CN102585007A - 用于检测β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别β-胡萝卜素类色素的特异性单克隆抗体和一种用于检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫方法及试剂盒。本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞DCC/C11所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201146。本发明的酶联免疫检测方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤。本发明的酶联免疫检测方法及试剂盒能一次性测出样品中斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸的总含量，缩短了检测时间，降低了检测成本，同时具有检测灵敏度高、精密度好、准确性好的特点。

Description

用于检测β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明涉及一种能识别β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体和一种用于检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫方法及试剂盒。

背景技术

β-胡萝卜素类色素有β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯、叶黄素、辣椒红、斑蝥黄、虾青素等。

目前，对β-胡萝卜素类物质的检测方法主要是仪器检测法，如纸层析法、薄层层析法、柱层析法、分光光度法、高效液相色谱或液质联用法。这些检测方法需要配备昂贵的仪器和专业性强的操作人员，样品的前处理复杂，检测时间长，不利于大批量样品的筛选，不能在现场进行快速的检测。酶联免疫检测方法(ELISA)是利用免疫反应(即抗原-抗体结合反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对药物进行定性和定量分析的一种综合性检测技术。它具有操作简便、高通量、高灵敏度、低费用等优点，能克服仪器检测方法的不足。目前，国内外没有针对β-胡萝卜素类的ELISA检测方法的文献报道。

对于小分子化合物ELISA检测方法的建立，小分子化合物的抗体制备是核心部分，而合理设计半抗原又是关键。半抗原的化学结构不同，连接到载体蛋白上的化学位点就不同，交联臂的化学性质也不同，而这是影响小分子化合物抗体性质的决定性因素。因此对小分子化合物进行化学结构改造，合理设计半抗原，将半抗原连接到载体蛋白上，是该发明的核心。

申请人检索到一篇申请号为201010140887.6的发明专利，该专利提供了一种氧化α-紫罗酮和β-紫罗酮的方法，但是并没有将其作为半抗原合成免疫原及应用于酶联免疫检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能识别β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能检测β-胡萝卜素类色素的ELISA方法。

本发明的第三个目的是提供一种检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在动物组织β-胡萝卜素类色素残留检测中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种能识别β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO：C201146杂交瘤细胞DCC/C11所分泌的。

所述胡萝卜素类色素指的是斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸。

所述杂交瘤细胞DCC/C11保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C201146。

所用的免疫原是通过半抗原β-紫罗酮酸与牛血清白蛋白偶联制备得到的。

进一步，本发明提供了一种检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下：

(1)将半抗原β-紫罗酮酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；

(2)将半抗原4-氧代-β-紫罗酮酸与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；

(3)利用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；

(6)将待测样品用体积比为乙酸乙酯∶氢氧化钠(2％)＝2∶1的混合溶液提取，经乙酸乙酯萃取和氮气吹干后，残渣用样品稀释液溶解得到待测物；

(7)对步骤(6)的待测物进行酶联免疫检测，

其中：

样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，N’，N’-二甲基乙酰胺20mL，加双蒸水至1000mL。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对β-胡萝卜素类色素的酶联免疫检测。

本发明的有益效果是：

1、本发明制备的单克隆抗体能识别β-胡萝卜素类色素中的斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸，专属性强，灵敏度高。

2、由于本发明采用β-紫罗酮酸作为半抗原，该半抗原保留了斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素所共有的化学结构，由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸。

3、本发明的ELISA方法和试剂盒能一次性测出待测物中斑蝥黄、β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸的总含量，缩短了检测时间，降低了检测成本。

4、本发明的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度高、精密度好、准确性好。

附图说明

附图1为本发明的技术路线图。

附图2为本发明的单克隆抗体与斑蝥黄(CTX)标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为斑蝥黄(CTX)标准溶液浓度对数值，Y轴为斑蝥黄标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B₀)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1 免疫原和包被原的制备

1.1 β-紫罗酮酸的合成

准确量取蒸馏水30mL，加入到预冷的圆底烧瓶中；向烧瓶中加入液溴20g，搅拌2小时后，形成A液备用。准确β-紫罗酮6g，溶解于二氧杂环己烷20mL中，形成B液。将B液加入A液中，室温下反应8小时。反应完成后，加入20％亚硫酸氢钠直到淀粉碘化钾试纸不再变蓝。然后加入浓盐酸至溶液中出现白色固体物质。过滤，将滤渣白色固体物质投入甲醇中，置60℃水浴搅拌至完全溶解后，过滤。将滤液置于-20℃过夜后过滤，滤饼置于50℃真空干燥箱中干燥，得到的产物进行质谱鉴定为β-紫罗酮酸。

