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CN102575248A - 用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA表达盒 - Google Patents

用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA表达盒 Download PDF

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CN102575248A CN201080028461XA CN201080028461A CN102575248A CN 102575248 A CN102575248 A CN 102575248A CN 201080028461X A CN201080028461X A CN 201080028461XA CN 201080028461 A CN201080028461 A CN 201080028461A CN 102575248 A CN102575248 A CN 102575248A
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Abstract

本发明涉及一种用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA，并且更具体地，涉及多顺反子shRNA表达盒，包含所述多顺反子shRNA表达盒的表达载体，用所述多顺反子shRNA表达载体转导的细胞，所述表达载体和转运体的复合物，抑制各种靶基因的方法，以及包含所述表达载体的用于抑制靶基因的组合物。

Description

用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA表达盒
发明背景
1.发明领域
本发明涉及用于抑制单或多靶基因的多顺反子shRNA，并且更具体地，涉及多顺反子shRNA表达盒，包含所述多顺反子shRNA表达盒的表达载体，用所述多顺反子shRNA表达载体转导的细胞，所述表达载体和转运体的复合物，抑制各种靶基因的方法，以及包含所述表达载体的用于抑制靶基因的组合物。
2.相关领域描述
RNA干扰(在下文中，被称为RNAi)是指通过细胞内引入双链RNA(dsRNA)选择性诱导靶mRNA降解以及靶基因沉默的现象，所述双链RNA(dsRNA)由与靶基因的mRNA同源的正义RNA和具有与所述正义RNA互补的序列的反义RNA组成。通过RNAi的选择性靶基因沉默代替通过同源重组的常规低效的基因阻断作为简单的基因敲低(knock-down)或基因治疗，越来越受关注和广泛利用。化学合成的小干扰RNA(在下文中，被称为“siRNA”)和启动子-依赖型表达的小发夹RNA(在下文中，被称为“shRNA”)在体外和体内显示有效力的基因沉默活性。然而，与化学合成的siRNA相比，启动子-依赖型shRNA提供几个优势特点，包括在细胞和整个有机体内稳定表达，组成型或诱导型表达，以及细胞类型特异性表达。可以将shRNA分成两种不同的类型：第一代和第二代shRNA(图1)。第一代shRNA简单地模拟化学合成的siRNA，而第二代shRNA源自在各种有机体内表达的天然microRNA，并且显示更强的功能性。第二代shRNA的结构特征(图1)还允许更灵活地选择启动子和靶shRNA序列。
在siRNA的情况下，作用于不同位点的混合siRNA比作用于单一位点的单个siRNA被更频繁地用于沉默单靶基因，因为作用于不同位点的混合siRNA显示更强的沉默活性，并且各种siRNA可以通过化学合成容易地制备。还将作用于不同位点的混合siRNA用于沉默多个不同的基因，从而适当地沉默各种基因。相反地，启动子-依赖型shRNA主要用作单顺反子，致使仅沉默一个单靶基因。因此，为利用启动子-依赖型shRNA沉默多靶基因，递送对应于靶基因数量的多个shRNA表达构建体是必要的。因而，若利用仅仅一个单一shRNA表达构建体可以沉默多靶基因，该方法将显著最小化由使用多个表达构建体引起的忧虑，包括难以表达等摩尔量的shRNA，相同的启动子重复序列之间重组频率高，以及shRNA表达构建体在治疗手段如基因治疗的开发中的质量控制。此外，该方法将允许简便且快速地分析多靶基因的功能。
为了通过利用一个shRNA表达构建体沉默单或多靶基因的目的，本发明人注意到第二代shRNA，尤其是源自mir-30的shRNA，因为该shRNA已被更好地表征结构和核酸酶剪切位点。本发明人假设mir-30microRNA的结构特征，重要的是与microRNA的先导序列相关的结构灵活性，可能允许形成表达含有多shRNA的多顺反子转录本的盒。本发明人做出努力以证明该假设，由此完成了本发明。
发明简述
本发明的目的是提供多顺反子shRNA表达盒，其包含启动子和可操作地连接到所述启动子的两个或更多个编码对靶基因特异的shRNA(小发夹RNA)的多聚核苷酸。
本发明的另一个目的是提供包含所述表达盒的表达载体，用所述表达载体转导的细胞，以及所述载体和转运体的复合物。
本发明的又一个目的是提供利用所述表达盒抑制各种目的靶基因的方法。
本发明的还一个目的是提供包含所述表达载体的用于抑制靶基因的组合物。
附图简要说明
