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CN102596208B - 用于诱导特异性免疫耐受的组合物 - Google Patents

用于诱导特异性免疫耐受的组合物 Download PDF

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CN102596208B CN201080048552.XA CN201080048552A CN102596208B CN 102596208 B CN102596208 B CN 102596208B CN 201080048552 A CN201080048552 A CN 201080048552A CN 102596208 B CN102596208 B CN 102596208B
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Abstract

本发明涉及在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的组合物，所述组合物包含含有活性物质的红细胞，所述活性物质选自：治疗性肽、多肽或蛋白质，肽、蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽、或蛋白质，以及肽或蛋白质移植抗原。

Description

用于诱导特异性免疫耐受的组合物
本发明涉及在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质(active principle)的免疫耐受的组合物，特别地针对治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，或者肽或蛋白质移植抗原。本发明还涉及治疗哺乳动物(包括人)的方法。
已知肝脏有助于诱导免疫耐受。这一点可以通过肝脏中食物抗原的耐受以及对肝脏异体移植的接受来举例证明。对某些递送到肝脏的外源性抗原的抗原特异性耐受也可以证明。E.Breous等的文章Hepatology，August 2009，612至621页报道了肝脏调节T细胞和枯否氏细胞是对靶向鼠肝脏之抗原的全身性T细胞耐受性的重要中介物。他们报道了在肝靶向基因转移模型中细胞毒T淋巴细胞对非自身抗原的应答受到肝脏调节T细胞的控制，肝脏调节T细胞应答于所述抗原而分泌免疫抑制性细胞因子白介素IL-10。此外，在此背景下，使得枯否氏细胞(Kupffer cell)致耐受而不是产生免疫应答。
枯否氏细胞的致耐受作用也由C.Ju等报道，Chem.Res.Toxicol.2003，16：1514～1519。另外参见A.H.Lau等Gut 2003，52：1075～1078。
本发明的目的是提供可用于诱导针对多种肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的组合物。特别地，其目的是提供针对一种或多种肽或蛋白质活性物质的特异性免疫耐受。
因此，本发明的一个目的是在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的组合物，所述组合物包含含有所述活性物质的红细胞。此活性物质可以是治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质移植抗原，以及其混合物。
所述活性物质可以是天然的、合成的或重组来源的。“含有”分子旨在涵盖含有目的肽、多肽或蛋白质以及另一部分的分子，所述另一部分可以是任何来源并且对于所述肽、多肽或蛋白质的作用无害。例如，这些部分包括半抗原。
不受理论的约束，认为本发明的组合物诱导抗原特异性调节T细胞(Treg)并且产生免疫抑制细胞因子或白细胞介素，特别是IL-10。
生物的和/或来源于生物技术的肽、多肽或蛋白质越来越多被用作治疗剂。然而，公认这些物质可诱导体液和/或细胞免疫应答。针对这些治疗剂的免疫反应的后果多种多样：从没有任何临床意义的抗体短暂出现到严重威胁生命的状况。潜在的临床后果是严重的过敏性反应、疗效降低和诱导自身免疫(包括针对所述肽、多肽或蛋白质之内源形式的抗体)。(European Medicines Agency，Committee for Medicinal products for human use(CHMP)，Guidelines on immunogenicity assessment of biotechnology-derivedtherapeutic proteins，Draft，London，24 January 2007)。
治疗性肽、多肽或蛋白质定义为有效治疗疾病的肽、多肽或蛋白质，或者是含有有效治疗疾病之分子的肽、多肽或蛋白质，所述疾病尤其是通过施以该分子可得到纠正的缺陷所引起的疾病。
在一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为抗体。涵盖其任何片段。
在另一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为凝血因子。涵盖其任何片段。
在另一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为酶。涵盖其任何片段。
在另一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为生长因子。涵盖其任何片段。
术语片段用于涵盖已知代替整个分子来有效治疗相关疾病的肽、多肽或蛋白质的任何片段。
这些定义也涵盖糖基化形式。
在一个实施方案中，所述活性物质为溶酶体酶。所述溶酶体酶可以是用于通过酶替代疗法(enzyme replacement therapy，ERT)治疗或纠正溶酶体储积症的酶，所述溶酶体储积症包括庞贝氏症(pompe disease)(糖原贮积病II型(Glycogen storage diseasetype II))、法布瑞氏症(Fabry disease)和粘多糖储积症(Mucopolysaccharidose)MPS I。例如：
-α葡萄糖苷酶(alphaglucosidase)，如治疗庞贝氏症的Myozyme@；
-拉罗尼酶(laronidase)，如治疗MPS I的Aldurazymen@；
-α半乳糖苷酶A(alphagalactosidase A)或阿加糖酶α(agalsidase alpha)，如治疗法布瑞氏症的Fabrazyme@和Replagal@。
在另一个实施方案中，所述活性物质为可用于治疗血友病的凝血因子。所述凝血因子可以是因子VIII，特别地用于治疗血友病A。所述凝血因子可以是因子IX，特别地用于治疗血友病B。所述凝血因子可以是因子VII，其用于治疗两种血友病。
