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CN102482641A - 细胞保存方法 - Google Patents

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CN102482641A
CN102482641A CN2010800373223A CN201080037322A CN102482641A CN 102482641 A CN102482641 A CN 102482641A CN 2010800373223 A CN2010800373223 A CN 2010800373223A CN 201080037322 A CN201080037322 A CN 201080037322A CN 102482641 A CN102482641 A CN 102482641A
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sodium
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CN2010800373223A
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田边雅茂
矶野友美
榎龙嗣
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Takara Bio Inc
Original Assignee
Takara Bio Inc
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Abstract

冷冻保存细胞的方法，其特征在于使用含有作为必须成分的下列物质的溶液：钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，该溶液还可选地包含选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。根据本发明，提供了用于冷冻保存细胞的方法，所述细胞能够在解冻之后维持高存活率，还提供了用于冷冻保存的冷冻保存溶液。另外，通过使用该冷冻保存方法，即使在解冻之后，细胞也可以保存在维持高存活率的状态，并维持其生理功能；此外，冷冻和解冻之后的细胞洗涤步骤是不必要的，从而使其在细胞的基础研究和医学处理的应用性研究上是非常有用的。

Description

细胞保存方法
技术领域
本发明涉及用于细胞的冷冻保存的方法和用于该方法的冷冻保存溶液。
背景技术
近年来，随着医药的进展，已经广泛进行了利用活细胞的基础研究和治疗。因此，用于安全地保存细胞而同时维持细胞活性的技术是必需的，对此已经进行了多项研究。作为保存细胞的方法，在短期保存的情况下，在悬浮状态下保存细胞而不冷冻的方法是已知的(例如，专利公开物1)；或者，在长期保存的情况下，包括冷冻的用于保存细胞的方法是已知的(例如，专利公开物2)。例如，在过继性免疫治疗或供体淋巴细胞输注(DLI)治疗(其为针对癌症的免疫治疗)中，有一些这样的情况：实际操作上难以在制备之后立即使用(施用)细胞；因此，需要冷冻保存细胞一定的时间段，直至使用细胞。作为冷冻保存的方法，已知有这样的方法：其中，通过将冷冻保护剂加入到含有大约40种成分的细胞培养基中来制备溶液，并使用该溶液作为细胞保存溶液。
然而，常规的方法使用如上所述的含有大约40种成分的培养基，在这些成分之中有可能会包括对于细胞或活体而言不想要的那些成分。另外，在“解冻冷冻保存的细胞后将细胞施用至活体”的情况下，需要将细胞保存在溶液状态持续一段时间，直至细胞被施用至活体，但是，常规的冷冻保存溶液具有一个问题：细胞的存活率，换言之，活细胞的数目，随着保存时间的延续而显著降低。另外，在“解冻之后需要洗涤细胞”的情况下，也存在一个问题：细胞的存活率进一步降低。
现有技术参考文献
专利公开物
专利公开物1：日本专利特开No.2006-230396
专利公开物2：日本专利特开No.2002-233356
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目标是提供用于冷冻保存细胞的方法，所述细胞能够维持在高存活率；还提供了具有用于冷冻保存的必须成分的冷冻保存溶液。
解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明人验证了在细胞的冷冻保存中常规使用的培养基中的大约40种成分的大量组合中的每一种，以期发现对于活体无害的成分以及在冷冻保存细胞时必不可少的成分。结果为，本发明人发现：通过使用含有钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂和碳酸氢盐和/或碳酸盐的溶液获得了即使在解冻后也具有高存活率的细胞。另外，通过使用该溶液，即使上述冷冻保存的细胞被解冻并经历在液体悬浮状态的长期保存时，本发明惊奇地发现：保存细胞是可能的，同时维持在高存活率，虽然细胞冷冻了一次，本发明由此完成。