图1显示siRNA、第一代shRNA和第二代shRNA的结构比较，其中比较了化学合成的siRNA和两种不同的shRNA，并且核苷酸链各自标示于框内，而颜色相反的框指示靶基因的正义和反义序列，并且在第二代shRNA中，圈出的是用于相应转录本正义链的第一个核苷酸，并且核酸酶剪切位点由Drosha和Dicer的直线标示。
图2显示单独的shRNA表达构建体的功能测试，其中：
A.显示源自mir-30的模板shRNA序列，除核苷酸链外，该序列标示于框内，而颜色相反的框通常用作制备所有shRNA表达构建体的模板；
B.显示设计用于沉默人XIAP、Akt和Bcl-2的shRNA序列，其中核苷酸链各自标示于框内，而颜色相反的框指示靶基因的正义和反义序列；
C.显示将与同源shRNA相应的插入DNA序列克隆至穿梭载体中用于生产腺病毒；
D.显示制备腺病毒，其中通过Cre-lox重组产生表达shRNA的腺病毒；及
E.显示用于表达单顺反子shRNA的腺病毒的沉默活性测试，其中用Ad-空对照病毒或每一Ad-shRNA感染HCT116细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。
图3显示通过多顺反子shRNA表达载体沉默基因，其中：
A.为用于含有多个shRNA的pAdlox(K)穿梭载体的示意图；
B.显示制备表达多顺反子shRNA的腺病毒，其中通过Cre-lox重组产生Ad-multi_shRNA；及
C.显示用于表达多顺反子shRNA的腺病毒的沉默活性测试，其中用Ad-空对照病毒或Ad-multi_shRNA感染HCT116细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。
图4显示用于由一个多顺反子转录本产生不同shRNA的过程的模型，其中转录和shRNA加工合并发生，以逐步的方式加工在一个单个转录本的每一shRNA单位，并且一旦转录第一个shRNA，它形成独特的结构并由主要位于细胞核内的核酸酶Drosha剪切，Drosha-剪切的shRNA被输出至细胞溶质并由细胞溶质的核酸酶Dicer进一步加工，并且不断重复这一完整的循环以产生在多顺反子转录本中编码的所有shRNA。
图5显示用于沉默一个单靶基因的多顺反子shRNA表达载体的组成，其中：
A.显示多顺反子shRNA表达载体中的shRNA各自靶向单靶基因的不同位点；以及
B.显示多顺反子shRNA表达载体中的shRNA各自靶向单靶基因的不同位点(ABC型)，或者单靶基因的相同位点(AAA、BBB、CCC型)。
图6显示用于单靶基因的多顺反子shRNA的组成，所述单靶基因即通过多顺反子mFas shRNA表达载体沉默的基因，其中：
A.显示设计用于沉默mFas的每一shRNA序列，核苷酸链各自标示于框内，而颜色相反的框指示靶基因的正义和反义序列；
B.显示制备表达多顺反子mFas shRNA的腺病毒，其中通过Cre-lox重组产生Ad-multi_shRNA(O、M、Q、R型)；
C.显示用于表达多顺反子shRNA的腺病毒的沉默活性测试，其中用Ad-空对照病毒或Ad-multi_shRNA(O：mFas#1-#2-#3)或Ad-multi_shRNA(M：mFas#1-#1-#1)或Ad-multi_shRNA(Q：mFas#2-#2-#2)或Ad-multi_shRNA(R：mFas#3-#3-#3)感染Hepa1-6细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。
D.显示比较表达单顺反子shRNA与多顺反子shRNA的腺病毒之间的沉默活性，其中用Ad-mFas #1对照病毒或Ad-multi_shRNA(O：mFas#1-#2-#3)或Ad-multi_shRNA(M：mFas#1-#1-#1)感染Hepa1-6细胞，随后裂解72小时并进行蛋白免疫印迹分析，并且β-肌动蛋白的蛋白水平用作内参照。以及
图7显示用于沉默单或多靶基因的多顺反子shRNA表达载体的组成，其中：
A.显示用于沉默单靶基因的多顺反子shRNA表达载体的组成，并且shRNA作用于靶向靶基因的两个或更多个位点(标记为A(N))，以及对应于每一作用位点的shRNA是相同的且数量为两个或更多个(标记为a1、a2等)；及
B.显示用于同时沉默多靶基因的多顺反子shRNA表达载体的组成，并且shRNA作用于靶向每一靶基因(标记为靶(1)、靶(2)等)的两个或更多个位点(标记为A(N)、B(N)等)，以及对应于每一作用位点的shRNA是相同的且数量为两个或更多个(标记为a1、a2等)。
优选实施方案详述
在一个实施方案中，为实现上述目的，本发明涉及多顺反子shRNA表达盒，其包含启动子和可操作地连接到所述启动子的两个或更多个编码对靶基因特异的shRNA(小发夹RNA)的多聚核苷酸。