肽或蛋白质自身抗原定义为是正常组织的成分并且在患者中作为有害的体液或细胞介导免疫应答靶标(如在自身免疫疾病中)的抗原。
在一个实施方案中，所述活性物质是针对风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)的。例如所述活性物质为髓磷脂碱性蛋白质。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对青少年糖尿病的，如1型糖尿病和LADA(Latent Autoimmune Diabetes of Adults，成人潜伏性自身免疫糖尿病)。例如，β细胞抗原，特别是谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)、前胰岛素和胰岛素样生长因子2(insuline-like growth factor-2，IGF2)、和其混合物。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对葡萄膜炎的。例如，视网膜S抗原。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对炎性肠病(inflammatory boweldisease，IBD)的，如克罗恩病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对系统性红斑狼疮的。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对银屑病的。
在另一个实施方案中，所述活性物质是针对获得性重症肌无力的。例如，乙酰胆碱受体。
诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质定义为在宿主中负责过敏反应的肽、多肽或蛋白质，所述反应可包括过敏性休克。
在一个实施方案中，所述诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质为以上提到的治疗性活性肽、多肽或蛋白质，其中本发明使得能够避免一些或任何对这些物质的过敏发应以及对其的中和。
在另一个实施方案中，所述诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质为食物来源的或者任何其他可进入血液循环并引起过敏反应的肽或多肽分子，例如在经口摄入后。
肽或蛋白质移植抗原定义为移植的组织所呈现的抗原，其参与患者中的移植物排斥，例如移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease，GVHD)。
在一个实施方案中，所述移植抗原是参与肾脏移植排斥的抗原。
在一个实施方案中，所述移植抗原是参与心脏移植排斥的抗原。
在一个实施方案中，所述移植抗原是参与肝脏移植排斥的抗原。
术语“宿主”优选地指人，但也指动物，特别是宠物(尤其狗或猫)和体育动物(尤其是马)。
根据本发明，所述红细胞含有(即封装有)活性物质(active principle，AP)，其表示AP位于或基本上位于红细胞内部。
在一个实施方案中，所述组合物靶向网状内皮系统的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)。根据这一特征，所述红细胞设计为、选为或修饰为促进对网状内皮系统的抗原呈递细胞(APC)的靶向。
在一个优选实施方案中，所述组合物靶向肝脏，尤其是枯否氏细胞。根据这一特征，所述红细胞设计为、选为或修饰为促进肝脏靶向。递送AP到肝脏的结果是诱导AP耐受性，尤其是AP特异性耐受性。这种耐受性的诱导涉及肝脏的致耐受性APC。这些细胞基本上是枯否氏细胞(Kupffer cell，KC)、未成熟的肝脏树突细胞，和肝窦内皮细胞。
在一个优选的实施方案中，所述组合物用于抑制APC的促炎反应。根据这一特征，所述红细胞优选地设计为或修饰为抑制APC的促炎反应。
在一个优选的实施方案中，本发明所述组合物包含含有AP并靶向肝脏的红细胞。所述组合物通过肝脏的APC，尤其KC，促进这些红细胞的吞噬作用。
根据第一个实施方案，所述红细胞含有AP，并且为与识别所述红细胞表面上表位的免疫球蛋白形成的免疫复合物形式，以促进肝脏的APC，尤其KC，对所述红细胞的吞噬作用。
所述组合物还使得促进巨噬细胞的吞噬作用成为可能。
优选地，所述免疫球蛋白为免疫球蛋白G。
可用来产生足够调理作用的抗体如抗凝血因子(anti-Rhesus)抗体、抗血型糖蛋白(anti-glycophorin)抗体、和抗CR1(CR1＝1型补体受体)抗体。优选抗凝血因子抗体。
根据另一个实施方案，所述靶向肝脏和/或抑制促炎症应答通过适当的化学处理来进行，所述化学处理使用修饰红细胞表面的试剂，特别地桥联或交联剂如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(bis(sulphosuccinimidyl)suberate，BS3或BS3)、戊二醛或神经氨酸酶。
根据另一个实施方案，所述靶向肝脏和/或抑制促炎症应答通过使用离子载体来进行。正如本领域技术人员所熟知的，离子载体表示一种脂溶性分子，其使得能够穿过细胞膜的脂双层来运输离子。离子载体可以是，特别地脂溶性分子，如微生物所合成以用于运输离子穿过细胞膜脂双层的。一般来说，所述离子载体能够与离子形成复合物并用作离子运载体。
在一个实施方案中，所述离子载体与二价阳离子如钙离子形成复合物。根据本发明，所述离子载体可与钙一起使用，其诱导细胞内钙浓度的增加和磷脂酰丝氨酸的暴露，导致红细胞的早衰。
例如，可使用钙离子载体A23187(卡西霉素)。认为，离子载体例如A23187诱导RBC细胞内钙离子浓度的增加，导致细胞衰老，以及对衰老红细胞的吞噬抑制促炎症应答。其根据Romero P.J.，RomeroE.A，Blood Cells Mol，Dis，25(1999)9-19；和Bratosin D.et al.，Cell Death Differ，8(2001)1143-1156。
在一个特定实施方案中，将至少两种靶向方法相组合，例如，所述组合物包含含有AP的红细胞，所述红细胞是免疫复合物的形式并经过化学处理以使得促进它们在肝脏中被摄取以及被APC(特别是KC)所吞噬。
在一个实施方案中，所述红细胞来源于患者自身。
在另一个实施方案中，所述红细胞来源于血型匹配的捐献者。
本发明的组合物在同一红细胞中可包含一种或多种AP，或在不同的红细胞中包含每一种AP。