具体地，本发明总体上涉及：
[1]用于冷冻保存细胞的方法，其特征在于，使用含有下列物质作为必须成分的溶液：钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，所述溶液另外可选地包含选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。
[2]根据[1]的方法，其中所述的糖是选自下列的至少一种糖：葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。
[3]根据[1]的方法，其中所述冷冻保护剂是选自下列的至少一种冷冻保护剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉、乙二醇和甘油。
[4]根据[1]的方法，其中所述蛋白质是源自血液的蛋白质。
[5]用于保存细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：使根据[1]定义的方法进行了冷冻保存的细胞溶液解冻；和，进一步将该细胞溶液保存在液体悬浮状态。和
[6]细胞的冷冻保存溶液，其特征在于，所述冷冻保存溶液包含作为必须成分的下列物质：钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，并且所述溶液另外可选地包含选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。
发明效果
根据本发明，使得获得在解冻之后保持高存活率的细胞的冷冻保存成为可能，甚至是当细胞在解冻之后维持在液体悬浮状态时，细胞也维持高存活率，并且也保持生理学功能；因此，本发明对于细胞的基础性研究和应用性研究和医学应用是非常有用的。
附图说明
图1的图显示了当研究本发明的保存方法中使用的溶液的必须成分时，细胞存活活性的一个实例。
图2的图比较了在反复冷冻和解冻冷冻保存的细胞之后，细胞的存活活性。
图3的图比较了在冷冻保存的细胞解冻之后、在液体悬浮状态保持一个长时间段时的细胞存活活性。
图4的图比较了在冷冻保存的不同细胞解冻之后、在液体悬浮状态保持一个长时间段时的细胞存活活性。
图5的图比较了反复冷冻和解冻冷冻保存的细胞之后的细胞存活活性。
图6的图比较了在冷冻保存的细胞解冻之后、在液体悬浮状态保持一个长时间段时的细胞存活活性。
具体实施方式
以下将更具体地描述本发明。
本发明提供了用于冷冻保存细胞的方法，其特征在于所述方法包括：将细胞悬浮于含有钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐的溶液中，并将得到的细胞悬浮液进行冷冻保存。换言之，钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐在本发明中对于细胞的冷冻保存是必需的且足够的[也称作用于本发明的冷冻保存方法的溶液(本发明的冷冻保存溶液)的必须成分]。
如本文使用的“钠盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该钠盐产生钠离子；可以使用含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括过碳酸钠(Na2CO4)、连二亚硫酸钠(sodium dithionite、sodium hydrosulfite)(Na2S2O4)、亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)、硫酸钠(sodium sulfate(总名称)：Na2SO4)、硫代硫酸钠(hypo)(Na2S2O3)、亚硝酸钠(NaNO2)和硝酸钠(NaNO2)；卤化物包括氟化钠(NaF)、氯化钠(NaCl)、溴化钠(NaBr)和碘化钠(NaI)；氧化物包括氧化钠(Na2O)和过氧化钠(Na2O2)；氢氧化物包括氢氧化钠(sodium hydroxide(总名称)：NaOH)；无机盐包括氢化钠(NaH)、硫化钠(Na2S)、硫氢化钠(sodium hydrosulfide)(NaHS)、硅酸钠(Na2SiO3)、磷酸三钠(Na3PO4)、硼酸钠(Na3BO3)、硼氢化钠(NaBH4)和四氯代金酸钠(Na[AuCl4])；有机酸盐包括乙酸钠(CH3COONa)和柠檬酸钠；等等。可以使用单一种类的这些钠盐或多个种类的组合。在本发明中，作为单一的种类，优选使用氯化钠；作为多个种类，优选使用氯化钠和柠檬酸钠。所包含的钠盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部钠离子的最终浓度而言，数量优选为0.01至5,000mmol/L，更优选为0.1至1,000mmol/L，进一步优选为1至300mmol/L。