如本文所使用的术语“启动子”是指通常位于编码区上游的不翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶的结合位点，并且起始启动子下游的基因转录成mRNA。在本发明的表达盒中，可以使用任何一种启动子，只要它能够起始shRNA表达。特别地，本发明的启动子可以是组成型启动子，其组成地诱导靶基因的表达，或是诱导型启动子，其在特定位点和特定时间诱导靶基因的表达，所述启动子的实例包括U6启动子、H1启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、SV40启动子、CAG启动子(Hitoshi Niwa等，Gene，108：193-199，1991)、CaMV 35S启动子(Odell等，Nature 313：810-812，1985)、Rsyn7启动子(美国专利申请号08/991,601)、水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，Plant Cell 2：163-171，1990)、泛素启动子(Christensen等，PlantMol.Biol.12：619-632，1989)、以及ALS启动子(美国专利申请号08/409,297)。此外，对本领域技术人员来说显而易见的任何一种已知的启动子，如可以使用但不限于美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463和5,608,142中公开的启动子。优选地，本发明的启动子可以是U6启动子、H1启动子或CMV启动子。根据本发明的一个优选实施方案，可以使用CMV启动子。
如本文所使用，术语“靶基因”意指打算要被沉默的基因，并且它可能是通过靶基因特异性的shRNA的表达而被沉默。本发明中的靶基因包括其功能可以由靶基因特异性的shRNA沉默的所有基因，并且优选XIAP(X-染色体连锁的凋亡抑制蛋白)、Akt、Bcl-2或Fas。
如本文所使用，术语“shRNA”意指50至100个核苷酸的单链RNA在细胞中形成茎-环结构，其包含5至30个核苷酸的环区和位于环区两侧的15至50个核苷酸的长互补RNA，所述长互补RNA在互补RNA之间通过碱基互补形成双链茎；以及在形成茎的每一互补链之前和之后包括另外的1至500个核苷酸。shRNA在细胞中通常由RNA聚合酶转录，随后在细胞核内由Drosha剪切，并且所剪切的shRNA从细胞核输出到细胞溶质，接着在细胞溶质中由Dicer进一步剪切。与siRNA类似，shRNA以序列特异性的方式结合靶mRNA，从而剪切和破坏靶mRNA，从而抑制靶mRNA的表达。本发明的编码shRNA的多聚核苷酸可以由源自microRNA的序列制备，并且并不特别限定microRNA的类型，优选的一种microRNA是源自mir-30的序列。特别地，本发明的编码shRNA的多聚核苷酸可以通过将源自mir-30的先导序列连接到待沉默的靶基因的正义链来制备。优选地，本发明的用于沉默XIAP的shRNA可以具有SEQ ID NO.2的正义链，用于沉默Akt的shRNA可以具有SEQ ID NO.3的正义链，用于沉默Bcl-2的shRNA可以具有SEQ ID NO.4的正义链，以及用于沉默mFas的shRNA可以具有SEQID NO.5、6或7的正义链。在实施例3的图3C中观测到由本发明的多顺反子shRNA多重和同时沉默XIAP、Akt、和Bcl-2基因。此外，在实施例3的图6C和图6D中检测了由本发明的多顺反子shRNA多重和同时沉默mFas。
以上结果中，用于基因敲低的多顺反子shRNAs表达构建体中的每一shRNA作用于相应靶基因的每一mRNA。
在本发明中，靶向靶基因的mRNA的shRNA可能作用于单靶基因的单个位点或不同位点，以及可能作用于两个或更多个不同的靶基因中的每一靶基因的单个位点或不同位点。为了利用本发明的多顺反子shRNA表达盒高效地沉默靶基因，优选的是shRNA作用于单靶基因的两个或更多个不同的位点，以及对应于每一位点的shRNA具有相同的序列，并且数量是两个或更多个。为高效地沉默两个或更多个不同的(多)靶基因，还可以将应用于单靶基因的方法以相同的方式应用于多靶基因的每一靶基因。
如本文所使用，术语“可操作地连接”意指将一个核酸片段连接到另一个核酸片段，使得每一片段功能在核酸片段的任何可能的结合组合中不受其它核酸片段的影响。此外，本发明的表达盒可能进一步包括用于调节转录的任何一种转录起始调节序列和转录终止调节序列。可操作的连接可以利用本领域内已知的基因重组技术来制备，并且可以利用本领域内通常已知的酶来实现位点特异性的DNA剪切和连接。
如本文所使用，术语“多顺反子(multi-cistronic)”意指多顺反子(multiple cistrons)，即将多个单位基因或多个单位shRNA表达构建体连接到一个启动子。
如本文所使用，术语“表达盒”意指能够表达shRNA的单位盒，其包含启动子和microRNA先导序列，其中所述microRNA先导序列包含靶基因的正义链和反义链，以及能够在正义链和反义链之间形成环的序列。进一步地，在本发明中，表达盒可以与表达构建体相互交换。优选地，能够表达shRNA的表达盒的主链可能是以SEQ ID NO.1作为模板的源自microRNA mir-30的shRNA。
为了构建本发明的单个多顺反子shRNA表达盒，本发明人首先在具体实施例中检测了单独的shRNA的功能。本发明人选择定义为SEQ IDNO.1(图2A)的源自mir-30的序列，并且通过PCR制备相应的DNA序列，以表达用于沉默作为靶的人XIAP(X-染色体连锁的凋亡抑制蛋白)、Akt或Bcl-2基因的每一shRNA(图2B)。本发明人将这些DNA序列各自克隆至CMV启动子-驱动的穿梭载体(图2C)，随后制备相应的腺病毒，分别命名为Ad-shXIAP、Ad-shAkt和Ad-shBcl-2(图2D)。本发明人用所制备的腺病毒感染HCT116细胞，并且通过检测XIAP、Akt和Bcl-2的蛋白水平来评估这些腺病毒的沉默活性(图2E)。结果是，除了对照Ad-空外，Ad-shXIAP、Ad-shAkt和Ad-shBcl-2沉默相应蛋白的表达，证实shRNA序列各自适当地作用以沉默靶基因。在用于评估Ad-shXIAP、Ad-shAkt和Ad-shBcl-2沉默活性的不同细胞(U-373MG)中，同样得到了相似的结果(数据未显示)。
