CN102511045A

CN102511045A - 通过计算机辅助设计来获得高亲和力的蛋白质的方法

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Publication number: CN102511045A
Application number: CN2009801615123A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 李博华; 王皓; 侯盛; 赵磊
Original assignee: Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Current assignee: Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2012-06-20
Also published as: BR112012006727A2; EP2482212A1; US20120191435A1; EP2482212A4; JP2013505707A; WO2011035456A1; CA2775159A1; AU2009353265A1

Abstract

本发明提供了通过计算机辅助设计来获得高亲和力的蛋白质的方法其步骤包括：1)根据已知的蛋白质和靶分子的复合物的共结晶结构确定候选的蛋白质突变位点；2)用计算机一次模拟候选的蛋白质突变位点上的氨基酸突变，从而获得优化的结构；3)用计算机搜索出步骤2)得到的优化的结构的构象；4)分析步骤3)得到的构象的总能量和均方根偏差，然后选择出总能量最低且均方根偏差较低的构象用以分析与靶分子结合的结合能并获得模拟结构；并且5)根据步骤4)得到的模拟结构，预测并验证突变的高亲和力的蛋白质。

Description

通过计算机辅助设计来获得高亲和力的蛋白质的方法技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体地说，涉及一种通过计算机辅助获得提高的亲和力的抗体或蛋白分子的方法。背景技术

上世纪八十年代以来，蛋白质结构被解析的数量逐年增加和界面友好的结构分析软件的不断发展使我们能够更加深刻地理解分子相互识别的原子基础。早先在结构的基础上改造酶的特异性的研究取得了一些成功的例子，这些证明了改造蛋白质功能在不远的将来成为可能。迄今为止，通过计算机辅助设计，研究人员已经成功地在一些研究模型上改造酶的活性，提高抗体亲和力，甚至通过改造产生自然界并不存在的催化活性。增强抗体亲和力对于提高其检测灵敏度、延长解离时间、降低药物使用剂量和增强药效都具有非常重要的意义。

目前，提高抗体亲和力的方法主要是以原亲本单抗为改造模板，通过构建其突变体抗体库（如核糖体展示、酵母双杂交、噬菌体展示抗体库等）进行筛选，最终袭得更高亲和力的单抗。但是，这些技术具有很大的局限性：很难构建出足以覆盖所有位点的、突变成任何氨基酸的突变文库；构建抗体库及其筛选过程费时费力；当目标蛋白难以表达或者在体外筛选的环境下结合不稳定的时候，就难以采用抗体库的方法进行筛选。

与以往的抗体库技术相比，计算机辅助设计可以通过虚拟突变的方法来进行筛选，大大节约了实验所用时间；可对抗体结合域所有位点进行单点和組合虚拟突变；其预测突变的氨基酸往往只有一个就可以显著提高抗体亲和力。但现有的计算机辅助设计方法还存在准确率低和计算量过大的问题。例如，在蛋白质的改造和模拟试驗中，生物信息学家对蛋白质的改造的尝试总是将与配体相互接触面上的所有的氣基酸突变成除了脯氨酸以外的其他氨基酸，由于蛋白质间接触面上的氨基酸数量众多，将所有氨基酸不加选择地进行突变需要完成相当大的计算量，而且受计算机运行速度的限制，在算法上也需要取很多的近似值来简化运算，最终不仅造成巨大的运算时间的浪费而且未必会产生很高的预测准确性。探索如何能够在不增加运算时间甚至是减少运算时间而快速准确地得到高亲和力的突变位点的方法是非常有必要和有意义的。发明内容本发明的目的是提供一种计算机辅助提高抗体亲和力的方法，该方法将抗体进化规律与计算机模拟技术相结合，增加了计算机模拟中真阳性的位点，显著提高了蛋白亲和力预测的准确率。

本发明首先对抗体亲和力成熟过程中的规律进行总结，建立了一种基于抗体进化规律的计算机辅助设计方法，以快速高效提高抗体的亲和力（准确率大于 57% )。为了证明本发明所述方法的通用性，本发明用该方法进一步进行融合蛋白受体的亲和力的提高试验，获得相似的准确率。原则上，本发明的方法能够广泛应用于提高蛋白质复合物间的相互作用，加速研发具有生物学和医学意义的蛋白质。同时，将抗体进化规律与计算机模拟技术相结合，为以后进行计算机辅助设计提供了一种新的思路。

本发明的计算机辅助提高抗体亲和力的方法，包括以下步驟：

一种通过计算机辅助获得高亲和力的抗体或蛋白分子的方法，包括以下步驟：

1 )根据已知的抗体或蛋白分子复合物的共结晶结构确定候选的抗体或蛋白分子的虚拟突变位点；

2 )依次将候选的虚拟突变位点上的氨基酸进行计算机模拟突变，获得经过初步优化的分子结构；

3 )对获得的经过初步优化的分子结构，采用计算机模拟的方法进行构象搜索，获得经过虚拟突变后的抗体或蛋白分子的模拟结构;

4 )将优化后的抗体或蛋白分子结构进行能量和均方根偏差分析，挑选出总能量最低且均方根偏差数值较小的突变体构象进行与靶分子结合的结合能分析，同时获得其模拟结构；

5 )根据模拟结构，构建并表达预测能够提高抗体或蛋白分子亲和力的突变体，分别进行与亲和力提高相关的实验脸证，获得具有高亲和力的抗体或蛋白突变体。

其中步據 1 ) 中，才艮据已知的抗体或蛋白的亲和力成熟过程中在晶体结构上发生的变化的特点选取突变位点，并选取那些在蛋白质复合物接触面和表面具有偏向性分布的氨基酸作为候选的突变氨基酸。选择的突变位点位于抗体或蛋白分子与抗原或结合蛋白的接触面外围且不与抗原或结合蛋白形成相互作用。

