CN102532286B - 白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列13的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与白僵菌素合成相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的与白僵菌素生物合成相关蛋白质系统及其编码基因簇可以帮助人们理解羧酸肽家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用

技术领域

本发明涉及白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用。

背景技术

白僵菌素是一种六元环状缩酯肽化合物，由3个甲基苯丙氨酸和(D)-α-羟基异戊酸残基交替相连而成，分子式为C₄₅H₅₇N₃O₉，分子量为786，结构如图1。白僵菌素是真菌的次生代谢产物，最早由Hamil于1969年首次从球孢白僵菌的菌丝体中提取到。至今为止已经从球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和几种其他的真菌中分离得到了白僵菌素。白僵菌素对蚊子幼虫、卤虫、绿头苍蝇和鞘翅目害虫等有杀伤作用。目前，白僵菌素主要用作杀虫剂和除菌剂等。

近年来，越来越多的发现表明白僵菌素除了杀虫之外还具有很多生物活性。2000年，Nilanonta报道了其同系物的抗结核和疟原虫的活性。2004年，Fukuda从Beauveria sp.FKI-1366中分离得到了白僵菌素及其3个同系物，并与咪康唑配合进行了抗白色念珠菌(Candidaalbicans)活性测定，结果表明通过配合白僵菌素使用咪康唑，不仅能够抑制普通白假丝酵母，而且能够有效抑制对咪康唑有抗药性的白假丝酵母。2004年，Jow等发现白僵菌素能够诱导人白血病细胞的凋亡。2005年，Lin等对白僵菌素诱导人肺癌细胞凋亡的机制进行了研究。然而，白僵菌素对哺乳动物的毒性较大，可影响动物或人类的健康，可引起鼠和人类肿瘤细胞系显著的细胞死亡，并且强效和特异地抑制鼠肝脏微体中胆固醇酰基转移酶活性。2003年，Dombrink-Kurtzman还发现白僵菌素能够诱导火鸡外周血液中淋巴细胞的凋亡，从而影响其免疫系统(Dombrink-Kurtzman MA，2003)。因此，白僵菌素的毒性极大地限制了它的应用。

然而，2007年的研究发现低剂量的白僵菌素与酮康唑能够产生互动作用(Synergy)杀死病原真菌，大大减少用药量，并降低毒副作用(Zhang LX，Yan KZ，Zhang Y，Huang R，Bian J etal.(2007)High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combinationagents for the treatment of fungal infections.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 104(11)：4606-4611.)。另外，在白僵菌中，白僵菌素的产量相对较低，Xu等利用Beauveria bassiana发酵得到约20mg/L的白僵菌素。如上所述，镰刀菌属中的株的白僵菌素的产量比白僵菌属中的产量高2～3个数量级。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与白僵菌素合成相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与白僵菌素合成相关的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列13的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与白僵菌素合成相关的由(a)衍生的蛋白质。

本发明所提供的与白僵菌素合成相关蛋白的编码基因，为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列1第27,092位到36,504位所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

含有与白僵菌素合成相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇。

本发明所提供的白僵菌素合成相关蛋白质系统，是由如下1)至15)中15种蛋白质组成的：

1)其氨基酸序列为序列表中的序列2或在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列2限定的蛋白质衍生的蛋白质；

2)其氨基酸序列为序列表中的序列3或在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列3限定的蛋白质衍生的蛋白质；

3)其氨基酸序列为序列表中的序列4或在序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列4限定的蛋白质衍生的蛋白质；

4)其氨基酸序列为序列表中的序列5或在序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列5限定的蛋白质衍生的蛋白质；

5)其氨基酸序列为序列表中的序列6或在序列表中序列6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列6限定的蛋白质衍生的蛋白质；

6)其氨基酸序列为序列表中的序列7或在序列表中序列7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列7限定的蛋白质衍生的蛋白质；

7)其氨基酸序列为序列表中的序列8或在序列表中序列8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列8限定的蛋白质衍生的蛋白质；

8)其氨基酸序列为序列表中的序列9或在序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列9限定的蛋白质衍生的蛋白质；

9)其氨基酸序列为序列表中的序列10或在序列表中序列10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列10限定的蛋白质衍生的蛋白质；

10)其氨基酸序列为序列表中的序列11或在序列表中序列11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列11限定的蛋白质衍生的蛋白质；