在红细胞中封装活性物质的技术是已知的，本文优选的裂解-再封装的基本技术描述于专利EP-A-101341和EP-A-679101，本领域技术人员可参考这些技术。根据此技术，向透析元件(如透析管或透析袋)的第一区室连续地供应红细胞悬浮液，而第二区室含有相对于红细胞悬浮液来说是低渗的水溶液，以裂解红细胞；然后，在再封装单元里，在AP存在下，通过增加渗透压和/或膨胀压诱导红细胞的再封装，之后收集含有AP的红细胞悬浮液。
在到目前为止所描述的方案中，优选WO2006/016247给出的方法，该方法使得可以有效、可重复、安全、稳定地封装AP。该方法包括以下步骤：
1.在等渗溶液中配制红细胞压积水平大于或等于65％的红细胞沉淀悬液，冷却至+1℃至+8℃。
2.用来自所述红细胞沉淀的红细胞样品测定渗透脆性，
步骤1和步骤2可以按任何次序实施(包括平行实施)，
3.在持续维持在+1℃至+8℃的温度下，在相同腔室内进行的细胞裂解和AP过程，其包括使红细胞压积水平大于或等于65％红细胞悬浮液和冷却至+1℃至+8℃的低渗裂解液通过透析袋；并且根据之前测定的渗透脆性调节裂解参数；和
4.在高渗溶液存在下，在温度为+30至+40℃的第二腔室中进行的再封装过程。
“内化”旨在表示AP渗透进入红细胞。
特别的，为了透析，将红细胞沉淀以高红细胞压积水平悬浮在等渗溶液中，红细胞压积水平大于或等于65％，优选的大于或等于70％，以及将该悬液冷却到+1℃至+8℃，优选+2℃至+6℃，通常+4℃附近。根据一个特定实施方案，红细胞压积水平为65％至80％，优选70％至80％。
有利地，在临细胞裂解之前测定红细胞的渗透脆性。有利地，红细胞或含有它们的悬液处于接近或等于用来溶解它们的温度。根据本发明的另一个有利特征，渗透脆性测量快速地进行，即裂解过程在取出样品后很短时间内实施。优选地，取出样品到开始裂解这段时间少于或等于30分钟，优选为少于或等于25分钟，甚至少于或等于20分钟。
有关在测量和考虑渗透脆性的情况下实施裂解再封装过程的形式，本领域技术人员可参考WO2006/016247以得到更多细节。
根据本发明的一个特征，本发明的组合物最终包含红细胞压积水平为约40％至约70％，优选约45％至约55％，更优选约50％的红细胞悬液。优选地包装成约1至约250ml的体积。包装物优选为血袋、注射器和类似的适于血液输注或施用的形式。优选地，对应于医学处方的所封装AP的量全部包含在血袋、注射器等中。
本发明的另一个目的是用于在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的方法，所述组合物包含含有选自下列的活性物质的红细胞：治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，以及肽或蛋白质移植抗原。该方法包括向宿主施用有效量的本发明组合物，特别是通过静脉内、注射或输注，优选通过输注。
根据本发明的一个特征，施用约1ml至约250ml，尤其是约10ml至约250ml，通常是约10ml至约200ml的红细胞悬液。施用具有合适的红细胞压积水平的所述悬液，一般为约40％至约70％，优选地为约45％至约55％，更好地为约50％。红细胞对于同时出现的活性物质(装入的活性物质)可以有它们自身的耐受性。因此，大数量的红细胞可有利于耐受作用。另一方面，如上所述的靶向肝脏可允许使用低剂量的红细胞。因此，本领域的技术人员可选择在患者中使用的最优量的活性物质和红细胞，也可以考虑是否处理红细胞以靶向肝脏。
本发明还有一个目的是本发明组合物用于诱导针对所施用的红细胞中所存在的活性物质之特异性免疫耐受的用途。
本发明的另一个目的是本发明的组合物，其用作诱导针对所施用的红细胞中所存在的活性物质之特异性免疫耐受的药物。
下面通过以采用非限制性实施例之实施方案的方式来详细描述本发明，其参考以下附图：
图1是表示表达FOXP3的CD4T细胞之百分比的图。
图2是表示产生IL-10的调节性CD4+CD25+T细胞之百分比的图。
图3是表示脾脏中表达FOXP3的CD4T细胞之百分比的图。
图4是表示肝脏中表达FOXP3的CD4T细胞之百分比的图。
图5是表示OVA特异性CD8T细胞之百分比的图。
实施例1：在小鼠红细胞中封装FITC-葡聚糖
使用柱式低渗透析将FITC-葡聚糖荧光染料(70kDa)封装到小鼠来源(OF1小鼠)的红细胞中。将血液离心，然后用PBS洗3遍。透析之前，在加至8mg/ml终浓度的FITC-葡聚糖存在下，将红细胞压积调节到70％。以2ml/分钟的速率相对于具有低渗透压的裂解缓冲液(逆流速率为15ml/分)透析红细胞。用高渗溶液将离开柱的裂解红细胞再次细胞化并在37℃孵育30分钟。用含有葡萄糖的PBS洗数次以后，将细胞调节到50％红细胞压积。
实施例2.用1mM的双磺基琥珀酰亚胺辛二酸盐(BS3)对含FITC-葡聚糖的红细胞的 化学处理
将封装了FITC-葡聚糖的红细胞悬液洗数次，然后用PBS调节到1.7×108细胞/μl，并与一体积的2mM BS3缓冲液(所述BS3溶液含有0.09％的葡萄糖和磷酸盐缓冲液，pH为7.4。)混合，这样得到1mM的BS3终浓度。细胞在室温下孵育30分钟。通过加入一体积的20mMtris-HCL和140mM的NaCl来停止反应。在室温孵育5分钟之后，将混合物于4℃以800g离心5分钟。然后将细胞用含葡萄糖的PBS(经800g离心)洗两次，用6％的SAG-BSA(以1000g离心)洗一次，每次10分钟，之后调节到红细胞压积为50％，得到终产品。
实施例3.用5mM的双磺基琥珀酰亚胺辛二酸盐(BS3)对含FITC-葡聚糖的红细胞的 化学处理
将封装了FITC-葡聚糖的红细胞悬液洗数次，然后用PBS调节到1.7×108细胞/μl，并与一体积的10mM BS3缓冲液(所述BS3溶液含有0.09％的葡萄糖和磷酸盐缓冲液，pH为7.4。)混合，以获得5mM的BS3终浓度。细胞在室温下孵育30分钟。通过加入一体积的20mM的tris-HCL和140mM的NaCl来停止反应。在室温孵育5分钟之后，将混合物于4℃以800g离心5分钟。然后将细胞用含葡萄糖的PBS(以800g离心)洗两次，用6％的SAG-BSA(以1000g离心)洗一次，每次10分钟，之后调节到红细胞压积为50％，得到终产品。
实施例4用A23187离子载体处理含FITC-葡聚糖的红细胞
将封装了FITC-葡聚糖的红细胞悬液用含Hepes 10mM，NaCl140mM，BSA 0.1％，CaCl2 2.5mM的缓冲液A洗一次，之后用缓冲液A将悬浮液稀释到1×106细胞/μl。将DMSO中的离子载体浓度用缓冲液A稀释，然后加入到细胞悬液中，得到0.15μM、0.2μM或0.3μM的终浓度。将细胞在37℃下孵育30分钟。混合物于4℃以800g离心6分钟。然后将细胞用含葡萄糖的PBS(以800g离心)洗两次，用6％的SAG-BSA(以1000g离心)洗一次，得到终产品。
实施例5.在小鼠中注射所述红细胞后FITC-葡聚糖的生物分布