如本文使用的“钾盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该钾盐产生钾离子；可以使用含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括硝酸钾(KNO3)、硫酸钾(K2SO4)和过碳酸钾(K2CO4)；卤化物包括氟化钾(KF)、氟氢化钾(KHF2)、氯化钾(KCl)、溴化钾(KBr)和碘化钾(KI)；氧化物包括过氧化钾(K2O2)和氧化钾(K2O)；氢氧化物包括氢氧化钾(KOH)；无机盐包括氢化钾(KH)、硫化钾(K2S)、硫氢化钾(potassiumhydrosulfide)(KHS)、高锰酸钾(KMnO4)、铬酸钾(K2CrO4)和氯酸钾(KClO3)；等等。可以使用单一种类的这些钾盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用氯化钾。所包含的钾盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部钾离子的最终浓度而言，数量优选为0.01至5,000mmol/L，更优选为0.1至1,000mmol/L，进一步优选为1至100mmol/L。
如本文使用的“碳酸氢盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该碳酸氢盐产生碳酸氢根离子；可以使用含多种阳离子的盐。例如，碳酸氢盐包括碳酸氢铵(NH4HCO3)、碳酸氢钾(KHCO3)、碳酸氢钙(Ca(HCO3)2)、碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢镁(Mg(HCO3)2)等。
如本文使用的“碳酸盐”无特别限定，只要当溶解于溶剂时该碳酸盐产生碳酸根离子；可以使用含多种阳离子的盐。例如，碳酸盐包括碳酸铵((NH4)2CO3)、碳酸钾(K2CO3)、碳酸钙(CaCO3)、碳酸钠(Na2CO3)、碳酸钡(BaCO3)、碳酸镁(MgCO3)、碳酸锂(Li2CO3)、碳酸铜(II)(CuCO3)、碳酸铁(II)(FeCO2)、碳酸银(I)(Ag2CO3)等。
可以使用单一种类的这些碳酸氢盐和/或碳酸盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用碳酸氢钠。所包含的碳酸氢盐和/或碳酸盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部碳酸氢根离子和碳酸根离子的最终浓度而言，数量优选为0.01至1,000mmol/L，更优选为0.1至500mmol/L，进一步优选为1至100mmol/L。
如本文使用的“糖”，可以使用单糖、寡糖或糖醇。例如，单糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖包括海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖；糖醇包括木糖醇和山梨糖醇；等等。可以使用单一种类的这些糖或多个种类的组合，在本发明中，糖优选是选自下列的至少一种糖：葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，更优选为葡萄糖。所包含的糖的量优选为冷冻保存溶液的0.01至100g/L，更优选为0.1至100g/L，进一步优选为0.25至50g/L。
如本文使用的“冷冻保护剂”包括二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉(HES)、乙二醇、甘油等。另外，商业上可获得的产品包括CP-1[含有17.65％(W/V)HES和14.71％(V/V)DMSO的生理盐水，由KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.生产]。可以使用单一种类的这些冷冻保护剂或多个种类的组合。在本发明中，优选使用DMSO和羟乙基淀粉。所包含的冷冻保护剂的量优选为冷冻保存溶液的0.01％-50％，更优选为1％-40％，进一步优选为3％-30％。另外，当使用DMSO和羟乙基淀粉共同作为冷冻保护剂时，所包含的它们的总量优选在上述范围内，各自的浓度为：DMSO浓度优选为0.01％-50％，更优选为1％-30％，进一步优选为2％-15％；羟乙基淀粉的浓度优选为0.01％-50％，更优选为1％-30％，进一步优选为2％-15％。
在本发明的优选实施方式中，除了用于本发明的冷冻保存细胞的方法中的溶液的必须成分之外，该溶液还可以可选地包含选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。
如本文使用的“蛋白质”没有特别限定，蛋白质包括分离的蛋白质或可用的重组蛋白质。例如，蛋白质包括源自血液的蛋白质。源自血液的蛋白质包括源自血浆的蛋白质以及源自血清的蛋白质，具体包括血清白蛋白、血清球蛋白等。同样，血清白蛋白包括人血清白蛋白或牛血清白蛋白。商业上可获得的产品包括Buminate Injection 25％(25％的人血清白蛋白，由BaxterLimited生产)等等。可以使用单一种类的这些蛋白质或多个种类的组合。在本发明中，蛋白质优选是人血清白蛋白。所包含的蛋白质的量优选为冷冻保存溶液的0.01％-50％，更优选为1％-30％，进一步优选为2％-15％。