11)其氨基酸序列为序列表中的序列12或在序列表中序列12所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列12限定的蛋白质衍生的蛋白质；

12)其氨基酸序列为序列表中的序列13或在序列表中序列13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列13限定的蛋白质衍生的蛋白质；

13)其氨基酸序列为序列表中的序列14或在序列表中序列14所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列14限定的蛋白质衍生的蛋白质；

14)其氨基酸序列为序列表中的序列15或在序列表中序列15所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列15限定的蛋白质衍生的蛋白质；

15)其氨基酸序列为序列表中的序列16或在序列表中序列16所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列16限定的蛋白质衍生的蛋白质。

本发明所提供的白僵菌素合成相关蛋白质系统的编码基因簇，为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码白僵菌素合成相关蛋白系统的DNA分子；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码白僵菌素合成相关蛋白系统的DNA分子。

本发明的又一个目的是提供一种重组载体。

本发明所提供的重组载体，为将序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列插入到出发载体上，得到的含有序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列作为上下游同源臂的重组载体。

所述出发载体为pRF-HU2克隆载体；所述pRF-HU2克隆载体携带有可以在大肠杆菌中复制的起始位点oriV元件，同时含有广谱宿主性的复制起始基因TrfA，可保证该载体可在各种真菌宿主中扩增(如曲霉、镰刀菌等)。另外，构巢曲霉来源的色氨酸启动子pTrpC和色氨酸终止子TtrpC对筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因hph的功能表达起到重要的作用，潮霉素抗性筛选在真菌分子生物中是很好的遗传标记。

本发明的又一个目的是提供一种制备产白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法。

本发明所提供的制备产白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法，包括如下步骤：

将所述重组载体导入能生产白僵菌素的真菌中，即得到产白僵菌素能力降低的基因工程菌；所述能生产白僵菌素的真菌为可育镰刀菌(Fusarium proliferatum)LF061。

根据所述方法制备得到的基因工程菌也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与白僵菌素生物合成相关蛋白质系统及其编码基因簇可以帮助人们理解羧酸肽家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明

图1为白僵菌素的化学结构。

图2为镰刀菌LF061基因组文库筛选三个阳性克隆子在白僵菌素合成簇上可能的排布方式。3个交叠的Fosmid黏粒代表了可育镰刀菌LF061基因组43kb的DNA区域，★代表筛选所用引物，fpBeasLJ1，fpBeas5#和fpBeas8#为筛选获得的三个阳性克隆子质粒。

图3为白僵菌素生物合成基因簇的基因组成；每一个箭头代表一个ORF，箭头方向代表转录方向；其中，白僵菌素合酶基因fpBeas，kivr和调节基因orf12用黑色箭头表示。

图4为FpBEAS合酶结构示意与提出的BEA的生物合成途径；其中，(I)FpBEAS合成酶结构。module1：L-苯丙氨酸识别和活化模块；module2：D-α-羟异戊酸活化模块；S：4′-硫酸泛酰巯基乙胺结合位点；C：缩合结构域；M：N-甲基转移酶域。(II)推测的镰刀菌中白僵菌素合成机制。

图5为重组载体pRF-HU2-fpBeas的构建过程示意图。

图6为重组载体pRF-HU2-fpBeas的示意图。

图7为白僵菌素合成基因fpBeas基因的阻断及分子验证；(I)突变子m1中fpBeas基因阻断示意；(II)PCR鉴定突变子：(L)HygU/HygL，(M)geneT1/T2，(R)geneT3/RF1扩增左侧区域和geneT4-RF2扩增右侧区域。

图8为可育镰刀菌LF061及突变株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析；(I)野生型可育镰刀菌LF061；(II)突变子m1(fpBeas基因单侧插入阻断)；(III)突变子m2(敲除载体异位插入LF061基因组别处位置)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、可育镰刀菌(Fusarium proliferatum)LF061白僵菌素合成相关基因簇的制备一、可育镰刀菌(Fusarium proliferatum)LF061白僵菌素合成相关基因簇的克隆