其中步骤 2 ) 中将所述虚拟突变位点突变为下述氨基酸：

Glu、 Arg、 Asn、 Ser、 Thr、 T r、 Lys、 Asp、 Pro和 /或 Ala。

其中步驟 4 ) 包括：

a )将步骤 3 ) 中获得的经过初步优化的抗体或蛋白分子，按照总体能量进行排序； b )根据抗体或蛋白分子复合物的晶体结构信息，确定位于靶分子上对结合起关键作用的氨基酸；；

c )对上述对结合起关键作用的氨基酸进行突变，模拟优化后的结构与晶体结构进行均方根偏差分析，选择那些总能量最低且均方根偏差数值相对较小的突变体结构进行结合能的计算和分析并排序；

d )根据步驟 C)的排序结果，获得高亲和力的抗体或蛋白分子的模拟结构。突变位点的选择

本发明中，突变位点的选择主要是根据已知的关于抗体亲和力成熟过程中在晶体结构上发生的变化的特点，并选取那些偏向性分布在蛋白质复合物接触面和表面的氨基酸；

选择突变的策略应首先满足以下方面： i )突变的位点最好位于 CDR区，尽量避免可能产生的免疫原性； ii ) 突变的位点不要太多，在有限的几个位置上能够协同显著提高亲和力而又不过分的改变抗体的接触面； iii )最终的方法必须高效，准确率高，能够通过有限的突变，快速得到提高亲和力的抗体。

本发明选取的突变位置具有以下两个特征： i ) 能够最大限度的保证单点突变具有加大的可能的位置； ii ) 能够最大限度的保证组合突变具有最佳的协同性，极大地提高氨基酸抗体的亲和力。

Clark L A等人对 PDB数据库中的抗原抗体共结晶进行数理和统计上的分析，通过信息挖掘技术得到了普遍分布于抗体接触面上的氨基酸组成的偏向性 [见图 2, Clark LA, Ganesan S, Papp S, et al. Trends in antibody sequence changes during the somatic hypermutation process. [J]. J Immunol. 2006, 177(1): 333-340; Lo C L, Chothia C, Janin J. The atomic structure of protein-protein recognition sites.[J]. J Mol Biol. 1999, 285(5): 2177-2198]。根据上述氨基酸分布的偏向性 ,本发明选择那些具有较高概率出现在抗体接触面和表面的氨基酸作为突变的选择氨基酸。在现有预测准确性的基础上，通过这种有目的性的筛选，排除了那些很少出现在抗体接触面上的预测假阳性的氨基酸，从而使得提高预测的准确性成为可能。

根据 Reichmann等人的研究，蛋白质接触面是呈簇分布的，位于簇中的氨基酸突变往往不能形成很好的协同效应，而位于不同簇中的氨基酸突变能够保证最大限度的氨基酸间的协同性。同时，由于抗体在经过亲和力成熟的过程中，接触面的中心地带往往是对亲和力起较大贡献，也是进化较为完全的地方；而对于接触面的四周，由于体内亲和力成熟的局限性，抗原的内吞，导致抗体的亲和力不高，且这些地方往往进化的不够完全。因此，本发明选取位于抗原抗体接触面的四周的位置作为突变位点，且最好是没有和抗原发生相互作用的氨基酸位点。

因此，本发明选择的抗体突变位点具有以下特征： ( 1 )选择的突变位点：位于抗体接触面外围且最好没有与抗原物质形成相互作用；（2 )选择的突变義基酸选自 Glu、 Arg、 Asn、 Ser、 Thr、 Tyr、 Lys、 Asp, Pro和 Ala。计算机模拟突变的方法

通过 PDB数据库（ PDB; Berman, Westbrook et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28, 235-242; http://www.pdb.org/ ) 中得到的 PDB文件导入 Insightll

( accelrys公司 )，采用 CVFF ( Consistent Valence Force Field )力场 [Pnina D O. Structure and energetics of ligand binding to proteins: Escherichia coli dihydrofolate reductase-trimethoprim, a drug-receptor system[J]. Proteins:

Structure, Function, and Genetics. 1988, 4(1): 31-47]，通过 Biopolymer

( InsigMI软件包中的模块）模块加氢，固定蛋白质所有的重原子对所加的氢键进行 5000步的能量最小化（步长为 lfs )。得到能量最小化优化后的结构，设定距离抗原 6A的距离为接触面。在接触面周围 25A的距离加入水分子。将选取的突变位置进行氨基酸的突变，对突变位点 6A距离的氨基酸分子进行 auto—rotamer选取空间上的最优起始位点 [Dunbrack R L. Rotamer Libraries in the 21st Century [J]. Current Opinion in Structural Biology. 2002, 12(4): 431-440. Ponder J W, Richards F M. Tertiary templates for proteins： Use of packing criteria in the enumeration of allowed sequences for different structural classes[J]. Journal of Molecular Biology. 1987， 193(4): 775-791.]。将蛋白质复合物外周的水分子和除蛋白盾复合物接触界面外的抗体分子进行固定（constraint ), 进行模拟退火来寻找最有可能的接触模式。

首先采用 Quartic VDW (van der waals) with coulombic interactions off 的方法进行初次筛选寻找可能的结合构象，降低此过程中范德华力和氢键的常数为 0.5,每次进行 6000步的寻找，最终产生 60个经过初步优化后的构象。然后对初次生成的 60个构象分别采用 cell— mutipole的方法进行更加精细的寻找 [Ding H Q, Karasawa N, Goddard 11. Atomic level simulations on a million particles: The cell multipole method for Coulomb and London nonbond interactions^]. J. Chem. Phys. 1992, 97(6): 4309-4315], 此时将范德华和库伦力的选项的常数设置为 0.5, 从 500K到 280K进行 50个阶段，每个阶段进行 100fs, 最终产生的结构在进行 6000步的能量最小化 [Senderowitz H, Guarnieri F, Still W C. A Smart Monte Carlo Technique for Free Energy Simulations of M lticonformational Molecules. Direct Calculations of the

Conformational Populations of Organic Molecules [J], J. Am. Chem. Soc. 1995, 117(31): 8211-8219.]。将生成的结构进行结合能、总体能量和 root mean square deviation ( RMSD )的打分，将总能量最低且 RMSD值相对较小的构象挑出。

将选择出的复合物导入 charmm V34bl ( Bernard, R. B. and E. B. Robert, et al. (1983). "CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations." J Comput Chem. 4(2): 187-217. ), 使用 HBUILD 命令在 PDB结构的重原子上加氢，采用 charmm力场（ Becker, O. M. and M. Karplus (2005). Guide to Biomolecular Simulations (Focus on Structural

Biology) for charmm， Springer. )。采用 Generalized Born with a simple

Switching ( GBSW ) [Im， W., Lee, M. S. & Brooks, C. L. Generalized born model with a simple smoothing function. J. Comput. Chem. 24， 1691-1702 (2003)] 隐性水模型对整个体系进行能量最小化，将达到平衡后的复合物采用

MM-PBSA的方法进行相对结合能的评价 [Kuhn， B.， Gerber, P., Schulz-Gasch, T. & Stahl, M. Validation and use of the MM-PBSA approach for drug discovery. J. Med. Chem. 48， 4040-4048 (2005). Alonso, H.， Bliznyuk, A. A. & Gready, J. E. Combining docking and molecular dynamic simulations in drug design. Med. Res. Rev. 26, 531-568 (2006).]。

结合自由能通过如下的公式进行评价：

AGbind = <Emm> + AGsolv -TAS ( Fogolari, F. and A.