如本文使用的“镁盐”没有特别限定，只要当溶解于溶剂时该镁盐产生镁离子；可以使用含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括硝酸镁(Mg(NO3)2)、硫酸镁(MgSO4)和过碳酸镁(MgCO4)；卤化物包括氟化镁(MgF2)、氟氢化镁(Mg(HF2)2)、氯化镁(MgCl2)、溴化镁(MgBr2)和碘化镁(MgI2)；氧化物包括过氧化镁(MgO2)和氧化镁(MgO)；氢氧化物包括氢氧化镁(Mg(OH)2)；无机盐包括氢化镁(MgH2)、硫化镁(MgS)、硫氢化镁(magnesium hydrosulfide)(Mg(SH)2)、高锰酸镁(Mg(MnO4)2)、铬酸镁(MgCrO4)和氯酸镁(Mg(ClO3)2)；等等。可以使用单一种类的这些镁盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用氯化镁。所包含的镁盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部镁离子的最终浓度而言，数量优选为0.01至10mmol/L，更优选为0.1至5mmol/L。
如本文使用的“钙盐”没有特别限定，只要当溶解于溶剂时该钙盐产生钙离子；可以使用含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐、有机酸盐等。例如，含氧酸盐包括硝酸钙(Ca(NO3)2)、硫酸钙(CaSO4)和过碳酸钙(CaCO4)；卤化物包括氟化钙(CaF2)、氟氢化钙(Ca(HF2)2)、氯化钙(CaCl2)、溴化钙(CaBr2)和碘化钙(CaI2)；氧化物包括过氧化钙(CaO2)和氧化钙(CaO)；氢氧化物包括氢氧化钙(Ca(OH)2)；无机盐包括氢化钙(CaH2)、硫化钙(CaS)、硫氢化钙(calcium hydrosulfide)(Ca(SH)2)、高锰酸钙(Ca(MnO4)2)、铬酸钙(CaCrO4)和氯酸钙(Ca(ClO3)2)；等等。可以使用单一种类的这些钙盐或多个种类的组合。在本发明中，优选使用氯化钙。所包含的钙盐的量无特别限定，就包含于本发明的冷冻保存溶液中的全部钙离子的最终浓度而言，数量优选为0.01至10mmol/L，更优选为0.1至5mmol/L。
本发明方法中使用的冷冻保存溶液的成分中的钠盐与钾盐的浓度比：钠离子与钾离子的浓度比，钠离子/钾离子优选为1/1000至1000/1，更优选为1/100至100/1，进一步优选为1/10至100/1，进一步优选为1/1至100/1，进一步优选为10/1至50/1。
另外，除了上述成分之外，本发明的冷冻保存溶液还可以包含不具有细胞毒性的物质，例如，维生素、氨基酸等。
此外，从调节pH或发挥缓冲作用的角度而言，除了上述成分之外，本发明的冷冻保存溶液可以包含磷酸根离子。然而，从“解冻后直接将细胞施用至活体”的角度而言，优选使该成分较少，或者，冷冻保存溶液可以不含磷酸根离子。
本发明的冷冻保存溶液可以这样制备：各称取所需量的钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，并将所有成分溶解于纯水或生理盐水中。或者，冷冻保存溶液可以这样制备：将每种成分分别溶解于纯水或生理盐水中，并将每种成分的溶液以所需的量混合。当按照如上所述准备冷冻保存溶液时，可以将每种成分溶解于纯水或生理盐水中，然后可以对其进行除掉细菌的步骤(例如，细菌消除过滤步骤)。此外，可选地，可以按照相同的方式制备蛋白质、镁盐或钙盐，并加入其中。或者，可以组合使用含有钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐的数种商业上可获得的溶液。可以在无菌条件下混合商业上可获得的产品，例如，BICARBONInfusion(由AJINOMOTO生产)、日本药典葡萄糖溶液(例如，由NissinPharmaceutical Co.，LTD.生产)、日本药典氯化钠溶液(例如，由OtsukaPharmaceutical Co.，LTD.生产)、日本药典氯化钾溶液(例如，由OtsukaPharmaceutical Co.，LTD.生产)、日本药典碳酸氢钠溶液(例如，由OtsukaPharmaceutical Co.，LTD.生产)、CP-1(KYOKUTO PHARMACEUTICALINDUSTRIAL CO.，LTD.)或Buminate Injection 25％(25％的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)，以包含用于本发明的必要的浓度。
当使用本发明的冷冻保存溶液时，渗透压无特别限定，理想的是，冷冻保存溶液具有不会对细胞产生损伤的渗透压比。例如，当用于人淋巴细胞的保存时，渗透压优选为120至1,500mOsm/L，更优选为250至300mOsm/L。在调节渗透压时，可以使用用于本发明的冷冻保存细胞方法的溶液的必须成分中的任一项。