1、白僵菌素产生菌镰刀菌LF061总DNA的提取

将单孢分离纯化的可育镰刀菌(Fusarium proliferatum)LF061菌株(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Zhang LX，Yan KZ，Zhang Y，Huang R，Bian J et al.(2007)High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites ascombination agents for the treatment of fungal infections.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 104(11)：4606-4611.)接种于含100mL PDA液体培养基中，28℃，200rpm的摇床上培养3天。过滤出菌丝体，再用无菌水洗涤1-2次，用灭菌的滤纸包住放置晾干。称取0.1g菌丝体，在液氮中研磨成粉，分装于1.5mL离心管中，加入600μL改良基因组提取液(4％SDS；100mM Tris-HCl，pH 8.0；10mM EDTA，pH 8.0；1.4M NaCl)(Moiler et al.，1992)，混匀，65℃水浴中保温30min处理。然后将离心管迅速移入冰浴中静置5-10min，加入Tris饱和酚和氯仿各300μL，充分混匀，室温静置10min，4℃，12,000rpm离心10分钟。吸取上清，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12,000rpm离心10min。继续吸取上清，加入1/10体积的3M的NaAC(pH6.0)和3/5体积的异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃，12,000rpm离心5min后用70％乙醇洗涤一次。12000rpm离心2min弃上清，晾干后加入100μL无菌去离子水，加入2μL的Rnase(10mg/mL)，37℃保温20min。

2、白僵菌素产生菌镰刀菌LF061基因组文库的构建

将上述提取的总DNA进行脉冲场琼脂糖凝胶电泳，电洗脱纯化回收36-45kb大片段DNA，用CopyControlTMFosmid Library Production Kit的End-Repair Enzyme Mix进行末端补平。以0.5×TE进行点透析2小时，换30％PEG8000浓缩DNA。紫外分光光度计测定DNA浓度，按插入片段分子数：pCC2FOS载体分子数1∶10的比例以Fast-Link DNA Ligase室温2小时进行连接。再次以0.5×TE进行点透析2小时，换30％PEG8000浓缩DNA。取10μL连接后的DNA加入到25μL冰上融化的MaxPlax Lambda Packaging Extracts，30℃，90分钟温育后加入另外25μL MaxPlax Lambda Packaging Extracts，30℃，90分钟温育，加入PDB缓冲液至终体积1mL。取大肠杆菌EPI300-T1^R单菌落接入LB液体培养基220rpm，37℃过夜培养进行活化。5ml过夜培养物加入到50mL新鲜LB培养基(含10mM MgSO₄)，37℃，220rpm振荡至OD₆₀₀＝0.8-1.0。取50μL包装后混合物加入950μL上述培养的大肠杆菌，37℃，20分钟温育。取部分菌液涂布于含12.5μg/mL氯霉素的LB培养基，37℃过夜培养计算文库克隆数；剩余菌液加入终浓度20％的甘油，储存于-80℃。

三、PCR克隆白僵菌素合酶A-domain合成基因

简并引物设计进行的菌落PCR筛选法是筛选基因组文库最常用的一种方法。文献调研表明：BEA生产菌Fusarium proliferatum LF061在分子系统进化树上与F.equiseti近源，而且后者产生次生代谢产物恩链孢菌素(enniatin)与白僵菌素同属NRPs一类，结构相近。以F.equiseti中ESYN(CAA79245)中腺苷酸模块EA结构域保守区域氨基酸序列作为探针，在NCBI上blastP比对搜索，选取近源的NRPSs序列，用Genedoc软件比对。以恩镰孢菌素合酶ESYN1中EA模块中的A-domain的保守序列设计简并引物，以Fusarium prolferatum LF061的总DNA为模板，克隆负责催化识别D-Hiv的腺苷酰化结构域基因。PCR体系包括：DMSO(8％，v/v)，dNTP(2.5mM)，Taq聚合酶缓冲液(10×)，简并性引物(30mM)及适量模板Fusariumproliferatum LF061总DNA。首先94℃，5min，1个循环；然后94℃，1min，50-70℃，1min，72℃，1min，30个循环；最后72℃，10min，1个循环。PCR结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检查结果。切胶回收合适大小的片段，PCR产物用BioSpin Gel Extraction Kit(BioFlux，Cat.NO.BSC02M1)纯化，与pMD-18T vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落过夜培养，抽提质粒，EcoRI酶切鉴定是否含有预期大小的DNA插入片段，阳性克隆质粒测序分析。测序结果表明：PCR扩增获得的基因片段如序列表中序列1第33,412位33,932位所示，即负责催化识别D-Hiv的腺苷酰化结构域基因。通过与结构类似的缩酯肽化合物的生物合成基因簇对比，可以确定该腺苷酰化结构域基因与LF061白僵菌素生物合成相关。