制备如下5批次来自小鼠OF1的含有FITC-葡聚糖的红细胞，所述红细胞按实施例1制取，用BS3或离子载体处理或者不做处理(基于实施例2至4)
批次1：不处理
批次2：BS3 1mM
批次3：BS3 5mM
批次4：离子载体0.2μM
批次5：离子载体0.3μM
将每一批次在J1通过IV注射进OF1小鼠。注射后1小时30分钟后处死小鼠，回收血液、脾脏、肝脏和骨髓：50μl血液的等分试样，对于脾脏、肝脏和骨髓则是这些器官的所有细胞研磨和匀浆处理后的50μl等分试样。将这些等分试样在-20℃冷冻至少20分钟，然后在室温下缓慢融解。来自对照组小鼠的等分试样用来制作FITC-葡聚糖标准浓度范围；这些等分试样随后用125μl不同浓度的FITC-葡聚糖裂解来建立标准浓度范围。
用125μl的蒸馏水裂解待分析的样品等分试样。然后在这些等分试样中加入175μl12％的TCA。然后，将混合物于4℃以15000g离心10分钟。取200μl的酸性上清，在荧光检测(494nm激发，521nm发射)前加入500μl 0.4M的三羟乙基胺。每个样品的FITC-葡聚糖浓度可以利用标准浓度范围算出，然后就可以推算出相应器官中FITC-葡聚糖的比例。
OF1小鼠中注射所述红细胞后1小时30分时FITC-葡聚糖的生物分布(表1)
批次 血液 肝脏 脾脏
1 57％ 19.8±7.6％ 7.7±1.9％
2 35.5±8％ 32±4,6％ 22.8±14％
3 11％ 20,6％ 13.30％
4 19.912,6％ 24±1,3％ 7.2±1,2％
5 14.7±1,3％ 36.7±7,2％ 9.2±0,8％
1mM的BS3处理诱导红细胞肝脏和脾脏靶向，而离子载体处理只诱导肝脏靶向。增加离子载体的剂量能够增强靶向作用。
实施例6.测定小鼠中含FITC-葡聚糖的红细胞的吞噬作用
制备如下5批次来自小鼠OF1的含有FITC-葡聚糖的红细胞，所述红细胞按实施例1制取，用BS3或离子载体处理或者不做处理(按实施例2至4)
批次1：不处理
批次2：BS3 1mM
批次3：BS3 5mM
批次4：离子载体0.2μM
批次5：离子载体0.3μM
将每一批次在J1通过IV注射进OF1小鼠。注射后1小时30分钟后处死小鼠，回收肝脏。使用流式细胞术测定表达F4/80标记的肝脏巨噬细胞、表达CD11b标记的肝脏细胞和表达CD11c标记肝脏树突细胞中所含的荧光。
在向小鼠注射后1小时30分吞噬了含FITC-葡聚糖的红细胞的肝脏细胞的百分比(表2)。
BS3和离子载体处理诱导巨噬细胞(F4/80和CD11b)和树突细胞对红细胞的吞噬。对于BS3处理来说，吞噬了经处理红细胞的细胞百分比剂量性依赖于用于处理的BS3量。
实施例7.在鼠和人红细胞中封装卵清蛋白的方法
方案1：
在透析管中通过低渗透析的方法将卵清蛋白(鸡蛋卵清蛋白，45kD蛋白质)封装到鼠红细胞(OF1小鼠或C57BL/6小鼠)中。将红细胞悬液洗几遍，之后调节到用于透析的70％红细胞压积。当热处理后透析发生时，在低渗透压裂解缓冲液中于透析管中进行透析约1小时或30分钟。然后，将红细胞用高渗透压溶液重新封装30分钟。清洗几次以后，将终产品放入Sag-甘露醇缓冲液中，将红细胞压积调节到50％。
方案2：
此处，在透析柱中通过低渗透析的方法将卵清蛋白封装到鼠红细胞中。将红细胞悬液洗几遍，之后调节到用于透析的70％红细胞压积。在低渗透压裂解缓冲液中于透析柱中进行透析约10分钟。红细胞一离开透析柱，就用高渗透压溶液在37℃重新封装30分钟。清洗几次后，将终产品放入含有葡萄糖SAG甘露醇的氯化钠葡萄糖缓冲液或去除补体的血浆中，将红细胞压积调节到50％。
实施例8.在小鼠红细胞中封装卵清蛋白的方法
通过低渗透析将卵清蛋白(Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)封装到小鼠红细胞中。由收集于肝素锂上的C57BL/6小鼠血液制备红细胞悬液。简言之，在透析前用盐溶液将红细胞洗三遍，并将血液的红细胞压积(Haematocrit，Hct)调节到70％。将OVA加到红细胞悬液中，终浓度为5或0.5mg/ml。相对于细胞裂解缓冲液(渗透压为50mOsmol/kg)进行透析(细胞流速为2ml/分)，所述细胞裂解缓冲液以逆流(15ml/分钟)循环进80中空纤维透析器(Gambro，Lyon，France)。通过加入(10％终体积)高渗溶液(1900mOsmol/kg)将红细胞“在线”重新封装，所述高渗溶液含有：0.4g/l的腺嘌呤(Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MI)、15.6g/l的肌苷(Sigma-Aldrich)、6.4g/l的丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)、4.9g/l的无水磷酸二氢钠(Sigma-Aldrich)、10.9g/l的十二水合磷酸氢二钠(Sigma-Aldrich)、11.5g/l的单水合葡萄糖(Sigma-Aldrich)和50g/l的NaCl(Sigma-Aldrich)。红细胞与高渗溶液一起在37℃孵育30分钟。在用0.9％NaCl 0.2％葡萄糖(Bioluz，Saint-jean-de-luz，France)洗几次以后，用含有Hepes 10mM，NaCl 140mM，BSA0.1％，CaCl2 2.5mM的缓冲液A洗一次，如实施例15所述，用缓冲液A稀释到1x106细胞/μl并用0.15μM钙离子载体A23187(Sigma)于37℃处理30分钟。用0.9％NaCl 0.2％葡萄糖洗3次以后，将终产品重悬并用去除补体的C57BL/6小鼠血浆(15％终体积)将红细胞压积调节到50％。将由此获得的产品储存在2至8℃。
实施例9.在小鼠红细胞中封装卵清蛋白的方法
通过低渗透析将卵清蛋白(Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)封装到小鼠红细胞中。由收集于肝素锂上的C57BL/6小鼠血液制备红细胞悬液。简言之，在透析前用盐溶液将红细胞洗三遍，并将血液的红细胞压积(Haematocrit，Hct)调节到70％。将OVA加到红细胞悬液中，终浓度为5或0.5mg/ml。相对于细胞裂解缓冲液(渗透压为50mOsmol/kg)进行透析(细胞流速为2ml/分钟)，所述细胞裂解缓冲液以逆流(15ml/分钟)循环进透析管。透析后，通过加入(10％终体积)高渗溶液(1900mOsmol/kg)将红细胞重新封装，所述高渗溶液含有：0.4g/l的腺嘌呤(Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MI)、15.6g/l的肌苷(Sigma-Aldrich)、6.4g/l的丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)、4.9g/l的无水磷酸二氢钠(Sigma-Aldrich)、10.9g/l的十二水合磷酸氢二钠(Sigma-Aldrich)、11.5g/l的单水合葡萄糖(Sigma-Aldrich)和50g/l的NaCl(Sigma-Aldrich)。红细胞与高渗溶液一起在37℃孵育30分钟，然后如实施例14中所述用BS3化学处理。