Brigo, et al. (2003). "Protocol for MM/PBSA molecular dynamics simulations of proteins." Biophys J 85(1): 159-66. )

其中 Emm是采用 CVFF力场计算得来的分子力学能量， AGsolv是溶剂化自由能， -TAS是溶质的熵。

其中分子力学能量由分子内能、范德华力和静电相互作用三部分组成。由于每个抗体在其结合与非结合抗原的时候结构并未变化，因此分子力学能量的内能部分对结合自由能的贡献为零。

AGsolv= AGPB +AGnp

AGPB表示静电溶剂化能， AGnp表示非极性溶剂化能；

由于仅仅是在原有抗体上进行点突变， 4艮小的改动，因此 -TAS的变化可以忽略不计； Kollman等人曾经对亲和力成熟抗体和其胚系抗体（ germline antibody )进行动力学模拟和结合能的分析得出 AGnp和 -TAS在亲和力成熟过程中其变化很小，对结合能的贡献不大 [Chong L T, Duan Y₅ Wang L, et al. Molecular dynamics and free-energy calculations applied to affinity maturation in antibody 48G7.[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999, 96(25): 14330-14335·]。 △GPB通常对蛋白质的结合起负作用，但是通过蛋白质之间的静电相互作用的补偿，使得蛋白质之间能够形成比较稳定的结合 [Novotny J, Sharp K.

Electrostatic fields in antibodies and antibody/antigen complexes. [J]. Prog

Biophys Mol Biol. 1992, 58(3): 203-224. Novotny J, Bruccoleri R E, Davis M, et al. Empirical free energy calculations: a blind test and further improvements to the method.[J]. J Mol Biol. 1997, 268(2): 401-411.]„ 因此，在这里我们对评价结合能的公式进行筒化，仅仅计算分子力学对结合能的贡献。对突变后的结构采用计算机模拟的方法进行构象搜索

首先 ,可采用 Quartic VDW (van der waals) with coulombic interactions off 方法对突变后的结构进行初次优化，生成满足条件的一定数量的初步优化后的结构。

由于蛋白质分子分子数多，自由度大，蛋白质分子的构象搜索仍然是结构模拟的一个瓶颈。在初始构象的搜索中，本发明首先采用筒单的刚性球体模型来评价范德华力 (van der waals), 且不计算分子间的库伦力的影响。进而使得能量介面变得更加平滑，能够相对容易地挑出局部能量最小值。

Quartic VDW (van der waals) with coulombic interactions off方法通常用来进行初始的构象空间搜索。然后，可采用 cell_mutipole方法对生成的初始结构进一步优化，进行最终精细的构象搜索，获得能量优化后的抗体或蛋白分子。

对于生物大分子来说，直接采用无限远的 cutoff的方法进行模拟需要耗费大量的时间，即使是最快的计算机现今也是不可行的。 Cell—mutipole (单元多偶极法)是一种快速高效的方法，具有与计算体系分子数呈线性关系的计算规模和适度的内存需求量，专门发展来用于大分子的模拟。 [Ding, H. Q. and N. Karasawa, et al. (1992). "Atomic level simulations on a million particles: The cell multipole method for Coulomb and London nonbond interactions." J. Chem. Phys. 97(6): 4309-4315.] 对优化结构进行综合评价

将优化好的结构进行能量打分、均方根偏差（RMSD )等指标的综合评价，获得预测的具有亲和力提高的抗体的突变点，具体步骤包括：首先将上述经过能量优化后的抗体或蛋白分子，按照总体能量进行打分，从高到低进行排序；然后根据蛋白质复合物的晶体结构信息，确定位于靶分子上对结合起关键作用的氨基酸；对这些对结合起关键作用的氨基酸进行突变模拟后与晶体结构进行 RMSD分析 (重原子），选择那些总能量最低且 RMSD 数值相对较小的突变体结构进行结合能的计算和分析；最终获得能够提高抗体或蛋白分子亲和力的模拟结构。

构建并表达预测的能够提高抗体或蛋白分子亲和力的突变体，分别进行与亲和力提高相关的实验验证，获得能够提高抗体或蛋白亲和力的突变体。

本发明通过总结和尝试最终将从抗体亲和力成熟过程的规律与传统的计算机模拟技术结合，开发了一种提高抗体或蛋白分子亲和力的方法。本发明的方法显著性提高了计算机模拟预测提高蛋白亲和力的准确率，大大减少了运算工作量，降低了提高抗体亲和力所用的实验室成本，使得蛋白亲和力的改变工作变得简单高效。附图说明

图 1: 显示本发明方法的实验流程图；

图 2: 显示氨基酸分布的偏向性分析；

图 3: 显示实验验证能够提高 Trastuzumab亲和力的突变位点；如图所示，为重链 55位 Asn, 重链 102位 Asp, 轻链 28位 Asp和轻链 93位 Thr。

图 4: 显示 Trastuzumab重链可变区（VH )和轻链可变区（ VL ) 的核苷酸序列和氨基酸序列；

图 5: 显示实验验证能够提高 Rituximab亲和力的突变位点；如图所示，为 H57Asp和 H102Tyr;

图 6: 显示 Rituximab重链可变区（VH )和轻链可变区（VL ) 的核苷

^^列和氨基列；

图 7: 显示在相同样品浓度下 biacore检测 Rituximab及 ituximab突变体的 sensorgram图；

图 8: 显示 CTLA-4膜外区核苷酸序列和氨基酸序列；

图 9: 显示在相同样品浓度下 biacore检测 Abatacept及 CTLA-4/Ig突变体的 sensorgram图。具体实施方式

以下实施方式伴细描述了对成熟抗体 ( Trastuzumab和 Rituximab )和融合蛋白受体（CTLA4-Ig )进行亲和力提高的试验方法，通过这些实施方式可以进一步理解本发明的特点和优点。

