(13)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg，以Phe取代第45位的Leu和以Ile取代第48位的Met；

(14)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu和以Ile取代第48位的Met；

(15)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Lys取代第67位的Arg；

(16)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Ala取代第68位的Val；

(17)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Leu取代第70位的Ile；

(18)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Val取代第72位的Ala；

(19)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met和以Lys取代第74位的Thr。

引入了2处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括，例如，以下(1)至(66)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Leu取代第20位的Val；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Lys取代第38位的Arg；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Leu取代第39位的Gln；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Phe取代第45位的Leu；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Ile取代第48位的Met；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Lys取代第67位的Arg；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Ala取代第68位的Val；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Leu取代第70位的Ile；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Val取代第72位的Ala；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Lys取代第74位的Thr；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys和以Thr取代第97位的Ala；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Lys取代第38位的Arg；

(13)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Leu取代第39位的Gln；

(14)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Phe取代第45位的Leu；

(15)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Ile取代第48位的Met；

(16)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Lys取代第67位的Arg；

(17)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Ala取代第68位的Val；

(18)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Leu取代第70位的Ile；

(19)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Val取代第72位的Ala；

(20)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Lys取代第74位的Thr；

(21)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(22)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Leu取代第39位的Gln；

(23)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Phe取代第45位的Leu；

(24)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Ile取代第48位的Met；

(25)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Lys取代第67位的Arg；

(26)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Ala取代第68位的Val；

(27)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Leu取代第70位的Ile；

(28)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Val取代第72位的Ala；

(29)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Lys取代第74位的Thr；

(30)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(31)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Phe取代第45位的Leu；

(32)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Ile取代第48位的Met；

(33)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Lys取代第67位的Arg；

(34)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Ala取代第68位的Val；

(35)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Leu取代第70位的Ile；

(36)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Val取代第72位的Ala；

(37)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Lys取代第74位的Thr；

(38)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln和以Thr取代第97位的Ala；

(39)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Ile取代第48位的Met；

(40)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Lys取代第67位的Arg；

(41)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Ala取代第68位的Val；

(42)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Leu取代第70位的Ile；

(43)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Val取代第72位的Ala；

(44)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Lys取代第74位的Thr；

(45)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu和以Thr取代第97位的Ala；

(46)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met和以Lys取代第67位的Arg；

(47)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met和以Ala取代第68位的Val；

(48)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met和以Leu取代第70位的Ile；

(49)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met和以Val取代第72位的Ala；

(50)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met和以Lys取代第74位的Thr；

(51)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met和以Thr取代第97位的Ala；

(52)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第67位的Arg和以Ala取代第68位的Val；

(53)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第67位的Arg和以Leu取代第70位的Ile；

(54)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第67位的Arg和以Val取代第72位的Ala；

(55)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第67位的Arg和以Lys取代第74位的Thr；

(56)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第67位的Arg和以Thr取代第97位的Ala；

(57)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ala取代第68位的Val和以Leu取代第70位的Ile；

(58)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ala取代第68位的Val和以Val取代第72位的Ala；

(59)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ala取代第68位的Val和以Lys取代第74位的Thr；

(60)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ala取代第68位的Val和以Thr取代第97位的Ala；

(61)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第70位的Ile和以Val取代第72位的Ala；

(62)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第70位的Ile和以Lys取代第74位的Thr；

(63)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第70位的Ile和以Thr取代第97位的Ala；

(64)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第72位的Ala和以Lys取代第74位的Thr；

(65)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第72位的Ala和以Thr取代第97位的Ala；

(66)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

引入了1处取代的VH的氨基酸序列的具体实例包括，例如，以下(1)至(12)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第20位的Val；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第38位的Arg；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第39位的Gln；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Phe取代第45位的Leu；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ile取代第48位的Met；

(7)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第67位的Arg；

(8)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Ala取代第68位的Val；

(9)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Leu取代第70位的Ile；

(10)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第72位的Ala；

(11)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Lys取代第74位的Thr；

(12)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中以Thr取代第97位的Ala。

在以上VH的氨基酸序列中，优选SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，和在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中进行了以下取代的氨基酸序列：以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala。

本发明的人源化抗体优选包括含有在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中第2位的Ile、第15位的Pro、第50位的Gln、第92位的Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的VL，并且本发明的VL的优选实例还包括含有在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中第15位的Pro、第50位的Gln、第92位的Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的VL。

此外，选自以下(1)至(4)的VL也优选作为本发明的人源化抗体所含有的VL：

(1)VL，其含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中第50位的Gln和第92位的Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；

(2)VL，其含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中第2位的Ile和第92位的Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；

(3)VL，其含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中第15位的Pro和第92位的Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；

(4)VL，其含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中第2位的Ile和第50位的Gln被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列。

VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中引入选自以下修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：以Val取代第2位的Ile，以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr。

本发明抗体中引入以上修饰的VL的氨基酸序列的更具体实例包括，例如，引入了以下四处至一处取代的VL的氨基酸序列。

引入了4处取代的VL的氨基酸序列的具体实例包括在SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile、以Leu取代第15位的Pro、以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr的氨基酸序列。

引入了3处取代的VL的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(4)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile，以Leu取代第15位的Pro和以Lys取代第50位的Gln；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile，以Leu取代第15位的Pro和以Phe取代第92位的Tyr；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile，以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr。

引入了2处取代的VL的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(6)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile和以Leu取代第15位的Pro；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile和以Lys取代第50位的Gln；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile和以Phe取代第92位的Tyr；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro和以Lys取代第50位的Gln；

(5)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro和以Phe取代第92位的Tyr；

(6)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr。

引入了1处取代的VL的氨基酸序列的具体实例包括以下(1)至(4)的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile；

(2)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro；

(3)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Lys取代第50位的Gln；

(4)氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Phe取代第92位的Tyr。

在以上VL的氨基酸序列中，优选SEQ ID NO：14表示的氨基酸序列，和在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile、以Leu取代第15位的Pro、以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr的氨基酸序列，和在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr的氨基酸序列。

本发明的抗体的具体实例包括通过分别组合上述VH和VL所获得的各种抗体中的任一种。

本发明的抗体的优选实例包括，例如，以下抗体(1)至(4)：

(1)人源化抗体，其包含含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的VL；

(2)人源化抗体，其包含含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的VH和含有图2所示的任一氨基酸序列的VL；

(3)人源化抗体，其包含含有图1所示的任一氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的VL；

(4)人源化抗体，其包含含有图1所示的任一氨基酸序列的VH和含有图2所示的任一氨基酸序列的VL。

在图1所示的VH的氨基酸序列中，优选6E4HV0和HV12。此外，在图2所示的VL的氨基酸序列中，优选6E4LV0、LV2a和LV4。

因此，作为包含含有图1所示的任一氨基酸序列的VH和含有图2所示的任一氨基酸序列的VL的人源化抗体，优选包含含有图1所示的6E4HV0和HV12中任一氨基酸序列的VH和含有图2所示的6E4LV0、LV2a和LV4中任一氨基酸序列的VL的人源化抗体。

具体的，实例包括：人源化抗体，其包含含有SEQ ID NO：12或15所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO：14、16和17所示的任一氨基酸序列的VL。

