CN102459311B

CN102459311B - 神经调节肽u衍生物

Info

Publication number: CN102459311B
Application number: CN201080025348.6A
Authority: CN
Inventors: 浅见泰司; 井冈博; 西泽直城
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2010-04-08
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2030-04-08
Also published as: WO2010116752A1; EP2418213B1; ES2525179T3; CN102459311A; EP2418213A4; US20120094899A1; JP5669728B2; JPWO2010116752A1; US9175037B2; EP2418213A1; CA2758264A1

Abstract

本发明的目的是提供一种新的食物摄取抑制剂。此外，本发明的目的是提供一种NMU衍生物，其即使在以通常的方式，例如外周施用时也体现出高的食物摄取抑制作用。这些目的可以通过式(I)表示的化合物或其盐来实现。在式(I)中，Y表示如下多肽，该多肽由在SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中具有1～4个氨基酸取代的氨基酸序列构成；X表示甲氧基聚乙二醇；X’是不存在的或者表示甲氧基聚乙二醇；式：La-Lb-[Lc]_j表示的部分表示接头。

Description

神经调节肽U衍生物

技术领域

本发明涉及神经调节肽U衍生物。

发明背景

使用子宫平滑肌收缩活性作为指标，第一次从猪小肠以由25个氨基酸残基组成的肽或以由8个氨基酸残基组成的肽分离出神经调节肽U(Neuromedin U，NMU)。基于氨基酸残基的数目，这些肽命名为猪NMU-25或猪NMU-8。猪NMU-8由猪NMU-25的C端8个残基组成，是切割猪NMU-25得到的物质。

类似地，NMU-25在人类中是已知的。人NMU-25的C端8个残基的氨基酸序列与猪NMU-8的C端8个残基的氨基酸序列相同。

大鼠NMU由23个氨基酸残基组成，并且命名为NMU-23。大鼠NMU-23的C端8个残基的氨基酸序列与猪NMU-8的C端8个残基的氨基酸序列相差1个氨基酸残基。

作为NMU的受体，最初鉴定出FM3，其是孤独GPCR(orphan GPCR)；随后，鉴定出TGR1。目前，这些受体分别称作NMUR1和NMUR2。FM3主要分布于肠道中，而TGR1位于下丘脑中。

另外，作为TGR1的受体，已经从大鼠脑分离出新的肽。因为此肽位于下丘脑内的视交叉上核中，所以使用视交叉上核(Suprachiasmatic Nucleus)的词首字母来将它命名为神经调节肽S(Neuromedin S，NMS)。

人NMS由33个氨基酸残基组成，并且C端8个氨基酸残基的氨基酸序列与大鼠NMU-23的C端8个残基的氨基酸序列相同。

NMUR1和NMUR2对NMU、NMS、和NMU-8展现出相似的亲和力。已经提示了，这些受体强烈地识别作为NMU和NMS共通序列的由C端8个残基构成的氨基酸序列。

大鼠NMU-23在大鼠中的脑室内施用诱导食物摄取抑制。还已经报告了NMU对室旁核(PVN)或弓状核(ARC)的局部施用诱导食物摄取抑制，与脑室内施用的情况中一样；因此，可以认为NMU的作用部位是PVN和ARC。此外，已经显示了抗NMU抗体的脑室内施用提高食物摄取量，这提示了中枢的NMU在生理方面产生抑制食物摄取的效果。还已经报告了，NMU KO小鼠展现出肥胖表型，而且过表达NMU的小鼠展现出较低的体重和低食物摄取量。这阐明内源NMU的生理学意义。

已经进一步报告了，NMU的脑室内施用引起体温的升高、热产生、和氧消耗的升高。可以认为该作用是由交感神经引起的脂肪组织和肌肉系统的活化。

还已经报告了，通过NMU的脑室内施用来引起对胃酸分泌的抑制和对胃排空(gastric emptying)的抑制。可以认为该作用是经由CRH分泌的中枢性作用。这些作用是导食物摄取量降低的作用。

尚未详细检查为何NMU的外周施用引起对肠道的作用；然而，考虑到NMUR1是在肠道中表达的，可以认为NMU的外周施用对肠道会引起某种作用。基于此推测，检查通过NMU外周施用引起的对胃或肠道的作用，并且已经发现了大肠特异性促运动活性(prokinetic activity)。

专利文献1和2披露了通过NMU的外周施用来获得食物摄取抑制效果。

本发明人还独立地发现了，NMU-23经由外周施用而体现食物摄取抑制作用。另一方面，NMU-8经由外周施用不体现食物摄取抑制作用，尽管NMU-8对受体NMUR1和NMUR2具有足够强的激动剂活性。

为了使神经调节肽U作为食物摄取抑制剂有用，神经调节肽U即使在利用通常的施用方式(例如外周施用)时也体现出高的食物摄取抑制作用是非常重要的。

此外，作为用于医学领域中的化学修饰用途的PEG衍生物，多种化合物是已知的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2007/075439

专利文献2：WO 2007/109135

发明概述

发明要解决的问题

本发明的目的是提供一种新的食物摄取抑制剂(anorectic agent)。

本发明的另一个目的是提供一种神经调节肽U衍生物，其即使利用通常的施用方式(例如外周施用)时也表现出高的食物摄取抑制作用。

解决问题的方法

本发明的发明人等推测：外周施用后未表现出食物摄取抑制作用的原因在于NMU--8在血液中的不稳定性。此外，发明人等推测如果是在血液中高度稳定的NMU--8衍生物(或修饰体)则会表现出足够的食物摄取抑制作用。

如此，发明人制备了神经调节肽U衍生物，其是经由接头，使特定的多肽，与甲氧基聚乙二醇结合而成的，该特定的多肽是在神经调节肽U的氨基酸序列的C端的8个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽中进行了1～4个氨基酸的取代而得到的。发明人揭示了，这样的NMU-8修饰体即使在外周施用时也显示出足够强的食物摄取抑制作用和体重减轻作用。

基于此发现，发明人等继续其研究，并完成本发明。

更具体地，本发明提供了项[1]～[9]的化合物、项[10]和[11]的药剂、项[12]的方法、和项[13]的用途等。

[1]一种以下式表示的化合物或其盐，

[式中，Y表示如下多肽，该多肽由在SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中具有1～4个氨基酸取代的氨基酸序列构成，

所述氨基酸取代选自：

(1)用Ala、Arg、Glu、Ser、Gln、NMeArg、Phe、NMeTyr、D-Tyr、Trp、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Val、Gln、Arg、Glu、Ser、Tyr、Pro、Cha、Trp、NMePhe、Nle、Tyr(PO₃H₂)、Hse、Nal(1)、Nal(2)、Phe(4F)、或Aib取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Glu、Ser、Val、Phe、Pro、Thr、Cha、Nle、NMeArg、Ile、Leu(Me)、Lys、NMeLeu、D-Leu、Ala、D-Ala、Gly、Abu、或Aib取代第3位的Leu；

(4)用Gln、Leu、Pro、Cha、NMePhe、Trp、Phe(4F)、Pya(4)、αMePhe、Nle、Ala、或Aib取代第4位的Phe；

(5)用Nle、Gln、NMeArg、Orn、Dbu、Pya(4)、Hse、或Aib取代第5位的Arg；

(6)用Ala、Hyp、NMeAla、MeGly、NMeSer、D-NMeAla、或Aib取代第6位的Pro；

(7)用Arg(Me)或NMeArg取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、Arg、Asp、Pro、Abu、NMeAsn、或Aib取代第8位的Asn；

X表示甲氧基聚乙二醇；

X’是不存在的或者表示甲氧基聚乙二醇；

La是以下式表示的二价或三价基团：

(其中R表示键、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NH-、-CO-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、-C(＝O)-NH-N＝CH-、-C(＝NH)-NH-、-CO-CH₂-S-、或

且

n表示0～5的整数)；

Lb表示-(CH₂)_i-(式中，i表示1～5的整数)；

Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中Q^c是式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-表示的二价基团

(式中，m1表示0～15的整数，

Z^c表示(a)键或(b)选自下组的二价基团：-CO-、-O-CO-、-CO-O-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-NH-CO-NH-、-CH(NH₂)-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、-CH(OH)-、-CH(COOH)-、-C(＝NH)-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、

(式中u表示1～18的整数，

v表示1～12的整数，

R^zc1表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基、或X-直链C_1-5烷基，且

R^zv2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基，其中X如上文所限定)，且

m2表示0～15的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)，或者

Lc表示式(ii)：-Q^c’-C^b’-

(式中Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-的二价基团

(式中m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示选自下组的二价基团：

且m2’表示0～15的整数)，且

C^b’表示-CO-或-SO₂-；且

j表示1～3的整数]。

[2]项[1]所述的化合物或其盐，其中所述氨基酸取代选自：

(1)用Ala、Arg、Glu、Ser、Gln、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Val、Gln、Arg、Glu、Ser、Tyr、Pro、Cha、或Aib取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Glu、Ser、Val、Phe、Pro、Thr、Cha、Nle、NMeArg、或Aib取代第3位的Leu；