在用0.9％NaCl 0.2％葡萄糖(Bioluz，Saint-jean-de-luz，France)洗几次以后，将终产品重悬并用去除补体的C57BL/6小鼠血浆(15％终体积)将红细胞压积调节到50％。将由此获得的产品储存在2至8℃。
实施例10.对含卵清蛋白的红细胞的抗体处理
将封装了卵清蛋白的红细胞悬液洗几遍，之后调节到109细胞/ml(用于体内测试)和108细胞/ml(用于体外测试)。与抗TER119抗体(体外测试为10μg/ml，体内测试为23μg/ml或5μg/ml)一起于4℃孵育30分钟。洗几遍以后，将终产物置于注射所需量的缓冲液中，将红细胞压积调节到50％。
实施例11.在体外测定树突细胞对含卵清蛋白红细胞的吞噬作用
在体外测定抗体处理对树突细胞吞噬根据实施例9得到的红细胞的影响。于4℃用荧光标记CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记所述红细胞20分钟。CFSE是扩散穿过细胞膜的非荧光染料。一旦进入细胞内，这些分子就在细胞内酯酶的切割下变成荧光染料。
使用磁珠从C57Bl/6小鼠的脾脏分离树突细胞。这些珠带有识别CD11c标记的抗体，因此使得能够分离CD11c+树突细胞级分。
随后，将CFSE标记的或未标记的红细胞与树突细胞(每毫升10×106细胞)以20∶1的比例在200μl/孔的终体积中一起于37℃5％CO2下在圆底96孔培养板中孵育4个小时。培养4个小时以后，将没有被树突细胞摄入的红细胞用NH4Cl裂解，清洗几遍。随后，通过流式胞术测定树突细胞对CFSE荧光染料的捕获(R.Segura et al.，J.Immuol，January 2006，176(1)：441-50)。
测定三个红细胞群体：
(A)负载卵清蛋白但没有用CFSE荧光染料标记的红细胞。
(B)负载卵清蛋白并且用CFSE标记的红细胞。
(C)负载卵清蛋白，用抗-TER 119抗体处理，并且用CFSE标记的红细胞。
结果：
表3：吞噬了发荧光的红细胞的树突细胞的百分比
红细胞群体 树突细胞％
(A) 4％
(B) 27％
(C) 36％
共培养4小时后，在体外，与未处理的红细胞相比，负载有卵清蛋白并且用抗-TER119抗体处理的鼠红细胞更有效地被分离自肝脏的树突细胞所吞噬。与没有抗体时的27％相比，36％的树突细胞吞噬了带有抗体的红细胞。
实施例12.在小鼠体内测定脾脏和肝脏的巨噬细胞和树突细胞对含卵清蛋白红细 胞的吞噬作用
本研究为同种异型体研究(allogenic study)，因为含卵清蛋白的OF1小鼠红细胞注射给了没有血缘关系的C57Bl/6小鼠。
制备3批次74×107来自小鼠的红细胞，负载有卵清蛋白(按实施例9)、用抗-TER119抗体处理(按实施例10)或不作处理。这些批次按以下分类。
批次1：不作抗体处理
批次2：经抗-TER119抗体处理。
用CFSE标记每一批次并静脉内注射给C57Bl/6小鼠。在注射以后3个小时，取小鼠的血液、脾脏和肝脏。用流式细胞术测定在小鼠血液中循环的发荧光的红细胞的百分比。用流式细胞术测定表达F4/80标记的脾脏巨噬细胞、表达F4/80标记的肝脏巨噬细胞、表达Cd11c标记的脾脏树突细胞中所含的荧光。
结果：
表4：在注射小鼠后3个小时，吞噬了发荧光红细胞的来自脾脏的巨噬细胞或树突细胞的百分比。
批次 巨噬细胞 树突细胞
1 28％ 5％
2 81％ 22％
注射以后3个小时，在小鼠血液中几乎不再有负载了卵清蛋白并且用抗-TER 119抗体处理过的鼠红细胞(1％)，但依然有未处理的负载了卵清蛋白的红细胞(4.6％)。
用抗-TER 119抗体处理的红细胞被来自脾脏的F4/80巨噬细胞和CD11c树突细胞所吞噬。
相比于未处理的红细胞，用抗-TER 119抗体处理的红细胞更有效地被脾脏F4/80巨噬细胞吞噬。81％的脾脏巨噬细胞吞噬了抗体处理的红细胞，而在未处理批次中只占28％(表4)。
相比于未处理的红细胞，抗体处理的红细胞也更有效地被脾脏CD11c树突细胞吞噬。分别为22％的树突细胞吞噬了抗体处理的红细胞，而对于未处理的红细胞仅5％(表4)。
表5在注射进小鼠后3个小时，吞噬了发荧光红细胞的肝脏巨噬细胞的百分比。
批次 巨噬细胞
1 24％
2 50％
用抗-TER119抗体处理的红细胞被肝脏F4/80巨噬细胞吞噬。
相比于未处理的红细胞，用抗-TER 119抗体处理的红细胞更有效地被肝脏F4/80巨噬细胞吞噬。50％的肝脏巨噬细胞吞噬了抗体处理的红细胞，而在未处理批次中只占24％(表5)。
综上所述，抗体与红细胞的结合允许所述红细胞有效靶向脾脏和肝脏，并且显著增加能够吞噬这些红细胞的树突细胞和巨噬细胞的百分比。
实施例13.小鼠中注射一次聚(I:C)和抗体处理或未处理的负载卵清蛋白的红细 胞后，测定调节T细胞的百分比以及它们产生的抗炎白介素10(IL-10)
本研究的目的是测定在注射聚(I:C)(Poly(I:C))和抗体处理(抗TER119)或未处理的负载卵清蛋白的红细胞后C57Bl/6小鼠中调节T细胞的百分比。
按照实施例8制备两批次30×107来自OF1小鼠的抗体处理的或未处理的负载卵清蛋白红细胞。在本研究中，还注射与封装的卵清蛋白等量的游离卵清蛋白，阴性对照为红细胞保存溶液(preservative solution)(氯化钠葡萄糖，其含有33％的小鼠去除补体的血浆)。给小鼠注射的游离或封装的OVA的量为2μg。给小鼠注射的游离聚(I:C)的量为25μg。
批次1：负载卵清蛋白的红细胞和聚(I:C)
批次2：经抗体处理的负载卵清蛋白的红细胞和聚(I:C)
这些批次静脉内注射给C57Bl/6小鼠(每组四只小鼠)。在这些批次注射后7天，处死小鼠并收集它们的脾脏。为了通过流式细胞术测定表达FOXP3的CD4+T细胞的百分比(图1，表6)，使用2.5×106的脾脏细胞。简言之，在用NH4Cl溶液(StemCell Technologies，目录编号7850)裂解RBC后，首先用PC5-抗-CD4(Biolegend，目录编号BLE100514)和FITC-抗-CD25单克隆抗体(Biolegend，目录编号BLE110569)对脾脏细胞染色，然后将细胞与固定和透化缓冲液(Biolegend，目录编号421303)一起孵育，之后与PE-抗-FOXP3mAb(Biolegend，目录编号320008)或同种型对照一起孵育。