作为图1所示的VH的氨基酸序列与图2所示的VL的氨基酸序列的组合，优选HV0与LV0、HV0与LV2a、HV0与LV4和HV12与LV4的组合。

因此，作为本发明的抗体，优选以下人源化抗体(1)至(4)：

(1)人源化抗体(HV0LV0)，其包含含有图1中的HV0所示的氨基酸序列的VH和含有图2中的LV0所示的氨基酸序列的VL；

(2)人源化抗体(HV0LV2a)，其包含含有图1中的HV0所示的氨基酸序列的VH和含有图2中的LV2a所示的氨基酸序列的VL；

(3)人源化抗体(HV0LV4)，其包含含有图1中的HV0所示的氨基酸序列的VH和含有图2中的LV4所示的氨基酸序列的VL；

(4)人源化抗体(HV12LV4)，其包含含有图1中的HV12所示的氨基酸序列的VH和含有图2中的LV4所示的氨基酸序列的VL。

以上抗体的具体实例包括VH和VL所含有的氨基酸序列组合为SEQ ID NO：12与14、SEQ ID NO：12与16、SEQ ID NO：12与17和SEQID NO：15与17的人源化抗体。

此外，本发明的人源化抗体的实例包括：在Aβ寡聚体结合方面与以上人源化抗体竞争的人源化抗体，和所结合的表位与以上人源化抗体所识别的表位相同的人源化抗体。

在本发明中，人抗体最初是天然存在于人体内的抗体，并且其还包括从人抗体噬菌体文库、产人抗体的转基因动物等中获得的抗体，它们是基于在基因工程、细胞工程和发育工程技术的近期进展而制备的。

存在于人体内的抗体可以，例如，通过以下方法制备：分离人外周血淋巴细胞，通过用EB病毒感染等而使其永生化，并然后将其克隆，从而获得能够产生抗体的淋巴细胞，培养由此获得的淋巴细胞，并且从培养上清液中纯化抗体。

人抗体噬菌体文库是通过将从人B细胞制备的编码抗体的基因插入噬菌体基因而将诸如Fab和scFV的抗体片段表达在噬菌体表面的文库。

用与抗原固定化基质结合的活性作为指标，可以从该文库中回收表达具有所需的细胞表面上抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。通过基因工程技术可以进一步将该抗体片段转化成含有两个完整H链和两个完整L链的人抗体分子。

产人抗体的转基因动物是人抗体基因被整合入细胞的的动物。具体地，可以如下制备产人抗体的转基因动物：将编码人抗体的基因引入小鼠ES细胞，将该ES细胞移植到其它小鼠的早期胚胎中，并且然后使其发育成为完整动物。

可以如下制备得自产人抗体的转基因非人动物的人源抗体：通过通常在非人动物中实行的杂交瘤细胞制备方法获得产人抗体的杂交瘤，培养所获得的杂交瘤，并且在培养上清液中产生和蓄积人抗体。

本发明的抗体或抗体片段还包括在构成以上抗体或抗体片段的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸、并且活性与以上抗体或抗体片段相近的抗体或其抗体片段。

缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸残基的数量是一个或者多个，并且没有特殊限定，但是其在用已知方法可以实现的缺失、取代或添加的范围内，所述已知方法如Molecular Cloning，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，John Willy & Sons(1987-1997)；Nucleic Acids Research，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)，Nucleic Acids Research，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中所述的位点定向诱变。例如，该数量为1至数十，优选为1至20，更优选为1至10，并且最优选为1至5。

在以上抗体的氨基酸序列中缺失、取代、插入、添加一个或多个氨基酸残基的意思如下，即，其意思是抗体的的一个或多个氨基酸序列在单一序列中的任何位置处存在一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同时发生，并且被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然型或非天然型。

天然型氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。

可以互相取代的氨基酸的优选实例在下面示出。同一组中的氨基酸可以互相取代：

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3二氨基丙酸

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸

F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、

G组：苯丙氨酸、酪氨酸

本发明的抗体片段包括Fab、F(ab’)₂、Fab、scFv、双价抗体、dsFv、含有CDR的肽，等等。

Fab是分子量为约50,000且具有抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶——木瓜蛋白酶(在H链的第224位氨基酸残基处切割)处理IgG抗体分子而获得的片段中，H链N端侧的约一半部分与整个L链通过二硫键结合在一起。

可以通过用蛋白酶、木瓜蛋白酶处理特异性识别Aβ寡聚体并与其胞外结构域结合的单克隆抗体而获得本发明的Fab。此外，也可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入原核生物表达载体或真核生物表达载体，并且将该载体引入原核生物或真核生物，从而表达Fab，来制备Fab。

F(ab’)₂是具有约100,000的分子量和抗原结合活性、并且含有两个Fab区的抗体片段，其中两个Fab片段在铰链部位结合，其是通过用酶——胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下部而获得的。

可以通过用蛋白酶——胃蛋白酶处理特异性识别Aβ寡聚体并与其胞外结构域结合的单克隆抗体而获得本发明的F(ab’)₂。此外，可以通过用硫醚键或二硫键结合以下所述的Fab’而制备F(ab’)₂。

Fab’是分子量为约50,000并且具有抗原结合活性的抗体片段，其是通过切割上述F(ab’)₂的铰链区的二硫键而获得的。

可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理特异性识别Aβ寡聚体并与其胞外结构域结合的F(ab’)₂，获得本发明的Fab’。

此外，可以如下制备Fab’：将编码抗体的Fab’片段的DNA插入原核生物表达载体或真核生物表达载体，并且将该载体引入原核生物或真核生物，从而表达Fab’。

scFv是VH-P-VL或者VL-P-VH多肽并且是具有抗原结合活性的抗体片段，其中利用适当的肽接头(以下称为“P”)连接VH链和VL链。

可以如下制备本发明的scFv：获得特异性识别Aβ寡聚体并与其胞外结构域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入原核生物表达载体或真核生物表达载体，并且将该表达载体引入原核生物或真核生物，从而表达scFv。

双价抗体是将scFv二聚化的抗体片段，并且其具有二价抗原结合活性。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同的或不同的。

可以如下制备本发明的双价抗体：获得特异性识别Aβ寡聚体并与其胞外结构域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA使得P的氨基酸序列长度是8个残基以下，将该DNA插入原核生物表达载体或真核生物表达载体，并且然后将该表达载体引入原核生物或真核生物，从而表达双价抗体。

通过将VH和VL各有一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽通过半胱氨酸之间的二硫键结合而获得dsFv。可以按照Reiter等[Protein Engineering，7，697(1994)]所示方法，基于抗体的三维结构预测选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。

可以如下制备本发明的dsFv：获得特异性识别Aβ寡聚体并与其胞外结构域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入原核生物表达载体或真核生物表达载体，并且然后将该表达载体引入原核生物或真核生物，从而表达dsFv。

通过包含VH和VL的CDR的至少一个区域以上，构建含有CDR的肽。通过将CDR直接连接或通过适当的肽接头连接，可以制备含有多个CDR的肽。

可以如下制备本发明的含有CDR的肽：构建特异性识别本发明Aβ寡聚体的人抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将该DNA插入原核生物表达载体或真核生物表达载体，并且然后将该表达载体引入原核生物或真核生物，从而表达该肽。也可以通过诸如Fmoc方法和tBoc方法的化学合成方法制备含有CDR的肽。

本发明的抗体包括抗体衍生物，其中本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体或其抗体片段与放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质、治疗抗体等以化学方式或基因方式结合。