(4)用Gln、Leu、Pro、Cha、NMePhe、或Aib取代第4位的Phe；

(5)用Nle、Gln、NMeArg、或Aib取代第5位的Arg；

(6)用Ala或Aib取代第6位的Pro；

(7)用Arg(Me)取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、Arg、Asp、Pro、或Aib取代第8位的Asn。

[3]项[1]所述的化合物或其盐，其中所述氨基酸取代选自：

(1)用Arg、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Gln取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Cha、NMeArg、或Val取代第3位的Leu；

(4)用Gln或NMeArg取代第5位的Arg；和

(5)用Arg(Me)取代第7位的Arg。

[4]项[1]所述的化合物或其盐，其中所述氨基酸取代选自：

(1)用Arg、Phe、NMeTyr、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Glu、Tyr、Trp、或Nal(2)取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Val、Cha、或NMeLeu取代第3位的Leu；

(4)用Trp取代第4位的Phe；

(5)用Gln或NMeArg取代第5位的Arg；

(6)用Ala或NMeAla取代第6位的Pro；和

(7)用Arg(Me)或NMeArg取代第7位的Arg。

[5]项[1]所述的化合物或其盐，其中Y是由从SEQ ID NO.：2～20中选择的任一个所表示的氨基酸序列组成的多肽。

[6]项[1]所述的化合物或其盐，其中从所述Lc的与Lb最接近的氮原子到神经调节肽U的N端的氮原子之间的距离是

[7]项[1]所述的化合物或其盐，其中Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

[式中，Q^c表示式：-(CH₂)_m1-表示的二价基团(m1表示0～15的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-]。

[8]项[1]所述的化合物或其盐，其中Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

[式中，Q^c为式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-表示的二价基团

(式中，m1表示0～10的整数，

Z^c是选自下组的二价基团：-CO-、-O-CO-、-CO-O-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-NH-CO-NH-、-CH(NH₂)-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、-CH(OH)-、-CH(COOH)-、-C(＝NH)-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、

(式中，u表示1～10的整数，

v表示1～10的整数，

R^zc1表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基、或X-直链C_1-5烷基(其中X如上文所限定)，

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基)，且

m2表示0～5的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-]。

[9]项[1]所述的化合物或其盐，其中Lc是式(ii)：-Q^c’-C^b’-表示的二价基团

[式中，Q^c’为：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示

且m2’表示0～15的整数)，且

C^b’表示键、-CO-或-SO₂-]。

[10]包含项[1]所述的化合物或其盐的食物摄取抑制剂。

[11]一种用于预防或治疗肥胖症的药剂，其包含项[1]所述的化合物或其盐。

[12]一种用于预防或治疗肥胖症的方法，其中，对哺乳动物施用有效量的项[1]所述的化合物或其盐。

[13]项[1]所述的化合物或其盐用于生产预防或治疗肥胖症用的药剂的用途。

本发明进一步提供了项[14]和[15]的化合物。

[14]一种下式表示的化合物或其盐：

所述SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中的氨基酸取代选自：

(1)用Ala、Arg、Glu、Ser、Gln、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(4)用Gln、Leu、Pro、Cha、NMePhe、或Aib取代第4位的Phe；

(5)用Nle、Gln、NMeArg、或Aib取代第5位的Arg；

(6)用Ala或Aib取代第6位的Pro；

(7)用Arg(Me)取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、Arg、Asp、Pro、或Aib取代第8位的Asn，

X表示甲氧基聚乙二醇(条件是多个X所表示的甲氧基聚乙二醇可以是相同或不同的)；

Lb表示-(CH₂)_i-(式中，i表示1～5的整数)；

Lc表示式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中，Q^c表示式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-

(式中，m1表示0～15的整数，

Z^c表示(a)键，或(b)选自下组的二价基团：

-CO-、-O-CO-、-CO-O-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-NH-CO-NH-、-CH(NH₂)-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、-CH(OH)-、-CH(COOH)-、-C(＝NH)-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、

(式中，u表示1～18的整数，

v表示1～12的整数，

R^zc1表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基、或X-直链C_1-5烷基，

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基，X如上文所限定，且

m2表示0～15的整数)，

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)，或

Lc表示式(ii)：-Q^c’-C^b’-

(式中，Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’是0～15的整数，且

Z^c’表示选自下组的二价基团：

且m2’表示0～15的整数)，且

C^b’表示-CO-或-SO₂-)；

k表示1～100的整数；

m表示1～100的整数；

p表示1～100的整数；且

j表示0～3的整数]。

[15]一种下式表示的化合物或其盐：

SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中的氨基酸取代选自：

(1)用Ala、Arg、Glu、Ser、Gln、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(4)用Gln、Leu、Pro、Cha、NMePhe、或Aib取代第4位的Phe；

(5)用Nle、Gln、NMeArg、或Aib取代第5位的Arg；

(6)用Ala或Aib取代第6位的Pro；

(7)用Arg(Me)取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、Arg、Asp、Pro、或Aib取代第8位的Asn，

X表示甲氧基聚乙二醇(条件是多个X所表示的甲氧基聚乙二醇可以是相同或不同的)，且

X”表示聚乙二醇(条件是多个X”所表示的聚乙二醇可以是相同或不同的)；

Lc表示式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中，Q^c表示式-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-表示的二价基团

(式中，m1表示0～15的整数，且

Z^c表示(a)键，或(b)选自下组的二价基团：

-CO-、-O-CO-、-CO-O-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-NH-CO-NH-、

-CH(NH₂)-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、-CH(OH)-、-CH(COOH)-、-C(＝NH)-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、

(式中，u表示1～18的整数，

v表示1～12的整数，

R^zc1表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基、或X-直链C_1-5烷基，且

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基，其中X如上文所限定)，且

m2表示0～15的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)，或

Lc表示式(ii)：-Q^c’-C^b’-

(式中，Q^c’是：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示选自下组的二价基团：

且m2’表示0～15的整数)，且

C^b’表示-CO-或-SO₂-)；且

R在每次出现时是相同或不同的，并且表示选自下组的二价基团：键、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NH-、-CO-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、-C(＝O)-NH-N＝CH-、-C(＝NH)-NH-、-CO-CH₂-S-或

h3表示0～3的整数；且

i3、j3、k3、m3、和n3可以彼此相同或不同，表示0～5的整数]。

所述化合物(I)、化合物(II)和化合物(III)可以共同称为本发明的化合物(或本发明的神经调节肽U衍生物)。

发明效果

本发明的神经调节肽U衍生物是高度稳定的，而且即使在以通常的方式，例如外周施用时等也可以展现出高的食物摄取抑制效果。如此，本发明的神经调节肽U衍生物作为食物摄取抑制剂是有用的。

此外，因为本发明的神经调节肽U衍生物是高度稳定的，而且即使在以通常的方式，例如外周施用时等也可以展现出高的抗肥胖作用，所以本发明的神经调节肽U衍生物作为预防或治疗肥胖症用的药剂是有用的。

具体实施方式

在本说明书中，“直链C_1-5烷基”的例子包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、和正戊基。依照本发明，甲基(CH₃)在下文有时表示为“Me”。

在本文中用于指明氨基酸等的缩写是依照IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)中所限定的缩写或此领域中所使用的常见缩写，其例子在下文显示。

此外，对于存在光学异构体的氨基酸，除非另有规定，表示其L-型。

Gly：甘氨酸

Ala：丙氨酸

Val：缬氨酸

Leu：亮氨酸

Ile：异亮氨酸

Ser：丝氨酸

Thr：苏氨酸

Cys：半胱氨酸

Met：甲硫氨酸

Glu：谷氨酸

Asp：天冬氨酸

Lys：赖氨酸

Arg：精氨酸

His：组氨酸

Phe：苯丙氨酸

Tyr：酪氨酸

Trp：色氨酸

Pro：脯氨酸

Asn：天冬酰胺

Gln：谷氨酰胺

Aib：2-氨基异丁酸

Arg(Me)：N^ω-甲基精氨酸

Cha：β-环己基丙氨酸

Nle：正亮氨酸

NMeArg：N^α-甲基精氨酸

NMePhe：N-甲基苯丙氨酸

Arg：精氨酸

Phe：苯丙氨酸

NMeTyr：N^α-甲基酪氨酸

D-Tyr：D-酪氨酸

Tyr(PO₃H₂)：O-磷酸酪氨酸

Hse：高丝氨酸

Nal(1)：1-萘基丙氨酸

Nal(2)：2-萘基丙氨酸

Leu(Me)：γ-甲基亮氨酸

NMeLeu：N^α-甲基亮氨酸

D-Leu：D-亮氨酸

D-Ala：D-丙氨酸

Abu：2-氨基丁酸

Phe(4F)：4-氟苯丙氨酸

Pya(4)：4-吡啶基丙氨酸

αMePhe：C^α-甲基苯丙氨酸

Orn：鸟氨酸

Dbu：2，4-二氨基丁酸

Hyp：反式-4-羟脯氨酸

NMeAla：N^α-甲基丙氨酸

MeGly：N-甲基甘氨酸

NMeAsn：N^α-甲基天冬酰胺

在说明书中，依照描述肽的常规方式显示肽；也就是说，在左手侧显示N端(氨基端)，而在右手侧显示C端(羧基端)。

简言之，本发明的化合物是由在NMU的C端的8个残基的氨基酸序列中具有1～4个氨基酸取代的氨基酸序列构成的多肽，并且经由接头与甲氧基聚乙二醇连接。即，这些化合物是神经调节肽U衍生物和缀合物(conjugate)。

