CN102565203B - 一种用液相色谱法分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用液相色谱法分离测定溴甲纳曲酮及其杂质和含量的方法，该方法包括a.采用烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为分离柱，b.以三氟乙酸缓冲溶液为流动相A，以有机溶剂为流动相B；c.流动相采用梯度洗脱，分离测定溴甲纳曲酮及其制剂的杂质和含量。采用该方法可以很好的将甲基纳曲酮与其它已知中间体杂质和未知杂质进行有效分离和测定。本发明方法专属性强，准确度高，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及用液相色谱法(HPLC)分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法，该方法包括a采用烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为分离柱：b以缓冲溶液为流动相A，有机溶剂为流动相B；c流动相采用梯度洗脱方式。该方法可以将溴甲纳曲酮与其相关物质有效分离测定。
背景技术
溴甲纳曲酮(Methylnaltrexone bromide)是一种外周阿片受体拮抗剂，其分子式为C21H26O4NBr，其结构式见下(I)。溴甲纳曲酮的化学名为：溴化17-(环丙甲基)-4，5α-环氧-3，14-二羟-17-甲基-6-氧代-吗啡喃，具有一个氮原子手性中心。本文中所用的术语“R”和“S”表示氮原子手性中心的特定结构。本文所述的溴甲纳曲酮的氮原子为(R)构型，而“S-N异构体”是指氮原子为(S)构型的溴甲纳曲酮的差向异构体。
根据相关文献(WO2010039851A1)报道，溴甲纳曲酮在溶液状态下对热及光照均不稳定，可能产生含有α，β-不饱和酮羰基结构的降解产物，其结构暗示该降解产物可能具有潜在遗传毒性。对于溴甲纳曲酮而言，需要重点控制的已知杂质有两个，单羟醌：(17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，14-二羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃甲酸化物，其结构式见下式(II)；双羟醌：(5α，17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，5，14-三羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃溴化物，其结构式见下式(III)。
CN101405031A、WO2010039851A1公开了一种以0.1％三氟乙酸溶液与甲醇不同比例的混合液作为流动相A(95∶5(V/V)的水/甲醇中的0.1％三氟乙酸)和流动相B(25∶75(V/V)或35∶65(V/V)的水/甲醇中的0.1％三氟乙酸)，然后进行梯度洗脱的HPLC检测溴甲纳曲酮的方法。但该方法不能将溴甲纳曲酮的“S-N异构体”与溴甲纳曲酮的降解产物单羟醌进行有效分离，其相对保留时间基本一致(相对保留时间均为0.89)，从而不能对单羟醌杂质进行有效的重点控制或检测。
对于合成溴甲纳曲酮引入的杂质及其降解产物杂质，不论是在溴甲纳曲酮原料药还是在含有溴甲纳曲酮的制剂都需要进行质量控制，尤其是杂质的分离和测定。因此，实现溴甲纳曲酮及其杂质的有效分离测定对溴甲纳曲酮原料药以及制剂的质量控制中具有重要的意义。
由于现有方法不能有效地将溴甲纳曲酮与其“S-N异构体”、单羟醌等杂质进行分离，为了准确地控制溴甲纳曲酮的质量，监控杂质，有必要寻找一种能简单、快速、准确、有效地分离检测溴甲纳曲酮及其有关杂质的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用液相色谱法(HPLC)分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法，从而实现对溴甲纳曲酮及其制剂质量的有效控制。
为实现本发明的目的，本发明提供的一种采用液相色谱法(HPLC)分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法，包括：
a采用烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为分离柱；
b以缓冲溶液为流动相A，以有机溶剂为流动相B；
c流动相采用梯度方式。
上述方法中，所说的烷基硅烷键合硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶，所说的缓冲溶液为三氟乙酸缓冲溶液，所说的(三氟乙酸)缓冲溶液的浓度为0.01％至0.3％，优选0.05％至0.15％；所说的有机溶剂为甲醇或乙腈或其混合溶液，优选甲醇。