提高 Trastuzumab抗体亲和力的试验描述

曲妥珠单抗（Trastuzumab, Herceptin )是由美国 Genentech公司开发的靶向 HER2 的人源化单克隆抗体，对 HER2受体有高度亲和力，用于治疗 HER2/neu过表达的转移性乳腺癌。本发明通过计算机进行体外模拟亲和力提高的过程，克服体内亲和力成熟过程的限制，进而得到表位相同但具有超高亲和力的 Trastuzumab。通过体内外的实验反复验证，最终得到具有更强抗肿瘤活性的新型的 Tratuzumabo

计算机模拟预测 Trastuzumab亲和力的提高

为了评价计算机模拟的预测准确率，首先选择 Trastuzumab的结合区域所有的氨基酸位进行虚拟突变，依次分别突变成其他 19种氨基酸。将 Trastuzumab与 Her2的共结晶 PDB文件 ( 1N8Z )导入 Insightll ( accelrys 公司），载入 CVFF力场，通过 Biopolymer加氢，固定蛋白质所有的重原子对所加的氢键进行能量最小化：首先进行 Steepest descent method进行能量最小化, 直到 maximum derivative小于 1000 kcal/mol/A,再采用 conjugate gradient method进行能量最小化，总共进行 10000步（步长为 lfs ), 最终使得收敛值 ( convergence )达到 0.01。得到优化后的结构，设定距离抗原 6A 的距离为接触面。在接触面周围 25A的距离加入水分子。将选取的突变位置进行氨基酸的突变，然后基于 Ponder和 Richards总结的的旋转异构体文库，对突变位点 6A距离的氨基酸分子进行 auto— rotamer选取空间上的最优化起始位点。将外周的水分子和除接触界面外的抗体分子进行固定，进行模拟退火来寻找最有可能的接触模式。

在选取最优结构上我们采用两步法进行寻找可能的构象：首先采用 quartic_vdw— no— Coulomb的方法进行初次筛选寻找可能的结合构象，降低此过程中范德华力的影响因子为 0.5, 每次进行 3000步的寻找，最终产生 60 个想要的结果。然后对初次生成的 60个结构采用 cell—mutipole的方法进行进行 4000步（ 1个步长 =lfs )能量最小化，此时将范德华和库伦力的选项的影响因子设置为 0.5 , 然后温度从 500K到 280K进行 50个阶段，每个阶段进行 100fs, 最终产生的结构在进行 8000步的能量最小化。将生成的结构进行结合能、总体能量和 RMSD的打分，将最有可能的结构挑选出来，进行不同突变体间结合能的评价。如表 1所示，计算机预测方法的准确率近几年达到 18.2%。

Trastuzumab亲和力提高的设计策略

首先，对 Trastuzumab和 Her2抗原上的接触面进行分析： Trastuzumab 与 Her2抗原的接触溶剂化表面为 675A,具有较大的接触面。对接触面外周的氨基酸依次进行虚拟突变。采用上述相同的计算机模拟步骤，最终才艮据预测，选取预测提高最高的 10个点进行实验验证。

实施例 1 人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂（ Invitrogen公司产品）提取总 RNA,才艮据文献（ Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder R Cell. 1980 Nov;22(l Pt 1): 197-207 )和文献（ The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma 1 gene. Ellison JW, Berson BJ, Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10;10(13):4071-9 )报道的序列分别设计引物： HC sense: GCTAG CACCA AGGGC CCATC GGTCT TCC; HC antisense: TTTAC CGGGA GACAG GGAGA GGCTC TTC; Lc sense: ACTGT GGCTG CACCA TCTGT CTTCA TCT; Lc antisense: ACACT CTCCC CTGTT GAAGC TCTTT GTG。采用 RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳純化回收并克隆到 pGEM-T载体（Promega公司）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。 SEQ ID ΝΟ:1显示重链恒定区（CH ) 的核苷酸序列， SEQ ID NO:2显示重链恒定区（CH ) 的氨基列， SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4分别显示了轻链恒定区（ CL )的核苷酸序列和氨基酸序列。本实施例中的正确克隆记作 pGEM-T/CH和 pGEM-T/CL。

实施例 2抗 Her2人源化抗体 Trastuzumab的表达载体构建

参照 1992年发表在 PNAS上的抗人 Her2单抗资料及序列（ Carter, P. and L. Presta, et al. (1992). Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4285-9 ), 合成抗人 Her2单克隆抗体 Trastuzumab重链可变区基因（ Her2VH )及轻链可变区基因（Her2VL ), 如图 4所示。

以 Her2VH基因和 pGEM-T/CH载体为模板通过重叠 PCR合成人源化抗体重链基因，反应条件为： 95TM5分钟； 94°C 50秒， 58°C50秒， 72°C 50秒， 30个循环； 72°C 10分钟。并使此人源化重链基因的 5'端含有限制酶位点 Hind III和信号肽基因序列， 3 '端含有翻译终止密码 TAA和限制酶位点 EcoR I。信号肽基因序列为： ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTAATC AGT GCC TCA GTC ATAATA TCC AGA GGA。最后琼脂糖凝胶电泳分离 PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到 pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用 ffindlll和 EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段 Her2VHCH,与用 Hind III和 EcoR I酶切的盾粒 pcDNA3.1 ( + ) (美国 Invitrogen公司产品）进行连接，构建成人源化重链真核表达载体 pcDNA3.1 ( + ) ( Her2VHCH )。

以 Her2VL基因和 pGEM-T/CL载体为模板通过重叠 PCR合成人源化抗体轻链基因，反应条件为： 95°C 15分钟； 94°C 50秒， 58°C50秒， 72°C 50 秒， 30个循环； 72°C 10分钟，得到 PCR产物 Her2VLCL, 其 5'端含有限制酶位点 Hindlll和信号肽基因序列， 3 '端含有翻译终止密码 TAA和限制酶位点 EcoR I。信号肽基因序列为： ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT TTC AGC 序正确的克隆用 Hind III和 EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段 C2B8VLCL, 与用 Hind III和 EcoR I酶切的质粒 pcDNA3.1 载体（美国 Invitrogen公司产品）进行连接，构建成人源化轻链真核表达载体 pcDNA3.1 ( Her2VLCL )。