该NMU的C端的8个残基的氨基酸序列是由SEQ ID NO.：1(Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂)表示的氨基酸。

在本说明书中，“由在SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中具有1～4个氨基酸取代的氨基酸序列构成的多肽”有时简称为“本发明所使用的肽”。就本发明所使用的肽的氨基酸残基的位置而言，按照描述肽的常规方式，N端的氨基酸残疾为第1位。

本发明所使用的肽优选在其N端的α-氨基处与接头结合。

下文会解释式(I)中所使用的术语，以及式(II)、(III)和式(I)中共通使用的术语。

Y表示多肽，该多肽由在SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中具有1～4个氨基酸取代的氨基酸序列构成，即本发明所使用的肽。

需要说明的是，所述氨基酸的取代数为3或4时，优选地，氨基酸取代包括：第1位Tyr的取代；第2位Phe的取代；第3位Leu的取代；第5位Arg的取代；和第6位Pro的取代中的任意取代。

<实施方案1>

SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中的所述氨基酸取代选自下组：

(7)用Arg(Me)或NMeArg取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、Arg、Asp、Pro、Abu、NMeAsn、或Aib取代第8位的Asn；

更优选地，所述氨基酸取代选自下组：

(1)用Arg、Phe、NMeTyr、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Glu、Tyr、Trp、或Nal(2)取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Val、Cha、或NMeLeu取代第3位的Leu；

(4)用Trp取代第4位的Phe；

(5)用Gln或NMeArg取代第5位的Arg；

(6)用Ala或NMeAla取代第6位的Pro；和

(7)用Arg(Me)或NMeArg取代第7位的Arg。

<实施方案2>

在本发明的另一个实施方案中，SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中的氨基酸取代选自下组：

(1)用Ala、Arg、Glu、Ser、Gln、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(4)用Gln、Leu、Pro、Cha、NMePhe、或Aib取代第4位的Phe；

(5)用Nle、Gln、NMeArg、或Aib取代第5位的Arg；

(6)用Ala或Aib取代第6位的Pro；

(7)用Arg(Me)取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、Arg、Asp、Pro、或Aib取代第8位的Asn。

更优选地，SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中的氨基酸取代选自下组：

(1)用Ala、Arg、Ser、Gln、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Val、Gln、Arg、Glu、Ser、Tyr、Pro、或Cha取代第2位的Phe；

(4)用Leu、Pro、Cha、或NMePhe取代第4位的Phe；

(5)用Nle、Gln、或NMeArg取代第5位的Arg；

(6)用Ala或Aib取代第6位的Pro；

(7)用Arg(Me)取代第7位的Arg；和

(8)用Nle、Gln、或Asp取代第8位的Asn。

更优选地，所述氨基酸取代选自下组：

(1)用Arg、NMeTyr、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Gln或Tyr取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Cha、Val、或NMeArg取代第3位的Leu；

(4)用Gln或NMeArg取代第5位的Arg；和

(5)用Arg(Me)取代第7位的Arg。

考虑到代谢稳定性，优选地，所述氨基酸取代包括(1)用NMeArg取代第5位的Arg；(2)用Arg(Me)取代第7位的Arg；或这两者。

更优选地，所述氨基酸取代包括(1)用Nal(2)取代第2位的Phe；(2)用NMeAla取代第6位的Pro；或这两者。

该氨基酸取代的数目优选为1或2，且更优选的是1。

本发明所使用的肽优选与神经调节肽U具有实质上相同的活性。

“与神经调节肽U的活性实质上相同的活性的例子”包括FM3结合活性、TGR1结合活性、和食物摄取抑制作用等。“实质上相同”意味着这些性质在性质方面(例如生理学或药理学方面)是实质上相同的。虽然期望这些活性是相似的(例如，约0.01～100倍，优选地约0.1～10倍，且更优选地0.5～2倍)，但是这些活性的大小可以是不同的。可以依照本说明书的实施例中所描述的方法来测量这些活性。

特别优选地，本发明所使用的肽是由选自SEQ ID NO.：2～20中的任一个所表示的氨基酸序列构成的多肽：

Tyr-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：2)；

Tyr-Phe-Gln-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：3)；

Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：4)；

Tyr-Phe-Val-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：5)；

Tyr-Tyr-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：6)；

Tyr-Phe-Cha-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：7)；

Arg-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：8)；

Pro-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：9)；

Phe-Trp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：10)；

Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asp-NH₂(SEQ ID NO：11)；

Tyr-Phe-Leu-Phe-NMeArg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：12)；

Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg(Me)-Asn-NH₂(SEQ ID NO：13)；

Tyr-Phe-NMeLeu-Phe-Arg-Pro-NMeArg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：14)；

NMeTyr-Phe-NMeLeu-Phe-NMeArg-Pro-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：15)；

Tyr-Trp-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：16)；

Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：17)；

Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：18)；

Tyr-Trp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：19)；和

Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂(SEQ ID NO：20)。

在本发明的另一个实施方案(实施方案2)中，本发明所使用的肽是由选自SEQ ID NO：2～9中的任一个所表示的氨基酸构成的多肽。

如根据上文清楚的是，SEQ ID NO：2～20中的C端是酰胺化的(也就是说，用NH₂取代羧基(-COOH)中的-OH)。

本发明所使用的肽可以是温血动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马、鸟、猫、犬、猴、和黑猩猩)的细胞[例如，脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰β-细胞、骨髓细胞、系膜细胞(mesangial cell)、朗格汉斯细胞(Langerhans’cell)、表皮细胞、上皮细胞、杯形细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T田胞、B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、和树突细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞、或癌细胞]来源的肽，或这些细胞所存在的任何组织[例如，脑或脑的各部分(例如，嗅球、杏仁核、基底神经节、海马体、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓(medula oblongata)、小脑)、脊髓、脑垂体、胃、胰、肾、肝、性腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、胃肠道(例如，大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、颌下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、脂肪组织、骨骼肌、腹膜]来源的肽。本发明所使用的肽可以以化学方式或在无细胞翻译系统中合成。或者，本发明所使用的肽可以是通过导入核酸的转化体生成的重组肽，所述核酸含有编码该氨基酸序列的碱基序列。

X表示甲氧基聚乙二醇。

X’是不存在的或表示甲氧基聚乙二醇。

优选地，X’是不存在的。

X和X’表示的“甲氧基聚乙二醇”可以是直链的或分支的。对于该“甲氧基聚乙二醇”和“聚乙二醇”的分子量(或平均分子量)没有特别限制，分别为约10000～40000道尔顿，优选为约20000～40000道尔顿，更优选为约20000～35000道尔顿的分子量(或平均分子量)，且甚至更优选为约20000道尔顿。

该“甲氧基聚乙二醇”以式：MeO-(CH₂-CH₂-O)_n-表示。其中n表示聚合度(或平均聚合度)，n优选为约350～约1350，且更优选为约450～约1350。

式(I)中的部分结构：

由表示的部分是连接X和X’表示的“甲氧基聚乙二醇”与Y表示的多肽的接头。对于该接头没有特别限制，并且可以使用通常用于多肽的PEG化(pegylation)的接头等。

La是下式表示的表示的二价或三价基团：

(式中，R表示键、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NH-、-CO-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、-C(＝O)-NH-N＝CH-、-C(＝NH)-NH-、-CO-CH₂-S-或

优选地，La是下式表示的二价或三价基团：

(式中，R表示键，且n表示整数0)。

即，La优选的是键或

Lb表示-(CH₂)_i-(式中，i表示1～5的整数)。

优选地，Lb是-(CH₂)_i-(式中，i表示整数3)。

Lc为式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中，Q^c是式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-表示的二价基团

(式中，m1表示0～15的整数，

Z^c是(a)键、或(b)选自下组的二价基团：

(式中，u表示1～18的整数，

v表示1～12的整数，

R^zc1表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基、或X-直链C_1-5烷基，且

m2是0～15的整数)，

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)，或

Lc为式(ii)：-Q^c’-C^b’-

(式中，Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示选自下组的二价基团：

且m2’表示0～15的整数)，且

C^b’表示-CO-或-SO₂-)。

优选地，Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中，Q^c是式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-表示的二价基团

(式中，m1表示整数0，

Z^c表示(a)键，或(b)选自下组的二价基团：

-CO-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、

(式中，u表示1～18的整数，

v表示1～12的整数，

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基)，且

m2表示0～10的整数)，

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)，或

Lc为式(ii)：-Q^c’-C^b’-表示的二价基团

(式中，Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’表示0，且

Z^c’表示选自下组的二价基团：

且m2’表示0～2的整数)，且

C^b’表示-CO-或-SO₂-)。

j表示1～3的整数，且

优选地，j表示1～2的整数。

从Lc中与Lb最接近的氮原子到以Y表示的多肽的N端的氮原子之间的距离优选为更优选为

优选地，Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

[式中，Q^c是式：-(CH₂)_m1-表示的二价基团(式中，m1是0～15的整数)，且C^b表示键、-CO-或-SO₂-]。

在此，优选地，从式：-NH-Q^c-C^b-的NH的氮原子到以Y表示的多肽的N端的氮原子的距离是

式：-NH-Q^c-C^b-的NH的氮原子在下式中用星号(*)标记。

-N^*H-Q^c-C^b-

优选地，Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价原子

[式中，Q^c表示式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-

(式中，m1表示0～10的整数，

(式中，u表示1～10的整数，

v表示1～10的整数，

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基)，

m2是0～5的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-]。

在此，优选地，从式：-NH-Q^c-C^b-中的NH的氮原子到与Z^c中的-(CH₂)_m1-部分最接近的原子之间的距离是并且，从与Z^c中的-(CH₂)_m1-部分最接近的原子到Y表示的多肽的N端的氮原子之间的距离是

