CN102586176B - 一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，应用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法从胎盘组织中提取了能够支持人胚胎干细胞长期培养的细胞外基质蛋白即人源化基质，同时以人血浆为原料，以NaCl沉淀的方法获得的组分配制成的人源化培养基，与人源化基质共同构成无动物源、无饲养层的培养系统。这一培养系统能够长期维持人胚胎干细胞的自我更新以及分化的潜能，同时无动物源的人诱导多能干细胞细胞系也可在这一培养系统中建立，因此这一成本低廉，易于扩大培养的无动物源、无饲养层培养系统为多能干细胞的临床应用打下基础。

Description

一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统

技术领域

本发明细胞培养技术领域，特别涉及一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，适用于人多能干细胞的长时间培养。

背景技术

人多能干细胞典型特点是，在体外不断自我更新，同时保持向各个胚层细胞分化的潜能。由于人胚胎干细胞建立涉及伦理与法律等问题，其研究与应用受到一定的限制。而诱导多能干细胞很好地解决了人胚胎干细胞存在的伦理争议，同时由于其具有与人胚胎干细胞相似的特性，即自我更新与分化潜能，因而为再生医学尤其是个性化的治疗带来了希望。

人多能干细胞不仅为基础研究提供了独特的模型，而且在细胞移植治疗方面具有巨大的应用价值。然而在培养人多能干细胞时，其与动物源制品(如动物血清或动物蛋白)的接触会提高这种细胞吸收非人源代谢产物或被非人源病原污染的风险。例如，在有动物源成分存在的培养体系中，细胞会吸收并表达唾液酸Neu5Gc。由于人类循环系统中存在识别Neu5Gc的抗体，当含有Neu5Gc的细胞或组织移植入人体时，机体会识别这些非人源的抗原，从而对移植细胞或组织产生排斥反应，造成移植失败。同时饲养层的存在导致耗费大量的人力和物力，且饲养层细胞的批次性也会导致系统的不稳定性。因此，确定培养系统中的各种成分则有利于优化培养系统并具有较高的可重复性。

近年，研究者们研究发展出如下不同的人多能干细胞的培养系统：

(一)饲养层培养体系的发展

人多能干细胞最初在以小鼠的胚胎干细胞的培养系统衍化而来的条件下建立并进行培养的，即含有鼠胚胎成纤维细胞的饲养层以及含有胎牛血清的培养基。为降低培养系统中非人源成分，研究者尝试不同组织来源的人源细胞作为饲养层培养人多能干细胞。Richard(Richards，M.，Fong，C.Y.，Chan，W.K.，Wong，P.C.&Bongso，A.、Human feeders support prolonged undifferentiated growth of humaninner cell masses and embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2002、20、9、933-6。)等首次以胎儿/成人成纤维细胞作为饲养层，以人血清作为培养基，建立首个无动物源的培养系统。随后人骨髓来源间充质细胞，新生儿包皮细胞，人胚胎干细胞分化来源的成纤维样细胞，胎盘来源的间充质干细胞等被尝试用作人多能干细胞的饲养层。虽然各种人源细胞用于培养人多能干细胞，但是其支持人多能干细胞不分化的能力各不相同。这可能与细胞来源，培养条件的不同等因素有关。同时，制备饲养层的细胞也需要大量的人力、物力，其批次之间的差异性也无法解决。因此，发展无饲养层的培养系统具有更大的应用价值。

(二)无饲养层培养体系的发展

Xu(Xu，C.，et al.、Feeder-free growth of undifferentiated humanembryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971-4。)等首次报道将人多能干细胞培养在由Matrigel(BD公司)作为细胞外基质以及鼠胚胎成纤维细胞来源的条件培养基构成的无饲养层的培养系统内。两种培养系统内人胚胎干细胞的mRNA表达谱相似，说明在此无饲养层的培养系统内，细胞不会受到额外的刺激。Matrigel是鼠EHS瘤细胞的提取物，因其来源提高人多能干细胞临床应用的风险以及其成分的不确定性，因此研究者们尝试以纯化的蛋白或人工合成物替代Matrigel。在胚胎成纤维细胞来源的条件培养基作为培养基以及含牛血白蛋白的无血清培养基中，层黏连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和重组表达的玻璃粘连蛋白(Vitronectin)均被报道能够代替Matrigel长期维持人多能干细胞的增殖。2006年，Ludwig(Ludwig，T.E.，et al.、Derivation of human embryonic stem cells indefined conditions、Nat Biotechnol、2006、24、2、185-7。)等报道在成分明确的培养基TeSR中使用四种大分子的混合物包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白和胶原IV(Colagen IV)等成功培养人多能干细胞并在此培养系统中建立新的人多能干细胞细胞株。但由于此培养系统的高昂费用不便于推广应用。