实施例 3 嵌合抗体的稳定表达与纯化

于 3.5cm组织培养皿中接种 3x105 CHO-K1 细胞（ ATCC CRL-9618 ), 细胞培养至 90%-95%融合时进行转染：取质粒 lO g (质粒 pcDNA3.1(+) ( Her2VHCH ) 4 g , 质粒 pcDNA3.1 ( Her2VLCL ) 6μ_δ ) 和 20μ1 Lipofectamine2000 Reagent ( Invitrogen公司产品）分别溶于 500μ1 无血清 DMEM培养基，室温静置 5分钟，将以上 2种液体混合，室温孵育 20分钟以使 DNA-脂质体复合物形成，其间用 3ml无血清的 DMEM培养基替换培养^:中的含血清培养基，然后将形成的 DNA-脂质体复合物加入到板中， C0₂ 孵箱培养 4小时后补加 2ml含 10%血清的 DMEM完全培养基，置于 C0₂ 孵箱中继续培养。转染进行 24h后细胞换含 60(^g/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用 ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人 IgG (Fc) 包被于 ELISA板， 4。C过夜，用 2 % BSA-PBS于 37。C封闭 2h, 加入待测的抗性克隆培养上清或标准品（Human myeloma IgGl , κ ), 37°C温育 2h, 加入 HRP-羊抗人 IgG ( κ )进行结合反应， 37。C温育 lh, 加入 TMB于 37。C 作用 5min, 最后用 H₂S0₄终止反应，测 A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用 Protein A亲和柱（ GE公司产品）分离纯化人源化抗体 trastuzumab。将纯化抗体用 PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。

实施例 4 Trastuzumab抗体突变体的构建及表达

采用 overlapPCR的方式进行 Trastuzumab抗体突变体的构建，其构建与表达、纯化的方法与 Trastuzumab人源化抗体相同。构建的抗体突变体共 10 个，分别为 Hmutl到 HmutlO, 具体氨基酸序列分别见 SEQ ID NO:5 ~ SEQ

实施例 5 Trastuzumab突变体的 ELISA鉴定

将 Her2膜外区蛋白按照 Carter的方法进行表达纯化，然后包被 ELISA 板， 37度，孵育 2小时；然后将固定浓度的抗体与等比稀释好的 Her2膜外区蛋白室温孵育 1小时。然后通过鉴定孵育抗体抗原复合物中游离的抗体的量，最终计算出亲和力的大小。具体请参见 [Carter P, et al. (1992) Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-4289; Friguet B, Chaffotte AF, Djavadi-Ohaniance antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immunol Methods 77:305-319]. 最终，十个实险组中总共有六个点可以提高亲和力，准确率达到了 60%。如图 3所示，其中显示了实验证明能够提高 Trastuzumab 亲和力的四个位点。

表 1： Trastuzumab抗体亲和力的预测和实验结果

位置突变位置 Kd^/Kd¹ mutant

d WT

0.16 ± 0.02 nM

L28Asp Pro 0.83 ± 0.12

L28Asp Met 0.32 ± 0.07

L30Asn Ser ND

L30Asn Arg 1.74 ± 0.17

L32Ala Gin ND

L94Thr Tyr 0.87 ± 0.05

H55Asn Lys 2.01 ± 0.19

H55Asn Pro 0.08 ± 0.01

H57Tyr lie 0.06 ± 0.01

HI 02 Asp Met 0.54 ± 0.15

H103Lys Arg 0.04 ± 0.01

实验误差用 SD表示，其来源于三次独立的实验； WT, 为 Trastuzumab抗体； ND, 表示由于亲和力太弱无法检测。

表 2: 竟争性 ELISA检测抗体突变体的亲和力

KdWT/Kdmuta KdHerc/Kdm 突变体名称位置突变为氨基酸 nt utant

KdWT = 0.16 ± 0.02 nM KdHerc : 0.21 ± 0.04 nM

Hmutl L28Asp Arg 1.86 ± 0.09 2.44 ± 0.12

Hmut2 L28Asp Pro 0.83 ± 0.12 1.09 ± 0.16

Hmut3 L93Thr Tyr 1.64 ± 0.18 2.15 ± 0.24

Hmut4 L93Thr Asn 0.21± 0.08 0.28 ± 0.11

Hmut5 H55Asn Pro 0.08 ± 0.01 0.11 ± 0.01

Hmut6 H55Asn Lys 2.01 ± 0.19 2.64士 0.25

Hmut7 H59Arg Lys 0.75士 0.02 0.98 ± 0.03

Hmut8 H102Asp Thr 2.16 ± 0.16 2.84 ± 0.21

Hmut9 H102Asp Tyr 3.11 ± 0.28 4.09 ± 0.37

Hmutl 0 H102Asp Lys 2.31 ± 0.20 3.03士 0.26 误差用 SD表示，来源于独立重复三次实验结果。 WT为未突变的抗体序列； Here表示为市售 Herceptin. 提高 Rituximab抗体亲和力试验的描迷

Rituximab是基因工程人鼠嵌合单克隆抗体，由鼠 Fab和人 Fc构成，分子量约 150kDa，可特异性地与 B淋巴细胞表面的 CD20抗原结合，最终导致 B淋巴细胞死亡，用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤等。

Rituximab定点突变的试验方法

Rituximab抗体突变的策略

首先，对 Rituximab上的接触面进行分析：通常短肽与蛋白接触的溶剂化可接触面积在 400-700A, 通常要比蛋白与蛋白接触的溶剂化可接触面积要小，而 ituximab与 CD20短肽接触的 SAS为 440A, 在短肽与蛋白相互作用中的 SAS 已经算是比较小的。选择在接触面外周氨基酸依次进行虚拟突变。

将 Rituximab与 CD20抗原肽的共结晶 PDB文件导入 Insightl accelrys 公司），载入 CVFF力场，通过 Biopolymer加氢，固定蛋白质所有的重原子对所加的氢键进行 10000 步的能量最小化（步长为 lfs ) , 最终使得 convergence达到 0.01。得到优化后的结构，设定距离抗原 6A的距离为接触面。在接触面周围 25A的距离加入水分子。将选取的突变位置进行氨基酸的突变，然后基于 Ponder和 Richards总结的的旋转异构体文库，对突变位点 6A距离的氨基酸分子进行 auto_rotamer选取空间上的最优化起始位点。将外周的水分子和除接触界面外的抗体分子进行固定，进行模拟退火来寻找最有可能的接触模式。在选取最优结构上我们采用两步法进行寻找可能的构象：首先采用 quartic_vdw— no—coul的方法进行初次筛选寻找可能的结合构象，降低此过程中范德华^"的影响因子为 0.5, 每次进行 6000步的寻找，最终产生 60个想要的结果。然后对初次生成的 60个结构采用 cell—mutipole 的方法进行进行 4000步（ 1个步长 =lfs )能量最小化，此时将范德华和库伦力的选项的影响因子设置为 0.5，然后温度从 500K到 280K进行 50个阶段，每个阶段进行 100fs, 最终产生的结构在进行 8000步的能量最小化。将上述过程生成的结构进行 RMSD ( Root mean square deviation )分析，比较生成的结构复合物中抗原肽上与抗体结合紧密的氨基酸与突变前的氨基酸的构象变化（heavy atom )。最终，我们选择那些总能量最低且 RMSD相对比较低的结构挑选出来。