此外，优选地，Lc是式(ii)：-Q^c’-C^b’-表示的二价基团

[式中，Q^c’为-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’表示0～15的整数，Z^c’表示

且m2’表示0～15的整数)，且

C^b’表示键、-CO-、或-SO₂-]。

在此，优选地，从Z^c’中与Lb最接近的氮原子到Y表示的多肽的N端的氮原子之间的距离是

这些原子间距离是使用商业分子建模和计算软件(例如Gaussian、MOPAC、AMBER、CHARMM、MOE、Insight等，由Ryoka Systems Inc.出售)，将化合物或化合物的部分结构的三维分子模型，作为延伸(extended)结构进行能量稳定化计算来输出的三维稳定结构中的原子间距离。在每种软件中，以如下的方式预先设置参数，使得原子间距离对应于通过X-射线晶体结构分析(例如Cambridge结构数据库等)评估的原子间距离，例如，由约20个常见的重原子组成的分子的误差为以下(关于AMBER，参见J.Am.Chem.Soc，106，765-784)。

优选地，(Lc)_j是(a)键，或(b)选自下组的二价基团：-NH-(CH₂)_mc1-CO-、-NH-(CH₂)_mc2-CO-NH-(CH₂)_mc3-CO-、

(式中，mc1表示1～11的整数，mc2和mc3独立表示1～5的整数(条件是优选mc2和mc3的和是4～7)，mc4表示1～5的整数，且X如上文所限定)。

优选地，Lb是键，且(Lc)_j是

部分结构：

表示的部分优选是

部分结构：

表示的部分特别优选是

式(I)表示的化合物的优选的例子为下式表示的化合物及其盐：

[式中，Y表示由选自SEQ ID NO：2～20中的任一个所表示的氨基酸序列组成的多肽，X表示甲氧基聚乙二醇；X’是不存在的；

La是下式表示的二价或三价基团：

(式中，R表示键、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NH-、-CO-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、-C(＝O)-NH-N＝CH-、-C(＝NH)-NH-、-CO-CH₂-S-、或

且n表示0～5的整数)；

Lb表示-(CH₂)_i-(式中，i表示1～5的整数)；

Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中Q^c表示式-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)_m2-

(式中，m1表示0～10的整数，Z^c是选自下组的二价基团：-CO-、-O-CO-、-CO-O-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-NH-CO-NH-、-CH(NH₂)-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、-CH(OH)-、-CH(COOH)-、-C(＝NH)-、-S-、-S-S-、-SO-、-SO₂-、-NH-SO₂-、-SO₂-NH-、

(式中，u表示1～10的整数，

v表示1～10的整数，

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基)，且

m2表示0～5的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)；且

j表示1～3的整数]。

在此，部分结构：

表示的部分优选为

式(I)表示的化合物的其它优选的例子为下式表示的化合物及其盐：

[式中，Y为选自SEQ ID NO：2～20中的任一个所表示的氨基酸序列，X表示甲氧基聚乙二醇；X’是不存在的；

La是下式表示的二价或三价基团：

且n表示0～5的整数)；

Lb表示式-(CH₂)_i-(式中，i表示1～5的整数)；

Lc表示式：-Q^c’-C^b’-表示的二价基团

(式中，Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-

(式中，m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示

m2’表示0～15的整数)，

C^b’表示键、-CO-或-SO₂-；且

j表示1～3的整数)。

在此，部分结构：

表示的部分优选为

所述SEQ ID NO.：1所表示的氨基酸序列中的氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：

(1)用Arg、NMeArg、或Pro取代第1位的Tyr；

(2)用Gln取代第2位的Phe；

(3)用Gln、Arg、Cha、Val、或NMeArg取代第3位的Leu；

(4)用Gln或NMeArg取代第5位的Arg；和

(5)用Arg(Me)取代第7位的Arg。

X表示甲氧基聚乙二醇；

X’是不存在的或表示甲氧基聚乙二醇；

La是下式表示的二价或三价基团：

(式中，R表示键，且

n表示整数0)；

Lb是-(CH₂)_i-(式中，i表示整数3)；且

Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团

(式中，Q^c是式：-(CH₂)_m1-Z^c-(CH₂)m₂-表示的二价基团

(式中，m1表示整数0，

Z^c表示(a)键，或(b)选自下组的二价基团：

-CO-、-CH(-NHR^zc1)-、-CH(R^zc2)-、

(式中，u表示1～18的整数，

v表示1～12的整数，

R^zc2表示氨基-直链C_1-5烷基-羰基氨基-直链C_1-5烷基)，

m2表示0～10的整数)，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-)，或

Lc是式(ii)：-Q^c’-C^b’-

(式中，Q^c’是式-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-表示的二价基团

(式中，m1’表示0，

Z^c’表示选自下组的二价基团：

m2’表示0～2的整数)，且

C^b’表示CO-或-SO₂-)；且

j是1～2的整数]。

在上述实施方案中，说明可以连接两个甲氧基聚乙二醇分子的直链接头和分支为2支的接头。在本发明的其它实施方案中，可以使用分支成更多分支，由此可以使用连接更多个甲氧基聚乙二醇的接头。

例如，可以通过将2-分支接头亚烷基部分分支来容易地设计4-分支接头结构。

例如，在具有2-分支接头的本发明的神经调节肽U衍生物具有以下结构时，

可以如下设计4-分支接头结构。

此外，例如，在具有2-分支接头的本发明的神经调节肽U衍生物具有以下结构时，

可以如下设计4-分支接头结构。

类似地，可以设计6-分支、8-分支、10-分支…至32-分支接头。这些接头也可以在本发明的神经调节肽U衍生物中使用。

下文会解释具有4-分支接头的本发明的神经调节肽U衍生物。

这样的神经调节肽U衍生物的一个实施方案是上述化合物(II)。

在式(II)中，k表示1～100的整数，m表示1～100的整数，p表示1～100的整数。

其它符号如上文所解释的。

具有4-分支接头的本发明的神经调节肽U衍生物的另一个实施方案是即上述化合物(III)。

在式(III)中，h3表示0～3的整数；且i3、j3、k3、m3、和n3彼此相同或不同，表示0～5的整数。

其它符号如上文所解释的。

[生成方法]

下文会解释用于生成本发明的神经调节肽衍生物的方法。

例如，可以通过经由接头将甲氧基聚乙二醇与本发明所使用的肽结合来生成本发明的神经调节肽衍生物。

可以通过本身已知的肽纯化方法从上述温血动物细胞或组织制备本发明的神经调节肽衍生物中所使用的肽。具体地，将温血动物的组织或细胞均质化，并将可溶性级分通过色谱，诸如反相色谱、离子交换色谱、和亲和色谱等来分离并纯化，以制备本发明的神经调节肽衍生物。

此外，本发明的神经调节肽衍生物中所使用的肽可以作为商品购买。

可以依照本身已知的肽合成法来生成本发明的神经调节肽衍生物中所使用的肽。

肽合成法可以是例如固相合成法或液相合成法。可以通过将可形成本发明的神经调节肽衍生物的部分肽或氨基酸与剩余的部分缩合，并在生成物具有保护基的情况下脱除保护基从而来生成目的蛋白质。

在此，缩合和保护基的脱除可以依照本身已知的方法，诸如那些记载于下述(1)～(5)的方法来进行：

(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，Peptide Synthesis，Interscience Publishers，New York(1966)；

(2)Schroeder和Luebke，The Peptide，Academic Press，New York(1965)；

(3)Nobuo Izumiya等：肽合成的基础和实验(Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken(Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments))，Maruzen Co.出版(1975)；

(4)Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara：生化学实验讲座1、蛋白质化学IV(Seikagaku Jikken Koza(Biochemistry Experiment Lecture Series)1，Tanpakushitsu no Kagaku(Protein Chemistry)IV)，205(1977)；和

(5)Haruaki Yajima编：续医药品的开发(Zoku Iyakuhin no Kaihatsu(Second Series Drug Development))，第14卷，肽合成(Peptide Synthesis)，Hirokawa Shoten出版。

可以通过已知的纯化方法来将如此获得的本发明的神经调节肽衍生物分离并纯化。

此外，本发明所使用的肽还可以通过如下方法来生成：可以通过培养含有编码本发明所使用的肽的核酸的转化体，并从获得的培养物分离并纯化本发明所使用的肽。

编码在本发明中使用的肽的核酸可以是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合物，优选为DNA。核酸可以是双链或单链。双链核酸可以是双链DNA、双链RNA、或DNA-RNA杂合物。单链核酸可以是有义链(即编码链)或反义链(即非编码链)。