可以如下制备抗体衍生物：将放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质、治疗抗体等与抗Aβ寡聚体人源化抗体或其抗体片段的H链和L链的N端侧或C端侧、抗体或其抗体片段的适当的取代基或侧链、抗体或其抗体片段的糖链等化学结合[抗体工学入门，地人书馆(1994)]。

此外，可以如下用基因方式制备本发明的抗体衍生物：将编码本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体或其抗体片段的DNA与编码待结合的蛋白质的其它DNA或者编码治疗抗体的DNA连接，将该DNA插入表达载体，并且将该表达载体引入宿主细胞。

在以上抗体衍生物被分别用作检测方法、定量方法或诊断方法的检测剂、定量测定剂或诊断剂的情况下，本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体或其抗体片段所结合的药剂的实例包括通常用于免疫检测或测定方法的标记物。

该标记物包括：诸如碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶的酶，诸如吖啶酯和洛粉碱的发光物质，诸如荧光素异硫氰酸酯(FITC)和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)的荧光物质。

以下描述制备该抗体的方法。

1.抗Aβ寡聚体单克隆抗体的制备

在本发明中，可以用以下方法制备抗Aβ寡聚体单克隆抗体。

(1)抗原的制备

制备作为抗原的Aβ寡聚体的方法如下：将合成的Aβ1-42(PeptideInstitute，Inc.大阪)溶解于去离子蒸馏水或10mmol/L的磷酸盐缓冲液中，并且在37℃温育18小时，用4至12％的SDS-PAGE分离该肽，用CBB染色使所产生的物质可视化，然后仅收集没有被Aβ1-42单体污染的Aβ1-42四聚体，从而可以制备Aβ1-42寡聚体。

可以如下制备含有多个寡聚体的Aβ1-40寡聚体：用常规方法化学结合6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)(SIGMA)与人工合成的Aβ肽的N端，然后进行合成的Aβ1-40(Peptide Institute，Inc.大阪)的聚合反应。

(2)动物的免疫

首先，用弗氏完全佐剂将2.5μg的Aβ1-42四聚体或Aβ1-40寡聚体乳化，然后在Balb-c小鼠的足垫上免疫接种该抗原。接着，进行另外6次免疫接种。可以使用已知方法进行产抗体细胞与骨髓瘤细胞之间的融合，如使用Kohler和Milstein等(Kohler.G和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)的方法等。具体地，从已经免疫接种抗原的小鼠的腹股沟淋巴结中获得产抗体的免疫细胞。

通过皮下、静脉或腹腔注射向动物施用抗原以及适当的佐剂，从而进行免疫，适当的佐剂如弗氏完全佐剂和氢氧化铝凝胶与百日咳疫苗的组合。

当用部分肽作为抗原时，制备与诸如BSA(牛血清白蛋白)和KLH(钥孔血蓝蛋白)的载体蛋白的结合物，将该结合物用作抗原。

用抗原免疫的动物可以是任何动物，只要可以制备杂交瘤即可，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、兔等。此外，本发明的抗体包括由杂交瘤产生的抗体，所述杂交瘤细胞是通过将骨髓瘤细胞与从体外免疫后的动物取得的具有产抗体活性的细胞融合而获得的。

(3)骨髓瘤细胞的制备

用源自小鼠的确立细胞株作为杂交瘤细胞。实例包括8-氮杂鸟嘌呤耐受性小鼠的骨髓瘤细胞株(源自BALB/c)P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology，18，1(1978)]、P3-NSl/l-Ag41(NS-1)[European J.Immunology，6，511(1976)]、SP2/0-Agl4(SP-2)[Nature，276，269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology，123，1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature，256，495(1975)]等。

在常规培养基(含有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPMI1640培养基)中将该骨髓瘤细胞继代培养。在细胞融合3或4天前，将细胞转移入常规培养基，从而确保融合当天的细胞数为2×10⁷以上。

(4)细胞融合与产单克隆抗体的杂交瘤的制备

可以用聚乙二醇1500将步骤(2)中所获得的用于融合的产抗体细胞和步骤(3)中所获得的骨髓瘤细胞融合，从而制备杂交瘤。

在培养后，将部分培养上清液取样并进行杂交瘤筛选方法，如斑点印迹和结合分析，从而鉴定产生如下文所述的与Aβ寡聚体反应且不与Aβ单体反应的抗体的细胞群。然后，用有限稀释法[第一轮中使用HT培养基(没有氨基喋呤的HAT培养基)，第二轮中使用常规培养基]克隆两次，并且选择稳定显示出高抗体效价的杂交瘤作为产单克隆抗体的杂交瘤。

(5)纯化单克隆抗体的制备

通过腹腔注射向8至10周龄的小鼠或裸鼠施用步骤(4)中所获得的产单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述小鼠或裸鼠用降植烷预处理(经腹腔施用0.5mL的2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)，随后喂养2周)。

杂交瘤在10至21天内形成腹水瘤，从小鼠中收集腹水液，离心除去固体，用40-50％硫酸铵进行盐析，然后用辛酸沉淀，过DEAE-琼脂糖凝胶柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱，从而收集IgG或IgM级分作为纯化单克隆抗体。

(6)单克隆抗体的选择

作为筛选抗体的方法，可以示例的是利用抗体与Aβ寡聚体的结合活性作为指标选择抗体的方法。

本发明的抗体对抗原(Aβ寡聚体)的结合活性可以用诸如以下方法中的至少一种方法进行分析：吸光度测定法、酶联免疫吸附分析法(斑点印迹法，ELISA)、酶免疫分析法(ELA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫荧光法和使用表面等离子体共振方法(SPR法)的Biacore(BiacoreLife Science)。

具体地，可以用斑点印迹法测定抗Aβ寡聚体单克隆抗体与Aβ寡聚体的结合，其中将2.5μL的Aβ1-42(2.5μg/点)预温育18小时，接着将其固定在硝酸纤维素膜上。在用含有5％低脂乳、1％BSA和0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液将膜上的非特异性结合位点封闭之后，用培养上清液温育该膜，并从而使用增强化学发光(ECL)试剂盒和LAS3000mini(Fujitsu，东京，日本)，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠F(ab’)₂(1∶3000；Amersham)检测培养上清液中结合抗体的Aβ寡聚体(WO 2009/051220)。

如下进行ELISA：将抗体固定在板上，向板上加入该抗体的抗原，并且加入含有所需抗体的样品，例如产该抗体的细胞的培养上清液和纯化抗体。接着，向其中加入识别一抗并且通过向其中加入诸如碱性磷酸酶的酶而添加标签的二抗，并且将该板温育。在清洗后，向板加入诸如对硝基苯磷酸盐的酶底物，并且测定吸光度从而评价目的样品的抗原结合能力。

另外，在本发明中，为了特异性检测Aβ寡聚体，而不检测Aβ单体，还可以使用采用化学发光的夹心酶联免疫吸附分析(化学发光ELISA)测定抗体的反应性(WO 2009/051220)。

另外，为了评价已经被施用到小鼠体内外周的单克隆抗体的效力，可以进行HPR标记的6E10(Senetek PLC，Napa，CA，美国)人特异性寡聚体ELISA，从而分析从本发明的被给药小鼠收集的血浆和器官的Aβ寡聚体(WO 2009/051220)。

此外，通过用含有大量Aβ寡聚体的淀粉样蛋白级分(Matsubara E等：Neurobiol Aging，2004)进行免疫沉淀实验(Ghiso J等：Biochem J，1993)，有可能测定本发明的抗Aβ寡聚体的人源化抗体是否可以与AD脑内的Aβ寡聚体结合(WO 2009/051220)。