本发明人利用以上功能良好的DNA序列制备多顺反子shRNA表达构建体(图3A)。本发明人制备腺病毒，命名为Ad-multi_shRNA(图3B)，并且评估它对相应靶基因的沉默活性。Ad-multi_shRNA高效且同时沉默多靶基因的表达(图3C)，而对照Ad-空不会。这些结果清楚地表明递送含有多顺反子shRNA的单个表达盒足以沉默多靶基因。
基于以上结果，本发明提供作为有力新工具的多顺反子shRNA表达盒，用于通过表达一个单个多顺反子转录本来沉默多靶基因。基于结构特征，定义为SEQ ID NO.1的源自mir-30的shRNA中的剪切位点，以及已知在剪切位点处实际剪切shRNA的核酸酶Drosha和Dicer的亚细胞定位，本发明人提出用于从单个多顺反子转录本产生不同shRNA的过程的模型(图4)。本发明的模型表明第一shRNA(shXIAP)区由RNA聚合酶转录来产生相应的shRNA，并且这种shRNA由位于细胞核的Drosha剪切，同时第二shRNA被转录。Drosha剪切的shRNA输出到细胞溶质，并且由位于细胞溶质中的Dicer再次剪切。这种循环继续至得到最终的shRNA(shBcl-2)。这种由Drosha和Dicer核酸酶的连续剪切过程很可能防止单个多顺反子转录本的缠结，并且按顺序产生shRNA。根据本发明人的模型，所述shRNA表达盒理论上可以含有许多单位的shRNA，优选两个或更多个单位的shRNA，并且更优选四个或更多个单位的shRNA。表达的shRNA的最大数量是对应于可以由表达载体稳定地表达的最大容量和大小的数量。
一般地，根据个体之间的差异，大量基因以多态形式存在。特别地，癌症细胞的肿瘤抑制基因和DNA修复系统有缺陷，从而观测到频繁的突变。当靶基因的碱基序列发生突变时，用于基因敲低的shRNA丧失它们的功能。为了克服功能丧失，对于一个单靶基因，需要靶向多个区域而不是单个区域作为shRNA靶(图5A)。在这点上，即使多顺反子shRNA表达构建体中的某些shRNA由于靶基因中的突变而不能履行它的功能，由相同表达构建体表达的其它shRNA作用于其他区域，从而高效地沉默靶基因。此外，当使用多顺反子shRNA沉默一个单靶基因时，shRNA的组合是非常重要的。例如，当多顺反子shRNA表达构建体由三个shRNA组成(A、B、C，在下文中称为“ABC”)以沉默一个单靶基因时(图5B)，由A降解和抑制的靶基因的mRNA还可以同时由B和C降解和抑制，从而在抑制效率方面，AAA或BBB或CCC型实际上可能比ABC型更高。为了证实此点，本发明人选择定义为SEQ ID NO.1(图2A)的源自mir-30的序列，并且通过PCR制备相应的DNA序列来编码shRNA用于沉默鼠Fas(mFas)，包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7(图6A)。本发明人将这些DNA序列克隆到CMV启动子-驱动的穿梭载体，随后制备相应的腺病毒，分别命名为Ad-mFas #1、Ad-mFas #2和Ad-mFas #3。本发明人用所制备的腺病毒感染Hepa1-6细胞，并且通过检测mFas的蛋白水平来评估这些腺病毒的沉默活性。结果是，除对照Ad-空外，Ad-mFas #1、Ad-mFas #2和Ad-mFas #3沉默相应蛋白的表达，证实shRNA序列各自适当地作用以沉默靶基因(数据未显示)。此后，本发明人将以上功能良好的mFas DNA序列克隆到CMV启动子-驱动的穿梭载体(图6B)，随后制备相应的腺病毒，命名为Ad-multi_shRNA O、M、Q和R(图6B)。本发明人用所制备的腺病毒感染Hepa1-6细胞，并且通过检测mFas的蛋白水平来评估这些腺病毒的沉默活性(图6C)。结果是，M、Q和R比O更高效地抑制相应蛋白的表达。这些结果清楚地表明，在利用多顺反子shRNA沉默一个单靶基因的情况下，AAA或BBB或CCC型(图5)显示比ABC型更高效的沉默活性。此外，对于mFas，Ad-mFas #1、Ad-mFas #2和Ad-mFas #3并未显示比命名为Ad-multi_shRNA O、M、Q和R(图6D)的相应腺病毒更高效的沉默活性。这些结果表明，由作用于一个单靶基因的不同位点的不同shRNA组成的多顺反子shRNA将显示比单个shRNA更高效的沉默活性。
总的来看，本发明人发现利用多顺反子shRNA沉默靶基因的最佳条件。也就是说，为沉默一个单靶基因(图7A)，shRNA可能作用于不同的位点(A(1)、A(2)......A(N))，且数量可以是两个或更多个，并且相应于每一位点的shRNA可能是单一类型(a1、a2......aN)，且数量可以是两个或更多个。也就是说，相应于每一作用位点的shRNA可以是单一类型，并且具有相同的序列。为沉默多个不同的靶基因(图7B)，还可以将应用于一个单靶基因的方法以相同的方式应用于多个不同靶基因的每一靶基因。