上述方法中所说的梯度方式为：0分钟至10分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)；10分钟至35分钟，流动相A线性减少至50％～70％(V/V)，流动相B线性增加至30％～50％(V/V)；35分钟至45分钟，流动相A为50％～70％(V/V)，流动相B为30％～50％(V/V)；45.1分钟至55分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)，即45.1分钟后为平衡色谱柱。
上述本发明的方法，还进一步包括以下步骤：
1)供试品溶液的配制：取溴甲纳曲酮或含溴甲纳曲酮的制剂适量，加稀释剂使溶解，并配制成每1ml含溴甲纳曲酮0.1mg至10mg的样品溶液为供试品溶液；
2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度5％～15％的溶液，作为对照溶液，其中，稀释剂为流动相A与流动相B的混合溶液，其体积比为95∶5～75∶25；
3)设置流动相的流速为0.5～1.5ml/mim，设置检测波长为280nm至320nm，设置色谱柱的柱温为20℃至50℃，设置进样量为5μl至100μl，分别精密量取等体积供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定。
上述本发明的方法，步骤1)中所述的流动相A与流动相B之体积比为85∶15；步骤2)中所述的流速为1.0ml/min，所述的检测波长为310nm，柱温为30℃，进样量为20μl。
本发明所说的杂质是指在合成溴甲纳曲酮的过程中产生的杂质，或原料药及其制剂在存放过程中降解产生的杂质。所述的杂质包括已知杂质和未知杂质，在已知杂质中至少包含以下化合物中的一种：(5α，17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，5，14-三羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃溴化物(简称双羟醌)、(17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，14-二羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃甲酸化物(简称单羟醌)，和S-N-溴甲纳曲酮(S-N异构体)。
所述的测定方法主要用于分离测定溴甲纳曲酮及其杂质，优选用于分离测定含有溴甲纳曲酮制剂中的杂质。
在一具体实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法(HPLC)分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法，包括：
a采用烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为分离柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶；
b流动相A为三氟乙酸缓冲溶液，流动相B为选自甲醇、乙腈或其混合溶液的有机溶剂，优选甲醇；
c流动相采用梯度方式。
其中，所述梯度方式为：0分钟至10分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)；10分钟至35分钟，流动相A线性减少至50％～70％(V/V)，流动相B线性增加至30％～50％(V/V)；35分钟至45分钟，流动相A为50％～70％(V/V)，流动相B为30％～50％(V/V)；45.1分钟至55分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)，即45.1分钟后为平衡色谱柱。
在另一具体实施方案中，一种采用液相色谱法(HPLC)分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法，包括：a采用烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为分离柱，b流动相A为缓冲溶液，优选三氟乙酸缓冲溶液，流动相B为有机溶剂，优选的有机溶剂选自为甲醇、乙腈或其混合溶液的有机溶剂，更优选甲醇，c流动相采用梯度方式；包括以下步骤：
1)供试品溶液的配制：取溴甲纳曲酮或含溴甲纳曲酮的制剂适量，加稀释剂使溶解，并配制成每1ml含溴甲纳曲酮0.1mg至10mg的样品溶液为供试品溶液；
2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度5％～15％的溶液，作为对照溶液，其中，稀释剂为流动相A与流动相B的混合溶液，其体积比为95∶5～75∶25；
3)设置流动相的流速为0.5～1.5ml/mim，设置检测波长为280nm至320nm，设置色谱柱的柱温为20℃至50℃，设置进样量为5μl至100μl，分别精密量取等体积供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定。
在上述具体实施方案中，所说的烷基硅烷键合硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶，所说的缓冲溶液为含三氟乙酸的缓冲溶液，所说的缓冲溶液的浓度为0.01％至0.3％，优选0.05％至0.15％；所说的有机溶剂为甲醇或乙腈或其混合溶液，优选甲醇。