对FpBEAS合成酶的分析，有两个模块构成(module1和module2)，其构成符合“C₁A₁T₁-C₂A₂(M)T_2aT_2b-C₃”特点。与恩链孢菌素合成酶作用机制类似，module1模块中A₁结构域识别并活化羟基异戊酸(D-Hiv)基团，后转移到相邻T结构域的磷酸泛酰巯基乙胺(Ppant)长臂上，形成氨酰基-Ser(丝氨酸)-酶中间产物。同样，module2模块A₂结构域活化L-苯丙氨酸(Phe)生成氨酰基-L-Phe-酶中间产物，在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Pptases)的作用下与T_2a结构域的Ser残基相连，最后在C₂结构域的作用下生成“二肽”单体(dipeptidolmonomer)。新合成的肽酰基中间产物被T结构域转移到下游C结构域而合成肽链，通过与恩链孢菌素合成机制类似的三次循环反应，从而环化生成白僵菌素，见图4。

四、筛选、克隆和分析白僵菌素的生物合成基因簇

利用上述克隆的该腺苷酰化结构域基因片段设计筛选引物，用菌落PCR方法从镰刀菌LF061的Fosmid基因组文库筛选获得fpBeasLJ1，fpBeas5#和fpBeas8#三个质粒(图2)。其中，fpBeasLJ1，fpBeas5#和fpBeas8#质粒的DNA序列由华大基因(BGI)用shotgun方法测序，拼接由Sequencher 4.9(Gene Codes)和Vector NTI suite 10.0(Invitrogen)完成。用FGENESH和AUGUSTUS在线分析软件工具对白僵菌素合成基因编码基因进行了分析，内含子/外显子临界预测用SPLICEVIEW在线工具。使用BLAST程序在GenBank的DNA数据库和蛋白数据库中进行DNA和氨基酸序列的同源性搜索。用Clustal W(Thompson，1994)程序进行氨基酸序列比对。NRPSs结构域预测使用UMA运算法则，A结构域活性位点氨基酸分析运用NRPSpredictor预测软件。获得合成白僵菌素的相关基因簇(43kb)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将其命名为bea，GC含量平均49.16％，包含15个开放阅读框，如图3所示。整个基因簇共包含15个基因的核苷酸序列或互补序列，其中，1个与白僵菌素大环生物合成相关的非核糖体多肽合酶基因，1个编码负责从前体物质到2-羟异戊酸的转化的还原酶，1个调节基因，1个ABC-型多药转运蛋白基因，5个参与编码辅助毒力蛋白因子，1个编码膜蛋白，1个胺氧化酶基因，1个编码乙酰转移酶基因，1个脱氢酶基因，3个未知功能的基因。开放阅读框详细的分析结果如表1所示。

表1bea基因簇上参与白僵菌素合成的ORF注释及比对

ND，功能未知；^c反向互补。

1)非核糖体合酶基因fpBeas全长9,410bp，位于bea基因簇第27,092位-36,504位碱基处，编码3,092个氨基酸的FpBEAS合酶，其氨基酸序列如序列表中序列13所示。它由两个外显子组成，分别位于bea基因簇上第27,092-32,667位和第32,802-36,501位碱基处，中间被134bp内含子隔断。对FpBEAS合成酶的分析，由两个模块构成(module1和module2)，其构成符合“C₁A₁T₁-C₂A₂(M)T_2aT_2b-C₃”特点。

2)白僵菌素合成的另外一个关键基因kivr，位于bea基因簇第24,722位-25,950位碱基处，编码NADPH-依赖的2-酮异戊酸还原酶，其氨基酸序列如序列表中序列12所示，负责从前体物质丙酮酸L-缬氨酸到2-羟异戊酸的转化。它含有1个内含子。由2个外显子组成，分别位于bea基因簇上第24,725-24,755位和第24,812-25,950位碱基处。

3)白僵菌素合成的抗性和调节基因，即orf10和orf12共2个基因：

orf10位于bea基因簇第19,172-23,623个碱基处，长度为3,906个碱基对，编码1,301aa的ABC-型多药转运蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列11所示，含有10个内含子。它由11个外显子组成，分别位于bea基因簇上19,175-19,198，19,263-19,696，19,749-19,867，19,928-21,582，21,658-22,632，22,683-23,018，23,068-23,122，23,188-23,272，23,335-23,440，23510-23623碱基处；

orf12位于bea基因簇39,528-40,190个碱基处，编码220aa的Gal4类似的转录调控因子，其氨基酸序列如序列表中序列15所示，典型特征是含保守的Zn(II)2Cys6锌簇DNA结合域。