将挑选出来的结构导入 charmm,进行能量最小化。采用 MM-PBSA的方法进行能量评价。为了评价计算机预测方法的准确性，我们在三个候选位点分别选取了预测能够提高亲和力的氨基酸和预测亲和力下降的氨基酸进行试验验证。

Rituximab抗体的构建实施例 6人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂（ Invitrogen公司产品）提取总 R A, 根据文献 Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cell. 1980 Nov; 22(1 Pt 1): 197-207 )和文献（ The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma 1 gene. Ellison JW₅ Berson BJ, Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10;10(13):4071-9 )报道的序列分别设计引物： HC sense: GCTAG CACCA AGGGC CCATC GGTCT TCC; HC antisense: TTTAC CGGGA GACAG GGAGA GGCTC TTC; Lc sense: ACTGT GGCTG CACCA TCTGT CTTCA TCT; Lc antisense: ACACT CTCCC CTGTT GAAGC TCTTT GTG。采用 RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 pGEM-T载体中，测序^ r证后确认获得了正确的克隆。 SEQ ID ΝΟ:1和 SEQ ID NO:2分别显示了重链恒定区 ( CH ) 的核苷酸序列和氨基酸序列。 SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4分别显示了轻链恒定区（CL ) 的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/CH和 pGEM-T/CL。

实施例 7抗 CD20嵌合抗体 Rituximab的表达载体构建合成抗人 CD20单克隆抗体 Rituximab ( C2B8 )重链可变区基因（ C2B8VH ) 及轻链可变区基因（C2B8VL )。图 6显示了 C2B8重链和轻链可变区的核苷列和氨基列。

以 C2B8VH基因和 pGEM-T/CH载体为模板通过重叠 PCR合成人源化抗体重链基因，反应条件为： 95°C 15分钟； 94°C 50秒， 58°C50秒， 72°C 50秒， 30个循环； 72°C 10分钟。并使此人源化重链基因的 5'端含有限制酶位点 Hindlll和信号肽基因序列， 3 '端含有翻译终止密码 TAA和限制酶位点 EcoR l。信号肽基因序列为： ATG GGATTC AGC AGGATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GTAACT ACA GGT GTC CAC TCC。最后琼脂糖凝胶电泳分离 PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到 pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用 Hindlll和 EcoR l酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段 C2B8VHCH, 与用 Hindlll和 EcoR I酶切的质粒 pcDNA3.1(+) (美国 Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化重链真核表达载体 _PcDNA3.1 (+) (C2B8VHCH)„

以 C2B8VL基因和 pGEM-T/CL载体为模板通过重叠 PCR合成人源化抗体轻链基因，反应条件为： 95°C 15分钟； 94 °C 50秒， 58°C50秒， 72°C 50 秒， 30个循环；，2。C 10分钟，得到 PCR产物 C2B8VLCL, 其 5'端含有限制酶位点 Hindlll和信号肽基因序列， 3 '端含有翻译终止密码 TAA和限制酶位点 EcoR I。信号肽基因序列为 ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC 选测序正确的克隆用 Hindlll和 EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段 C2B8VLCL,与用 Hindlll和 EcoR I酶切的质粒 pcDNA3.1 载体 (美国 Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化轻链真核表达载体 pcDNA3.1 (C2B8VLCL)。

实施例 8 嵌合抗体的稳定表达与纯化

于 3.5cm组织培养亚中接种 3 x l05 CHO-Kl 细胞（ ATCC CRL-9618 ), 细胞培养至 90%-95%融合时进行转染：取质粒 10 g(质粒 pcDNA3.1(+)(C2B8VHCH)4 g, 质粒 pcDNA3.1(C2B8VLCL)6 g)和 20μ1 Lipofectamine 2000 Reagent ( Invitrogen公司产品）分别溶于 500μ1无血清 DMEM培养基，室温静置 5分钟，将以上 2种液体混合，室温孵育 20分钟以使 DNA-脂质体复合物形成，其间用 3ml无血清的 DMEM培养基替换培养 JUL中的含血清培养基，然后将形成的 DNA-脂^:体复合物加入到板中， C02 孵箱培养 4小时后补加 2ml含 10%血清的 DMEM完全培养基，置于 C02 孵箱中继续培养。转染进行 24h后细胞换含 ⁶0(^g/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用 ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人 IgG (Fc) 包被于 ELISA板， 4。C过夜，用 2 % BSA-PBS于 37。C封闭 2h, 加入待测的抗性克隆培养上清或标准品 (Human myeloma IgGl,K) , 37。C 温育 2h，加入 HRP -羊抗人 IgG(K)进行结合反应， 37°C温育 lh,加入 TMB于 37°C作用 5min, 最后用 H2S04终止反应，测 A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用 Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化嵌合抗体 C2B8。将纯化抗体用 PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。

实施例 9 C2B8抗体突变体的构建及表达

采用 overlapPCR的方式进行 C2B8抗体突变体的构建，其构建与表达、纯化的方法与 C2B8 嵌合抗体相同。构建的抗体突变体共 10 个，分别为 Rmutl到 Rmut7，具体氨基酸序列分别见 SEQ ID NO: 25 ~ SEQ ID NO: 38。实施例 10 Rituximab及突变体的 biacore鉴定