在上述具体实施方案中，所说的梯度方式为：0分钟至10分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)；10分钟至35分钟，流动相A线性减少至50％～70％(V/V)，流动相B线性增加至30％～50％(V/V)；35分钟至45分钟，流动相A为50％～70％(V/V)，流动相B为30％～50％(V/V)；45.1分钟至55分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)，即45.1分钟后为平衡色谱柱。
在上述具体实施方案中，步骤1)中所述的流动相A与流动相B之体积比为85∶15；步骤2)中所述的流速为1.0ml/min，所述的检测波长为310nm，柱温为30℃，进样量为20μl。
本发明所述的方法，在流动相A中，所说的缓冲溶液为三氟乙酸溶液，其浓度为0.01％至0.3％，优选0.05％至0.15，最优0.1％
本发明所述的已知杂质，至少包括以下已知化合物中的一种：(17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，14-二羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃甲酸化物(简称单羟醌)、(5α，17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，5，14-三羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃溴化物(简称双羟醌)，和S-N-溴甲纳曲酮(S-N异构体)。
本发明采用Breeze AQ-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，能够有效地分离检测溴甲纳曲酮及其制剂的杂质。选用梯度0分钟至10分钟等度段比例流动相作为稀释剂溶解样品，排除了溶剂峰的干扰；柱温为30℃，采用梯度洗脱，能有效分离单羟醌及“S-N异构体”，同时确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效。
本发明所述的方法可以将溴甲纳曲酮与杂质峰有效分离，同时能将“S-N异构体”与单羟醌的有效分离，能准确的测定杂质，而且峰形对称性较好，柱效较高，从而解决了溴甲纳曲酮及其制剂杂质难以分离和测定的问题，尤其解决了“S-N异构体”与单羟醌难以分离的问题，从而保证了溴甲纳曲酮及其制剂的质量可控。同时，本发明的方法，与现有方法相比，流动相A和B均没有采用三氟乙酸溶液与有机物的混合物，流动相简单，容易配制，操作简单，成本低。
附图说明
图1实施例1的稀释剂的液相色谱图
图2实施例1的溴甲纳曲酮、“S-N异构体”、单羟醌、双羟醌混合样品的液相色谱图
图3实施例1的溴甲纳曲酮注射液空白辅料供试品溶液的液相色谱图
图4实施例1的梯度洗脱的液相色谱基线
图5实施例2的溴甲纳曲酮注射液有关物质测定供试品溶液的液相色谱图
图6实施例2的溴甲纳曲酮注射液有关物质10％对照溶液的液相色谱图
具体实施方式
实施例1
仪器与条件
戴安Ulitimate 3000高效液相色谱仪及化学工作站；自动进样；以Breeze AQ-C18(4.6×250mm，5μm)为色谱柱；设置紫外检测器波长为310nm；流动相：以0.1％三氟乙酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下述方式进行梯度洗脱：：0分钟至10分钟，流动相A为85％(V/V)，流动相B为15％(V/V)；10分钟至35分钟，流动相A线性减少至60％(V/V)，流动相B线性增加至40％(V/V)；35分钟至45分钟，流动相A为60％(V/V)，流动相B为40％(V/V)；45.1分钟至55分钟，流动相A为85％(V/V)，流动相B为15％(V/V)，即45.1分钟后为平衡色谱柱。柱温为30℃，流速为1.0ml/min，进样体积为20μl。
实验步骤
分别准确称取溴甲纳曲酮、S-N异构体、单羟醌、双羟醌对照品适量，分置10ml量瓶中，用稀释剂(流动相A-流动相B(85∶15))溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各自的对照品溶液；分取各对照品适量，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。
分别取稀释剂及混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2；
另精密量取溴甲纳曲酮注射液处方比例的空白辅料0.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为空白辅料供试品溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果见图3。
另外，不进样，按上述色谱条件采集梯度洗脱基线，见图4。