编码本发明所使用的肽的DNA的例子可以列举：基因组DNA、温血动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马、鸟、猫、犬、猴、和黑猩猩)的任何细胞[例如，脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰β-细胞、骨髓细胞、系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T田胞、B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、树突细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞、或癌细胞等，以及血细胞]，或这些细胞所存在的任何组织[例如，脑、脑的各部分(例如，嗅球、杏仁核、基底神经节、海马体、丘脑、下丘脑、底丘脑核、大脑皮质、延髓、小脑、枕叶、额叶、颞叶、壳(putamen)、尾状核、胼胝体、黑质)、脊髓、脑垂体、胃、胰、肾、肝、性腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、胃肠道(例如，大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、颌下腺、外周血、外周血细胞、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌、和腹膜]来源的cDNA；和合成的DNA等。

可以依照本身已知的方法，例如聚合酶链式反应(下文称为“PCR法”)和逆转录酶-PCR(下文缩写为“RT-PCR法”)使用自上述细胞或组织制备的基因组DNA级分和总RNA或mRNA级分分别作为模板来直接扩增编码本发明所使用的肽的基因组DNA和cDNA。或者，可以通过本身已知的方法，诸如菌落或噬斑杂交或PCR等来分别从基因组DNA文库和cDNA文库克隆编码本发明所使用的肽的基因组DNA和cDNA，所述基因组DNA文库和cDNA文库通过将自上述细胞和组织制备的基因组DNA和总RNA或mRNA片段插入合适的载体来制备。在文库中使用的载体可以例如是任何噬菌体、质粒、粘粒、和噬菌粒等，可以使用上述中的任何。

可以例如通过下列任何方法来合成本发明的神经调节肽衍生物。

(1)将含有活性酯的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT MEGC-30-TS(商品名)，NOF Corporation)与本发明所使用的肽的氨基结合。

(2)将含有醛的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT ME-300-AL(商品名)，NOF Corporation)与本发明所使用的肽的氨基结合。

(3)将二价交联试剂(例如，GMBS(Dojindo Laboratories)、EMCS(Dojindo Laboratories)、KMUS(Dojindo Laboratories)、SMCC(Pierce))与本发明所使用的肽结合，随后结合含有巯基的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT ME-300-SH(商品名)，NOF Corporation)。在此情况中，本发明的神经调节肽衍生物中的接头来自PEG化试剂和二价交联剂。

(4)将SH导入剂(例如，D-半胱氨酸残基、L-半胱氨酸残基、Traut氏试剂)导入本发明所使用的肽中，并使含有马来酰亚胺基的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT ME-300-MA(商品名)，NOF Corporation)与该巯基反应。在此情况中，本发明的神经调节肽衍生物中的接头来自PEG化试剂和SH导入剂。

(5)将SH导入剂(例如，D-半胱氨酸残基、L-半胱氨酸残基、Traut氏试剂)导入本发明所使用的肽中，并使含有碘代-乙酰胺基的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT ME-300-IA(商品名)，NOF Corporation)与该巯基反应。在此情况中，本发明的神经调节肽衍生物中的接头来自PEG化试剂和SH导入剂。

(6)将ω-氨基羧酸或α-氨基酸作为接头导入本发明所使用的肽的N端氨基，并使含有活性酯的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT MEGC-30-TS(商品名)，NOF Corporation)与该接头来源的氨基反应。在此情况中，本发明的神经调节肽衍生物中的接头来自PEG化试剂和ω-氨基羧酸，或PEG化试剂和α-氨基酸。

(7)将ω-氨基羧酸或α-氨基酸作为接头导入本发明所使用的肽的N端氨基，并使含有醛基的PEG化试剂(例如，SUNBRIGHT MEGC-30-AL(商品名)，NOF Corporation)与该接头来源的氨基反应。在此情况中，本发明的神经调节肽衍生物中的接头来自PEG化试剂和ω-氨基羧酸，或PEG化试剂和α-氨基酸。

上述试剂可以例如作为商品获得。每种反应可以通过本领域技术人员已知的方法来实施。

本发明的神经调节肽U衍生物可以是盐。此类盐的例子包括与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。

与无机碱的盐的优选的例子包括碱金属盐诸如钠盐、钾盐等；碱土金属盐诸如钙盐、镁盐等；以及铝盐、铵盐等。

与有机碱的盐的优选的例子包括与三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N，N-二苯甲基乙二胺等的盐。

与无机碱的盐的优选的例子包括与氢氯酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。

与有机酸的盐的优选的例子包括与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸等的盐。

与碱性氨基酸的盐的优选的例子包括与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐。

与酸性氨基酸的盐的优选的例子包括与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。

在通过上述合成方法以游离状态获得本发明的神经调节肽U衍生物时，可以依照通常的方法将其转化成盐。或者，在以盐形式获得本发明的神经调节肽U衍生物时，可以依照通常的方法将其转化成游离形式或其它盐。可以通过已知的手段，诸如相转移、浓缩、溶剂提取、分馏、结晶、重结晶、和色谱等来从反应溶液分离并纯化这样得到的本发明的神经调节肽U衍生物。

在本发明的神经调节肽U衍生物以构型异构体、非对映异构体、构象异构体等形式存在时，根据需要，可以分别通过上文所提及的分离和纯化手段来分离。在本发明的神经调节肽U衍生物为外消旋体时，可以通过通常的旋光拆开手段来将其分成S-型和R-型。

在本发明的神经调节肽U衍生物以立体异构体形式存在时，该异构体单独存在的形式及其混合物形式均包括在本发明的范围内。

此外，本发明的神经调节肽U衍生物可以是水合物或非水合物。此外，本发明的神经调节肽U衍生物可以是溶剂合物或非溶剂合物。

可以用同位素(例如，³H、¹⁴C、或³⁵S)等来标记本发明的神经调节肽U衍生物。此外，可以用氘来取代本发明的神经调节肽U衍生物。

本发明的神经调节肽U衍生物作为食物摄取抑制剂，或作为预防或治疗肥胖症用的药剂是有用的。

本发明的神经调节肽U衍生物，由于其安全且毒性低，可以作为食物摄取抑制剂或预防或治疗肥胖症用的药剂以通常的方式(例如外周施用等)对哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、鸟、猫、犬、猴、黑猩猩等)施用。

本发明的神经调节肽U衍生物通常作为药物组合物使用，该药物组合物依照已知的方法(例如，日本药典中所描述的方法)通过用本发明的神经调节肽U衍生物与药理学可接受载体共同配制来获得。

作为药理学可接受载体，可以使用通常作为药物制剂用的材料使用的多种有机或无机载体物质。此类载体的例子包括固体制剂用的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂；和液体制剂中的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、无痛剂等。根据需要，在配制成药剂时，可以使用防腐剂、抗氧化剂、着色剂、增甜剂等药剂添加物。

赋形剂的优选的例子包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇、D-山梨糖醇、淀粉、预胶凝淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、支链淀粉(pullulan)、轻质无水硅酸、合成的硅酸铝、硅酸铝镁、木糖醇、山梨糖醇、赤藓醇等。

滑润剂的优选的例子包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅、聚乙二醇6000等。

粘合剂的优选的例子包括预胶凝淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

崩解剂的优选的例子包括乳糖、蔗糖、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、轻质无水硅酸、碳酸钙等。

溶剂的优选的例子包括注射用水、生理盐水、林格溶液、醇类、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油、棉籽油等。

增溶剂的优选的例子包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等。

悬浮剂的优选的例子包括表面活性剂诸如硬脂酰三乙醇胺(stearyltriethanolamine)、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等；亲水性聚合物诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等；聚山梨醇酯类、聚氧乙烯氢化蓖麻油等。

等渗剂的优选的例子包括氯化钠、甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、果糖等。

缓冲剂的优选的例子包括缓冲溶液诸如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。

无痛剂的优选的例子包括丙二醇、盐酸利多卡因、苯甲醇等。

防腐剂的优选的例子包括对-羟苯甲酸酯类(p-oxybenzoic acid esters)、三氯叔丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。

抗氧化剂的优选的例子包括亚硫酸盐、抗坏血酸盐等。

着色剂的优选的例子包括水溶性可食用焦油色素(例如，食用色素诸如食用色素红色No.2和3、食用色素黄色No.4和5、和食用色素蓝色No.1和2等)、水不溶性莱克(lake)色素(例如，上述水溶性可食用焦油色素的铝盐)、天然色素(例如，β-胡萝卜素、叶绿素、氧化铁红)等。

增甜剂的优选的例子包括糖精钠、甘草酸二钾、阿斯巴甜(aspartame)、甜菊(stevia)等。

上述药物组合物的剂型的例子包括口服制剂诸如片剂(包括舌下片剂和口服可崩解片剂)、胶囊剂(包括软胶囊剂和微囊剂)、颗粒剂、粉剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、悬混剂等；和非口服制剂诸如注射剂(例如，皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹膜内注射剂、静脉滴注剂)、外用制剂(例如，经皮制剂、软膏剂等)、栓剂(例如，直肠栓剂和阴道栓剂)、弹丸剂(pellets)、经鼻制剂、经肺制剂(吸入剂)、滴眼剂等。这些制剂可以是受控释放的配制剂，诸如快速释放配制剂和持续释放配制剂(例如，持续释放微囊剂)等。