将 SA芯片在 50μ1/πώι的 PBS溶液中 25°C平衡 30min，然后用 lM NaCl 50mM NaOH的活化液活化 3次，每次 lmin; 将 biotin标记的抗原肽（其为人 CD20 分子膜外区的部分片段，其来源参见文献（ Structural Basis for Recognition of CD20 by Therapeutic Antibody Rituximab. Du, J.; Wang, H.; Zhong, C. (..·)· J Biol Chem, 2007, 282(20): 15073-15080 )稀释成最终浓度为 ^g/ml, ΙΟμΙ/min的流速包被 ARu=1000; 然后用 PBS緩冲液 50μ1/ηιίη平衡 10min。将平衡后的芯片用 0.04%的生物素溶液封闭芯片。将抗体等两倍比稀释五个浓度， 50μ1/πώι上样 75 sec, 然后用 PBS解离 10min。图 7显示了在相同样品浓度下 biacore检测的 sensorgram ¾；具体检测亲和力数值见表 3。最终， C2B8抗体突变体 Rmut3亲和力提高了 6.08倍，突变体 Rmut7亲和力提高了 3.96倍。其预测准确率达到了 71.4%。如图 5所示，其中显示出亲和力提高的突变位点为重链 57位 Asp和重链 102位 Tyr。

表 3: biacore检测抗体突变体的亲和力

突变位置及突变为

名称 KdWT/Kdmutant KdRitu/Kdmutant

的氨基酸

K 4.1 ± 0.30 nM Kd^ritu=56.1 ± 0.40 nM

Rmutl H55NE 0.54±0.21 0.69±0.27

Rmut2 H55NR 0.61±0.18 0.78±0.23

Rmut3 H57DE 6.08±1.48 7.73±1.88

Rmut4 H102YR 1.75±0.25 2.23±0.32

Rmut5 H102YS 1.85±0.35 2.35±0.45

Rmut6 H102YT 1.84±0.24 2.34±0.31

Rmut7 H102YK 3.96±0.39 5.04±0.50

ND表示没有采用 biacore检测; WT表示未突变的 C2B8; ritu表示市售 rituximab。提高 CTLA4-Ig融合受体亲和力试验的描述

细胞毒 T细胞抗原 4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4, CTLA-4)为同源二聚体，主要表达于活化 T细胞，与 CD28具有高度同源性。

阿巴西普（Abatacept )是 CTLA-4膜外区与免疫球蛋白的融合蛋白，通过与 B7分子结合抑制 T细胞的激活，进而作为一种特异性的共刺激因子调节剂，用于治疗抗 TNF-α治疗无效的类风湿性关节炎。 Belatacept同样也是由施贵宝公司开发，其与阿巴西普仅仅只有两个氨基酸的改变，但是显著提高与配体（CD80、 CD86 ) 的亲和力。

CTLA4/Ig定点突变的试 ¾r方法

将 CTLA4/Ig与 CD86的共结晶 PDB文件（ li85 )导入 Insightl accelrys 公司），载入 CVFF力场，通过 Biopol mer加氢，固定蛋白质所有的重原子对所加的氢键进行能量最小化：首先进行 Steepest descent method进行能量最小化 , 直到 maximum derivative小于 1000 kcal/mol/A,再采用 conjugate gradient method进行能量最小化，总共进行 10000步（步长为 lfs ), 最终使得 convergence达到 0.01。得到优化后的结构，设定距离抗原 6A的距离为接触面。在接触面周围 25A的距离加入水分子。将选取的突变位置进行氨基酸的突变，然后基于 Ponder和 Richards总结的的旋转异构体文库，对突变位点 6A距离的氨基酸分子进行 auto— rotamer选取空间上的最优化起始位点。将外周的水分子和除接触界面外的抗体分子进行固定，进行模拟退火来寻找最有可能的接触模式。在选取最优结构上我们采用两步法进行寻找可能的构象：首先采用 quartic_vdw— no— Coulomb的方法进行初次筛选寻找可能的结合构象，降低此过程范德华力的影响因子为 0.5,每次进行 3000步的寻找，最终产生 60 个想要的结果。然后对初次生成的 60 个结构采用 cell— mutipole的方法进行进行 4000步（ 1个步长 =lfs )能量最小化，此时将范德华和库伦力的选项的影响因子设置为 0.5,然后温度从 500K到 280K进行 50个阶段，每个阶段进行 100fs, 最终产生的结构在进行 8000步的能量最小化。将生成的结构进行结合能、总体能量和 RMSD的打分，将最有可能的结构挑选出来，进行不同突变体间结合能的评价。为了评价计算机预测方法的准确性，我们在三个候选位点分别选取了预测能够提高亲和力的氨基酸进行试验验证。

CTLA4/Ig突变体的构建和功能检测

实施例 11 CTLA-4膜外区基因和 Fc区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂（Invitrogen公司产品)提取总 RNA，设计引物扩增 CTLA-4膜外区基因 (GenelD: 1493), 并用引物 FC有义： GCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGAC和 FC反义： GAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG扩增抗体 Fc区。 PCR反应均采用热启动，反应条件： 94°C 15分； 94°C45秒； 60°C 45秒； 72°C 1 分 10秒； 30个循环； 72°C 10分钟。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 pGEM-T(promega)载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。图 8显示了 CTLA-4的核苷酸和氨基酸序列。 SEQ ID NO:39和 SEQ ID NO:40 分别显示了 Fc 区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/CT和 pGEM-T/Fc。

实施例 12 CTLA-4/Ig融合蛋白的表达载体构建

设计引物将合成的信号肽序列 SEQ ID NO:41与克隆出来的 CTLA-4膜外基因片段进行 overlapPCR, 将连接测序正确的片段与抗体 Fc 进行 overlapPCR, 装 pGEM-T载体进行测序。 4兆选测序正确的克隆用 Hindlll和 EcoR l酶切 CTLA-4/Ig融合受体蛋白基因，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，与用 Hindlll和 EcoR I酶切的质 pcDNA3.1(+) (美国 Invitrogen公司产品)进行连接，构建成人源化重链真核表达载体 pcDNA3.1 (+) , 记作 pcDNA3.1 (+) (CTLA-4/Ig)。

实施例 13 融合受体的稳定表达与纯化

于 3.5cm组织培养亚中接种 3 105 CHO-K1 细胞（ ATCC CRL-9618 ), 细胞培养至 90%-95%融合时进行转染：取质粒 10μβ(质粒 pcDNA3.1 (+) (CTLA-4/Ig) 和 20μ1 Lipofectamine2000 Reagent ( Invitrogen 公司产品）分别溶于 500μ1无血清 DMEM培养基，室温静置 5分钟，将以上 2种液体混合，室温孵育 20分钟以使 DNA-脂质体复合物形成，其间用 3ml无血清的 DMEM培养基替换培养亚中的含血清培养基，然后将形成的 DNA-脂质体复合物加入到板中， C0₂孵箱培养 4小时后补加 2ml含 10%血清的 DMEM完全培养基，置于 C0₂孵箱中继续培养。转染进行 24h后细胞换含 60(^g/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用 ELISA 检测筛选高表达克隆：羊抗人 IgG (Fc)包被于 ELISA板， 4。C过夜，用 2% BSA-PBS 于 37。C 封闭 2h , 加入待测的抗性克隆培养上清或标准品 (Abatacept), 37°C温育 2h,加入 HRP -羊抗人 Fc(CH2)进行结合反应， 37°C 温育 lh, 加入 TMB于 37。C作用 5min，最后用 ¾S0₄终止反应，测 A450 值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用 Protein A亲和柱（ GE公司产品）分离纯化嵌合抗体 C2B8。将纯化抗体用 PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。

