CN102485211A

CN102485211A - 阿霉素脂质体及其制备方法

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Publication number: CN102485211A
Application number: CN2010105681769A
Authority: CN
Inventors: 邓意辉; 杨强
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2010-12-01
Publication date: 2012-06-06

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了阿霉素脂质体及其制备方法，所述的阿霉素脂质体由阿霉素、磷脂类物质、胆固醇、PEG脂质衍生物等组成，本发明的阿霉素脂质体采用pH梯度法制备，按此方法制备的阿霉素脂质体的包封率大于96%；乙醇含量不大于10%，脂质体相关参数几乎没有变化，本发明提供的制剂及其制备方法能使脂质体制备过程中乙醇含量得到控制，且确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响。为脂质体的制备及工业生产中的乙醇含量控制提供参考。

Description

阿霉素脂质体及其制备方法

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及阿霉素脂质体及其制备方法，该制备方法能使脂质体制备过程中乙醇含量得到控制，且确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响。

背景技术：

阿霉素（Doxorubicin）是一种常见的经典抗生素类广谱抗肿瘤药物，其作用机制主要是通过影响拓扑异构酶Ⅱ的活性，抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。阿霉素是一广谱抗肿瘤药，临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、何杰金和非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱瘤、甲状腺瘤、绒毛膜上皮癌、前列腺癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。阿霉素能够通过血-神经屏障（blood-nerve barrier）而损害神经节细胞。其他主要的毒性反应包括，白细胞和血小板减少、毛发脱落、心脏毒性、恶心、食欲减退；特别是当药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。所有这些问题均可以制备脂质体解决。

一般而言，脂质体是由磷脂分子悬浮在水溶液中聚集形成的，磷脂膜为对称双分子膜，分子间为弱相互作用(疏水相互作用、范德华力、氢键等)，磷脂分子间排列紧密, 碳氢链高度有序, 膜流动性小，但常因温度、pH值和含水量等因素的变化发生相变和相分离。当发生凝胶相→液晶相相变，膜分子间隔加大，流动性和通透性显著增加；当发生凝胶相→六角相相分离, 膜上形成孔洞或发生膜融合, 所载药物迅速渗漏。在制备脂质体时，常常采用乙醇作为溶媒溶解脂质，乙醇能诱导流动磷脂的酰基链无序化，也形成一个交错凝胶相，它使脂质膜的离子半径、分子间范德华力、静电力大小发生变化，对膜的结构有一定的影响。

远距离来说，脂质体间存在范德华力和静电排斥力；当两表面接触很近时，1-3nm，脂质体间存在水合力，一种强烈的排斥力，超过范德华力和静电斥力成为主导作用。水合力是水分子与磷脂的亲水基团作用，可阻止脂质体膜间的聚集。当有高浓度乙醇存在时，水分子就被乙醇分子取代，其吸附于膜表面，或者分布在膜的疏水区。这种取代使脂质体表面的水合层消失，引起DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）脂质体的聚集。

基于乙醇可引起侧向相分离，导致卵磷脂/磷脂酰乙醇胺脂质体膜的渗透性增加，过多的乙醇易造成脂质体的聚集、双分子层融合以及药物的渗漏，从而影响脂质体的包封率，粒径及稳定性等。因此已有的阿霉素脂质体（DOXIL，凯莱）商品中乙醇残留量要求小于0.01%。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种阿霉素脂质体及其制备方法。

基于乙醇毒性低，对脂质体膜材溶解性好方面考虑，我们以改良乙醇注入法制备空白脂质体，采用离子梯度装载技术制备阿霉素脂质体。考察不同乙醇含量对空白脂质体、梯度脂质体及载药脂质体包封率、粒径及抗肿瘤效率的影响，惊喜地发现最终脂质体制剂的乙醇残留量可以控制在10%（v/v）以内，确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响，极大地缩短简化工业生产中的乙醇含量控制提供参考。由此我们建立改良乙醇注入法制备阿霉素脂质体的制备工艺，具体方法如下：配制水化介质于45~75 ℃保温待用；以制剂产品终体积百分比小于10%的乙醇，包括无水乙醇，于45~75 ℃溶解脂质相；将水化介质按照一定速度加入至脂质相中，搅拌分散，降低粒径，得空白脂质体；按照梯度载药法即可。