(7)抗Aβ寡聚体抗体活性的评价

在本发明中，通过用于硫磺素(ThT)分析的Aβ温育、Aβ诱导的神经毒性分析和对具有超滤或者凝胶过滤分级的多种分子尺寸的Aβ寡聚体的反应性测定，可以确定抗Aβ寡聚体抗体与Aβ寡聚体特异性结合，并且具有细胞保护活性，Yamamoto N等：J.Biol.Chem.，282：2646-2655，2007或者WO 2009/051220中公开了全部所述方法。

此外，可以利用ThT分析和电子显微镜分析来测定抑制Aβ淀粉样纤维形成的活性。

在本发明中，通过利用抗Aβ寡聚体人源化抗体检测免疫沉淀中SDS稳定的4-、5-、8-、12-聚体的存在，可以测定两抗体在AD脑内捕获Aβ寡聚体的能力。

此外，在本发明中，在APPswe转基因小鼠(Tg2576)中测定预防AD样病变的能力的方法的实例包括如下方法：将本发明的人源化抗体施用给小鼠，从而检测是否可以预防AD样病变，如记忆障碍、神经炎性斑病变、突触功能障碍和Aβ蓄积(WO 2009/051220)。

2.重组抗体的制备

制备稳定表达重组抗体的转化体和该重组抗体的方法可以如下进行。

(1)表达重组抗体的载体的构建

表达重组抗体的载体是动物细胞表达载体，其中已经被插入了编码人抗体的CH和CL的DNA，并且其是通过将编码人抗体的CH和CL的各个DNA克隆到动物细胞表达载体中而构建的。

人抗体的C区可以是任何人抗体的CH和CL。实例包括属于γ1亚类的CH、属于κ类的CL等。可以使用含有外显子和内含子的染色体DNA、或cDNA作为编码人抗体的CH和CL的DNA。

可以使用任何表达载体作为动物细胞表达载体，只要编码人抗体C区的基因可以被插入其中并在其中表达即可。实例包括pAGE107[Cytotechnol.，3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene，27，223(1984)]、pKCR[Proc.Nail.Acad.Set USA，78，1527(1981)]、pSGlbd2-4[Cytotechnol.，4，173(1990)]、pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.，13，79(1993)]等。

用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40早期启动子[J.Biochem.，101，1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]、免疫球蛋白H链启动子[Cell，41，479(1985)]和增强子[Cell，33，717(1983)]等。

表达重组抗体的载体可以是编码抗体H链的基因和编码抗体L链的基因存在于不同载体上的类型或者两个基因都存在于同一载体上的类型(串联型)。在构建表达重组抗体的载体的容易性、引入动物细胞的容易性和动物细胞中抗体H和L链的表达量之间的平衡方面，更优选表达重组抗体的串联型载体[J.Immunol.Methods，167，271(1994)]。

表达重组抗体的串联型载体的实例包括pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18[Hybridoma，17，559(1998)]等。

(2)编码非人动物源抗体V区的cDNA的制备和氨基酸序列分析

从产生非人动物源抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA以合成cDNA。将所合成的cDNA克隆入载体，并使用DNA测序仪进行序列分析，从而测定编码VH和VL的核苷酸序列。

可以如下证实所获得的cDNA是否编码含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列：从所测定的核苷酸序列估计VH和VL的全长氨基酸序列，并将它们与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Healthand Human Services(1991)]进行比较。

通过比较含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991)]，可以推断分泌信号序列和N端氨基酸序列的长度，并且还可以知道其所属亚组。

此外，通过比较所获得的氨基酸序列与已知抗体VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Healthand Human Services(1991)]，可以找出VH和VL的各个CDR的氨基酸序列。

(3)表达人嵌合抗体的载体的构建

将编码非人动物抗体的VH和VL的cDNA克隆到以上(1)中所述表达重组抗体的载体中编码人抗体CH或CL的基因的上游，从而构建表达人嵌合抗体的载体。

例如，设计和构建编码VH和VL的cDNA，使其含有编码适当的氨基酸并具有适当的限制性酶识别位点的接头序列，使得可以在非人动物抗体来源的VH或VL的cDNA的3’-末端与人抗体来源的CH或CL的5’-末端之间产生连接。

将所产生的编码VH和VL的每个cDNA进行克隆，使得每个cDNA在以上(1)中所述表达人源化抗体的载体中编码人抗体CH或CL的基因的上游以适当的形式表达，从而构建表达人嵌合抗体的载体。

此外，使用在两端具有合适的限制性酶识别序列的合成DNA，用PCR方法扩增编码非人动物的VH或VL的cDNA，并且将每个cDNA克隆到以上(1)中所述的表达重组抗体的载体中。

(4)编码人源化抗体V区的cDNA的构建

可以如下获得编码人源化抗体的VH或VL的cDNA。

首先，选择人抗体VH或VL中的骨架区(以下称为“FR”)的氨基酸序列，所述人抗体中被移植了源自非人动物抗体的抗体VH或VL中CDR的氨基酸序列。可以使用人抗体的VH或VL中任何FR的氨基酸序列，只要其源自人即可。

实例包括诸如蛋白质数据库的数据库中所登记的人抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列，和人抗体的VH或VL中FR亚组的共同氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Healthand Human Services(1991)]，等等。

为了抑制抗体的结合活性，选择与源抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列的同源性高(至少60％以上)的氨基酸序列。

然后，分别将源抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列移植到所选择的人抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列上，从而设计人源化抗体的VH或VL的各氨基酸序列。

通过考虑在抗体基因的核苷酸序列中所发现的密码子使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health andHuman Services(1991)]，将所设计的氨基酸序列转化为DNA序列，并且设计人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA编码序列。

(5)人源化抗体V区的氨基酸序列的修饰

已知的是，当通过仅仅将非人动物源抗体的VH和VL的CDR简单移植到人抗体的VH和VL的FR中而产生人源化抗体时，人源化抗体的抗原结合活性低于源自非人动物的源抗体[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。

对于人源化抗体，在人抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列中，鉴别与结合抗原直接相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、以及维持抗体的三维结构并且与结合抗原间接相关的氨基酸残基，并将其改变为在非人的源抗体中所发现的氨基酸残基，从而增强已经降低的抗原结合活性。

为了鉴别FR中与抗原结合活性相关的氨基酸残基，构建抗体的三维结构，用于X射线晶体分析[J.Mol.Biol，112，535(1977)]、计算机建模[Protein Engineering，7，1501(1994)]等。

此外，通过重复不同的尝试以产生每个抗体的几种修饰并且检测修饰抗体与其抗原结合活性之间的关系，可以鉴别具有合适的抗原结合活性的修饰的人源化抗体。

如(4)中所述，使用用于修饰的各种合成DNA进行PCR，可以实现对人抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列的修饰。按照(2)中所述的方法测定PCR扩增产物的核苷酸序列，从而确认已经发生预期的修饰。

(6)表达人源化抗体的载体的构建

将编码所构建的重组抗体的VH或VL的每个cDNA如(1)中所述克隆到表达重组抗体的载体中编码人抗体的CH或CL的每个基因的上游中，可以构建表达人源化抗体的载体。

例如，在(4)和(5)中用于构建人源化抗体的VH或VL的合成DNA之中，将合适的限制性酶识别序列引入位于两端的合成DNA的5’末端，使得能够将该VH或VL克隆到以上(1)中所述人源化抗体表达载体中编码人抗体的CH或CL的每个基因的上游，从而将其以合适的形式进行表达。