启动子-驱动的shRNA可以在有机体内局部或普遍稳定地表达。用于单靶基因(图7A)不同区域的多重沉默的多顺反子shRNA的稳定表达预计比单独的单顺反子shRNA更有力地沉默单靶基因。因而有趣的是，评估设计用于沉默一个单靶基因的多顺反子shRNA在整个有机体内的稳定表达在功能上是否与基因敲除(knock-out)相当。稳定地表达多顺反子shRNA以沉默多靶基因还将成为用于分析由沉默的多基因产生的结果的有力工具。用于表达多顺反子shRNA的细胞类型特异性启动子将促进分析单或多靶基因的细胞类型特异性沉默作用。从治疗的角度来看，多顺反子shRNA将被用作需要沉默多靶基因的个体化治疗(tailored therapy)。因此，本发明的多顺反子shRNA提供用于各种应用的多功能工具。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含所述多顺反子shRNA表达盒的表达载体，所述多顺反子shRNA表达盒包含启动子和可操作地连接到所述启动子的两个或更多个编码对靶基因特异的shRNA(小发夹RNA)的多聚核苷酸。所述多顺反子shRNA表达盒与以上所述相同。
可以将多顺反子shRNA表达构建体引入至细胞。为实现此点，所述多顺反子shRNA表达构建体可能包括于允许将所述多顺反子shRNA表达构建体高效引入至细胞的转运体中。所述转运体优选是载体，并且所述载体可以是病毒载体或非病毒载体。所述病毒载体可以示例为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒，并且优选但不限于腺病毒。所述非病毒载体可以示例为质粒。根据本发明一个优选的实施方案，使用穿梭载体pAdlox(K)。
还可以将多顺反子shRNA表达构建体以各种复合物形式，与PEG(聚乙二醇)、PEI(聚乙烯亚胺)、壳聚糖、PEG-壳聚糖、DEAE-葡聚糖、核蛋白、脂类或肽一起引入至细胞。为实现此点，所述多顺反子shRNA表达构建体可以包含于复合物的主要组成转运体中，并且允许将多顺反子shRNA表达构建体高效引入至细胞。
进一步优选的是，载体进一步包括选择性标记物。如本文所使用，为了容易地选择通过引入多顺反子shRNA表达构建体而转化的细胞，术语“选择性标记物”是必需的。对标记物没有给予特别限制，只要它能够使得引入的载体容易地检测或测量。一般，可以使用用于赋予可选择的表型的标记物，所述可选择的表型例如药物抗性、自养作用、对细胞毒性试剂的抗性或表面蛋白表达。所述标记物的实例包括GFP(绿色荧光蛋白)、嘌呤霉素、新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)以及鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)，并且优选GFP(绿色荧光蛋白)、新霉素或嘌呤霉素标记物。
在又一个实施方案中，本发明涉及用所述表达载体转导的细胞。
如本文所使用，术语“引入”旨在意味着将外来DNA通过转染或转导递送至细胞。转染可以利用本领域内已知的各种方法来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体(lipofectamine)转染以及原生质体融合。转导是指物体凭借利用病毒颗粒通过感染的方法转移至细胞的过程。优选地，转导可以通过具有转运体PEG、壳聚糖、PEG-壳聚糖、DEAE-葡聚糖、核蛋白、脂类或肽的复合物来实现。
从治疗的角度来看，通过引入能够选择性地沉默靶基因的多顺反子shRNA表达构建体，可以在病人-个体化治疗中使用通过引入表达载体转导的细胞。
此外，若选择细胞类型特异性启动子，它们将促进容易分析单或多靶基因的细胞类型特异性沉默作用，从而所转导的细胞可以用作分析细胞类型特异性沉默作用的模型。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于将载体引入至细胞的具有转运体的复合物，所述转运体选自PEG、PEI、壳聚糖、PEG-壳聚糖、DEAE-葡聚糖、核蛋白、脂类和肽。
在还一个实施方案中，本发明涉及抑制每一靶基因的方法，其包括以下步骤：(a)制备包含所述多顺反子shRNA表达盒的表达载体；和(b)将所制备的载体引入至细胞。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于抑制靶基因的组合物，其包含多顺反子shRNA表达盒，所述多顺反子shRNA表达盒包含以上所述的启动子和可操作地连接到所述启动子的两个或更多个多聚核苷酸。
用于抑制靶基因的组合物可以进一步包含药学上可接受的转运体并且与所述转运体一起制备。如本文所使用，术语“药学上可接受的转运体”是指对有机体不会引起明显刺激并且不会去掉所给予化合物的生物学活性和特性的转运体或稀释剂。为了将本发明的组合物用于液体制剂中，所述药学上可接受的转运体优选适合用于灭菌和活体。它可能与一种或多种选自以下的溶液一起制备：盐水、无菌水、林格氏(Ringer’s)溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及它们的组合，并且若必要的话，与其它常用添加剂包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等组合。可选择地，本发明的组合物可以与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂一起制成诸如水溶液、悬浮液和乳剂的可注射制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。