本发明的冷冻保存溶液的pH没有特别限定，理想的是，溶液具有不会对细胞产生损伤的pH。例如，当用于保存人淋巴细胞时，pH优选为3.0至10.0，更优选为4.5至9.0。当调节pH时，可以使用用于本发明的冷冻保存细胞方法的溶液的必须成分中的任一项。
本发明中还包括，如上所述的，用于本发明的冷冻保存细胞方法中的，冷冻保存溶液，其含有包括下列的必须成分：钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，另外可选地含有选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。
可用于本发明的冷冻保存方法中的细胞包括分离自哺乳动物、包括人类的多种细胞和细胞群体，以及从中诱导的细胞。多种分离的细胞包括，例如，外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、脐带血单核细胞、血细胞系细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、稚细胞、记忆细胞等，诱导的细胞包括淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、细胞毒性T细胞(CTL)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)、NK细胞等，每种具有细胞毒性活性，并且细胞不限于这些细胞。这些细胞可以通过已知的方法制备。
当期望的细胞匀质地悬浮于冷冻保存溶液中时，细胞浓度无特别限定，可以根据细胞的种类、细胞的用途和应用、细胞的大小、保存容器的大小、保存期限等适宜地决定细胞浓度，细胞浓度是例如，优选为1×104至1×109个细胞/mL，更优选为1×105至1×109个细胞/mL，甚至优选为2×105至5×108个细胞/mL。保存容器无特别限定，只要保存容器能够冷冻保存细胞，可以使用冷冻保存袋子、铝保护器、特效袋(miracle bag)、低温管等。
在本发明中，冷冻保存细胞的方法是指包括下列步骤的方法：将期望的细胞悬浮于本发明的冷冻保存溶液中，以制备细胞悬浮液；将该细胞悬浮液在置于超低温度的冰箱中静置，从而将细胞悬浮液保存于冷冻状态。超低温度在本文中无特别限定，只要其是使细胞悬浮液完全冷冻的温度，通常可以是零下60℃或更低。同样，本发明中也包括使用液氮的冷冻保存细胞的方法。优选地，细胞悬浮液保存于充满液氮的温度为零下70℃或更低的冰箱中。根据本发明的方法的冷冻保存时间无特别限定，冷冻保存时间是例如5分钟至48个月，优选为1天至12个月。
然后，根据本发明的方法进行了冷冻保存的细胞悬浮液被解冻，从而可以在非冷冻状态下进一步保存解冻的细胞悬浮液。换言之，本发明还提供了用于保存细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将经历冷冻保存的上述细胞悬浮液(即冷冻保存的细胞悬浮液)解冻，并进一步在非冷冻状态保存解冻的细胞悬浮液，换言之，在液体悬浮状态保存。解冻冷冻保存的细胞悬浮液的方法无特别限定，优选可以在0℃至40℃、更优选20℃至37℃的温度解冻处于冷冻状态的细胞悬浮液。解冻之后的保存温度优选是0℃至40℃，更优选4℃至37℃。非冷冻状态的细胞悬浮液的保存时间无特别限定，保存时间是例如0至18天，优选0至10天，更优选0至3天。
即使在解冻之后，根据本发明的方法进行了冷冻保存的细胞也保持高细胞存活率，在解冻之后继续保存细胞也是可能的。另外，在解冻之后可以不经历洗涤细胞的步骤而直接将细胞施用至活体。
实施例
以下将通过实施例的方式更具体地显示本发明，但不是意在将本发明的范围限制于此。在本发明的实施例中，“室温”是指20℃至30℃。
实施例1：关于保存溶液的研究
(1)制备待研究的溶液
制备如表1所示的溶液作为用于筛选的保存溶液
[表1]
表1
Figure BPA00001514926600091
(2)细胞的制备
在知情同意的情况下，从人类健康供体收集60毫升补充了肝素的血液。将所获得的血液分注入锥形管(由Becton Dickenson或Greiner生产)：每管的量约为15mL，然后在室温在700xg离心20分钟，以分离为血浆级份——离心后的上清液，和含有人外周血单核细胞(PBMC)的细胞级份。以Dulbecco’s PBS(由Invitrogen生产或由NISSUI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.生产)将锥形管填充至20mL的体积，以此来稀释含有PBMC的细胞级份。以20mL Ficoll-Paque PREMIUM(由GE Healthcare Bioscience生产)覆盖所获得的经稀释的细胞溶液，并在室温在700×g离心20分钟。离心之后，使用移液管从分离的层中收集PBMC层，以RPMI 1640培养基将管填充至30mL的体积，然后在4℃在650×g离心10分钟以除掉上清液。类似地，依次进行离心程序，同时将离心力逐步降低至600×g，然后至500×g，并且进行洗涤，总共重复3次。使用自动化血细胞计数设备(nucleocounter，由Chemometec生产)计算所获得的PBMC的活细胞的数目及其存活率(％)。