4)白僵菌素的辅助毒力基因，即orf1，orf3，orf4，orf5和orf6共5个基因：

orf1位于bea基因簇544-1,272个碱基处，长度为672个碱基对，编码224aa的硫酯酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，含有1个内含子。它由2个外显子组成，分别位于bea基因簇上544-945，1,000-1,269碱基处；

orf3位于bea基因簇2,449-4,533个碱基处，长度为1,968个碱基对，编码655aa的脂酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示，含有2个内含子。它由3个外显子组成，分别位于bea基因簇上2,452-3,054，3,117-3,986，4,042-4,533碱基处；

orf4位于bea基因簇5,226-7,165个碱基处，长度为1,635个碱基对，编码544aa的几丁质酶，其氨基酸序列如序列表中序列5所示，含有6个内含子。它由7个外显子组成，分别位于bea基因簇上5,226-5,470，5,522-6,142，6,195-6,315，6,367-6,454，6,504-6,653，6,701-6,962，7,018-7,162碱基处；

orf5位于bea基因簇7,517-8,632个碱基处，长度为1,116个碱基对，编码371aa的锌-依赖的金属蛋白酶，其氨基酸序列如序列表中序列6所示；

orf6位于bea基因簇10,169-13,032个碱基处，长度为2,061个碱基对，编码686aa的胞壁酸酶(可能参与裂解细胞壁功能)，其氨基酸序列如序列表中序列7所示，含有5个内含子。它由4个外显子组成，分别位于bea基因簇上10,169-10,635，10,689-11,386，11,962-12,388，12,520-12,943，12,988-13,029碱基处。

5)白僵菌素合成簇上膜蛋白基因orf11位于bea基因簇36,749-37,828个碱基处，长度为1,029个碱基对，编码342aa的膜蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列14所示，可能参与中间代谢产物或前体物的运输等，含有1个内含子。它由2个外显子组成，分别位于bea基因簇上36,752-37,268，37,320-37,828碱基处。

6)白僵菌素合成簇其他功能未知蛋白，即orf2，orf7，orf8，orf9和orf13共五个基因：

orf2位于bea基因簇1,396-2,088个碱基处，长度为693个碱基对，编码230aa的乙酰转移酶，其氨基酸序列如序列表中序列3所示；

orf7位于bea基因簇15,201-16,378个碱基处，长度为1,125个碱基对，编码374aa的未知功能蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列8所示，含有1个内含子。它由2个外显子组成，分别位于bea基因簇上15,201-15,730，15,784-16,375碱基处；

orf8位于bea基因簇16,467-17,272个碱基处，长度为708个碱基对，编码235aa的短链型还原酶，其氨基酸序列如序列表中序列9所示，含有2个内含子。它由3个外显子组成，分别位于bea基因簇上16,470-16,647，16,696-16,978，17,029-17,272碱基处；

orf9位于bea基因簇18,293-18,847个碱基处，长度为555个碱基对，编码184aa的未知功能蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列10所示；

orf13位于bea基因簇42,373-43,979个碱基处，长度为1,440个碱基对，编码479aa的胺氧化酶，其氨基酸序列如序列表中序列16所示，含有2个内含子。它由3个外显子组成，分别位于bea基因簇上42,373-42,653，42,705-43,328，43,383-43,947碱基处。

二、可育镰刀菌(Fusarium proliferatum)LF061白僵菌素合成相关基因簇的功能

1、白僵菌素产生菌镰刀菌LF061遗传转移系统的建立

选定fpBeas基因上1.5kb A₂和部分M₂部分序列作为敲除靶区基因，设计敲除靶区的上下游序列的引物。其中，B-HRS1F和B-HRS 1R(B-HRS1F：5’-GGTCTTAAUCGTCGTCTCGTCTCACCT-3’和B-HRS 1R：5’-GGCATTAAUCCGCCTTGTCAATCTCAC-3’)扩增敲除靶区的上游序列；B-HRS2F和B-HRS2R(B-HRS2F：5’-GGACTTAAUGCCACGAAACTCATCTCA-3’和B-HRS2R：5’-GGGTTTAAUTGCTGTTCCACCTCACTCT-3’)扩增敲除靶区的下游序列。聚合酶使用