1.2 β-紫罗酮酸-BSA的合成

取β-紫罗酮酸93mg，1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)50mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)33mg溶解于二氧杂环己烷5mL，室温避光搅拌8小时，反应产物过滤后形成A液。另取BSA80mg溶解于磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH8.0)20mL中，形成B液。冰浴搅拌下，将A液滴加到B液；将反应12小时后的反应液于4000r/分钟离心10分钟；取上清装入透析袋中，对生理盐水透析5-6天，即得偶联物β-紫罗酮酸-BSA。离心后取上清冷冻干燥，置-20℃保存，作为免疫原。

1.3 4-氧代-β-紫罗酮的合成

将β-紫罗酮20g和二氯甲烷60ml加入到三口瓶中；水浴加热至37℃，加入15ml含有2g碘化钾的水溶液和6ml含有3g硫酸氢钠的水溶液。搅拌条件下，再加入含有8g溴酸钠的20ml水溶液，反应完成后，分离有机相。该有机相用8g无水硫酸镁干燥后，旋蒸浓缩。用石油醚和丙酮进行柱层析，分离目标物质。将分离出来的目标物质旋蒸浓缩后，加入同体积的石油醚，置-20℃过夜后过滤。滤饼置于50℃真空干燥箱中干燥，得到的产物进行质谱鉴定为4-氧代-β-紫罗酮。

1.4 4-氧代β-紫罗酮酸(4-keto-β-ionone acid)的合成

准确称取NaOH4g，溶于20mL水中，滴入溴素2mL，继续搅拌。称取4-氧代-β-紫罗酮粗品1.2g，溶于二氧杂环己烷4mL，加入上述活化好的反应液中，至淀粉碘化钾试纸不再变蓝时停止反应。加入30％的NaHSO₄16mL，用二氯甲烷萃取除杂，对水相加入浓盐酸酸化，静置至出现红色沉淀。沉淀过滤后，滤渣用二氯甲烷溶解，采用石油醚和乙醇柱层析，分离目标物质。将分离出来的目标物质旋蒸浓缩后，加入同体积的二氯甲烷，置于-20℃过夜后过滤。滤饼置于50℃真空干燥箱中干燥，得到的产物进行质谱鉴定为4-氧代-β-紫罗酮酸。

1.5 4-氧代-β-紫罗酮酸-OVA(4-keto-β-ionone acid-OVA)的合成

取4-氧代β-紫罗酮酸48mg，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)2mL，然后加入三乙胺60μL，再加入氯甲酸异丁酯60μL，室温下搅拌反应60分钟，形成A液。另取OVA100mg溶解在30mL0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中，形成B液。将A液滴加到B液中，搅拌反应16小时。反应完成后，将反应液在5000r/分钟、4℃离心10分钟。取上清液对生理盐水彻底透析，即得偶联物4-氧代-β-紫罗酮酸-OVA。离心后取上清冷冻干燥，置-20℃保存，作为包被原。

实施例2 单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞的制备：参照薛庆善《体外培养的原理与技术》(科学出版社2001年版)中的方法：以实施例1制备的偶联物β-紫罗酮酸-BSA免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)。免疫程序是取含偶联物β-紫罗酮酸-BSA 125μg的蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化后，于小鼠背部皮下多点注射。以后每间隔2周加强一次，换用不完全佐剂(购自sigma公司)乳化。最后于融合前三天(最好与上次免疫相隔4周以上)，腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

融合时，取经最后强化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5分钟消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1-2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫脾细胞(1∶10～1∶15)的比例于50mL离心管中混匀，1500r/分钟，离心10分钟。倒净上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1分钟内慢慢滴入预温至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL(购自sigma公司产品)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌1分钟。然后慢慢加入37℃预温的1640(购自Hyclone公司商业培养基)基础培养基10mL。具体方法为：第一分钟逐滴滴入1mL，第二分钟加1mL，第3～4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL 1640液，也需慢慢加入。800r/m离心5分钟，去上清，于37℃放置5～8分钟。用HAT(购自Sigma公司)培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μL/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。融合后第二天开始观察有无污染，于第4天补加1滴HAT培养基，第8～10天吸去100μL培养基换HT(购自sigma公司)培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。采用4-氧代-β-紫罗酮酸-OVA作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗斑蝥黄抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版)进行克隆、筛选。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗β-胡萝卜类色素抗体的单克隆杂交瘤细胞。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为58，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在92～104之间，均高于两亲本细胞的染色体数目。杂交瘤细胞的染色体数目明显多于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。对筛选出的该单克隆杂交瘤细胞，申请人将其命名为DCC/C11，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：C201146。

腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11扩大培养的细胞，并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京：人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG₁亚型。

实施例3 ELISA检测方法的建立

3.1 试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加超纯水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，吐温200.5mL，加超纯水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：卵清蛋白0.1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物溶液：由武汉飞远科技有限公司提供。

终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2 包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

以方阵滴定法初步选择包被原和抗体的工作浓度组合。使用包被液将包被原4-keto-β-ionone acid-OVA倍比稀释成0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL横向包被酶标板；DCC/C11单克隆抗体使用抗体稀释液(购自武汉飞远科技有限公司)倍比稀释成1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000纵向加入酶标板。方阵滴定结果见表1，初步选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：(2，1000)、(4，4000)、(8，8000)和(16，16000)。

结果如表1，初步确定包被原4-keto-β-ionone acid-OVA的包被浓度为8μg/mL，抗体工作浓度为1∶8000。

表1 DCC/C11单克隆抗体方阵滴定

3.3 最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

以方阵滴定选择的包被浓度和抗体稀释度组合分别作抑制曲线，CTX标准品浓度设置为0、1、2、3、4、5μg/mL，其“0”孔与IC₅₀值见表2。抗原抗体的比例是影响其灵敏度的关键，如果出现抗原或抗体过剩都将造成IC₅₀偏高，由数据可见，最佳包被浓度为8μg/mL，抗体稀释度初步确定为1∶8000。

最佳抗体稀释度确定：以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1∶8000为中心浓度等差设计4个稀释梯度，其0孔与IC₅₀值见表3。随着抗体稀释度的增加，IC₅₀值降低，但是“0”孔值也降低，当0孔值过低时其IC₅₀值反而升高，因此选择1∶8000为最佳抗体稀释度。

表2 最佳包被浓度优化

包被原浓度(μg/mL)	抗体稀释倍数(1∶X)	0孔OD值	IC50值(μg/mL)
				2	1000	1.77	5.3
4	4000	1.5	4.7
				8	8000	1.63	2.7
16	16000	1.44	4.8

表3 最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数(1∶X)	0孔OD值	IC50值(μg/mL)
			6000	1.755	2.93
7000	1.712	3.46
			8000	1.6	2.93
9000	1.48	3.17
			10000	1.38	3.58

3.4 标准曲线的建立

将CTX标准品配制成0、1、2、3、4、5μg/mL等6个浓度梯度，按照上面确定的间接竞争ELISA方法测定，绘制标准曲线。如图2所示，本发明间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：y＝-0.7076+0.8366，r＝0.996，IC₅₀值为3.05±0.274μg/mL，线性范围为1-5μg/mL。

3.5 特异性

分别将各种β-胡萝卜素类的药物及其结构相似的物质标准品倍比稀释成浓度梯度进行间接竞争ELISA，计算IC₅₀值，与CTX标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率，结果见表4。结果表明，本研究建立的间接竞争ELISA方法对β-胡萝卜素、β-阿朴-8’-胡萝卜素醛、叶黄素、辣椒红素、β-紫罗酮酸有很好交叉反应，与β-紫罗酮有一定的交叉反应，而与4-氧代-β-紫罗酮酸、视黄酸、视黄醇均无交叉反应。

表4 本发明ELISA检测方法的特异性

竞争物	IC50(μg/mL)	交叉反应率(％)
			斑蝥黄	2.99	100
β-胡萝卜素	3.22	92.9
			β-阿朴-8′-胡萝卜素醛	3.06	97.7
叶黄素	3.12	95.8
			辣椒红素	3.32	90.1
β-紫罗酮酸	2.13	140.4
			β-紫罗酮	44.33	6.7
4-氧代-β-紫罗酮酸	＞10000	＜0.03
			视黄酸	＞10000	＜0.03
视黄醇	＞10000	＜0.03