(三)培养基的发展

在含有胎牛血清的培养体系中，很多干细胞死亡并大量分化。随后，Amit(Amit，M.，et al.、Clonally derived human embryonic stemcell lines maintain pluripotency and proliferative potential forprolonged periods of culture、Dev Biol、2000、227、2、271-8。)等尝试用KO SR(Invitrogen)代替胎牛血清降低了因血清批次间差异带来的不稳定性。随后Xu(Xu，C.，et al.、Feeder-free growth ofundifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971-4。)等应用鼠胚胎成纤维细胞来源的条件培养基，以Matrigel作为细胞外基质成分能长期维持人多能干细胞不分化的状态，也就是现在最广泛应用的培养方法。但是该培养直接接触到鼠源、牛源的物质，对将来应用的临床应用上会有很大的障碍。

发明内容

多能干细胞的培养需要有细胞外基质的支持，同时需要适合的培养基，然而现有的培养系统含有动物源制品，显然提高了多能干细胞吸收非人源代谢产物或被非人源病原污染的风险。鉴于现有技术的不足，本发明旨在克服这个难点，通过应用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法从胎盘组织中提取了能够支持人胚胎干细胞长期培养的细胞外基质蛋白即人源化基质，同时以人血浆为原料，以NaCl沉淀的方法获得的组分配制成的人源化培养基，与人源化基质共同构成无动物源、无饲养层的培养系统。

为实现该目的，本发明提供了一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，它包括支持人多能干细胞长期培养的人源化基质和人源化培养基，所述的人源化基质富含人IV型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白，所述的人源化培养基富含纤维粘连蛋白和玻璃连接蛋白。

优选地，所述的人多能干细胞培养系统中的人源化基质按如下步骤制备而成：

(1)新鲜胎盘去掉羊膜与脐带后，剪成不超过0.3×0.3×0.3cm大小的组织块，以冷水将组织块悬起，4℃搅拌，12h后，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织仍用冷水悬起，以冷水洗2天，每12h换水一次，第三次过滤后，将截留的组织用冷的1M NaCl缓冲液悬起，4℃搅拌；其中所述的NaCl缓冲液按如下方法配制：58.5g NaCl与25ml Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7.5，定容至1L；所述的Tris缓冲液按如下方法配制：242.28g Tris碱溶于800ml Milli-Q水中，调节pH至7.5，加Milli-Q水定容至1L；

(2)以冷的1M NaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次，第八次更换NaCl缓冲液时，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织用冷的0.5M醋酸溶液悬起，4℃搅拌；

(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h换液一次，第六次换0.5M醋酸溶液时，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织称重；以胃蛋白酶∶组织为1∶400的质量比加入胃蛋白酶，同时以200g/L将酶与组织块悬起于0.5M醋酸溶液中，4℃搅拌24h；

(4)7100g，4℃离心1h，去掉上清，收集沉淀并称重，以质量体积比为1∶1的条件加入2M尿素缓冲液，4℃搅拌24h；其中所述的尿素缓冲液按如下方法配制：240.0g尿素、12.1g Tris碱、18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水定容至2L；

(5)13000rpm，4℃离心30min，上清液装入25KD的透析袋中，以TBS缓冲液+0.5％氯仿为周围溶液于4℃透析2h，然后彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS缓冲液为周围溶液，继续4℃透析，每2h换TBS缓冲液一次，共换3次，最后一次透析时，4℃，过夜，透析好的液体，即为人源化基质；其中所述的TBS缓冲液按如下方法配制：12.1g Tris碱，18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水补齐至2L。

优选地，所述的人多能干细胞培养系统中的人源化培养基含有人血浆的NaCl沉淀组分。

优选地，所述的人血浆的NaCl沉淀组分按如下步骤制备而成：

(1)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均匀后再加入2MCaCl2至终浓度为20mM，混匀，置于37℃水浴锅孵育两小时，将已凝固的血浆，存于-20℃过夜；

(2)将处理过的血浆从-20℃冰箱拿出置于4℃冰箱，过夜解冻，高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清；