用于靶基因抑制的包含所述表达载体和药学上可接受的转运体的组合物可以制成包含作为活性成分的组合物的任何一种剂型，无论是口服还是肠胃外。本发明的药学上的制剂可以通过口腔、直肠、鼻腔、局部(包括大丸药和舌下)、经皮、阴道或肠胃外(包括肌肉、皮下和静脉内)途径给予或经过吸入或吹入给予。
包含作为活性成分的本发明组合物的口服剂型的实例包括片剂、锭剂、糖剂、水可溶或油悬浮液、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、糖浆或酏剂。对于片或胶囊制剂，有用的添加剂包括粘合剂如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶，赋形剂如磷酸二钙，崩解剂如玉米淀粉或甘薯淀粉，以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、富马酸硬脂钠或聚乙二醇蜡。除了这些添加剂之外，液体转运体如脂肪油可以用于胶囊制剂。
为了用于肠胃外给药，本发明的组合物可以制成通过皮下、静脉内或肌肉途径的可注射的制剂、栓剂或通过吸入的喷雾剂如气雾剂。可以通过将本发明的组合物与稳定剂或缓冲液在水中混合，从而提供以单位剂量如安瓿或小瓶包装的溶液或悬浮液来制备可注射的制剂。对于栓剂，本发明的组合物可以制成用于直肠给药的组合物如栓剂或灌肠剂，所述栓剂包括常用基质如可可油或甘油酯。制成如气雾剂的喷雾剂时，本发明的组合物可以与推进物混合制成水分散的浓缩物或湿粉的形式。
用于抑制靶基因的组合物，即多顺反子shRNA表达载体，可以是表达所述表达载体的细胞。所述细胞可以是能够瞬时或稳定地表达用于靶基因抑制的多顺反子shRNA表达载体的细胞。
在下文中，参考实施例将更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅是用于阐述的目的，本发明并不打算受这些实施例限制。
实施例1：shRNA表达构建体和相应的腺病毒的制备
通过重叠PCR制备用于人XIAP、Akt和Bcl-2以及鼠Fas(mFas)的相应每一shRNA的DNA序列。化学合成包含正义或反义shRNA序列的模板DNA，并通过利用含有不同限制性酶切位点的共有引物组的PCR扩增。用限制性酶消化PCR产物并克隆至用于腺病毒生产的穿梭载体pAdlox(K)的相应位点。通过核苷酸序列分析验证插入序列。
根据Jeong，M等在PLoS ONE 4，E4545(2009)中描述的方法，通过Cre-lox重组制备E1/E3-双重删除的复制不合格腺病毒。利用腺病毒纯化试剂盒Ad EZ-Prep(Genenmed Inc.，Seoul，Korea)纯化腺病毒。
结果是，基于源自mir-30的SEQ ID NO.1碱基序列(图2A)，制备用于沉默人XIAP、Akt、Bcl-2(图2B)或mFas基因的shRNA的每一DNA序列(图6A)。本发明人将这些DNA序列各自克隆至CMV启动子-驱动的穿梭载体(XIAP、Akt、Bcl-2：图2C，mFas：数据未显示)，随后制备相应的腺病毒，分别命名为Ad-shXIAP、Ad-shAkt和Ad-shBcl-2(图2D)。
进一步地，本发明人利用功能良好的每一DNA序列制备多顺反子shRNA表达构建体(图3A，图6A)。通过利用此，制备腺病毒，命名为Ad-multi_shRNA(图3B，图6B)。
实施例2：细胞培养
HCT116、U373-MG或Hepa1-6细胞最初从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)获得。所述细胞分别在McCoy’s 5A(HCT116)和DMEM(U373-MG和Hepa1-6)中培养。
实施例3：蛋白免疫印迹分析和靶基因沉默
为了检测每一shRNA和多顺反子shRNA表达构建体的沉默活性，本发明人用实施例1中制备的腺病毒感染HCT116、U373-MG或Hepa1-6细胞，接着观测每一靶基因的表达模式。
将HCT116、U373-MG或Hepa1-6细胞用腺病毒孵育4小时。更换新鲜培养基之后，将细胞进一步孵育72小时。收集细胞并在RIPA缓冲液中裂解，接着进行蛋白免疫印迹(Western blot)分析。使用用于检测XIAP(#2045，Cell signaling Technology)、Akt(LF-PA0166，Ab Frontier)、Bcl-2(sc-492，Santa Cruz Biotechnology)、mFas(610197，BD Pharmingen)和β-肌动蛋白(LF-PA0066，Ab Frontier)的抗体。
结果是，相应于Ad-shXIAP、Ad-shAkt、Ad-shBcl-2、Ad-mFas #1、Ad-mFas #2和Ad-mFas #3的蛋白表达被沉默(图2E，Ad-mFas：数据未显示)。然而，对照Ad-空并未抑制它们的表达。这些结果表明，每一shRNA序列适当地作用以沉默靶基因的表达。
此外，Ad-multi_shRNA高效且同时沉默相应靶基因的表达(图3C、图6C)，而对照Ad-空不会。本发明人的这些结果清楚地显示递送含有多顺反子shRNA的单个表达盒足以沉默多靶基因。