上述药物组合物中的神经调节肽U衍生物的含量是例如0.1～100wt％。

下文具体解释了用于生成此类口服制剂和非口服制剂的方法。口服制剂可以通过将例如赋形剂(例如，乳糖、蔗糖、淀粉、D-甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、赤藓醇、结晶纤维素、轻质无水硅酸)、崩解剂(例如，碳酸钙、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、轻质无水硅酸)、结合剂(例如，预胶凝淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、结晶纤维素、甲基纤维素、蔗糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精)、或滑润剂(例如，滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、胶体二氧化硅、聚乙二醇6000)等添加至活性成分，并通过压缩成形来生成。

此外，为了掩饰味道、肠溶包衣、或持续释放的目的，可以通过本身已知的方法来包覆口服制剂。可用的涂层剂的例子包括肠溶性聚合物(例如，醋酸邻苯二甲酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、甲基丙烯酸共聚物LD、甲基丙烯酸共聚物S、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羧甲基乙基纤维素)、胃溶性聚合物(例如，聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酯、氨烷基甲基丙烯酸酯共聚物E)、水溶性聚合物(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、水不溶性聚合物(例如，乙基纤维素、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物RS、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物)、蜡等。进行包覆时，可以与上文所提及的涂层剂一起使用增塑剂诸如聚乙二醇等、和光屏蔽剂诸如钛氧化物、三氧化二铁等。

活性成分可以与分散剂(例如，Tween 80(由Atlas Powder，USA制造)、HCO 60(由Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造)、聚乙二醇、羧甲基纤维素、海藻酸钠)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯甲醇、三氯叔丁醇、酚)、等渗剂(例如，氯化钠、甘油、D-山梨糖醇、D-甘露醇、木糖醇、葡萄糖、果糖)等一起在水性溶剂(例如，蒸馏水、生理盐水、林格溶液)或油性溶剂(例如，植物油诸如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油等；丙二醇、聚乙二醇(Macrogol)、三辛酸甘油酯)中溶解、悬浮、或乳化来生成注射剂。在此情况中，根据需要，可以添加下列添加剂：增溶剂(例如，水杨酸钠、乙酸钠、聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠)、悬浮剂(例如，表面活性剂诸如硬脂酰三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等；亲水性聚合物诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等)、缓冲剂(例如，缓冲溶液诸如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白)、无痛剂(例如，丙二醇、盐酸利多卡因、苯甲醇)、防腐剂(例如，对-羟苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、氯化苯甲烃铵、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸)等。

可以通过将活性成分配制成固体、半固体或液体组合物来生成外用制剂。

例如，可以通过将活性成分按现状磨碎，或者通过将赋形剂(例如，乳糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素、蔗糖)、增稠剂(例如，天然橡胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物)等添加至活性成分，将它们混合，然后将该混合物磨碎来生成如上文所提及的固体组合物。如上文所提及的液体组合物可以以与注射剂几乎相同的方式来生成。半固体组合物为水性或油性凝胶剂、或软膏状形式。此外，这些组合物均还可以含有pH调控剂(例如，磷酸、柠檬酸、氢氯酸、氢氧化钠)、防腐剂(例如，对-羟苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、氯化苯甲烃铵、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸)等。可以通过使活性成分形成为油性或水性的固体、半固体、或液体组合物来生成栓剂。在生成该组合物中使用的油性基质的例子包括高级脂肪酸甘油酯(例如，可可脂、和Witepsols)、中级脂肪酸甘油三酸脂(例如，Miglyols)、植物油(例如，芝麻油、大豆油、棉籽油)等。水性基质的例子包括聚乙二醇类、丙二醇等。水性凝胶基质的例子包括天然橡胶类、纤维素衍生物、烯类聚合物、丙烯酸聚合物等。

可以依照施用受试者、施用路径、目标疾病、症状等来适当地选择本发明的神经调节肽U衍生物的剂量。例如，就在对成人患者皮下施用含有本发明的神经调节肽U衍生物作为有效成分的药物组合物时的投入量而言，通常以一次每人约5～5000μg，且优选地约50～500μg给予作为活性成分的神经调节肽U衍生物。优选地，一天1次～3次施用此剂量。

为了增强本发明的衍生物的作用(例如，食物摄取抑制效果，对肥胖症的预防或治疗效果)或者降低其量，可以使本发明的神经调节肽U衍生物与对本发明的神经调节肽U衍生物没有不利影响的其它药物一起使用。这样的药物的例子包括“糖尿病治疗药剂”、“糖尿病并发症治疗药剂”、“抗肥胖剂”、和“高脂血症治疗药剂”等。可以以适合于使用的比率组合两种或更多种这样的药物(下文有时简称为“并用药物(concomitant drug)”)。

上述“糖尿病治疗药剂”的例子包括胰岛素制剂(例如，从牛、猪的胰提取的动物胰岛素制剂；使用大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母通过基因工程合成的人胰岛素制剂；锌胰岛素；鱼精蛋白锌胰岛素；胰岛素的片段或衍生物(例如，INS-1)、口服胰岛素制剂)、胰岛素敏化剂(例如，吡格列酮(pioglitazone)或其盐(优选地盐酸盐)、罗格列酮(rosiglitazone)或其盐(优选地马来酸盐)、Tesaglitazar、罗格里扎(Ragaglitazar)、莫格他唑(Muraglitazar)、依格列宗(Edaglitazone)、Metaglidasen、Naveglitazar、AMG-131、THR-0921)、α-糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖、米格列醇、和乙格列酯)、双胍类(例如，二甲双胍、丁福明(buformin)、或它们的盐(例如，盐酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐))、胰岛素促分泌素[磺酰脲类(例如，甲苯磺丁脲、格列本脲、格列齐特(gliclazide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、醋酸己脲(acetohexamide)、格列吡脲(glyclopyramide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列丁唑(glybuzole))、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、米格列奈(mitiglinide)或它们的水合钙盐]、二肽基肽酶IV抑制剂(例如，维格列汀(Vildagliptin)、西他列汀(Sitagliptin)、沙格列汀(Saxagliptin)、T-6666、TS-021)、β3激动剂(例如，AJ-9677)、GPR40激动剂、GLP-1受体激动剂[例如，GLP-1、GLP-1MR剂、NN-2211、AC-2993(毒晰外泌肽-4(exendin-4))、BIM-51077、Aib(8，35)hGLP-1(7，37)NH₂、CJC-1131]、糊精激动剂(例如，普兰林肽(pramlintide))、磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，钒酸钠)、糖异生抑制剂(例如，糖原磷酸化酶抑制剂、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂)、SGLUT(钠-葡萄糖协同转运蛋白)抑制剂(例如，T-1095)、11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂(例如，BVT-3498)、脂联素(adiponectin)或脂联素激动剂、IKK抑制剂(例如，AS-2868)、瘦蛋白抗性(leptin resistance)改善药物、促生长素抑制素受体激动剂、葡糖激酶激活剂(例如，Ro-28-1675)、和GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素肽)等。

上述“糖尿病并发症治疗药剂”的例子包括醛糖还原酶抑制剂(例如，托瑞司他(tolrestat)、依帕司他(epalrestat)、折那司他(zenarestat)、唑泊司他(zopolrestat)、米那司他(minalrestat)、非达司他(fidarestat)、雷尼司他(ranirestat))、神经营养因子和神经营养因子提高药物(例如，NGF、NT-3、BDNF、WO01/14372中所描述的神经营养因子生成-分泌促进剂(例如，4-(4-氯苯基)-2-(2-甲基-1-咪唑基)-5-[3-(2-甲基苯氧基)丙基] 唑))、PKC抑制剂(例如，鲁伯斯塔(ruboxistaurin mesylate))、AGE抑制剂(例如，ALT946、匹马吉定(pimagedine)、溴化N-苯乙酰噻唑(N-phenacylthiazolium bromide)、EXO-226、Pyridorin、吡多胺(pyridoxamine))、活性氧清除剂(例如，硫辛酸)、脑血管扩张药(例如，硫必利(tiapride)、美西律(mexiletine))、促生长素抑制素受体激动剂(例如，BIM23190)、细胞凋亡信号调节激酶-1(ASK-1)抑制剂、神经元再生促进剂(例如，Y-128、VX-853、神经营养肽(Prosaptide))。

上述“抗肥胖剂”的例子包括中枢抗肥胖剂(例如，右芬氟拉明(dexfenfluramine)、芬氟拉明(fenfluramine)、芬特明(phentermine)、西布曲明 (sibutramine)、安非拉酮(amfepramone)、右旋苯丙(dexamphetamine)、马吲哚(mazindol)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、氯苄雷司(clobenzorex)；神经肽Y拮抗剂(例如，CP-422935)；大麻素受体拮抗剂(例如，SR-141716、SR-147778)；生长激素释放肽拮抗剂(ghrelin antagonists)；11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂(例如，BVT-3498)、胰脂肪酶抑制剂(例如，奥利司他(orlistat)、赛利司他(cetilistat)、β3激动剂(例如，AJ-9677)、肽食欲抑制剂(例如，瘦蛋白、CNTF(睫状神经营养因子))、促胰酶素激动剂(例如，林替曲特(1intitript)、FPL-15849)、和食物摄取抑制剂(例如，P-57)等。