(3)在4℃冷柜中，向血清中缓慢、均匀地加入NaCl，至终浓度为28/100ml，搅拌过夜；

(4)高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒；

(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的双蒸水中搅拌透析2小时以上；

(6)重复步骤(5)两次；

(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培养基，搅拌透析过夜；

(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12培养基为对照，280nm测定蛋白浓度，0.22μm过滤后，保存于4℃，此即为血浆的NaCl沉淀组分。

上述步骤(1)中所述的林格液按如下方法配制：将NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl₂ 0.0242g，溶于100ml的双蒸水，用0.22μm的滤膜过滤备用。

与现有技术相比，本发明涉及的人多能干细胞培养系统具有如下优点和显著的进步：

(1)制备成本低。本发明以胎盘为原材料制备人源化基质，胎盘是一种富含细胞外基质蛋白的人体组织，婴儿出生后即被废弃，因而具有来源广泛，成本低廉等特点。

(2)无动物源、无饲养层。本发明应用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法从胎盘组织中提取了能够支持人胚胎干细胞长期培养的细胞外基质蛋白即人源化基质，同时以人血浆为原料，以NaCl沉淀的方法获得的组分配制成的人源化培养基，与人源化基质共同构成无动物源、无饲养层的培养系统。这一培养系统能够长期维持人胚胎干细胞的自我更新以及分化的潜能，同时无动物源的人诱导多能干细胞细胞系也可在这一培养系统中建立，因此这一成本低廉，易于扩大培养的无动物源、无饲养层培养系统为多能干细胞的临床应用打下基础。

(3)促进干细胞贴壁。与Matrigel的成分相似，本发明的细胞外基质富含人IV型胶原(Collagen IV)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)和层粘连蛋白(Laminin)(见图2-A、B、C)。同时，本发明通过以人的血浆为原材料，比较阴离子交换柱层析、饱和硫酸铵沉淀和NaCl沉淀的方法，最后选定利用NaCl沉淀的方法从人血浆中提取制成了血浆抽提物，配制成人源化的培养基，该培养基富含纤维粘连蛋白(Fibronectin)和玻璃连接蛋白(Vitronectin)(见图2-D、E)，对促进干细胞的贴壁有重要作用。

(4)可长时间培养人胚胎干细胞。通过实验证明，本发明的人源化细胞外基质和人血浆抽提物，可长时间培养人胚胎干细胞，经过39代(约270天)的培养，胚胎干细胞仍然保持核型的稳定(见图3-B)，并且具有和传统培养方法相似的形态学特征，干性相关基因的表达水平(见图3-A、C、D)。为了检测在该人源化系统中，干细胞是否能保持三胚层分化的全能性，发明人分别检测了其在体外、体内分化的能力(图4-A、B)。体外的EBs和体内畸胎瘤都检测到三胚层的代表标记。

(5)支持诱导产生诱导多能干细胞。更进一步，通过进行人多能干细胞的诱导试验证明，本发明的人源化干细胞培养系统能够支持诱导人皮肤细胞去分化成为诱导多能干细胞，诱导产生的诱导多能干细胞能表达多能性相关的蛋白(图5-A)以及相似的RNA表达水平(图5-B)。由于重编程的另一个主要特征是表观遗传的改变，发明人检测了Oct4与Nanog基因启动子的甲基化水平，结果显示诱导多能干细胞的甲基化水平与人真皮成纤维细胞相比大大降低，与干细胞的水平相近。这说明其形成确实经历了表观水平的变化(图5-C)，且诱导的诱导多能干细胞具有体外、体内的朝三胚层分化的潜能(图6-A、B)。

附图说明

通过下面结合附图对本发明的优选实施例进行的描述，本发明的技术方案及其技术效果将变得更加清楚，且更加易于理解。其中：

图1示出了本发明的人源化基质制备流程图。

图2示出了人源化基质(FCF matrix)及培养基(XF medium)大分子成分的电泳图。Western blot显示人源化基质中富含Collagen IV、Fibronectin和Laminin(A、B、C)，而培养基中富含Fibronectin以及Vitronectin等细胞外基质蛋白(D、E)。

图3示出了培养在本发明培养系统中的hESCs具有正常核型以及表达多能性相关的蛋白。(A)明场中培养在传统MEF-CM/MG系统(左)以及无动物源无饲养层(XF/FCF)系统的H7细胞的形态；(B)在XF/FCF中培养39代后，H7细胞的G-带染色结果；(C)FACS分析不同培养条件下，表达多能性相关的蛋白Oct4，SSEA4，TRA-1-60and TRA-1-81的H7细胞的百分比；两者之间没有明显区别。(D)定量RT-PCR分析不同培养系统中，H7细胞Oct4，Sox2 and Nanog的表达量(基因的表达水平以GAPDH的表达量归一)，两者之间没有明显区别。