此外，关于所制备的mFas-沉默的Ad-multi_shRNA来沉默单靶基因，对于mFas，包括三个相同序列的Ad-multi_shRNA(M：mFas#1-#1-#1)、Ad-multi_shRNA(Q：mFas#2-#2#2)和Ad-multi_shRNA(R：mFas#3-#3-#3)来沉默相同的区域显示比所制备来沉默靶基因内不同区域的Ad-multi_shRNA(O：mFas#1-#2-#3)更高效的沉默活性(图6C)，并且比Ad-mFas#1更高效的沉默活性(图6D)。
这些结果表明，当具有相同序列的多个shRNA作用于包括于一个单个多顺反子shRNA的相同区域时，它可以更高效地沉默靶基因。
本发明的作用
稳定地表达多顺反子shRNAs表达构建体以沉默多靶基因还将成为用于分析来自所沉默多基因结果的有力工具。用于表达多顺反子shRNA的细胞类型特异性启动子将促进分析单或多靶基因的细胞类型特异性沉默作用。从治疗的角度来看，所述多顺反子shRNA表达构建体将用作需要沉默多靶基因的个体化治疗。因此，本发明多顺反子shRNA表达构建体可以提供用于各种应用的多功能工具。

Claims (14)

1.多顺反子shRNA表达盒，其包含启动子和可操作地连接到所述启动子的两个或更多个编码对靶基因特异的shRNA(小发夹RNA)的多聚核苷酸。
2.根据权利要求1所述的多顺反子shRNA表达盒，其中所述两个或更多个多聚核苷酸是编码对一个靶基因的单一位点或不同位点特异的shRNA的多聚核苷酸。
3.根据权利要求1所述的多顺反子shRNA表达盒，其中所述两个或更多个多聚核苷酸是编码对多靶基因中每一靶基因的单一位点或不同位点特异的shRNA的多聚核苷酸。
4.根据权利要求1所述的多顺反子shRNA表达盒，其中所述两个或更多个多聚核苷酸具有相同的序列。
5.根据权利要求1所述的多顺反子shRNA表达盒，其中所述启动子选自U6启动子、H1启动子和CMV启动子。
6.根据权利要求1所述的多顺反子shRNA表达盒，其中所述靶基因选自XIAP、Akt、Bcl-2和Fas。
7.根据权利要求1所述的多顺反子shRNA表达盒，其中所述shRNA源自SEQ ID NO.1的microRNA mir-30。
8.包含权利要求1至7中任一项所述的多顺反子shRNA表达盒的表达载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒。
10.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述表达载体选自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒。
11.用权利要求8所述的表达载体转导的细胞。
12.权利要求8所述的载体和用于将所述载体转导至细胞的转运体的复合物，所述转运体选自PEG(聚乙二醇)、PEI(聚乙烯亚胺)、壳聚糖、PEG-壳聚糖、DEAE-葡聚糖、核蛋白、脂类和肽。
13.在细胞中抑制各种靶基因的方法，其包括：
(a)制备权利要求8所述的表达载体；和
(b)将所制备的载体导入所述细胞。
14.用于抑制靶基因的组合物，其包含权利要求8所述的表达载体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795875A (zh) * 2012-04-30 2018-11-13 达特茅斯大学理事会 T细胞受体缺陷型t细胞组合物
CN109415733A (zh) * 2016-05-05 2019-03-01 贝尼泰克生物制药有限公司 用于治疗乙型肝炎病毒(hbv)感染的药剂及其使用
CN114127083A (zh) * 2019-05-13 2022-03-01 Dna2.0股份有限公司 使用人工微rna修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2821378A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Genentech, Inc. Autophagy inducer and inhibitor combination therapy for the treatment of neoplasms
RU2525935C2 (ru) * 2012-03-01 2014-08-20 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Способ получения кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько рнк-шпилек
WO2015164818A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Strike Bio, Inc. Multiple targeted rnai for the treatment of cancers
EP3218386B1 (en) 2014-11-14 2021-03-17 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
WO2017180720A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai A system for f-box hormone receptor regulated protein expression in mammalian cells