使用由此所获得的PBMC，根据WO 2009/019450中描述的方法制备人T淋巴细胞。从所获得的人T淋巴细胞中除掉培养基，将淋巴细胞悬浮于生理盐水中以获得3×108细胞/mL的细胞浓度，以制备细胞溶液。
(3)经历微温(37℃)处理的细胞溶液的筛选
对于每种待研究的溶液，将40微升的实施例1-(1)中制备的每种待研究的溶液和10μL的实施例1-(2)中制备的细胞溶液置于1.5ml的塑料管(由Treff生产)中，混合，以制备细胞悬浮液。然后，使细胞悬浮液在37℃的恒温器中静置3小时。
(4)通过MTT测验法测定细胞存活活性
使用如下文所描述的MTT测验法，就细胞代谢(呼吸)测定经过实施例1-(3)所述进行处理后的每种细胞悬浮液，作为细胞存活活性。
首先，向每种50μL的细胞悬浮液中加入经过Dulbecco’s PBS(-)(由NISSUI PHARMACEUTICALCO.，LTD.生产)配制为5mg/mL浓度的MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑溴化物，由Nakalai Tesque生产]50μL，和400μL RPMI 1640培养基(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)，该培养基中含有10％的胎牛血清(由GIBCO生产)和1％的青霉素-链霉素混合溶液(由Nakalai Tesque生产)，并混合。然后，将混合的溶液接种至96孔多孔板(由Costar生产或由Becton Dickenson)生产的4个孔中，每个的体积为100μL，将细胞在37℃、5％CO2的条件下培养90分钟。停止培养之后，向其中加入盐酸-2-丙醇测试溶液[按照第15次修订的日本药典制备：通过以100∶0.33的比例混合2-丙醇(特殊级别，由Nakalai Tesque生产)和盐酸(由Nakalai Tesque生产)而制备溶液]，以使其中的色素完全溶解。使用微量板吸收分光光度计(680XR，由Bio-Rad生产)以655nm的对照波长、在570nm的测量波长测定溶解后的溶液的吸光度。所获得的吸光度被认为是细胞代谢(呼吸)的细胞存活活性(MTT活性值)。结果显示于图1。换言之，图1的图显示了对于每种类型的溶液，吸光度的测量值的平均值(在4个孔测量)。在图中，横坐标轴显示了MTT的活性值。另外，在图中，“误差线＝S.E.”显示了对于4个孔的测量值的标准误差。
从图1中清晰可见，相对于含有7种成分的溶液2，不含碳酸氢钠的溶液5和不含氯化钾的溶液7具有降低的MTT活性数值，所以证明了这些成分对于细胞的稳定是必不可少的。另一方面，在不含硝酸钙、硫酸镁或磷酸氢二钠的溶液中(分别是溶液3、溶液4或溶液6)，MTT活性值没有降低，所以证明：这些成分对于细胞的稳定不是必不可少的。
对于RPMI 1640培养基中所含的所有40种成分，按照各种组合、各种浓度进行了类似的测试，对于一种或数种成分的组合的作为冷冻保护剂的DMSO和羟乙基淀粉以及作为蛋白质的白蛋白进行了另外的测试。总共对100或更多种溶液进行了筛选，比较性地研究了哪些成分对于细胞的稳定是必不可少的。其结果是，在上述40种成分中，证明了4种成分即钠盐、钾盐、碳酸氢盐和/或碳酸盐、以及糖是必要和足够的。
实施例2：冷冻-解冻的影响
(1)待研究的溶液的制备
作为用于研究抵抗冷冻-解冻程序的稳定性的保存溶液，制备了如表2所示的3种溶液。
[表2]
表2
(2)待测试的细胞的制备
按照实施例1-(2)中相同的方式制备细胞溶液，条件是细胞悬浮于生理盐水中以具有6×108个细胞/mL的浓度。
(3)细胞的保存(细胞溶液的冷冻-解冻处理)
对于每种待研究的溶液，将40微升实施例2-(1)中制备的每种待研究的溶液、10μL的实施例2-(2)中制备的细胞溶液、34μL CP-1(由KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.生产)(细胞悬浮液中包含的冷冻保护剂的量为34％)和16μL Buminate Injection 25％(25％的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)[细胞悬浮液中包含的蛋白的量为4％(W/V)]置于低温管(由NALGENE生产)中，混合，以制备细胞悬浮液。此处制备各3个管的细胞悬浮液。此后，使细胞悬浮液在设定于冷下85℃的超低温恒冷器中静置18小时或更长的时间，以允许细胞悬浮液完全冷冻。确认完全冷冻之后，将细胞悬浮液转移至设定为37℃的恒温器中并解冻5分钟。重复该程序1次，3次或7次，产物用于随后的测定。
(4)通过MTT测验法测定细胞存活活性