(7)重组抗体的瞬时表达

为了有效评价所制备的各种人源化抗体的抗原结合活性，可以用如(3)和(6)中所述的表达重组抗体的载体或其经修饰的表达载体瞬时表达重组抗体。

可以用任何细胞作为用于引入表达载体的宿主细胞，只要该宿主细胞可以表达重组抗体即可。通常使用COS-7细胞(ATCC CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.，CRC Press，283(1991)]。将表达载体引入COS-7细胞的方法的实例包括DEAE-葡聚糖方法[Methods in NucleicAcids Res.，CRC Press，283(1991)]、脂质转染法[Proc.Natl Acad Sci.USA，84，7413(1987)]、等等。

(8)稳定表达重组抗体的转化体的建立和重组抗体的制备

通过将(3)和(6)中所述的表达重组抗体的载体引入合适的宿主细胞，可以获得稳定表达重组抗体的转化体。

将表达载体引入宿主细胞的方法的实例包括电穿孔法[日本特开平2-257891号公报、Cytotechnology，3，133(1990)]等。

可以用任何细胞作为被引入表达重组抗体的载体的宿主细胞，只要其是可以表达重组抗体的宿主细胞即可。实例包括CHO-K1(ATCCCCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies，目录号11619)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(也称为YB2/0；ATCC CRL1662)、鼠骨髓瘤细胞NS0、鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4细胞(ATCC CRL1581)、鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、缺失二氢叶酸还原酶基因(以下称为“dhfr“)的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77，4216(1980)]、凝集素抗性株Lecl3[Somatic Cell and Molecular genetics，12，55(1986)]、6-岩藻糖基转移酶基因缺失的CHO细胞(WO 2005/35586，WO 02/31140)等。

此外，还可以使用以下蛋白质的活性被降低或消除的宿主细胞：诸如与胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶的蛋白质；诸如与糖链修饰有关的酶的蛋白质，所述糖链中岩藻糖的1-位与复合型N-糖苷-连接型糖链中的N-乙酰葡萄糖胺的6-位在还原末端通过α键结合；或者与胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体转运有关的蛋白质，所述宿主细胞如WO05/35586、WO02/31140中所述的缺失α1，6-岩藻糖基转移酶基因的CHO细胞。

在引入表达载体后，通过在含有诸如G418硫酸盐(以下也称为“G418”)的试剂的动物细胞培养基中培养，选择稳定表达重组抗体的转化体(日本国特开平2-257891号公报)。

动物细胞培养基的实例包括RPMI1640培养基(Invitrogen制造)、GIT培养基(日本制药社制造)、EX-CELL301培养基(JRH制造)、IMDM培养基(Invitrogen制造)、杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen制造)、它们的含有诸如FBS的各种添加剂的衍生培养基。

通过在培养基中培养所选择的转化体，可以在培养上清液中产生和蓄积重组抗体。可以用ELISA等测定培养上清液中的重组抗体的表达量和抗原结合活性。

此外，在转化体中，可以按照日本国特开平2-257891号公报所公开的方法，用DHFR扩增系统等增加重组抗体的表达量。

可以用蛋白A柱从转化体的培养上清液中纯化重组抗体[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，Academic Press(1996)，Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。

例如，可以通过凝胶过滤、离子交换层析、超滤等的组合来纯化重组抗体。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下称为“SDS-PAGE”)[Nature，227，680(1970)]、Western印迹[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，Academic Press(1996)，Antibodies-A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)]等测定被纯化的重组抗体的H链或L链、或者整个抗体分子的分子量。

3.控制抗体的效应子活性的方法

作为控制本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体的效应子活性的方法，已知有：控制岩藻糖(以下也称为“核心岩藻糖”)的量的方法，所述岩藻糖通过α-1，6键与位于复合型N-连接糖链的还原末端的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合，所述N-连接糖链与抗体Fc区第297位的天冬酰胺(Asn)结合(WO2005/035586、WO2002/31140和WO00/61739)；通过修饰抗体Fc区的氨基酸基团而控制单克隆抗体的效应子活性的方法；改造抗体的亚类的方法，等等。可以用这些方法中的任何方法控制本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体的效应子活性。

“效应子活性”指由抗体Fc区所诱导的抗体依赖的活性。作为效应子活性，已知有：抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC活性)，补体依赖性细胞毒作用(CDC活性)，由诸如巨噬细胞和树突状细胞的吞噬细胞介导的抗体依赖性吞噬作用(ADP活性)，等等。

通过控制抗体的Fc的复合型N-连接糖链的核心岩藻糖的含量，可以增强或降低抗体的效应子活性。作为降低与抗体的Fc所结合的复合型N-连接糖链结合的岩藻糖含量的方法，可以通过用编码α1，6-岩藻糖基转移酶的基因缺失的CHO细胞表达抗体，而获得未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高ADCC活性。

另一方面，根据增加与抗体的Fc所结合的复合型N-连接糖链结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用引入了编码α1，6-岩藻糖基转移酶的基因的宿主细胞来表达抗体，而获得结合了岩藻糖的抗体。结合了岩藻糖的抗体的ADCC活性低于未结合岩藻糖的抗体。

另外，通过修饰抗体Fc区的氨基酸残基，可以增强或降低ADCC活性或CDC活性。例如，通过使用US2007/0148165中所述的Fc区的氨基酸序列，可以增强抗体的CDC活性。此外，通过如美国专利Nos.6,737,056或7,297,775或7,317,091所述修饰氨基酸，可以增强或降低ADCC活性或CDC活性。

此外，已知在人IgG亚类中，IgG2和IgG4亚类的效应子活性低于IgG1和IgG3亚类。因此，通过用效应子活性较低的抗体亚类的Fc区替换Fc区，可以制备效应子活性较低的抗体。

对于IgG2和IgG4亚类抗体的稳定性，可以使用WO2006/075668、WO2006/035586等所述的方法制备效应子活性受控的稳定的IgG2和IgG4抗体。

此外，通过对一种抗体使用以上所述方法的组合，可以获得抗体的效应子活性受控的抗体。

4.使用本发明的抗Aβ寡聚体抗体的治疗方法

已经表明，伴随AD的记忆衰退与可溶性Aβ寡聚体引起的突触功能障碍有关[Klein WL.，2001.Trends Neurosci；Selkoe DJ.2002，Science]。因此，Aβ寡聚体的过度蓄积和沉积可能引发导致AD的复杂的下游级联。

在本发明中，治疗并不必须对由于病症或疾病而显示出症状的器官和组织具有彻底的治疗作用或预防作用，而可以提供部分所述效果。

本发明中AD的治疗是指改善可能由于AD而发生的至少一种症状。实例包括：改善或抑制认知功能障碍，改善或抑制神经炎性斑形成，改善或抑制突触功能障碍，和降低或抑制脑组织、血液等中的Aβ蓄积。

本文的认知功能障碍包括，例如，长期/短期记忆受损、物体识别记忆受损、空间记忆受损、和情绪记忆受损。

此外，作为使用本发明的抗Aβ寡聚体人源化抗体的治疗方法，实例包括：抑制认知功能障碍的方法，抑制AD的方法，抑制AD进展的方法，抑制神经炎性斑形成的方法，抑制Aβ蓄积的方法，中和(抑制)神经毒活性的方法，抑制Aβ淀粉样纤维形成的方法，和中和(抑制)突触毒活性的方法。