图4示出了培养在XF/FCF的H7体内体外均具有向三胚层细胞分化的潜能。(A)RT-PCR分析由MEF-CM/MG(左)以及XF/FCF(右)培养的H7分化形成的EBs基因表达情况；(B)H7在XF/FCF培养14代后在NOD/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，对畸胎瘤进行苏木精-伊红染色。箭头指示来源于三胚层的典型结构。标尺，100μm。

图5示出了形成的hiPSCs表达多能性相关蛋白同时具有与胚胎干细胞hESCs相似的甲基化水平。(A)iPS细胞表达Oct4，SSEA4，TRA-1-60以及TRA-1-81等蛋白的免疫荧光染色，标尺，100μm；(B)定量RT-PCR分析H7与iPS细胞内Oct4，Sox2以及Nanog的表达量，基因的表达水平以GAPDH的表达量归一；(C)重亚硫酸盐测序分析H7，HDFs以及iPS细胞内，Oct4与Nanog启动子甲基化状态，空圈代表未甲基化的CpGs，黑圈代表甲基化的CpGs。

图6示出了形成的hiPSCs体内体外均具有向三胚层细胞分化的潜能。(A)RT-PCR分析由iPS(右)与H7(左)分化形成的EBs基因表达情况；(B)C1-OSN在XF/FCF培养7代后在NOD/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，对畸胎瘤进行苏木精-伊红染色。箭头指示来源于三胚层的典型结构。标尺，100μm。

具体实施方式

本发明提供的新型无动物源、无饲养层的干细胞培养系统主要包含二个主要的方面：1)干细胞赖以贴壁生长的细胞外基质(FCF matrix)；2)维持胚胎干细胞自我更新的细胞培养基(XF medium)。

1、人源化基质的提取

我们通过对Matrigel提取方法的优化，发展出了一种简单易行的从胎盘中提取细胞外基质的方法。

首先，我们从医院取得乙肝、艾滋病、梅毒等检测阴性的健康产妇的胎盘。根据人源化基质提取过程主要分为四部分(图1)，首先将胎盘组织剪碎，其次去除血液蛋白与细胞蛋白，再次提取细胞外基质蛋白的组分，最后除菌以及透析到TBS溶液中。

1、1准备试剂

(1)2M Tris缓冲液，pH 7.5

242.28g Tris碱溶于800ml Milli-Q水中，调节pH至7.5，加Milli-Q水补齐至1L。

(2)1M NaCl缓冲液，pH 7.5

58.5g NaCl与25ml 2M Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7.5补齐至1L。

(3)2M尿素缓冲液

240.0g尿素，12.1g Tris碱，18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水补齐至2L。

(4)TBS缓冲液

12.1g Tris碱，18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水补齐至2L。

(5)75％乙醇溶液。

所有溶液储存于4℃。

1、2准备胎盘

(1)取回的新鲜胎盘储存于冰盒内。

(2)去掉羊膜与脐带后，将胎盘剪成大概5×5cm的组织块，-80℃保存。

(3)提取基质时，将胎盘组织块取出，室温解冻。

(4)以解剖剪剪成不超过0.3×0.3×0.3cm大小的组织块，称取重量。

1、3实验步骤

(1)以2L左右的冷水将组织块悬起，4℃搅拌，12h后，用1mm×1mm的筛网过滤。将截留的组织仍用2L冷水悬起。

(2)以冷水洗2天，每12h换水一次。

(3)第三次过滤时，将截留的组织用2L冷的1M NaCl缓冲液悬起，4℃搅拌。

(4)以冷的1M NaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次。

(5)第八次更换NaCl缓冲液时，1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织用冷的0.5M醋酸溶液悬起，4℃搅拌。

(6)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h换液一次。

(7)第六次换0.5M醋酸溶液时，1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织称重。以胃蛋白酶∶组织为1∶400的质量比加入胃蛋白酶(pepsin)，同时以200g/L将酶与组织块悬起于0.5M醋酸溶液中。4℃搅拌24h。