KR102652994B1 (ko) 2016-05-18 2024-04-01 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US20200270635A1 (en) * 2017-05-05 2020-08-27 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
US12188036B2 (en) * 2017-10-11 2025-01-07 Celltrion Inc. Expression cassette for production of high-expression and high-functionality target protein and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080020992A1 (en) * 2004-11-18 2008-01-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois MULTICISTRONIC CONSTRUCTS WITH siRNA TO INHIBIT TUMORS

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
EP0452269B1 (en) 1990-04-12 2002-10-09 Syngenta Participations AG Tissue-preferential promoters
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
CA2116449C (en) 1991-08-27 2005-04-05 Vaughan Alan Hilder Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
ITMI20012110A1 (it) * 2001-10-12 2003-04-12 Keryos Spa Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico
WO2008148068A1 (en) * 2007-05-23 2008-12-04 Mannkind Corporation Multicistronic vectors and methods for their design

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080020992A1 (en) * 2004-11-18 2008-01-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois MULTICISTRONIC CONSTRUCTS WITH siRNA TO INHIBIT TUMORS

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDULLAH ELY等: "Efficient silencing of gene expression with modular trimeric Pol II expression cassettes comprising microRNA shuttles", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
DAN C MCMANUS ET AL: "Loss of XIAP protein expression by RNAi and antisense approaches sensitizes cancer cells to functionally diverse chemotherapeutics", 《ONCOGENE》 *
YING POI LIU等: "Inhibition of HIV-1 by multiple siRNAs expressed from a single microRNA polycistron", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795875A (zh) * 2012-04-30 2018-11-13 达特茅斯大学理事会 T细胞受体缺陷型t细胞组合物
CN109415733A (zh) * 2016-05-05 2019-03-01 贝尼泰克生物制药有限公司 用于治疗乙型肝炎病毒(hbv)感染的药剂及其使用
CN114127083A (zh) * 2019-05-13 2022-03-01 Dna2.0股份有限公司 使用人工微rna修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成
CN114127083B (zh) * 2019-05-13 2024-11-15 Dna2.0股份有限公司 使用人工微rna修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成

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