此外，其它形式的实例包括：预防和治疗认知功能障碍至少其一的方法，与预防和治疗AD至少其一的方法。

含有本发明的单克隆抗体或抗体片段或其衍生物的治疗剂可以仅仅作为活性成分的抗体或者抗体片段或者其衍生物组成，并优选通过将其与一种或多种药学上可接受的载体混合，提供成用药学技术领域公知的适当方法所制备的药物制剂。

给药途径的实例包括：口服给药和肠胃外给药，如口腔，气管、直肠、皮下、肌内或静脉内给药。

剂型的实例包括喷雾剂、胶囊、片剂、粉剂、颗粒、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、胶带等。

适合口服给药的药物制剂包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉剂、颗粒等。

可以使用以下物质作为添加剂制备诸如乳剂和糖浆的液体制剂：水；糖类，如蔗糖、山梨醇和果糖；二醇类，如聚乙二醇和丙二醇；油类，如芝麻油、橄榄油和大豆油；防腐剂，如对羟基苯甲酸酯；香料，如草莓香精和胡椒薄荷；等等。

可以用以下物质作为添加剂制备胶囊、片剂、粉剂、颗粒等：赋形剂，如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；崩解剂，如淀粉和藻酸钠；润滑剂，如硬脂酸镁和滑石粉；粘合剂，如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶；表面活性剂，如脂肪酸酯；增塑剂，如甘油；等等。

适合于肠胃外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂等。

可以用诸如盐溶液、葡萄糖溶液和二者的混合物的载体制备注射剂。

可以用诸如可可脂、氢化脂肪或羧酸的载体制备栓剂。

可以使用本发明的抗体或抗体片段本身，或者将其与不刺激患者的口腔或气道粘膜并能够通过将化合物分散成为细颗粒而促进该化合物吸收的载体一起使用，制备喷雾剂。

该载体包括乳糖、甘油等。可以制备诸如气雾剂和干粉的药物制剂。

此外，也可以将作为口服制剂的添加剂示例的组分添加到肠胃外制剂。

实施例1

抗Aβ寡聚体人源化抗体的制备

(1)抗Aβ寡聚体人源化抗体6E4的VH和VL的氨基酸序列的设计

如下设计抗Aβ寡聚体人源化抗体6E4的VH的氨基酸序列。

首先，基于Kabat等人的报道[Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991)]，将氨基酸序列的(SEQ ID NO：8)的CDR序列确定为在参考例中制备的抗Aβ寡聚体小鼠单克隆抗体6E4抗体的VH。因此，将该VH的CDR1至3的氨基酸序列设定为SEQ ID NO：1至3所示的序列。

然后，如下设计抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体的氨基酸序列。为了移植VH的CDR 1至3的氨基酸序列(SEQ ID NO：1至3)，选择人源化抗体中VH的FR的氨基酸序列。

Kabat等人已经基于氨基酸序列的同源性将各种已知人抗体的VH分为亚组(HSG I至III)，并且已经报道了各个亚组的共有序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health andHuman Services(1991)]。

因此，研究了人抗体的I至III亚组VH中共有的FR的氨基酸序列与6E4VH的FR的氨基酸序列之间的同源性。同源性研究的结果是，HSGI、HSGII和HSGIII的同源性分别是75.9％、54.0％和57.5％。因此，6E4VH的FR的氨基酸序列与I亚组具有最高的同源性。

基于以上结果，将6E4VH的每个CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：l至3)移植到人抗体的I亚组VH中共有的FR的氨基酸序列中的适当位置。由此设计了抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体的VH的氨基酸序列6E4HV0(SEQ ID NO：12)。

接着，以与H链相同的方式，将VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)的CDR 1至3的序列分别确定为SEQ ID NO：4至6的氨基酸序列，并且如下设计抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体的VL的氨基酸序列。

为了分别移植6E4抗体的VL的CDR 1至3的氨基酸序列(SEQ IDNO：4至6)，选择人抗体中VL的FR的氨基酸序列。

Kabat等人已经基于氨基酸序列的同源性将各种已知人抗体的VL分为亚组(HSG I至IV)，并且已经报道了各个亚组的共有[Sequencesof Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health and HumanServices(1991)]。

因此，研究了人抗体的I至IV亚组VL中共有的FR的氨基酸序列与6E4VL的FR的氨基酸序列之间的同源性。同源性研究的结果是，HSGI、HSGII、HSGIII和HSGIV的同源性分别是67.5％、86.3％、68.8％和76.3％。因此，6E4VL的FR的氨基酸序列与II亚组具有最高的同源性。

基于以上结果，将6E4VL的每个CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：4至6)移植在人抗体的II亚组VL中共有的FR的氨基酸序列中的适当位置。

但是，6E4VL的氨基酸序列的第110位Leu不是在Kabat等人所示例的人抗体的FR的氨基酸序列中相应位点最经常使用的氨基酸残基，而是以相对高频率使用的氨基酸残基。

因此，采用在以上6E4的氨基酸序列中所见到的氨基酸残基。如上所述，设计抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体的VL的氨基酸序列(SEQID NO：14)，6E4LV0。

所设计的抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体中VH的氨基酸序列6E4HV0和VL的氨基酸序列6E4LV0是通过仅将抗Aβ寡聚体小鼠单克隆抗体6E4的CDR的氨基酸序列移植到所选择的人抗体的FR的氨基酸序列上而构建的序列。

但是，一般在人源化抗体的构建中，在将小鼠抗体的CDR的氨基酸序列简单移植到人抗体的FR的很多情况下，结合活性降低。

因此，为了防止结合活性的降低，在移植CDR的氨基酸序列时，同时对位于人抗体的FR中并且与小鼠抗体的相应氨基酸残基不同的氨基酸残基之中被认为影响结合活性的氨基酸残基进行修饰。

因此，在本实施例中，以如下方式鉴别被认为影响结合活性的FR的氨基酸残基。

首先，用计算机建模技术构建抗体V区(以下称为HV0LV0)的三维结构，所述抗体V区含有如上所述而设计的抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体中VH的氨基酸序列6E4HV0和VL氨基酸序列6E4LV0。

使用Discovery Studio(Accelrys，Inc.)，按照其所附的说明进行三维结构坐标的构建和三维结构的展示。也用同样方法构建抗Aβ寡聚体小鼠单克隆抗体6E4中V区的三维结构的计算机模型。

此外，在HV0LV0的VH和VL的FR的氨基酸序列之中选择与6E4中不同的氨基酸残基，制备对6E4的氨基酸残基具有修饰的氨基酸序列，并且用同样方法构建其三维结构模型。

比较6E4、HV0LV0和修饰形式中所制作的这些V区的三维结构，鉴别被认为影响抗体的结合活性的氨基酸残基。

因此，在HV0LV0中的FR的氨基酸残基之中，作为被认为改变抗原结合位点的三维结构且影响抗体的结合活性的氨基酸残基，分别选择6E4HV0中SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中第12位的Lys、第20位的Val、第38位的Arg、第39位的Gln、第45位的Leu、第48位的Met、第67位的Arg、第68位的Val、第70位的Ile、第72位的Ala、第74位的Thr和第97位的Ala，以及6E4LV0的第2位的Ile、第15位的Pro、第50位的Gln和第92位的Tyr。