对于经历了实施例2-(3)中描述的处理之后的各细胞悬浮液，通过如实施例1-(4)相同的方式通过MTT测验法测定细胞存活活性。结果显示于图2。换言之，图2的图显示了每种溶液的测量值(在4个孔所测)的吸光度的平均值和冷冻-解冻的循环数。在图中，横坐标轴显示了冷冻-解冻循环数，纵坐标轴显示了MTT活性值。另外，溶液8的结果通过连接空心方框的虚线表示。溶液9的结果通过连接实心方框的虚线表示。溶液10的结果通过连接实心圆圈的实线表示。
如图2所示，在1次、3次和7次冷冻-解冻循环的任意情况下，仅含有4种成分即氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠和葡萄糖的溶液10证明具有与含有40种成分的溶液8(RPMI 1640培养基)等同的细胞存活活性水平。另一方面，重复的冷冻-解冻程序使生理盐水的活性显著降低，所以证明了仅有该成分是不够的。
实施例3：在细胞解冻过程中以及解冻之前或之后的对微温状态(37℃)的稳定性
(1)待研究的溶液的制备
制备了类似于实施例2-(1)中所述溶液的溶液。
(2)待测试的细胞的制备
按照与实施例2-(2)相同的方式制备了细胞溶液。
(3)细胞溶液的微温(37℃)处理
对于每种待研究的溶液，将40微升实施例3-(1)中制备的每种待研究的溶液、10μL的实施例3-(2)中制备的细胞溶液、34μL CP-1(由KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.生产)和16μL BuminateInjection 25％(25％的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)置于低温管(由NALGENE生产)中，混合，以制备细胞悬浮液。此后，使细胞悬浮液经历与实施例2-(3)相同方式的冷冻-解冻，条件是冷冻-解冻循环进行一次，将解冻后的每种细胞溶液在37℃的恒温器中静置3小时。此处，细胞悬浮液中冷冻保护剂的含量和蛋白的含量与实施例2-(3)中的描述是相同的。
(4)通过MTT测验法测定细胞存活活性
对于经历了实施例3-(3)中描述的处理之后的各细胞悬浮液，通过如实施例1-(4)相同的方式通过MTT测验法测定细胞存活活性。结果显示于图3。换言之，图3的图显示了每种溶液的测量值(在4个孔所测)的吸光度的平均值。在图中，横坐标轴显示了MTT活性值。
使用按照与实施例1-(2)相同的方式从不同于实施例1-(2)的那些的人类健康供体的血液制备的细胞(知情同意的情况下获得)，制备了实施例2-(1)中描述的溶液和以下的溶液11，进行了类似的研究，前提是将16μL生理盐水(由Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)与每种细胞悬浮液混合，替换实施例3-(3)中使用的Buminate Injection。需要生理盐水以调节渗透压，并且也用于阴性对照，所以需要添加。通过添加，离子浓度增加，但是认为由此不会引起特别的稳定化效应。
-溶液11：水溶液，其含有6.6g/L氯化钠，0.40g/L氯化钾和2.0g/L葡萄糖(最终浓度：钠离子：112.94mmol/L；钾离子：5.37mmol/L；钠离子/钾离子＝21.03/l)。
结果显示于图4。换言之，图4的图显示了每种溶液的测量值(在4个孔所测)的吸光度的平均值。在图中，横坐标轴显示了MTT活性值。
如图3和4所示，即使当冷冻和解冻之后的细胞溶液在微温状态静置一个长时间段，含有4种成分即氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠和葡萄糖以及冷冻保护剂和蛋白质的溶液10证明具有与用于常规方法中的含有40种成分和冷冻保护剂和蛋白质的溶液8(RPMI 1640培养基)等同的活性水平。另一方面，当使细胞溶液在冷冻和解冻之后在微温状态静置一个长的时间段时，溶液9(生理盐水)和溶液11(不含碳酸氢钠的溶液10)具有显著降低的活性，所以证明了仅有该成分是不够的。另外，在图3和4的溶液8至10中，保存的细胞显示出相同的趋势，所以证明了保存的细胞不受供体差异的影响。
实施例4：由具有注射实绩的药物构成的能力或无能性1
(1)待研究的溶液的制备
制备了表3所示的溶液以研究当以在日本注册为药物并且具有注射实绩的溶液构成实施例2和3中通过冷冻和解冻具有高细胞存活活性的溶液时，是否会获得相似的结果。
[表3]
表3
Figure BPA00001514926600141
(2)待测试的细胞的制备
按照实施例2-(2)中相同的方式制备细胞溶液。
(3)细胞溶液的冷冻-解冻处理
对于每种待研究的溶液，将40微升实施例4-(1)中制备的每种待研究的溶液、10μL的实施例4-(2)中制备的细胞溶液、34μL CP-1(由KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.生产)和16μL BuminateInjection 25％(25％的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)置于低温管(由NALGENE生产)中，混合，以制备细胞悬浮液。此处制备各3个管的细胞悬浮液。此后，按照与实施例2-(3)相同的方式进行冷冻和解冻程序，那些经历1次，3次或7次重复冷冻和解冻的用于随后的测定。细胞悬浮液中冷冻保护剂的含量和蛋白质的含量与实施例2-(3)中的相同。