图2中保留时间为8.925min的色谱峰为双羟醌，15.075min的色谱峰为单羟醌，15.900min的色谱峰为“S-N异构体”，18.567min的色谱峰为溴甲纳曲酮。
图1证明，稀释剂不干扰测定；图3证明，空白辅料不干扰测定；图4证明，色谱系统没有干扰；图2证明，本方法可以有效分离溴甲纳曲酮中可能存在的已知杂质，即本方法可以用于溴甲纳曲酮及其制剂的杂质测定。
实施例2
液相色谱法测定溴甲纳曲酮注射液的杂质。
仪器与条件
Agilent 1200高效液相色谱仪及化学工作站；自动进样；色谱条件与实施例1相同。
取溴甲纳曲酮注射液适量(约相当于溴甲纳曲酮10mg)，置10ml量瓶中，加稀释剂(流动相A∶流动相B＝85∶15)使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；照实施例2的色谱条件进行液相色谱分析，结果见图5、图6。图5、图6表明几乎没有检测到溴甲纳曲酮原料药中有杂质，说明溴甲纳曲酮原料药纯度高，杂质含量极低。
实施例3
液相色谱法测定溴甲纳曲酮原料药的杂质
仪器与条件
Agilent 1200高效液相色谱仪及化学工作站；自动进样；色谱条件与实施例1相同。
实验步骤
取溴甲纳曲酮约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂(流动相A∶流动相B＝85∶15)使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按上述色谱条件进行液相色谱分析，观察在供试品溶液的色谱图中单羟醌和双羟醌的位置是否有杂质峰，如有，杂质峰的面积不得大于对照溶液主峰面积的0.001倍(0.01％)。结果与实施2的结果基本一致，也几乎没有检测到溴甲纳曲酮原料药中有杂质，说明溴甲纳曲酮原料药纯度高，杂质含量极低，达到几乎检测不出的限量。
实施例2和3也证明本发明的方法能有效检测和控制溴甲纳曲酮及其杂质的量。
Claims (7)
1.一种用液相色谱法分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法，包括：
a采用烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱为分离柱；
b以缓冲溶液为流动相A，以有机溶剂为流动相B；
c流动相采用梯度洗脱方式，
其中，所说的梯度洗脱方式为：0分钟至10分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)；10分钟至35分钟，流动相A线性减少至50％～70％(V/V)，流动相B线性增加至30％～50％(V/V)；35分钟至45分钟，流动相A为50％～70％(V/V)，流动相B为30％～50％(V/V)；45.1分钟至55分钟，流动相A为75％～95％(V/V)，流动相B为5％～25％(V/V)，即45.1分钟后为平衡色谱柱，所述流动相A为0.1％三氟乙酸溶液，所述流动相B为甲醇，检测波长为310nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，进样体积为20μl。
2.根据权利要求1所述的方法，所说的烷基硅烷键合硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶。
3.根据权利要求1所述的方法，所说的有机溶剂为乙腈或乙腈与甲醇的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，所说的缓冲溶液的浓度为0.01％至0.3％。
5.根据权利要求4所述的方法，所说的缓冲溶液的浓度为0.05％至0.15％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所说的方法还包含以下步骤：
1)供试品溶液的配制：取溴甲纳曲酮或含溴甲纳曲酮的制剂适量，加稀释剂使溶解，并配制成每1ml含溴甲纳曲酮0.1mg至10mg的样品溶液为供试品溶液；
2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度5％～15％的溶液，作为对照溶液，其中，稀释剂为流动相A与流动相B的混合溶液，其体积比为95∶5～75∶25；
3)设置流动相的流速为1.0ml/mim，设置检测波长为310nm，设置色谱柱的柱温为30℃，设置进样量为20μl，分别精密量取等体积供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定。
7.根据权利要求1所述的方法，所述的杂质包含至少以下两种化合物中的一种：
(5α，17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，5，14-三羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃溴化物、(17R)-17-(环丙甲基)-10，11-二脱氢-3，11-二氢-4，14-二羟基-17-甲基-3，6-二氧代吗啡喃甲酸化物。
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