(8)7100g，4℃离心，1h。去掉上清，收集沉淀并称重。

(9)以质量体积比为1∶1的条件加入2M尿素溶液。4℃搅拌24h。

(10)13000rpm，4℃离心30min。保留上清。

(11)上清装入25KD的透析袋中，以TBS+0.5％氯仿为周围溶液透析，4℃，2h。

(12)彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS为周围溶液，继续透析，4℃。

(13)每2h换TBS一次，共换3次，最后一次透析时，4℃，过夜。

(14)将透析好的液体，即为FCF matrix，在超净台内小心分装于1.5ml EP管内，尽量避免温度升高。保存于-20℃。

与Matrigel的成分相似，本发明制备的人源化基质富含人IV型胶原(Collagen IV)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)和层粘连蛋白(Laminin)(见图2-A、B、C)。

2、人源化培养基的制备

2、1准备试剂

(1)Ringer solution：

NaCl：0.9g，KCl：0.042g，CaCl2：0.0242g，溶于100ml的ddH20，用0.22um的滤膜过滤备用。

(2)2M CaCl₂：

CaCl2：11.1g，溶于50ml的ddH20，用0.22um的滤膜过滤备用。

2、2血浆处理

(1)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管。每管加入6ml的Ringer solution，混合均匀。再加入2M CaCl₂至终浓度为20mM，混匀，置于37℃水浴锅孵育两小时。

(2)将已凝固的血浆，存于-20℃过夜。

2、3实验步骤

(1)将处理过的血浆从-20℃冰箱拿出置于4℃冰箱，过夜解冻。

(2)高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清。

(3)在4℃冷柜中，缓慢、均匀的加入NaCl，至终浓度为28g/100ml，搅拌过夜。

(4)高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒。

(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的ddH20中搅拌透析2小时以上。

(6)重复步骤(5)两次。

(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12，搅拌透析过夜。

(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12为对照，280nm测定蛋白浓度，0.22μm过滤后，保存于4℃，此即为血浆的NaCl沉淀组分。

2、3人源化培养基配制

(1)微量元素的配制

Milli-Q水以浓HCl调节pH值至0.9-1.0。称取下列药品：

(2)氨基酸母液的配制

Milli-Q水以浓HCl调节pH值至0.9-1.0。称取下列药品：

		用量(mg)	终浓度(mg/l)
				1	glycine	150	150
2	L-histidine	940	940
				3	L-Isoleucine	3400	3400
4	L-Methionine	90	90
				5	L-Phenylalanine	1800	1800
6	L-Proline	4000	4000
				7	L-Hydroxyproline	100	100
8	L-Serine	800	800
				9	L-Threonine	2200	2200
10	L-Tryptophan	440	440
				11	L-Tyrosine	77	77
12	L-Valine	2400	2400

(3)Selenite溶液的配制

称取2.8mg selenite粉末溶于40ml Milli-Q水内，浓度为70μg/ml

(4)Insulin溶液的配制

25mM Hepes溶液，调节pH至8.2。称取388.8mg insulin粉末，加入67.76ml的25mM Hepes溶液，再加入20ul左右NaOH(10M)，调节pH至8.2，此时溶液变澄清。再用5ml 25mM Hepes溶液冲洗pH计探头等，并于insulin溶液混合，0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

(5)Thiamine-Reduced glutathione-Ascorbic acid-Mg(TRA)100×母液配制

(6)人源化培养基的配制

最后以DMEM/F12培养基将体积补齐至500ml，0.22μm过滤，4℃保存。

本发明通过以人的血浆为原材料，比较阴离子交换柱层析、饱和硫酸铵沉淀和NaCl沉淀的方法，最后选定利用NaCl沉淀的方法从人血浆中提取制成了血浆抽提物，配制成人源化的培养基，该培养基富含纤维粘连蛋白(Fibronectin)和玻璃连接蛋白(Vitronectin)(见图2-D、E)，对促进干细胞的贴壁有重要作用。

通过实验证明，本发明的人源化细胞外基质和人血浆抽提物，可长时间培养人胚胎干细胞，经过39代(约270天)的培养，胚胎干细胞仍然保持核型的稳定(见图3-B)，并且具有和传统培养方法相似的形态学特征，干性相关基因的表达水平(见图3-A、C、D)。为了检测在该人源化系统中，干细胞是否能保持三胚层分化的全能性，发明人分别检测了其在体外、体内分化的能力(图4-A、B)。体外的EBs和体内畸胎瘤都检测到三胚层的代表标记。