其处方及制备工艺如下：

阿霉素 0.5%～40%

磷脂类物质 10%～90%

胆固醇 0%～44.5%

PEG脂质衍生物 0%～40%

称取处方量氢化大豆磷脂、胆固醇、PEG脂质衍生物，用适量无水乙醇/乙醇溶解，加入一定浓度pH=4.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，搅拌分散至形成均一的混悬液，探头超声/或者其它方法降低粒径后微孔滤膜过滤，即得空白脂质体混悬液。向其中加入一定量的碱性溶液，即得梯度脂质体。将梯度脂质体与盐酸阿霉素溶液混合，于一定温度下孵育一定时间，即得盐酸阿霉素脂质体。其中枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度为100～500mM，药脂质量比为1：1～1：20，载药温度为45～75℃，载药时间为2～60min，脂质体外水相pH值为5.0～8.0；乙醇含量小于10%（V/V）。作为优选，其中枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度为200～400mM，药脂质量比为1：4～1：8，载药温度为50～55℃，载药时间为10～20min，脂质体外水相pH值为6.5～7.5；乙醇含量小于10%（V/V）。

脂质体药物制剂可通过常规技术测定药物在脂质体中的包封率。脂质体包封率测定的方法有超滤法、透析法、柱层析法、微柱离心法等，这些方法均存在一定问题。我们采用离子交换树脂（纤维）进行包封率测定，具有耗时短、操作简单、价格低廉、可重复使用、不需要昂贵的仪器设备等优点。

本发明提供的制剂及其制备方法能使脂质体制备过程中乙醇含量得到合理控制，且确保制备过程中残留的乙醇对脂质体性质无显著性影响。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。这些实施例只是举例说明，它们不应当构成对本发明的限制。

实施例1 pH梯度法制备盐酸阿霉素脂质体（DOX-L）

空白脂质体的制备

称取脂质成分，用适量无水乙醇于65 ℃水浴搅拌溶解，挥除乙醇，加入一定浓度pH=4.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，65 ℃水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。将初品探头超声8 min（200 w×2 min、400 w×6 min）后，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液（最终磷脂质量浓度为50 mg·mL^-1）。

梯度脂质体的制备及载药

取上述空白脂质体混悬液1.0 mL，加入一定量的500 mmol·L^-1的磷酸钠溶液，即得梯度脂质体。取一定量梯度脂质体与盐酸阿霉素溶液（5.0 mg·mL^-1）混合，于一定温度下孵育一定时间，即得DOX-L。

DOX-L包封率的测定

采用阳离子交换树脂法测定DOX-L包封率，具体操作如下：精密移取0.1 mLDOX-L于10.0 mL容量瓶中，加入1.6 mL蒸馏水，以体积分数为90%的异丙醇溶液（含0.75 mol·L^-1HCl）破乳并定容，摇匀，480 nm波长下测定吸光度A₀（药物总吸收度）。另精密移取0.1 mLDOX-L，置于阳离子交换树脂柱顶端表面中央，2000 r·min^-1离心4 min，再于柱顶端加入400 μL蒸馏水，2000 r·min^-1离心4 min，重复4次，合并洗脱液。洗脱液转移至10.0 mL量瓶中，用体积分数为90%的异丙醇溶液（含0.75 mol·L^-1HCl）破乳并定容，摇匀，测定吸光度A₁（包封药物吸收度），计算包封率。