实施例4 ELISA检测试剂盒的组装

4.1 试剂盒组成成分

(1)包被有包被原4-keto-β-ionone acid-OVA的酶标板；

(2)CTX标准品溶液6瓶，浓度分别为0、1、2、3、4、5μg/mL；

(3)保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11单克隆抗体工作液；

(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

(5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 4.00g，Na₂HPO₄·12H₂O58.00g，KCl 2.00g，加双蒸水至1000mL；

(6)浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，Tween 20 5mL，加双蒸水至1000mL

(7)底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。

(8)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2 酶标板的制备

(1)包被：用包被液将包被原4-keto-β-ionone acid-OVA稀释成8μg/mL，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12小时。

(2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次，拍干。

(3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2小时。

(4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30秒后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次，拍干。

(5)烘干：将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5小时。

(6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。

实施例5 动物组织中β-胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒测定程序

5.1 试剂配制

洗涤液配制：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl2.00g，吐温20 5mL，加双蒸水至1000mL。

样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，N’，N’-二甲基乙酰胺20mL，加双蒸水至1000mL。

底物混合液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1∶100的比例混匀，现配现用。

5.2 组织样品处理

称取鸡肌肉匀质样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入乙酸乙酯10mL，立即漩涡混合1分钟使样品分散完全。加入2％氢氧化钠溶液5mL，漩涡混合5分钟；4000r/分钟离心5分钟，取上清液5mL于10mL离心管中40-50℃氮气吹干。残渣用N，N-二甲基乙酰胺0.5ml溶解，再取50μL用样品稀释液稀释4倍后上样检测。

注：本方法对鸡肌肉的稀释倍数是2。

5.3 ELISA测定程序

(1)取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

(2)先加CTX标准品溶液或样品液50μL到各微孔中；标准品和样品做两个平行，记录标准品和样品的位置。再加保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11单克隆抗体工作液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育30分钟。

(3)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次。

(4)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育30分钟。

(5)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤3次。

(6)加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15分钟。

(7)加终止液50μL至各孔；30分钟内在450nm处测量吸光值。

5.4 结果判定

将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100％，即为抑制率。在1-5μg/mL范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以相应的稀释倍数，即为样品中β-胡萝卜素类的残留浓度。

实施例6 试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1 本发明试剂盒的灵敏度

取20份空白组织样品，进行ELISA检测，测定OD值，计算空白样品OD值的平均值

将

代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的最低检测限(LOD)。如表5所示，斑蝥黄在鸡肌肉中的最低检测限为1.29μg/g。

表5 斑蝥黄在鸡肌肉中的最低检测限

6.2 本发明试剂盒的精密度实验

分别将1、2、3、4、5μg/mL等CTX标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表6。结果表明，标准曲线的板内变异系数均＜15％，板间变异系数均＜20％，说明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有较好的精密度。

表6 本发明试剂盒的精密度

6.3 本发明试剂盒的准确度

用添加回收率反映试剂盒的准确度。取空白组织样品，按照药物在各种组织中的最高残留限量(MRL)分别进行添加实验，使组织中添加药物的浓度为0.5×MRL、MRL、2×MRL，每个样品浓度设置5个平行样。样品处理后ELISA测定药物浓度，重复3批，计算回收率批内和批间变异系数。如表7所示，药物回收率在77.05％～122.12％之间，批内和批间差异均小于25％。

表7 本发明试剂盒的准确度

Claims (7)

1.一种能识别β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO：C201146杂交瘤细胞DCC/C11所分泌的。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞DCC/C11，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201146。

3.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是用于检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒。

5.一种用于检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下：

(1)将半抗原β-紫罗酮酸与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

(2)将半抗原4-氧代-β-紫罗酮酸与卵清蛋白偶联得到包被原；

(3)利用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201146的杂交瘤细胞DCC/C11制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；

(6)将待测样品用体积比为乙酸乙酯∶氢氧化钠(2％)＝2∶1的混合溶液提取，经乙酸乙酯萃取和氮气吹干后，残渣用样品稀释液溶解得到待测物；

(7)对步骤(6)的待测物进行酶联免疫检测，

其中：

样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，N’，N’-二甲基乙酰胺20mL，加双蒸水至1000mL。

6.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测β-胡萝卜素类色素的酶联免疫试剂盒中的应用。

7.权利要求3或4所述的试剂盒在动物组织β-胡萝卜素类色素残留检测中的应用。

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