(4)通过MTT测验法测定细胞存活活性
对于经历了实施例4-(3)中描述的处理之后的各细胞悬浮液，通过如实施例1-(4)相同的方式通过MTT测验法测定细胞存活活性。结果显示于图5。换言之，图5的图显示了每种溶液的测量值(在4个孔所测)的吸光度的平均值和冷冻-解冻的循环数。在图中，横坐标轴显示了冷冻-解冻循环数，纵坐标轴显示了MTT活性值。另外，溶液12的结果通过连接空心方框的虚线表示。溶液13的结果通过连接实心方框的虚线表示。溶液14的结果通过连接实心圆圈的实线表示。
如图5所示，溶液14具有与溶液12(RPMI 1640培养基)等同的活性水平。从结果可见，由于保存溶液是使用具有注射实绩的药物构成的，其含有4种成分即氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠和葡萄糖，所以证明获得了与使用用于常规方法中的含有多种准药物的溶液获得的保存溶液具有等同水平的保存溶液。
实施例5：由具有注射实绩的药物构成的能力或无能性2
(1)待研究的溶液的制备
制备了实施例4-(1)描述的溶液和表4所示的溶液。
[表4]
表4
Figure BPA00001514926600151
(2)待测试的细胞的制备
按照实施例2-(2)中相同的方式制备细胞溶液。
(3)细胞溶液的微温(37℃)处理
将40微升实施例5-(1)中制备的每种待研究的溶液、10μL的实施例5-(2)中制备的细胞溶液、34μL CP-1(由KYOKUTO PHARMACEUTICALINDUSTRIAL CO.，LTD.生产)和16μL Buminate Injection 25％(25％的人血清白蛋白，由Baxter Limited生产)置于低温管(由NALGENE生产)中，混合，以制备细胞悬浮液。此后，使细胞悬浮液经历与实施例2-(3)相同方式的冷冻-解冻，条件是冷冻-解冻循环进行一次，将解冻后的每种细胞溶液在设定为37℃的恒温器中静置3小时。此处，细胞悬浮液中冷冻保护剂的含量和蛋白的含量与实施例2-(3)中的描述是相同的。
(4)通过MTT测验法测定细胞存活活性
对于经历了实施例5-(3)中描述的处理之后的各细胞悬浮液，通过如实施例1-(4)相同的方式通过MTT测验法测定细胞存活活性。结果显示于图6。换言之，图6的图显示了每种溶液的测量值(在4个孔所测)的吸光度的平均值。在图中，横坐标轴显示了MTT活性值。
如图6所示，溶液14和15具有与溶液12(RPMI 1640培养基)等同的活性水平。从结果可见，由于保存溶液是使用具有注射实绩的药物构成的，其含有4种成分即氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠和葡萄糖，所以证明获得了与使用用于常规方法中的含有多种准药物的溶液获得的保存溶液具有等同水平的特性。
工业实用性
根据本发明，提供了用于冷冻保存细胞的方法，所述细胞能够在解冻之后维持高存活率，还提供了用于冷冻保存的冷冻保存溶液。另外，通过使用该冷冻保存方法，即使在解冻之后，细胞也可以保存在维持高存活率的状态，并维持其生理功能；此外，冷冻和解冻之后的细胞洗涤步骤是不必要的，从而使其在细胞的基础研究和医学处理的应用性研究上是非常有用的。

Claims (6)

1.用于冷冻保存细胞的方法，其特征在于，使用含有下列物质作为必须成分的溶液：钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，所述溶液另外可选地包含选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的糖是选自下列的至少一种糖：葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述冷冻保护剂是选自下列的至少一种冷冻保护剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉、乙二醇和甘油。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述蛋白质是源自血液的蛋白质。
5.用于保存细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：使根据权利要求1至4中任一项的方法进行了冷冻保存的细胞溶液解冻；和，进一步将该细胞溶液保存在液体悬浮状态。
6.细胞的冷冻保存溶液，其特征在于，所述冷冻保存溶液包含作为必须成分的下列物质：钠盐、钾盐、糖、冷冻保护剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐，并且所述溶液另外可选地包含选自下列的成分：蛋白质、镁盐和钙盐。
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