更进一步，通过进行人多能干细胞的诱导试验证明，本发明的人源化干细胞培养系统能够支持诱导人皮肤细胞去分化成为诱导多能干细胞，诱导产生的诱导多能干细胞能表达多能性相关的蛋白(图5-A)以及相似的RNA表达水平(图5-B)。由于重编程的另一个主要特征是表观遗传的改变，发明人检测了Oct4与Nanog基因启动子的甲基化水平，结果显示诱导多能干细胞的甲基化水平与人真皮成纤维细胞相比大大降低，与干细胞的水平相近。这说明其形成确实经历了表观水平的变化(图5-C)，且诱导的诱导多能干细胞具有体外、体内的朝三胚层分化的潜能(图6-A、B)。

对于所属技术领域的技术人员而言，随着技术的发展，本发明构思可以不同方式实现。本发明的实施方式并不仅限于以上描述的实施例，而且可在权利要求的范围内进行变化。

Claims (1)

1.一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养系统，其特征在于：包括支持人多能干细胞长期培养的人源化基质和人源化培养基，所述的人源化基质富含人IV型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白，所述的人源化培养基富含纤维粘连蛋白和玻璃连接蛋白；

所述的人源化基质按如下步骤制备而成：

(1)新鲜胎盘去掉羊膜与脐带后，剪成不超过0.3×0.3×0.3cm大小的组织块，以冷水将组织块悬起，4℃搅拌，12h后，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织仍用冷水悬起，以冷水洗2天，每12h换水一次，第三次过滤后，将截留的组织用冷的1M NaCl缓冲液悬起，4℃搅拌；其中所述的NaCl缓冲液按如下方法配制：58.5g NaCl与25ml Tris缓冲液，溶于Milli-Q水中，调节pH至7.5，定容至1L；所述的Tris缓冲液按如下方法配制：242.28g Tris碱溶于800ml Milli-Q水中，调节pH至7.5，加Milli-Q水定容至1L；

(2)以冷的1M NaCl缓冲液洗4天，每12h换液一次，第八次更换NaCl缓冲液时，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织用冷的0.5M醋酸溶液悬起，4℃搅拌；

(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h换液一次，第六次换0.5M醋酸溶液时，用1mm×1mm的筛网过滤，将截留的组织称重；以胃蛋白酶：组织为1∶400的质量比加入胃蛋白酶，同时以200g/L将酶与组织块悬起于0.5M醋酸溶液中，4℃搅拌24h；

(4)7100g，4℃离心1h，去掉上清，收集沉淀并称重，以质量体积比为1∶1的条件加入2M尿素缓冲液，4℃搅拌24h；其中所述的尿素缓冲液按如下方法配制：240.0g尿素、12.1g Tris碱、18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水定容至2L；

(5)13000rpm，4℃离心30min，上清液装入25KD的透析袋中，以TBS缓冲液+0.5％氯仿为周围溶液于4℃透析2h，然后彻底清洗烧杯与透析袋外表面后，以冷的TBS缓冲液为周围溶液，继续4℃透析， 每2h换TBS缓冲液一次，共换3次，最后一次透析时，4℃，过夜，透析好的液体，即为人源化基质；其中所述的TBS缓冲液按如下方法配制：12.1g Tris碱，18.0g NaCl溶于1.8L Milli-Q水中，浓HCl调节pH至7.4，Milli-Q水补齐至2L

所述的人源化培养基含有人血浆的NaCl沉淀组分，所述的人血浆的NaCl沉淀组分按如下步骤制备而成：

(1)将经过安全检测的四种血型的血浆，以等体积比例混合，分装成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均匀后再加入2M CaCl₂至终浓度为20mM，混匀，置于37℃水浴锅孵育两小时，将已凝固的血浆，存于-20℃过夜；所述的林格液按如下方法配制：将NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl2 0.0242g，溶于100ml的双蒸水，用0.22um的滤膜过滤备用；

(2)将处理过的血浆从-20℃冰箱拿出置于4℃冰箱，过夜解冻，高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，即是血浆来源的血清；

(3)在4℃冷柜中，向血清中缓慢、均匀地加入NaCl，至终浓度为28g/100ml，搅拌过夜；

(4)高速冷冻离心机在4℃，以16000rpm离心30分钟，收集上清，将收集的上清用滤纸过滤掉悬浮的小颗粒；

(5)将过滤的上清，装入25KD的透析袋中，在冷的双蒸水中搅拌透析2小时以上；

(6)重复步骤(5)两次；

(7)将步骤6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培养基，搅拌透析过夜；

(8)取出透析袋内的溶液，以外部DMEM/F12培养基为对照，280nm测定蛋白浓度，0.22μm过滤后，保存于4℃，此即为血浆的NaCl沉淀组分。 

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