CxHotstart DNA polymerase，94℃5min，94℃30s，59℃1min，72℃1.5min，72℃10min，28cycles，1％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果为：分别获得1,463bp的敲除靶区的上游序列，将其命名为B-HRS1，其核苷酸序列如序列表中序列17所示；1,562bp的敲除靶区的下游序列，将其命名为B-HRS2，其核苷酸序列如序列表中序列18所示。将上述PCR基因片段B-HRS1和B-HRS2与经过PacI和Nt.BbvCI限制性内切酶双酶切处理的pRF-HU2克隆载体(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：FrandsenRJN，Andersson JA，Kristensen MB，Giese H(2008)Efficient four fragment cloning for theconstruction of vectors for targeted gene replacement in filamentous fungi.BMC MolecularBiology 9：70.)进行USER连接反应，体系如：B-HRS1 5μL，B-HRS2 5μL，pRF-HU2(PacI/Nt.BbvCI)7μL，USER enzyme mix(NEB)1μL，10×Taq buffer 2μL。37℃反应20min，25℃继续反应20min，建议PCR仪器上进行。

转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD501)，分别以B-HRS1F/B-HRS1R和B-HRS2F/B-HRS2R引物，利用菌落PCR方法筛选含有插入片段(B-HRS1和B-HRS2)的fpBeas敲除载体的阳性克隆子，fpBeas敲除载体的构建过程见图5，并送中国农业科学院作物科学研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室测序验证。测序结果显示：菌落PCR产物DNA序列与fpBeas基因上B-HRS1和B-HRS2序列一致，说明敲除载体构建正确，将其命名为pRF-HU2-fpBeas，见图6。

将含有fpBeas基因敲除载体pRF-HU2-fpBeas转化农杆菌A.tumefaciens AGL(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Murata H，Sunagawa M，Yamazaki T，Shishido K，Igasaki T(2006)Expression of the autofluorescent protein，DsRed2，inthe recombinants of the ectomycorrhizal basidiomycete，Suillus grevillei，generated byAgrobacterium-mediated transformation.Mycorrhiza 16(6)：407-412.)。制备农杆菌AGL-1的感受态细胞，加入1μg质粒pRF-HU2-fpBeas混匀后，冰浴30min。后置液氮中速冻5min，37℃热激5min，冰上放置2min。加入1mL YEB液体摇匀，置28℃，150rpm摇床培养3h；涂布于含有50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的YEB抗性平板上，28℃培养2-3天。同样，分别以B-HRS1F/B-HRS1R和B-HRS2F/B-HRS2R引物，利用菌落PCR方法筛选含有插入片段(B-HRS1和B-HRS2)的fpBeas敲除载体的农杆菌阳性克隆子。将已转入目的质粒的农杆菌AGL-1的农杆菌单克隆接种到4mL YEB液体中(含Kan和利福平分别为50μg/mL)，于28℃，250rpm摇床，过夜培养。将培养液12000rpm离心2min，并用IMAS(2.5×MM salts，80mL，葡萄糖0.36g，50％甘油20mL，加水定容到192mL，高压灭菌后，加入1M 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，pH5.3)和乙酰丁香酮(AS)至终浓度40mM和200μM。摇床震荡培养4-6小时，最终OD₆₀₀值在0.6～0.8之间。同时，从培养7-15天左右的PDA平板上刮去适量的镰刀菌LF061孢子到1mL无菌的0.05％吐温20溶液中，涡旋分散。收集孢子，用1mL无菌生理盐水(w/v 0.85％NaCl)重悬孢子，重复洗涤一次。用适量生理盐水重悬孢子，浓度10⁵～10⁶个孢子/mL。将上述农杆菌悬液100μL和镰刀菌LF061孢子悬液100μL混匀，涂布于IMAS平板，27℃共培养2天。最后，将共培养物用2-3mL无菌水洗涤，涂布于含有50μg/mL潮霉素和300μg/mL噻孢霉素的M-100平板上吹干，27℃培养筛选，待生长5-6天后挑选生长比较迅速的菌落转移到M-100平板上进行第二次筛选。二次筛选后的M-100平板上能长出来的菌落视为疑似转化子，分别挑取少量菌丝或菌块，于25℃摇床200rpm培养2-3天后，抽提基因组验证是否转化成功。用潮霉素磷酸转移酶的引物对HygU/HygL(HygU：5’-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3’和HygL：5’-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3’)，PCR扩增都能获得588bp的潮霉素磷酸转移酶编码基因片段，说明镰刀菌LF061转化成功。