为了用流式细胞术测定产生IL-10的调节T细胞(CD4+CD25+)的百分比(图2)，将脾脏细胞(5×106细胞/ml)与0.1μg/ml的OVA323-339肽(Genscript，目录号41007-1)一起于37℃，5％CO2的空气中在24孔培养板中培养4小时。开始培养后1个小时，加入布雷菲德菌素A(Brefeldin A，Ebioscience，产品号420601)来阻断细胞因子的分泌。在培养结束时，首先用PC5-抗-CD4和FITC-抗-CD25单克隆抗体对细胞进行染色，然后将细胞与固定缓冲液(Biolegend，目录编号420801)和透化缓冲液(Biolegend，目录编号421002)一起孵育，之后与PE-抗-IL-10mAb(Biolegend，目录编号505008)或同种型对照一起孵育。
相比于注射保存溶液的对照小鼠，注射聚(I:C)以及经抗体处理的负载OVA的红细胞或游离OVA后表达转录因子FOXP3的调节CD4T细胞的百分比显著增加(图1，表6，t检验分别为，p＜0.007和p＜0.05)。
表6：表达FOXP3的CD4T细胞的百分比
然而，只有经抗体处理的负载OVA的红细胞和聚(I:C)的注射诱导的调节T细胞在体外用OVA肽再刺激时可产生抗炎细胞因子(IL-10)(图2，表7)。
表7产生IL-10的CD4+CD25+T细胞的百分比。
总之，注射抗体处理的负载OVA的红细胞和聚(I:C)诱导产生的调节T细胞在与抗原再刺激后能产生IL-10。
在图1中，在向C57BL/6小鼠静脉内注射经抗体处理的(黑色柱)或未处理(深灰色柱)的负载OVA的红细胞和聚(I:C)，或者游离OVA和聚(I:C)(浅灰色柱)，或者对照介质(白色柱)7天后，用流式细胞术测定脾脏中FOXP3+CD4+T细胞的百分比。给小鼠注射的游离的或负载的OVA的量为2μg，聚(I:C)的量为25μg。
在图2中，从用经抗体处理的(黑色柱)或未处理(深灰色柱)的负载OVA的红细胞和聚(I:C)，或者游离OVA和聚(I:C)(浅灰色柱)，或者对照介质(白色柱)注射7天后的C57BL/6小鼠分离脾脏细胞，用0.1μg/mlOVA肽对其进行体外再刺激，之后用流式细胞术测定调节CD4+CD25+T细胞产生的IL-10。给小鼠注射的游离的或负载的OVA的量为2μg，聚(I:C)的量为25μg。
实施例14.对含有卵清蛋白的红细胞的BS3处理
将封装OVA的红细胞悬液(实施例8)洗几遍，之后用PBS调节到1.7×106细胞/μl，然后与1体积2mM的BS3缓冲液混合(所述BS3溶液含有0.09％的葡萄糖和磷酸盐缓冲液，pH为7.4。)，从而得到1mM的BS3终浓度。细胞在室温下孵育30分钟。通过加入一体积20mM的tris-HCL和140mM的NaCl来停止反应。在室温孵育5分钟之后，将混合物于4℃以800g离心5分钟。然后将细胞用氯化钠葡萄糖(以800g离心)洗三次，每次10分钟，之后用去除了补体的血浆调节到50％红细胞压积。
实施例15.对含有卵清蛋白的红细胞的离子载体处理
将封装OVA的红细胞悬液(实施例8)用含Hepes 10mM，NaCl140mM，BSA 0.1％，CaCl2 2.5mM的缓冲液A洗一次，之后用缓冲液A将悬液稀释到1×106细胞/μl。用缓冲液A稀释DMSO中浓缩的离子载体，然后加至细胞悬液，从而得到0.15μM的终浓度。将细胞在37℃孵育30分钟。混合物于4℃以800g离心6分钟。然后将细胞用氯化钠葡萄糖(以800g离心)洗三次，每次10分钟，之后用去除补体的血浆调节到50％红细胞压积。
实施例16.给小鼠注射一次经处理以靶向肝脏和/或抑制APC促炎症应答的负载卵 清蛋白的红细胞后，对肝脏和脾脏中调节T细胞百分比的测定
本研究的目的是证明在小鼠中使用作为抗原递送系统的经处理靶向肝脏且抑制APC促炎症应答的RBC诱导调节T细胞百分比的增加。
按照实施例8制备来自C57BL/6小鼠的126×107抗体处理的、BS处理的、或离子载体处理的负载卵清蛋白的红细胞批次。给小鼠注射的封装OVA的量为8μg。
批次1：经离子载体处理的负载卵清蛋白的红细胞。
批次2：经BS3处理的负载卵清蛋白的红细胞。
批次3：经抗体处理的负载卵清蛋白的红细胞。
批次4：经抗体处理的负载卵清蛋白的红细胞和聚(I:C)。
将这些批次静脉内注射给C57Bl/6小鼠(每组3只小鼠)。注射这些批次7天后，处死小鼠并收集其肝脏和脾脏。为了通过流式细胞术测定脾脏中(图3，表8)和肝脏中(图4，表8)表达FOXP3的CD4+T细胞的百分比，使用1×106和2.5×106的肝脏细胞和脾脏细胞。简言之，在用NH4Cl溶液(StemCell Technologies，目录编号7850)裂解RBC后，首先用PC5-抗-CD4(Biolegend，目录编号BLE100514)和FITC-抗-CD25单克隆抗体(Biolegend，目录编号BLE110569)对脾脏细胞进行染色，然后将细胞与固定和透化缓冲液(Biolegend，目录编号421303)一起孵育，之后与PE-抗-FOXP3mAb(Biolegend，目录编号320008)或同种型对照一起孵育。
在图3中，在向C57BL/6小鼠静脉内注射经离子载体处理的(深灰色柱)、BS3处理的(灰色柱)、或抗体处理的(浅灰色柱)负载OVA的红细胞，或者经抗体处理的负载OVA的红细胞和聚(I:C)(黑色柱)，或者对照介质(白色柱)后7天，通过流式细胞术测定脾脏中FOXP3+CD4+T细胞的百分比。给小鼠注射的封装OVA的量为8μg。
在图4中，在向C57BL/6小鼠静脉内注射经离子载体处理的(深灰色柱)、BS3处理的(灰柱)、或抗体处理的(浅灰色柱)负载OVA的红细胞，或者经抗体处理的负载OVA的红细胞和聚(I:C)(黑色柱)，或者对照介质(白色柱)后7天，通过流式细胞术测定肝脏中FOXP3+CD4+T细胞的百分比。给小鼠注射的封装OVA的量为8μg。
为了用流式细胞术测定OVA特异性CD8T细胞的百分比(图5，表9)，用PC7-抗-CD8(Biolegend，目录编号BLE100722)、FITC-抗-CD3(Biolegend，目录编号BLE100203)和PC5-抗-CD62L单克隆抗体(Biolegend，目录编号BLE104410)和PE-OVA-四聚体(BeckmanCoulter，目录编号T20076)对脾细胞染色。
在图5中，在向C57BL/6小鼠静脉内注射经离子载体处理的(深灰色柱)、BS3处理的(灰柱)、或抗体处理的(浅灰色柱)负载OVA的红细胞，或者经抗体处理的负载OVA的红细胞和聚(I:C)(黑色柱)，或者对照介质(白色柱)后7天，通过流式细胞术测定脾脏中OVA特异性CD8+T细胞的百分比。给小鼠注射的封装OVA的量为8μg。