在这些被选择的氨基酸残基之中，将至少一个氨基酸序列修饰为存在于6E4的相同位点的氨基酸残基，从而设计含有包含各种修饰的氨基酸序列的人源化抗体的VH和VL。

具体地，在VH中，引入以下氨基酸修饰中的至少一种修饰：在SEQIDNO：12所示的氨基酸序列中以Val取代第12位的Lys、以Leu取代第20位的Val、以Lys取代第38位的Arg、以Leu取代第39位的Gln、以Phe取代第45位的Leu、以Ile取代第48位的Met、以Lys取代第67位的Arg、以Ala取代第68位的Val、以Leu取代第70位的Ile、以Val取代第72位的Ala、以Lys取代第74位的Thr、和以Thr取代第97位的Ala。

此外，在VL中，引入以下氨基酸修饰中的至少一种修饰：在SEQID NO：14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile、以Leu取代第15位的Pro、以Lys取代第50位的Gln和以Phe取代第92位的Tyr。

作为HV0LV0的FR中至少一个氨基酸残基被修饰的抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体的抗体V区，设计了HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV2b、HV0LV2c、HV0LV2d、HV0LV3、HV0LV4、HV2LV0、HV2LV2a、HV2LV2b、HV2LV2c、HV2LV2d、HV2LV3、HV2LV4、HV3LV0、HV3LV2a、HV3LV2b、HV3LV2c、HV3LV2d、HV3LV3、HV3LV4、HV4LV0、HV4LV2a、HV4LV2b、HV4LV2c、HV4LV2d、HV4LV3、HV4LV4、HV5LV0、HV5LV2a、HV5LV2b、HV5LV2c、HV5LV2d、HV5LV3、HV5LV4、HV7aLV0、HV7aLV2a、HV7aLV2b、HV7aLV2c、HV7aLV2d、HV7aLV3、HV7aLV4、HV7bLV0、HV7bLV2a、HV7bLV2b、HV7bLV2c、HV7bLV2d、HV7bLV3、HV7bLV4、HV9LV0、HV9LV2a、HV9LV2b、HV9LV2c、HV9LV2d、HV9LV3、HV9LV4、HV12LV0，HV12LV2a、HV12LV2b、HV12LV2c、HV12LV2d、HV12LV3和HV12LV4。

图1和图2分别显示了H链可变区HV2、HV3，HV4、HV5、HV7a、HV7b、HV9和HV12的氨基酸序列，以及L链可变区LV2a、LV2b、LV2c、LV2d、LV3和LV4的氨基酸序列。

(2)抗Aβ寡聚体人源化抗体的制备

利用在编码6E4VH和6E4VL的氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO：7至9)中所使用的密码子，设计编码抗Aβ寡聚体人源化抗体可变区的氨基酸序列的DNA。在氨基酸修饰中，用哺乳动物细胞中的常用密码子设计DNA。

SEQ ID NO：11和13分别显示了抗Aβ寡聚体6E4人源化抗体的6E4HV0和6E4LV0的氨基酸序列的DNA编码序列。此外，利用在6E4VH和6E4VL的氨基酸序列的编码DNA中所用的密码子设计具有氨基酸修饰的可变区。

利用这些氨基酸序列，构建人源化抗体的表达载体，并且表达人源化抗体。

(3)抗Aβ寡聚体人源化抗体的VH的编码cDNA的构建

用完全化学合成法，制备SEQ ID NO：12中所显示的、已经在以上(1)中设计的抗Aβ寡聚体人源化抗体中VH的氨基酸序列6E4HV0和图1所显示的在以上方法(2)中已经设计的HV12的编码cDNA。

(4)抗Aβ寡聚体人源化抗体的VL的编码cDNA的构建

用完全化学合成法，制备SEQ ID NO：14中所显示的、已经在以上(1)中设计的抗Aβ寡聚体人源化抗体中VL的氨基酸序列6E4LV0和图2所显示的在以上方法(2)中已经设计的LV2a和LV4的编码cDNA。

(5)抗Aβ寡聚体人源化抗体表达载体的构建

将以上(3)和(4)中所获得的编码6E4LV0或者HV12的cDNA和编码6E4LV0、LV2a和LV4中任一种的cDNA插入WO 97/10354所公开的人源化抗体表达载体pKANTEX93的适当位置中，从而构建各种抗Aβ寡聚体人源化抗体表达载体。

(6)使用动物细胞表达抗Aβ寡聚体人源化抗体

使用常规方法[Antibody Engineering，A Practical Guide，W.H.Freeman and Company(1992)]，用以上(5)中所获得的抗Aβ寡聚体人源化抗体表达载体来获得产生抗Aβ寡聚体人源化抗体(HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)的转化体，在动物细胞中执行抗Aβ寡聚体人源化抗体的表达。

作为动物细胞株，使用通过双敲除α1，6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)而得到的CHO/DG44细胞株(以下称为FUT8敲除的CHO细胞)。已知用该宿主细胞株所表达的抗体的复合型N-连接糖链的核心部分没有添加岩藻糖(WO 2002/31140)。

(7)纯化的抗Aβ寡聚体人源化抗体的制备

用常规培养方法培养本实施例的(6)中所获得的转化体，之后收集细胞悬液。然后，在3000rpm和4℃的条件下离心20分钟。在收集后，用孔径为0.22μm的Millex GV过滤器将培养上清液过滤灭菌。

将0.5ml Prosep vA High Capacity(Millipore Corporation制造)填充到直径为0.8cm的柱中，接着使5.0ml纯水和5.0ml PBS缓冲液(pH7.4)通过其中来平衡载体。

然后，在使培养上清液通过柱子之后，用5.0ml PBS缓冲液(pH7.4)清洗柱子。清洗后，以2.0ml 0.1mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)、2.0ml 0.1mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH3.5)和2.0ml 0.1mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)的顺序洗脱被载体吸附的抗体。

获得500μL、超过4个级分的洗脱液。之后，对由此获得的纯化级分进行SDS-PAGE分析，收集检测到目的蛋白的洗脱液级分，并且在4℃下用150mmol/L的NaCl和10mmol/L的柠檬酸钠溶液(pH 6.0)对其进行超过一昼夜的透析。

在透析之后，收集抗Aβ寡聚体人源化抗体溶液，并用孔径为0.22μm的Millex GV(Millipore Corporation)对其进行过滤灭菌。用吸光度测定仪(SHIMADZU UV-1700)测定其在280nm的吸光度(OD280nm)，从而计算各纯化的抗Aβ寡聚体人源化抗体的密度。

结果，产生四种类型的抗Aβ寡聚体人源化抗体，其包括：含有抗体的VH为6E4HV0和抗体的VL为6E4LV0的HV0LV0，含有抗体的VH为6E4HV0和抗体的VL为LV2a的HV0LV2a，含有抗体的VH为6E4HV0和抗体的VL为LV4的HV0LV4，和含有抗体的VH为HV12和抗体的VL为LV4的HV12LV4。

实施例2

抗原的制备

(1)Aβ寡聚体的制备

用六氟异丙醇将淀粉样β蛋白——人1-42肽(Peptide Institute，Inc.制造)溶解为1mmol/L。超声处理10分钟后，在室温下将所制备的溶液风干过夜。

之后，向其中加入4μL二甲亚砜，并进行3分钟的超声处理。向所制备的溶液中加入200μL醋酸溶液(pH4.5)，并将所产生的物质以静置方式在4℃下保持过夜，从而产生Aβ寡聚体。