正交设计优化DOX-L的制备工艺

在预实验的基础上，以枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度（A）、药脂质量比（B）、载药温度（℃）、载药时间（D）及△pH值（E）为主要考察因素，每个因素取4个水平（表 1），选用L ₁₆（4⁵）正交设计表（表 2）进行实验，测定包封率，以相应包封率（EE）为指标对结果进行分析。

表1 5因素4水平表

表2 正交试验L ₁₆ （4 ⁵ ）表

由表2可知，处方13，即A₄B₁C₁D₂E₃（枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度400mM、药脂比1：8、载药温度50℃、载药时间15min及△pH值3）的包封率最高，可达99.4%。

另外，由表2可知，五因素对包封率的影响顺序为B﹥A﹥C﹥E﹥D，最优组合为A₃B₂C₂D₂E₃，由于B因素的2和3两个水平即药脂比1:6和1:4对包封率的影响差异较小，综合考虑包封率和载药量分别以A₃B₂C₂D₂E₃（枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度300mM、药脂比1：6、载药温度55℃、载药时间15min、△pH值为3）和A₃B₃C₂D₂E₃（枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度300mM、药脂比1：4载药温度55℃载药时间15min、△pH值为3）两个组合各制备三批脂质体，并对其包封率和粒径进行测定，结果见表3。

表 3 阿霉素脂质体包封率及粒径

处方	EE%	MD/nm
			A₃B₂C₂D₂E₃	99.5±1.6	114.6±1.7
A₃B₃C₂D₂E₃	98.3±1.2	113.1±2.6

由表3可知，在其他处方因素不变的情况下，采用药脂比1:6和1:4制备的脂质体包封率和粒径无显著性差异，综合考虑包封率和载药量，最终选择最优处方为A₃B₃C₂D₂E₃，即采用pH=4.0的300 mmol·L^-1的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液作为水化介质，用500 mmol·L^-1的磷酸钠溶液调节外水相pH=7.0，以药脂比1:4（w/w），55 ℃载药15 min。

综合表2结果及A₄B₁C₁D₂E₃（枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度400mM、药脂比1：8、载药温度50℃、载药时间15min及△pH值3）、A₃B₂C₂D₂E₃（枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度300mM、药脂比1：6、载药温度55℃、载药时间15min、△pH值为3）和A₃B₃C₂D₂E₃（枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度300mM、药脂比1：4载药温度55℃载药时间15min、△pH值为3）中各参数，并考虑实际操作的波动性，我们确定最终处方组成及工艺条件为：枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度200～400mM，药脂比1：4～1：8，载药温度50～55℃，载药时间12～18min及△pH值2.8～3.2。

实施例2 乙醇残留对脂质体的影响

处方组成

二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC） 3g

胆固醇（CH） 1g

聚乙二醇1000胆固醇半琥珀酸酯（mPEG1000-CHEMS） 0.5g

称取处方量DSPC、CH、mPEG1000-CHEMS，分别用2.5%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%和40%（乙醇与水化介质体积比）的无水乙醇溶解膜材，加入pH=4.0的300 mmol·L^-1的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，最终磷脂质量浓度为50 mg·mL^-1，65 ℃水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。将初品探头超声8 min（200 w×2 min、400 w×6 min）后，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液，采用激光粒度测定仪测定各脂质体粒径，结果表明，当乙醇残留量未超过10%（v/v）时，脂质体粒径在107.3~111.8 nm之间，未发生显著变化；当乙醇残留量增加至15%（v/v）时，脂质体粒径增加至122.1 nm；当乙醇量为20~25%（v/v）时脂质体粒径降低为80 nm；乙醇残留量为30%（v/v）时，粒径又增加至120 nm；乙醇残留量为40%（v/v）时，探头超声后形成乳白色凝胶状沉淀。按照最优处方制备载药脂质体，测定包封率，结果当乙醇残留量未超过10%（v/v）时，脂质体包封率在96.2~98.9%之间；当乙醇残量为15%（v/v）时，包封率下降至88.5%，且随着乙醇残留量的增加包封率逐渐下降，当乙醇残留量为30%（v/v）时，包封率只有16.1%。