为了用流式细胞术测定产生IL-10的调节T细胞(CD4+CD25+)的百分比(表10)，将脾脏细胞(5×106细胞/ml)与0.1μg/ml的OVA323-339肽(Genscript，目录号41007-1)一起或者在没有肽的情况下于37℃，5％CO2的空气中在24孔培养板中培养4小时。开始培养1个小时后，加入布雷菲德菌素A(Ebioscience，产品号420601)来阻断细胞因子的分泌。在培养结束时，首先用PC5-抗-CD4和FITC-抗-CD25单克隆抗体对细胞进行染色，然后将细胞与固定缓冲液(Biolegend，目录编号420801)和透化缓冲液(Biolegend，目录编号421002)一起孵育，之后与PE-抗-IL-10mAb(Biolegend，目录编号505008)或同种型对照一起孵育。
离子载体处理是唯一能诱导肝脏和脾脏两者中表达FOXP3的调节CD4T细胞显著增加的处理(表8和图3和图4，p＜0.05)。抗体处理只能诱导脾脏中表达FOXP3的调节CD4T细胞的显著增加(表8、图3，p＜0.05)。
表8：脾脏和肝脏中调节性FOXP3 CD4+T细胞的百分比。
只有共注射经抗体处理的负载OVA的RBC和聚(I:C)诱导了OVA特异性CD8T细胞百分比的增加(表9、图5)
表9：脾脏中OVA特异性CD8+T细胞的百分比。
只有共注射经抗体处理的负载OVA的RBC和聚(I:C)诱导了脾脏中产生IL-10的CD4+CD25+T细胞百分比的增加，并且这种产生不是OVA特异性的。(表10)。
表10.脾脏中产生IL-10的调节CD4+CD25+T细胞的百分比
实施例17.在小鼠中注射三次经处理靶向肝脏并抑制APC促炎症应答的负载卵清 蛋白的红细胞后，对小鼠免疫耐受OVA的测定
本研究的目的是证明注射经处理靶向肝脏并抑制APC促炎症应答的负载OVA的RBC抑制OVA和聚(I:C)诱导的OVA T和B细胞应答。
处理之前，通过眶后穿刺将C57BL/6小鼠的血液样品(200μl)收集到血清凝胶分离管(Becton Dickinson，Microtainer TM SST，ref365951)中来获得免疫前血清。然后在第-7、-3、-1天给小鼠通过静脉内注射三次对照介质、游离OVA或按照实施例8用C57BL/6小鼠血样制备的经离子载体处理的负载卵清蛋白红细胞批次(每组3至4只小鼠)。给小鼠注射的游离的和封装的OVA的量分别为120μg和90μg。在第0天和21天，用OVA和聚(I:C)攻击小鼠(分别为100μg和50μg/小鼠)。一些小鼠只接受对照介质。最后一次注射后6天，收集小鼠的血液样品(200μl)来获取免疫后血清，向小鼠注射以1∶1的比例存在或不存在OVA257-264肽的CFSE标记的C57BL/6脾细胞悬液，来评估细胞毒性CD8 T细胞裂解SIINFEKL细胞的能力。在注射OVA257-264细胞以后16小时，处死小鼠并收集它们的脾脏。
为了通过流式细胞术测定激活的OVA特异性CD8 T细胞的百分比(表11)，用以下物质对脾脏细胞染色：PC7-抗-CD8(Biolegend，目录编号BLE100722)、FITC-抗-CD3(Biolegend，目录编号BLE100203)、PC5-抗-CD62L单克隆抗体(Biolegend，目录编号BLE104410)、PE-OVA-四聚体(Beckman Conlt，目录编号T20076)。
为了测定OVA特异性体内裂解的百分比(表12)，用流式细胞术测定低CFSE细胞和高CFSE细胞的百分比，并用以下公式计算。
％＝[1-(经处理小鼠中的比例/未处理小鼠中的比例)]×100，其中比例＝高CFSE细胞百分比/低CFSE细胞百分比。
为了测定血清中抗OVA IgG1和IgG2a效价(表13)，将多种稀释度的免疫前血清和免疫后血清(1/50至1/36450)在用OVA(Serlabo，目录编号WQ-LS003054，5μg/ml)预包被的96孔MaxiSorp平板(Nunc，cat nb 442404)中孵育。通过以下来显示抗OVA IgG1和IgG2a的存在：与抗小鼠IgG1(Thermo Scientific，cat nb cat PA1-86031，稀释1/4000)或抗小鼠IgG2a(Thermo Scientific，cat nb cat PA1-86039，稀释1/4000)缀合的辣根过氧化物酶(HorseRadishPeroxidase，HRP)孵育，接着与四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)底物(Biolegend，cat nb421101)孵育。通过2N的H2SO4溶液终止反应，使用平板读取器(Biotek，cat nb ELx808)测定450nm和630nm的光密度。用630nm下获得的数据减去在450nm下获得的数据，抗体效价由光密度高于稀释到1/50的免疫前血清所得到的O.D.值3倍时的稀释度决定。
相比于注射OVA，注射经离子载体处理的负载OVA的RBC能够显著降低OVA和聚(I:C)诱导的特异性CD8T细胞的增殖和活化(表11；p＜0.05)。
表11：脾脏中活化的OVA特异性CD8+T细胞的百分比。
注射经离子载体处理的负载OVA的RBC能够显著降低OVA和聚(I:C)诱导的OVA特异性细胞裂解(表12；p＜0.01)。
表12：OVA特异性体内裂解的百分比。
相比于用OVA预处理的小鼠，用经离子载体处理的负载OVA的RBC预处理的小鼠具有非常低和/或没有抗OVAIgG1和IgG2a抗体效价(表13)。
表13：血清中抗OVAIgG1和IgG2a抗体效价。
实施例18.在小鼠中注射多个量的负载卵清蛋白的红细胞后，对OVA免疫耐受的测 定
按照实施例17所述进行实验，不同的是两个不同批次的经离子载体处理的负载卵清蛋白的红细胞由2个不同浓度的OVA制备，得到具有53250±6800 OVA分子/RBC(如实施例17)的一个批次(批次1)和具有8250±840分子/RBC的另一批次(批次2)。