2、基因阻断突变菌株的获得与分子鉴定

ATMT转化共获得130个潮霉素(Hyg)抗性克隆子，经过2次传代后仍然保持Hvg^R抗性，随机挑取20个克隆子用潮霉素抗性基因特异引物扩增能扩增出潮霉素抗性基因，并测序验证。同时，发酵结果显示选择的30个突变株，40％的突变子发酵BEA产量比野生株LF061高出5-40倍产量，8株无白僵菌素产生，其他突变子BEA产量降低或变化不大。从突变子中挑选m1和m2，PDA液体培养基培养3-5天提取基因组DNA，野生株LF061(W)基因组作为对照。四对PCR引物为分子鉴定用引物，其中HygU/HygL(序列如上)用于扩增潮霉素磷酸转移酶基因，gene-T1/gene-T2(gene-T1：5’-GCACAGCCCAGGACATCA-3’和gene-T2：5’-CGCCGCAGGAACTGTAAG-3’)扩增fpBeas基因内部靶区序列(敲除的基因序列)。geneT3/RF1(geneT3：5’-GCAGCTTGTTGGCGTTGGTGTCAT-3’和RF1：5’-AAATTTTGTGCTCACCGCCTGGAC-3’)扩增敲除靶区上游区，可鉴定敲除质粒插入B-HRS1区；geneT4/RF2(geneT4：5’-TCTCCTTGCATGCACCATTCCTTG-3’和RF2：5’-CCCGGGACTGAAGAGGAACGAATT-3’)可扩增敲除靶区下游区，可鉴定敲除质粒插入B-HRS2区，其中RF1和RF2为pRF-HU2质粒上设计引物。

如图7所示，突变子m1和m2用HygU/HygL引物都能扩增出片段，而野生株LF061(W)基因组做为模板却不能扩增得到片段；同时，gene-T1/gene-T2在W、m1和m2中都能扩增出520bp大小的基因片段，说明靶区序列并未被敲除。geneT3/RF1以m1基因组DNA为模板能扩增出1.9kb基因片段，与理论扩增片段长度一致，经过进一步测序表明1.9kb基因片段是质粒pRF-HU2部分序列和fpBeas基因部分序列的杂合体，而m2和野生株W均不能扩增出任何片段。geneT4/R2引物在突变子m1、m2和LF061中均不能扩增出基因片段，说明突变子m1在左侧臂(B-HRS1)同源整合，为单交换。而m2为异位整合，即整合到LF061基因组上其他位置。

3、白僵菌素发酵、产物分离纯化

将镰刀菌突变子m1和m2从M-100平板上接种到PDA平板上生长5天，同时接种LF061野生株(W)。待菌长满平板后，取其菌丝，用无菌去离子水配成浓度为1×10⁵的菌悬液，确定突变株(m1和m2)与出发野生株LF061孢子浓度一致。每个250mL的三角瓶中放入20g玉米粒，加入12mL蒸馏水，封口，浸泡4小时。在121℃灭菌30min，冷却备用。每瓶加入2mL上述菌悬液，每个样品做3个重复。28℃培养10天。结束发酵后，用15mL的86％乙腈浸泡过夜，离心取上清。HPLC分析条件：HPLC分析采用Agilent 1100RP-HPLC平台，色谱柱为ZORBAX SB C₁₈，4.6mm×150mm，5μm；流动相为：80％甲醇(溶于水)；流速为：1mL/min；检测波长：210nm；标准品为白僵菌素(beauvericin)(购自Sigma，产品目录号为B7510)；标准品的的保留时间为10.4min；突变株(m2)与野生株LF061(W)中的白僵菌素的保留时间为10.5min。发酵实验数据表明(见图8)，m1丧失白僵菌素产生能力，与对照野生株W相比，m2保留微弱的白僵菌素产生能力，具体分子机制未知。

Claims (2)

1.一种重组载体，为将序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列插入到出发载体上，得到的含有序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列作为上下游同源臂的重组载体。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述出发载体为pRF-HU2克隆载体。

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