(2)Aβ单体的制备

用0.1％的氨水将生物素-β-淀粉样蛋白——人1-40(AnaSpec，Inc.制造)溶解为250μmol/L。在将所制备的溶液进行超声处理5分钟后，在16,000rpm和4℃的条件下将所产生的物质离心60分钟。从而，通过收集上清液而制备Aβ单体。

实施例3

抗Aβ寡聚体人源化抗体的活性评价

(1)用Biacore评价抗Aβ寡聚体人源化抗体对Aβ寡聚体的结合活性

为了以化学动力学方式分析每个抗Aβ寡聚体人源化抗体(HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)对Aβ寡聚体的结合活性，使用表面等离子体共振方法(SPR方法)测定结合活性。

以下所有操作都使用Biocore T100(GE Healthcare Bio-sciences制造)进行。用胺偶联法将实施例2的(1)中所获得的Aβ寡聚体固定到CM5传感芯片(GE Healthcare Bio-sciences)上。

在固定了Aβ寡聚体的测定芯片上，依次注入通过二倍稀释法从30μg/mL逐级稀释而制备成8个浓度的样品(HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)，并且以从较低浓度开始的顺序基于多动力学自动程序进行测定。

使用仪器所附的分析软件Biacore T100评价软件(Biacore LifeScience制造)，用二价分析物(Bivalent Analyte)模型进行分析，从而计算每个抗体对Aβ寡聚体的结合速率常数ka和解离速率常数kd。

表1中分别显示了由此获得的每个抗体的结合速率常数ka1、解离速率常数kd1和解离常数KD(kd1/ka1)。

表1 抗Aβ寡聚体人源化抗体对Aβ寡聚体的结合活性

如表1所示，所有抗Aβ寡聚体人源化抗体(HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)都显示出亲和力从3×10⁷至4×10⁸mol/L的对Aβ寡聚体的结合能力。

(2)用Biacore评价抗Aβ寡聚体人源化抗体对Aβ单体的结合活性

为了分析各个抗Aβ寡聚体人源化抗体(HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)对Aβ单体的结合活性，用与本实施例的(1)相同的方法测定结合活性。此外，测定抗Aβ抗体6E10(CONVANCE制造)的结合活性作为对照抗体。

用生物素捕获方法将实施例(2)的(2)中所获得的Aβ单体固定到SA传感芯片上(GE Healthcare Bio-sciences制造)。在固定了Aβ单体的芯片上，依次注入通过二倍稀释法从30μg/mL逐级稀释而制备成5个浓度的测定样品(6E10、HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)，并且以从较低浓度开始的顺序基于多动力学模式自动程序进行测定。图3显示了其传感图。

如图3所示，已经发现四类抗Aβ寡聚体人源化抗体(HV0LV0、HV0LV2a、HV0LV4和HV12LV4)对Aβ单体都没有显示出结合能力。

参考例

1.抗原的制备

合成Aβ1-40肽，以制备N端化学结合6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)(SIGMA)的荧光异硫氰酸酯的化合物。用Aβ1-40肽(Peptide Institute，Inc)进行该化合物的聚合反应，从而制备含有大量寡聚体的制剂(Aβ1-40寡聚体)。

2.产抗体杂交瘤的建立

用以上述方式制备的抗原免疫接种Balb-c小鼠的足垫，并且后续进行6次追加免疫接种。通过使用聚乙二醇1500，将腹股沟淋巴结与Sp2/0-Ag14细胞融合而制备杂交瘤。

3.斑点印迹分析

用斑点印迹分析进行初步筛选，所述斑点印迹中将已经预温育18小时的2.5μL Aβ1-42(2.5μg/点)固定在硝酸纤维素膜上。用含有5％低脂乳、1％BSA和0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液封闭膜上的非特异性结合位点，并且用培养溶液的上清液温育非特异性结合位点。

用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠F(ab’)₂(1∶3000；Amersham)检测培养上清液中与Aβ寡聚体结合的抗体，并且使用LAS3000mini(Fujitsu，Tokyo，日本)，用灵敏化学发光(ECL)试剂盒显示所述抗体。通过这样的操作，建立了抗Aβ寡聚体小鼠单克隆抗体6E4。

PCT/JP 2009/52039(WO2009/099176)中公开了以上参考例。

虽然已经详细并参照其具体实施方案说明了本发明，但对于本领域技术人员来说显然可以在其中作出多种变动和修改而不偏离其精神和范围。本申请是基于2009年8月7日提交的美国临时申请(No.61/232,038)，通过引用将所述临时申请的全部内容并入本文，并且将本文所引用的所有参考文献的全部内容并入。

序列表自由文本：

SEQ ID NO：1-人工序列的说明；HCDR1氨基酸序列

SEQ ID NO：2-人工序列的说明；HCDR2氨基酸序列

SEQ ID NO：3-人工序列的说明；HCDR3氨基酸序列

SEQ ID NO：4-人工序列的说明；LCDR1氨基酸序列

SEQ ID NO：5-人工序列的说明；LCDR2氨基酸序列

SEQ ID NO：6-人工序列的说明；LCDR3氨基酸序列

SEQ ID NO：11-人工序列的说明；编码6E4HV0的DNA序列

SEQ ID NO：12-人工序列的说明；6E4HV0可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：13-人工序列的说明；6E4LV0可变区的DNA序列

SEQ ID NO：14-人工序列的说明；6E4LV0可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：15-人工序列的说明；HV12可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：16-人工序列的说明；LV2a可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：17-人工序列的说明；LV4可变区的氨基酸序列

Claims

1.人源化抗体，其不与淀粉样β蛋白单体结合而与淀粉样β蛋白寡聚体结合，并且其含有以下的(a)抗体重链可变区和(b)抗体轻链可变区：

(a)抗体重链可变区，其含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中进行了以下氨基酸修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：以Val取代第12位的Lys，以Leu取代第20位的Val，以Lys取代第38位的Arg，以Leu取代第39位的Gln，以Phe取代第45位的Leu，以Ile取代第48位的Met，以Lys取代第67位的Arg，以Ala取代第68位的Val，以Leu取代第70位的Ile，以Val取代第72位的Ala，以Lys取代第74位的Thr和以Thr取代第97位的Ala，

(b)抗体轻链可变区，其含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中进行了以下氨基酸修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：以Val取代第2位的Ile，以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln，和以Phe取代第92位的Tyr。

2.权利要求1的人源化抗体，其中抗体重链可变区含有SEQ IDNO：12或15所示的氨基酸序列，且抗体轻链可变区含有SEQ ID NO：14、16或17所示的氨基酸序列。

3.抗认知功能障碍剂，其含有权利要求1或2的人源化抗体作为活性成分。

4.用于治疗阿尔茨海默病的药物，其含有权利要求1或2的人源化抗体作为活性成分。

5.用于抑制神经炎性斑形成的药剂，其含有权利要求1或2的人源化抗体作为活性成分。

6.淀粉样β淀粉样纤维形成的抑制剂，其含有权利要求1或2的人源化抗体作为活性成分。

7.用于认知功能障碍的预防和治疗中的至少一种的方法，其包括施用权利要求1或2的人源化抗体。

8.用于阿尔茨海默病的预防和治疗中的至少一种的方法，其包括施用权利要求1或2的人源化抗体。

9.用于抑制阿尔茨海默病进展的方法，其包括施用权利要求1或2的人源化抗体。