在第-7、-3和-1天向C57BL/6小鼠静脉内注射三次110μl或30μl的批次1，110μl的批次2，110μl的游离OVA或110μl的保存溶液。给小鼠注射的OVA和RBC的量在表14显示。在第0天和第21天，用OVA和聚(I:C)(分别为100μg和50μg/小鼠)攻击小鼠。最后一次注射后6天，处死小鼠，收集脾脏并按照实施例17所述用缀合HRp的抗小鼠IgG2b(Southern Biotech，1090-05)和抗小鼠IgG2c(Southern Biotech，1079-05)测定血清中IgG1、IgG2b和IgG2c的量。为了测定IFNγ的产生，脾脏细胞(5×106细胞/ml)先与0.1μg/ml的OVA323-339肽(Genscript，cat nub 41007-1)一起或在没有所述肽的情况下于37℃、5％CO2的空气中在24孔培养板中培养48小时。然后使用Cytometric Bead Array(BD Bioscience，558296和558266)通过流式细胞术测定上清中的IFNγ。为了通过流式细胞术测定表达细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的CD4+CD25+T细胞的百分比，首先用PC5-抗-CD4(Biolegend，cat nbBLE100514)和FITC-抗-CD25单克隆抗体(Biolegend，cat nb BLE110569)对脾脏细胞染色，然后用1％多聚甲醛的PBS(Sigma Aldrich，F1635-25ml)固定，用0.3％的皂苷(SigmaAldrich，84510)透化，之后与PE-抗-CTLA-4mAb(BD Pharminghen，cat nb 553720)或同种型对照一起孵育。
表14：每次注射向小鼠注射的OVA和RBC的量。
相比于用OVA预处理的小鼠，用高剂量的批次1(大量的OVA和RBC)预处理的小鼠，显著降低了抗OVA IgG1，IgG2b IgG2c抗体效价(表15，IgG1：p＜0.002，IgG2b和IgG2c：p≤0.05)。此外，相比于用OVA预处理的小鼠，用批次2(相同量的RBC但低剂量的OVA)预处理的小鼠(每只小鼠8至11μg)也显著降低了抗OVA IgG1和IgG2c抗体效价(表15，IgG1：P＜0.006，IgG2c：P≤0.05)。然而，用低剂量的批次1预处理的小鼠(少量的OVA和RBC)具有明显的抗体效价。因此，每只小鼠注射的OVA和RBC的量在诱导免疫耐受中具有重要的作用。
表15：血清中抗OVA IgG1，IgG2b，IgG2c抗体效价
OVA和聚(I:C)的攻击诱导应答于OVA刺激的IFNγ产生增加。此增加可以在用游离OVA预处理的小鼠中观察到，但不能在用经离子载体处理的负载OVA的RBC预处理的小鼠中观察到，表16，(p＜0.005)。
表16：用OVA 2类限制肽刺激的脾细胞产生的IFNγ(平均值±标准偏差)。
通过将抑制信号传送到T细胞，CTLA-4是一种在免疫系统中有重要调节作用的蛋白质，通过流式细胞术测定其在CD4CD25调节T细胞上的表达。相比于用OVA预处理的小鼠和只接受OVA+聚(I:C)攻击的小鼠，用高剂量批次1和批次2预处理的小鼠具有显著更高的CD4CD25调节T细胞中CTLA-4表达百分比(表17，批次1分别为：p≤0.03和p≤0.02，批次2：p≤0.05)。另外，用批次1高剂量预处理的小鼠也具有显著更高的CD4CD25调节T细胞中CTLA-4表达的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)(表17，p≤0.03)。最后，相比于只接受OVA+聚(I:C)攻击的小鼠，用低剂量批次1预处理的小鼠在CD4CD25调节T细胞中具有明显更高的CTLA-4表达百分比(表17，p≤0.04)。
表17：CD4CD25调节T细胞中CTLA-4的百分比和平均荧光强度(MFI)。(平均值±标准偏差)。
总之，用经离子载体处理的负载抗原的RBC处理使得能够防止或降低预防性模型中抗原特异性T和B细胞应答。在这种治疗中，不仅抗原的量，而且每只小鼠注射的RBC的量也具有重要的作用。

Claims (20)

1.包含红细胞的组合物在制备诱导宿主中对肽或蛋白质活性物质免疫耐受的药物中的用途，所述红细胞含有所述肽或蛋白质活性物质，所述活性物质是治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，或者肽或蛋白质移植抗原，或者其混合物。
2.根据权利要求1的用途，其中所述红细胞已用双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐处理过。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述活性物质为有效治疗疾病的治疗性肽、多肽或蛋白质，所述活性物质包含在所述红细胞中用以诱导免疫耐受。
4.根据权利要求3的用途，其中所述治疗性肽、多肽或蛋白质为抗体或其片段、凝血因子或其片段、酶或其片段、或者生长因子或其片段。
5.根据权利要求3的用途，其中所述活性物质为用于酶替代疗法(ERT)的酶。
6.根据权利要求5的用途，其中所述活性物质为溶酶体酶。
7.根据权利要求6的用途，其中所述溶酶体酶为用于庞贝氏症(糖原贮积病II型)、法布瑞氏症或粘多糖储积症MPS I之替代疗法(ERT)的酶。
8.根据权利要求6的用途，其中所述溶酶体酶选自：α葡萄糖苷酶、拉罗尼酶以及α半乳糖苷酶A和阿加糖酶α。
9.根据权利要求3的用途，其中所述活性物质为用于治疗血友病的凝血因子。
10.根据权利要求9的用途，其中所述凝血因子为因子VII、因子VIII或因子IX。
11.根据权利要求1或2的用途，其中所述活性物质为肽或蛋白质自身抗原，并且含有所述自身抗原的所述红细胞组合物用于治疗自身免疫疾病。
12.根据权利要求11的用途，其中所述活性物质是针对风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、青少年糖尿病、葡萄膜炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、银屑病或者获得性重症肌无力的。
13.根据权利要求11的用途，其中所述活性物质是针对多发性硬化(MS)的髓磷脂碱性蛋白质，针对青少年糖尿病的β细胞抗原、前胰岛素、胰岛素样生长因子2(IGF2)或其混合物，针对葡萄膜炎的视网膜S抗原，或者针对获得性重症肌无力的乙酰胆碱受体。
14.根据权利要求1或2的用途，其中所述活性物质为肽或蛋白质移植抗原，并且含有所述抗原的红细胞组合物用于抗移植排斥。
15.根据权利要求1或2的用途，其中所述诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质为食物来源的。
16.根据权利要求1或2的用途，其中所述红细胞：(1)含有所述活性物质以及(2)为与识别红细胞表面上表位的免疫球蛋白形成的免疫复合物的形式，以促进肝脏靶向。
17.根据权利要求16的用途，其中所述红细胞与抗凝血因子或抗血型糖蛋白A或抗CR1的抗体形成免疫复合物。
18.根据权利要求1或2的用途，其中所述红细胞经化学处理以靶向肝脏。
19.根据权利要求14的用途，其中所述移植排斥是肾脏、心脏或肝脏移植排斥。
20.根据权利要求16的用途，其中所述免疫球蛋白是IgG。
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