上述“高脂血症治疗药剂”的例子包括HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，普伐他汀(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、及它们的盐(例如，钠盐和钙盐))、鲨烯合成酶抑制剂(例如，WO 97/10224中所描述的化合物，例如N-[[(3R，5S)-1-(3-乙酰氧基-2，2-二甲基丙基)-7-氯-5-(2，3-二甲氧基苯基)-2-氧基-1，2，3，5-四氢-4，1-苯并氧氮杂卓-3-基]乙酰基]哌啶-4-乙酸)、贝特(fibrate)类化合物(例如，苯扎贝特(bezafibrate)、氯贝丁酯(clofibrate)、双贝特(simfibrate)、克利贝特(clinofibrate))、ACAT抑制剂(例如，阿伐麦布(avasimibe)、依鲁麦布(eflucimibe))、阴离子交换树脂(例如，考来烯胺(colestyramine))、普罗布考(probucol)、烟酸类药物(例如，尼可莫尔(nicomol)、戊四烟酯(niceritrol))、二十碳五烯酸乙酯(ethyl icosapentate)、植物固醇(例如，大豆固醇、γ-谷维素)等。

上述并用药物的施用时机不受限制。可以同时，或者相隔一定时间分开对受试者施用本发明的化合物和并用药物。可以基于临床上使用的剂量来确定并用药物的剂量，并且其可以根据施用受试者、施用路径、疾病、组合等来适当地选择。

对于并用药物的施用方式没有限制，只要是在施用时组合本发明的化合物和并用药物即可。施用模式的例子如下：

(1)施用通过同时配制本发明的化合物与并用药物而获得的单一制剂；

(2)通过同一施用路径同时施用两种制剂，该两种制剂是通过分别配制本发明的化合物和并用药物而获得的；

(3)通过同一施用路径相隔一定时间施用两种制剂，该两种制剂是通过分别配制本发明的化合物和并用药物而获得的；

(4)通过不同的施用路径同时施用两种制剂，该两种制剂是通过分别配制本发明的化合物和并用药物而获得的；及

(5)通过不同的施用路径相隔一定时间施用两种制剂，该两种制剂是通过分别配制本发明的化合物和并用药物而获得的(例如以本发明的化合物和并用药物的次序，或以相反的次序施用)等。

可以依照施用受试者、施用路径、疾病等来适当地选择本发明的化合物与并用药物的混合比率。

可以与饮食疗法(例如，糖尿病的饮食疗法)、运动疗法组合使用本发明的化合物。

附图说明

图1-1是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物A、B)。

图1-2是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物C～E)。

图1-3是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物F～J)。

图1-4是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物K)。

图1-5是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物L～N)。

图1-6是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物O～R)。

图1-7是显示添加相对于FM3膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物S～V))。

图2-1是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物A、B)。

图2-2是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物C～E)。

图2-3是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物F～J)。

图2-4是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物K)。

图2-5是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物L～N)。

图2-6是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物O～R)。

图2-7是显示添加相对于TGR1膜级分浓度变化的NMU衍生物及PEG缀合物时的¹²⁵I-NMU8结合抑制的图(化合物S～V)。

图3是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式(100nmol/kg)时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物A、B)。

图4是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式(100nmol/kg)时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物C～E)。

图5是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式(100nmol/kg)时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物F～J)。

图6是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物C、J)。

图7是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物K)。

图8是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物L、M、N)。

图9是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物P、Q)。

图10是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物T、V)。

图11是显示在小鼠禁食再喂食测试中皮下施用NMU-PEG化形式时的小鼠食物摄取量的变化的图(化合物S、U)。

实施例

在下文，本发明通过参照试验例、参考例、和实施例来详细描述。然而，本发明不限于此。

在实施例中，SEQ ID NO.：1或由SEQ ID NO.：1构成的肽有时表述为NMU-8。

氨基酸后所显示的数字表示氨基酸编号。下文显示了SEQ ID NO.：1中的氨基酸编号。具体地，认为NMU-8的N端Tyr的位置是1，而认为C端Asn的位置是8。

Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

1 2 3 4 5 6 7 8

例如，化合物1(参考例1)的β-Ala0，Gln5-NMU-8表示将β-Ala延伸到NMU-8的N-端(第0位)，并用Gln取代第5位的Arg而得到的肽。

注意，上文是方便的注释；该β-Ala是接头，不形成本发明所使用的多肽。

下文是试验例、参考例、和实施例中所使用的化合物。上文以SEQ ID NO.：2～20显示了该化学式中的多肽部分的碱基序列。

在这里，β-Ala的α-位的羧基结合本发明所使用的肽的N端的氨基酸残基的氨基(α-位的氨基)。此外，“-NH₂”指明用-NH₂取代本发明所使用的肽C端的氨基酸残基的羧基(-COOH)中的-OH。

(化合物1)

β-Ala0，Gln5-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：2

(化合物2)

β-Ala0，Gln3-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Gln-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：3

(化合物3)

β-Ala0，Arg3-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：4

(化合物4)

β-Ala0，Val3-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Val-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：5

(化合物5)

β-Ala0，Tyr2-NMU-8

β-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：6

(化合物6)

β-Ala0，Cha3-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Cha-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：7

(化合物7)

β-Ala0，Arg1-NMU-8

β-Ala-Arg-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：8

(化合物8)

β-Ala0，Pro1-NMU-8

β-Ala-Pro-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：9

(化合物9)

Arg3-NMU-8

Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：4

(化合物10)

NpipAc-Arg3-NMU-8

NpipAc-Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：4

(化合物11)

NpipAc0，Phe1，Trp2，Ala6-NMU-8

NpipAc-Phe-Trp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：10

(化合物12)

β-Ala0，Asp8-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asp-NH₂

SEQ ID NO：11

(化合物13)

β-Ala0，NMeArg5-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-NMeArg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：12

(化合物14)

β-Ala0，Arg(Me)7-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg(Me)-Asn-NH₂

SEQ ID NO：13

(化合物15)

β-Ala0，NMeLeu3，NMeArg7-NMU-8

β-Ala-Tyr-Phe-NMeLeu-Phe-Arg-Pro-NMeArg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：14

(化合物16)

β-Ala0，NMeTyr1，NMeLeu3，NMeArg5-NMU-8

β-Ala-NMeTyr-Phe-NMeLeu-Phe-NMeArg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：15

(化合物17)

β-Ala0，Trp2，NMeAla6-NMU-8

β-Ala-Tyr-Trp-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：16

(化合物18)

β-Ala0，Glu2，NMeAla6-NMU-8

β-Ala-Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：17

(化合物19)

NpipAc0，Glu2，Ala6-NMU-8

NpipAc-Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：18

(化合物20)

NpipAc0，Trp2，Ala6-NMU-8

NpipAc-Tyr-Trp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：19

(化合物21)

NpipAc0，Glu2，NMeAla6-NMU-8

NpipAc-Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：17

(化合物22)

NpipAc0，Nal(2)2，NMeAla6-NMU-8

NpipAc-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：20

(化合物A)

PEG30k-NH-β-Ala0，Gln5-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：2

(化合物B)

PEG30K-NH-β-Ala0，Gln3-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Gln-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：3

(化合物C)

PEG30K-NH-β-Ala0，Arg3-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：4

(化合物D)

PEG30K-NH-β-Ala0，Val3-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Val-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：5

(化合物E)

PEG30K-NH-β-Ala0，Tyr2-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：6

(化合物F)

PEG30K-NH-β-Ala0，Cha3-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Cha-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：7

(化合物G)

PEG30K-NH-β-Ala0，Arg1-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Arg-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：8

(化合物H)

PEG30K-NH-β-Ala0，Pro 1-NMU-8

PEG30K-NH-β-Ala-Pro-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：9

(化合物I)

PEG20k-NpipAc0，Arg3-NMU-8

PEG20k-NpipAc-Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：4

(化合物J)

PEG30k-NpipAc0，Arg3-NMU-8

PEG30k-NpipAc-Tyr-Phe-Arg-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：4

(化合物K)

PEG20k-NpipAc0，Phe 1，Trp2，Ala6-NMU-8

PEG20k-NpipAc-Phe-Trp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：10

(化合物L)

PEG30k-NH-β-Ala0，Asp8-NMU-8

PEG30k-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asp-NH₂

SEQ ID NO：11

(化合物M)

PEG30k-NH-β-Ala0，NMeArg5-NMU-8

PEG30k-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-NMeArg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：12

(化合物N)

PEG30k-NH-β-Ala0，Arg(Me)7-NMU-8

PEG30k-NH-β-Ala-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg(Me)-Asn-NH₂

SEQ ID NO：13

(化合物O)

PEG20k-NH-β-Ala0，NMeLeu3，NMeArg7-NMU-8

PEG20k-NH-β-Ala-Tyr-Phe-NMeLeu-Phe-Arg-Pro-NMeArg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：14

(化合物P)

PEG20k-NH-β-Ala0，NMeTyr1，NMeLeu3，NMeArg5-NMU-8

PEG20k-NH-β-Ala-NMeTyr-Phe-NMeLeu-Phe-NMeArg-Pro-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：15

(化合物Q)