因此，对于pH梯度法制备阿霉素脂质体的处方工艺，最终制剂中的乙醇含量应该控制为小于等于10%（v/v）。

实施例3 阿霉素脂质体制备

制备脂质混合物粉末：将HSPC、CHOL与PEG2000 - DSPE按照（3：1：1）的质量比混合，用乙醇溶解得到澄明溶液，喷雾干燥后获得脂质粉末（也可以采用叔丁醇溶解各脂质成分，冷冻干燥方法获得脂质粉末）。

制备空白脂质体：将上述脂质粉末用300mM硫酸铵溶液在50-65℃水化，剪切分散，得到粒径不均的多室脂质体。加入不同量的无水乙醇，用微射流设备降低脂质体的粒度（大约80nm），制备含有不同浓度乙醇的脂质体。

制备梯度脂质体：采用离子交换树脂/纤维除去脂质体外水相的硫酸铵即得。

载药：按照药脂比1：6（质量比）的比例，在空白梯度脂质体中加入盐酸阿霉素溶液（10mg/mL），在60-65℃孵育约20min，即可。测定包封率及粒径，结果见表4。

表4 乙醇对阿霉素脂质体包封率及粒径的影响

乙醇浓度（v/v）	0%	5%	10%	15%	20%	25%
							包封率（%）	98.3	98.6	96.6	93.8	61.2	28.6
粒径（nm）	81.3	86.5	83.2	95.6	110.1	118.6

由表可知，当乙醇大于等于20%时，粒径增大，包封率下降，乙醇对粒径的影响明显。采用硫酸铵梯度制备阿霉素脂质体，最终制剂中的乙醇含量应该控制为小于等于15%（v/v）。

本发明的脂质体药物制剂中还可加入等渗调节剂、抗氧化剂等物质，蔗糖、海藻糖、木糖醇、组氨酸、生育酚、EDTA钙钠等。

实施例4 其它处方

磷脂 10g

胆固醇 0~4g

PEG脂质衍生物 0~4g

该处方所说磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物如DSPC、DSPG、DSPE、DPPC、DPPG、DPPE、DOPC、DOPC、DOPE代替HSPC，也可以获得类似结果。PEG脂质衍生物可以是磷脂衍生物，如PEG-DSPE（PEG分子量200～20000），也可以是其他脂质衍生物。

按照上述实施例3的研究方法发现，乙醇大于等于20%时，脂质体各项指标均发生显著性变化。

同样，采用EDTA铵梯度、离子梯度（如离子载体A23187）、蔗糖八硫酸酯梯度等；梯度建立的方法包括“离子交换法”、“透析法”、“超滤法”、“分子筛分离法”等，也可以将乙醇控制在15%以内，所制备的阿霉素脂质体其粒径和包封率与未加乙醇制剂相比无显著性变化。

实施例5 抗肿瘤试验

药物：“实施例3”的阿霉素脂质体，制剂中乙醇含量分别为0%、5%、10%、15%、20%、25%。

将48只接种S180肿瘤的小鼠随机分为8组，即生理盐水对照组（NS）、阿霉素溶液组、阿霉素脂质体组，每组6只动物，接种后分别于第4、7、10天尾静脉注射给药（6mg/kg）。给药后动物正常饲养，每日称量小鼠体重，同时观察小鼠的生长状态。接种后第13天，处死动物，完整剥离皮下肿瘤，计算抑瘤率，结果见表5。

表5 不同乙醇含量阿霉素脂质体抑瘤结果

	溶液组	0%乙醇	5%乙醇	10%乙醇	15%乙醇	20%乙醇	25%乙醇
								抑瘤率（%）	43.1	89.5	90.2	92.3	70.2	50.6	52.7

