CN102511471B - 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不含有动物源蛋白和DMSO的间充质干细胞冻存液，由海藻糖、混合糖电解质注射液、ATP和人血清白蛋白组成。该冻存液具有高复苏率（>90%），不影响干细胞的特性，细胞增殖不改变、细胞分化不改变；容易使用、稳定性好等优点。本发明还公开了上述冻存液的制备方法。

Description

一种间充质干细胞冻存液及其制备方法

技术领域 

      本申请涉及一种间充质干细胞冻存液及其制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

间充质干细胞具有可以大量扩增的特点，扩增后的干细胞有时需要被冻存起来，以备于科研及临床随时复苏使用。在间充质干细胞的冻存中主要使用有毒性的二甲基亚砜(DMSO)和动物血清等，DMSO具有毒性不可避免的会对细胞有一定的损伤，而动物血清则有动物病原污染的可能性，这都为细胞的制增加了操作步骤和不确定因素。因此，寻找一种可替代DMSO冻存细胞，并可以直接用于临床的产品具有非常重要的意义。

海藻糖（Trehalose）是由两个葡萄糖分子以a,a,1,1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境，表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。和自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种不含有动物源蛋白和DMSO的间充质干细胞冻存液。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种间充质干细胞冻存液，其由海藻糖、混合糖电解质注射液、ATP和人血清白蛋白组成。

在本发明中的间充质干细胞冻存液中，每100ml混合糖电解质溶液中加入海藻糖的质量为2g~15g，优选7.5g；加入ATP的质量为0.05~0.3g，优选0.15g；加入人血清白蛋白的质量为0.01~0.1g，优选0.025g。

本发明的另一目的是提供一种上述间充质干细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：

1）称取海藻糖，溶解于混合糖电解质注射液。 

2）添加ATP和人血清白蛋白。

3）将混合液用细菌滤器过滤除菌，即为配制的间充质干细胞冻存液。

作为优选，步骤3中的细菌滤器为0.22                                                

细菌滤器。

本发明的另一目的是提供一种上述间充质干细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：

1）取已经过鉴定的间充质干细胞，用低糖DMEM加10%FBS培养，扩增培养至10⁷个细胞时备用。

2）间充质干细胞的冻存 用已配制好的细胞冻存液悬浮细胞，按照10⁶个/ml量用程序降温盒冻存至-76℃冰箱内。

在本发明中，细胞活率分析 4周后取冻存细胞，37℃水浴复苏。取100

细胞悬液和100

台盼兰染液混合染色分析活率，结果显示冻存细胞活率均达到90%以上。

本发明的有益效果

本发明创造了一种新的间充质干细胞冻存液，可在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞不受细胞外冰晶的损害。具有以下特点：不含有动物源蛋白和DMSO；高复苏率>90%，不影响干细胞的特性，细胞增殖不改变、细胞分化不改变；容易使用、稳定性好。

具体实施方式

实施例1

    用混合糖电解质溶液配制含有200Mm海藻糖、3mM  ATP和0.025%人血清白蛋白的冻存液，然后分别取已培养鉴定的脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞进行冻存实验，结果表明对于三种间充质干细胞在-76℃温度下保存一个月细胞活率均可维持在90%以上。

实施例2： 本发明冻存液与含DMSO冻存液效果对比

冻存液1：         海藻糖     200mM；

                           ATP     3mM；

             人血清白蛋白      0.025%; 

      按照上述浓度，将上述三种物质加入到混合糖电解质溶液中，配制冻存液1。

冻存液2：         DMSO       体积比10%；

                           胎牛血清      体积比10%；

                    DMEM培养基      体积比80%；

按照上述比例配制混合冻存液2。

操作步骤：

1）将海藻糖、ATP、人血清白蛋白、混合糖电解质溶液按上述比例配制出冻存液1；将DMSO、胎牛血清、DMEM培养基按上述比例配制出冻存液2；

2）分别用冻存液1和冻存液2冻存脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞，装入2ml冻存管中，其中干细胞数量为1×10⁶/ml；各配制5管，程序降温盒冻存至-76℃低温冰箱中；

3）细胞复苏：将已冻存好的细胞迅速放至37℃水浴锅内，使其在1~2分钟内复苏，用台盼兰染色进行细胞计数，计算活率。每组结果取平均值如表1所述。

表1：间充质干细胞在冻存液1和冻存液2冻存细胞复苏后细胞活率的检测结果

。

从表1中可以看出，新型间充质细胞冻存液1冻存三种间充质干细胞时取得了与传统DMSO冻存液一样的效果，说明其可以取代传统的细胞冻存液，成为一种新型的间充质干细胞冻存液。 

Claims (7)

1.一种间充质干细胞冻存液，由海藻糖、混合糖电解质注射液、ATP和人血清白蛋白组成；其中每100ml混合糖电解质溶液中加入海藻糖的质量为2g-15g，加入ATP的质量为0.05-0.3g，加入人血清白蛋白的质量为0.01-0.1g。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其中每100ml混合糖电解质溶液中加入海藻糖的质量为7.5g。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其中每100ml混合糖电解质溶液中加入ATP的质量为0.15g。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其中每100ml混合糖电解质溶液中加入人血清白蛋白的质量为0.025g。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的间充质干细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：

1）称取海藻糖，溶解于混合糖电解质注射液； 

2）添加ATP和人血清白蛋白；

3）将混合液用细菌滤器过滤除菌，即为配制的间充质干细胞冻存液。

6.如权利要求5所述的方法，其中步骤3中的细菌滤器为0.22                                                

细菌滤器。

7.一种如权利要求1-4任一项所述的间充质干细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：

1）取已经过鉴定的间充质干细胞，用低糖DMEM加10%FBS培养，扩增培养至10⁷个细胞时备用；

2）间充质干细胞的冻存 用已配制好的细胞冻存液悬浮细胞，按照10⁶个/ml量用程序降温盒冻存至-76℃冰箱内。