实施例 14 融合受体突变体的构建及表达

采用 overlapPCR的方式对 CTLA-4/Ig突变体进行构建，其构建（如图 8所示）与表达、纯化的方法与 CTLA-4/Ig融合蛋白相同。突变体氨基酸序列见 SEQ ID NO:42 ~ SEQ ID NO:50。

实施例 15 Abatacept. CTLA-4/Ig突变体的 biacore鉴定

将 CM5芯片在 50μ1/ιηίη的磷酸盐缓冲液( PBS )溶液中 25°C平衡 30min, 然后用 ΙΟΟμΙ的 Ν-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)和 ΙΟΟμΙ 1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙基) -碳化二亚胺 (EDC)混合，以 ΙΟμΙ/ml 活化芯片 8min。然后将终浓度为 5 g/ml 的 CD86-FC ( R&D公司）蛋白以 ΙΟμΙ/ml 的流速包被芯片，最终 △Ru=100 Ru。然后用 PBS緩冲液 50μ1/πΰη平衡 10min。将待检测样品以等两倍比稀释五个浓度， 50μ1/ηώι上样 75 sec, 然后用 PBS解离 10min。图 9 显示了在相同样品浓度下 biacore检测的 sensorgmm图；具体检测亲和力数值见表 4。其中，我们构建的 CTLA-4/Ig的亲和力与 Abatacept的亲和力相似；提高亲和力程度较高的单点突变体为：突变体 CTmutl和 CTmut2,亲和力分别提高了 4.04和 3.98倍；突变体 CTmut6, 亲和力提高了 2.29倍；突变体 CTmutlO, 亲和力提高了 2.68倍。最终，预测准确率达到了 70%。表 4:

突变体名称位置突变为氨基酸

Κ/τ=44.1士 0.30 nM Kd^ritu=56.1 ± 0.40 nM

CTmutl D31Ala Tyr 3.98 ± 0.19 4.24 ± 0.20

CTmut2 D31Ala Lys 4.04 ± 0.90 4.31 ± 0.96

CTmut3 D53Thr Lys 0.55 ± 0.14 0.58 ± 0.15

CTmut4 D55Met Glu 1.75 ± 0.07 1.87 ± 0.08

CTmut5 D63Leu Lys 1.85 ± 0.16 1.97 ± 0.17

CTmut6 D63Leu Tyr 2.29 ± 0.31 2.44 ± 0.33

CTmut7 D35Arg Pro 0.55 ± 0.14 0.58 ± 0.15

CTmut8 D106Leu Glu 2.00 ± 0.39 2.13 ± 0.42

CTmut9 D106Leu Asn 0.88 ± 0.06 0.94 ± 0.06

CTmutl 0 D106Leu Ser 2.68 ± 1.14 2.86 ± 1.22 实验误差采用 SD表示，通过三次不同的实验确定。 WT, 表示未突变的原本融合受体; abat,表示市售 Abatacept; 工业应用性

本发明的方法能够广泛应用于提高蛋白质复合物间的亲和力，加速研发具有生物学和医学意义的高亲和力蛋白质分子。同时，将抗体进化规律与计算机模拟技术相结合，为以后进行计算机辅助设计提供了一种新的思路。

Claims

权利要求书

1、一种通过计算机辅助获得高亲和力的抗体或蛋白分子的方法，包括以下步骤：

1 据已知的抗体或蛋白分子复合物的共结晶结构确定候选的抗体或蛋白分子的虚拟突变位点；

2 )依次将候选的虚拟突变位点上的氨基酸进行计算机模拟突变，获得经过初步优化的分子结构；

3 )对获得的经过初步优化的分子结构，采用计算机模拟的方法进行构象搜索 , 获得经过虚拟突变后的抗体或蛋白分子的模拟结构；

4 )将优化后的抗体或蛋白分子结构进行能量和均方根偏差分析，挑选出总能量最低且均方根偏差数值较小的突变体构象进行与靶分子结合的结合能分析，同时获得其模拟结构；

5 )根据模拟结构，构建并表达预测能够提高抗体或蛋白分子亲和力的突变体，分别进行与亲和力提高相关的实验验证，获得具有高亲和力的抗体或蛋白突变体。
2、权利要求 1所述的方法，其中步骤 1 ) 中，根据已知的抗体或蛋白的亲和力成熟过程中在晶体结构上发生的变化的特点选取虚拟突变位点，并选取那些在蛋白质复合物接触面和表面具有偏向性分布的氨基酸作为候选的突变氨基酸。
3、权利要求 2所述的方法，其中根据抗体或蛋白分子复合物的晶体结构进行步驟 1 )所述的突变位点选取，选择的突变位点位于抗体或蛋白分子与抗原或结合蛋白的接触面外围且不与抗原或结合蛋白形成相互作用。
4、权利要求 2所述的方法，其中步骤 2 ) 中将所述虚拟突变位点突变为下述氨基酸：

Glu、 Arg、 Asn、 Ser、 Thr、 Tyr、 Lys、 Asp, Pro和 /或 Ala。
5、权利要求 1所述的方法，其中步骤 4 ) 包括：

a )将步骤 3 ) 中获得的经过初步优化的抗体或蛋白分子，按照总体能量进行排序；

b )根据抗体或蛋白分子复合物的晶体结构信息，确定位于靶分子上对结合起关键作用的氨基酸；；

c )对上述对结合起关键作用的氨基酸进行突变，模拟优化后的结构与晶体结构进行均方根偏差分析，选择那些总能量最低且均方根偏差数值相对较小的突变体结构进行结合能的计算和分析并排序；

d )根据步骤 C)的排序结果，获得高亲和力的抗体或蛋白分子的模拟结构。