由表可知，乙醇含量大于等于15%时，抗肿瘤效果显著降低。

虽然乙醇含量在15%时对脂质体的粒径与包封率影响不大，但体内药效却明显降低，因此在制备阿霉素脂质体时，乙醇含量应该控制在10%以内。

实施例6 生存试验

采用“实施例5”的模型，观察荷瘤鼠生存时间。实验结果显示，空白组小鼠在接种后第12-17天全部死亡；阿霉素溶液组与25%乙醇脂质体组在接种后第16-22天期间全部死亡；15%乙醇组所有动物在接种后第13-23天期间全部死亡，0%、5%、10%乙醇组所有动物在接种后第30-40天期间全部死亡。

尽管此处已经描述了本发明的某些优选实施方案，但是这些实施方案不应被理解为是对本发明范围的限制。实际上，除了本文所显示和描述的以外，在阅读了本申请的公开内容之后，结合本领域的普通知识，普通技术人员将十分清楚本发明的各种其他修饰、改变和变化，它们均应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种阿霉素脂质体，其特征在于，其组成及重量百分比如下：

阿霉素 0.5%～40%

磷脂类物质 10%～90%

胆固醇 0%～44.5%

PEG脂质衍生物 0%～40% 。

2.如权利要求1所述的阿霉素脂质体，其特征在于，所述的双分子膜材料是磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物、及上述物质通过常用方法氢化的物质；作为构成双分子膜的主要膜材料可以只含一种磷脂，也可以含有多种磷脂；处方中尚可以加入其他成分，包括糖脂质、胆固醇、谷固醇类中任意一种或多种。

3.如权利要求2所述的阿霉素脂质体，其特征在于，其中所述的脂质体制剂的膜材中磷脂优选HSPC、HEPC、DSPC；“其他成分”优选胆固醇。

4.如权利要求1所述的阿霉素脂质体，其特征在于，其中可加入进一步修饰脂质体表面特征的辅料，可选自聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰甘油（PEG-DSPG）、聚乙二醇修饰的胆固醇（PEG-CHOL）、聚维酮修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PVP - DSPE）、聚维酮修饰的二硬脂酰磷脂酰甘油（PVP - DSPG）或者其组合，更优选聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）衍生物。

5.如权利要求4所述的阿霉素脂质体，其特征在于，PEG-DSPE中PEG的分子量通常为200-20000道尔顿，优选1000-7000道尔顿，更优选2000-5000道尔顿；其用量相对于膜脂质的比率通常为0.0-20mol%，优选0.5-10%。

6.如权利要求1所述的阿霉素脂质体，其特征在于，采用pH梯度法、柠檬酸梯度法、硫酸铵梯度法、蔗糖八硫酸酯梯度法、EDTA铵梯度法、金属离子梯度法将药物装载进入脂质体，控制乙醇含量为0-15%（V/V）。

7.如权利要求6所述的阿霉素脂质体，其特征在于，乙醇含量小于10%（V/V）。

8.如权利要求6所述的阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于，通过pH梯度法制备阿霉素脂质体，其工艺为：称取处方量氢化大豆磷脂、胆固醇、PEG脂质衍生物，用适量乙醇，包括无水乙醇，于55～65℃水浴搅拌溶解，加入一定浓度pH=4.0的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，55～65℃水浴搅拌至形成均一的混悬液，探头超声后微孔滤膜过滤，即得空白脂质体混悬液，向其中加入一定量的碱性溶液，即得梯度脂质体。

9.将梯度脂质体与盐酸阿霉素溶液混合，于一定温度下孵育一定时间，即得盐酸阿霉素脂质体；其中枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度为100～500mM，药脂质量比为1：1～1：20，载药温度为45～75℃，载药时间为2～60min，脂质体外水相pH值为5.0～8.0；乙醇含量小于10%（V/V），作为优选，其中枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液浓度为200～400mM，药脂质量比为1：4～1：8，载药温度为50～55℃，载药时间为10～20min，脂质体外水相pH值为6.5～7.5；乙醇含量小于10%（V/V）。