PEG20k-NH-β-Ala0，Trp2，NMeAla6-NMU-8

PEG20k-NH-β-Ala-Tyr-Trp-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：16

(化合物R)

PEG20k-NH-β-Ala0，Glu2，NMeAla6-NMU-8

PEG20k-NH-β-Ala-Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：17

(化合物S)

PEG20k-NpipAc0，Glu2，Ala6-NMU-8

PEG20k-NpipAc-Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：18

(化合物T)

PEG20k-NpipAc0，Trp2，Ala6-NMU-8

PEG20k-NpipAc-Tyr-Trp-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：19

(化合物U)

PEG20k-NpipAc0，Glu2，NMeAla6-NMU-8

PEG20k-NpipAc-Tyr-Glu-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：17

(化合物V)

PEG20k-NpipAc0，Nal(2)2，NMeAla6-NMU-8

PEG20k-NpipAc-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-NMeAl a-Arg-Asn-NH₂

SEQ ID NO：20

本说明书中所使用的缩写的含义如下：

缩写：名称

Ac：乙酰基

Abu：2-氨基丁酸

AcOEt：乙酸乙酯

AcOH：乙酸

Aib：α-氨基异丁酸

Arg(Me)：N^ω-甲基精氨酸

Arg(Pbf)：N^ω-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃磺酰精氨酸

β-Ala：β-丙氨酸

Boc：叔-丁氧基羰基

Bu^t：叔丁基

Bzl：苯甲基

Cha：β-环己基丙氨酸

Dbu：2，4-二氨基丁酸

DCM：二氯甲烷

DEA：二乙胺

DIEA：N，N-二异丙基乙胺

DIPCDI：1，3-二异丙基碳二亚胺

DMAP：4-二甲基氨基吡啶

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

EDT：1，2-乙二硫醇

Fmoc：9-芴基甲氧基羰基

HOAt：1-羟基-7-氮杂-苯并三唑

HOBt：1-羟基苯并三唑

HOOBt：3，4-二氢-3-羟基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪

HONB：N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺

Hse：高丝氨酸

Hyp：反式-4-羟基脯氨酸

Leu(Me)：γ-甲基亮氨酸

MBHA：对甲基二苯甲胺

MeOH：甲醇

αMePhe：C^α-甲基苯丙氨酸

Nal(1)：1-萘基丙氨酸

Nal(2)：2-萘基丙氨酸

Nle：正亮氨酸

NMeAla：N^α-甲基丙氨酸

NMeArg：N^α-甲基精氨酸

NMeAsn：N^α-甲基天冬酰胺

NMeLeu：N^α-甲基亮氨酸

NMePhe：N^α-甲基苯丙氨酸

NMeSer：N^α-甲基丝氨酸

NMeTyr：N^α-甲基酪氨酸

NpipAc：2-(哌嗪-1-基)乙酰基

OBu^t：叔-丁氧基

Orn：鸟氨酸

Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰

Phe(4F)：4-氟苯丙氨酸

PhOH：酚

PhSMe：苯甲硫醚

Pya(4)：4-吡啶基丙氨酸

PyAOP：(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)-三(吡咯烷)膦六氟磷酸盐

PyBOP：(苯并三唑-1-基氧基)-三(吡咯烷)膦六氟磷酸盐

PyBrop：溴-三(吡咯烷)膦六氟磷酸盐

MeGly：N-甲基甘氨酸

TIS：三异丙基硅烷

Trt：三苯甲基

TFA：三氟乙酸

TFE：三氟乙醇

Tyr(PO₃H₂)：O-磷酸酪氨酸

Z：苄氧基羰基

参考例1

(合成方法a)：β-Ala0，Gln5-NMU-8(化合物1)的生成

使用425mg Fmoc-NH-SAL树脂(Watanabe Chemical Industries，Ltd.，0.59mmol/g)作为起始材料，并依照通用的Fmoc策略(HBTU/HOBt)使用433A型肽合成仪(由Applied Biosystems生产)来顺序缩合Fmoc-氨基酸。由此，获得β-Ala-Tyr(But)-Phe-Leu-Phe-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-NH-SAL树脂881mg。然后，将7.94mL TFA/TIS/H₂O(95∶2.5∶2.5)添加至获得的肽树脂，于室温处理2小时，并用乙醚沉淀，将粗肽制备成白色粉末。通过使用ODS柱的制备型HPLC(Shimadzu LC-8A System，YMC-Pack ODS-A，30×250mm)来纯化获得的粗肽。以20mL/分钟的流速用溶液A(0.1％TFA-水)/溶液B(含有0.1％TFA的乙腈)为85.3/14.7～65.3/34.7来实施线性密度梯度洗脱(80分钟)。将含有目标产物的洗脱级分收集、浓缩、并冷冻干燥以产生107mg白色粉末。

质谱(M+H)⁺1154.6(计算值：1154.6)

HPLC洗脱时间：13.8分钟

洗脱条件

柱：Wakosil-II 5C18HG(4.6×100mm)

洗脱剂：溶液A：0.1％TFA-水；溶液B：含有0.1％TFA的乙腈，用溶液A/溶液B：100/0～50/50实施的线性密度梯度洗脱(25分钟)

流速：1.0mL/分钟。

参考例2

(合成方法b)：β-Ala0，Arg1-NMU-8(化合物7)的生成

使用391mg Sieber酰胺树脂(Nova，0.64mmol/g)作为起始材料，并依照通用的Fmoc策略(DCC/HOBt)使用433A型肽合成仪(由Applied Biosystems生产)来顺序缩合Fmoc-氨基酸。由此，获得763mgPhe-Leu-Phe-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-NH-Sieber酰胺树脂。然后，用DMF来清洗61.1mg(0.02mmol)获得的树脂，在DMF中膨胀，然后用51.9mg(0.08mmol)Fmoc-Arg(Pbf)、0.16mL(0.08mmol)0.5M HOAt/DMF溶液、13.9μL(0.08mmol)DIPCDI来处理120分钟，由此导入Arg(Pbf)残基。在完成反应后，将树脂清洗，然后用20％哌啶/DMF处理以除去N-端Fmoc基团。以与上述方式相似的方式，导入Boc-β-Ala。然后，将0.6mL TFA：苯甲硫醚∶间甲酚∶H₂O∶EDT∶TIS (80∶5∶5∶5∶2.5∶2.5)添加至获得的肽树脂，于室温处理90分钟，并用乙醚沉淀，将粗肽制备成白色粉末。通过使用ODS柱的制备型HPLC(Shimadzu LC-8A System，Daisopak-SP100-5-ODS-P，20×250mm)来纯化获得的粗肽。以15mL/分钟的流速用溶液A(0.1％TFA-水)/溶液B(含有0.1％TFA的乙腈)为88/12～68/32来实施线性密度梯度洗脱(120分钟)。将含有目标产物的洗脱级分收集、浓缩、并冷冻干燥以产生11.2mg白色粉末。

质谱(M+H)⁺1175.5(计算值1175.7)

HPLC洗脱时间：10.6分钟

洗脱条件

柱：Wakosil-II 5C18HG(4.6×100mm)

流速：1.0ml/分钟。

参考例3

(合成方法c)：2-(哌嗪-1-基)乙酰基-Arg3-NMU8(化合物10)的生成

将9μmol(10.6mg)Arg3-NMU8(化合物9)在1000μL二甲基甲酰胺中溶解。向此溶液添加如下的溶液以于室温反应1小时，所述溶液通过将13.5μmol氰基磷酸二乙酯(diethyl cyanophosphate)和36μmol三乙胺添加至先前通过将等于18μmol的量的2-(4-叔-丁氧基羰基哌嗪-1-基)乙酸(Fluorochem Ltd.)在500μL二甲基甲酰胺中溶解制备的溶液来获得。将反应溶液蒸发后，将所得的产物在100μL蒸馏水中溶解。然后，对其添加1.9mL三氟乙酸以于室温反应30分钟，由此除去Boc基团。将反应溶液用乙醚稀释15倍，并彻底混合。此后，将混合物于4℃以3000rpm离心15分钟。通过倾析来弃去上清液，并将15mL乙醚再次添加至沉淀物，并彻底混合。随后，重复相同操作。将获得的沉淀物于室温干燥，然后溶解在6mL 0.1M乙酸中。将所得的溶液以30.0mL/分钟的流速注射到CAPCELL PAK柱CN柱(UG120，30×250mm，Shiseido Co.，Ltd.)中，该柱用100％/0％比率的溶液A和溶液B(0.1％三氟乙酸/80％乙腈)平衡。在将浓度快速提高到溶液A/溶液B：85％/15％后，花费40分钟将浓度进一步线性提高到溶液A/溶液B：45％/55％。由此，洗脱出2-(哌嗪-1-基)乙酰基-Arg³-NMU8。然后，将目标产物的峰分级，并进行冷冻干燥。

参考例4

以与参考例1～3的方法相似的方式合成化合物2～6、化合物8～9、和化合物11～22。

下文的表1(表1-1和1-2)指明每种合成方法。

实施例1

(合成方法d)：使用PEG-醛来制备NMU衍生物-PEG缀合物(1)

将2.0μmol NMU-8衍生物(β-Ala0，Gln5-NMU-8；β-Ala0，Gln3-NMU-8；β-Ala0，Arg3-NMU-8；β-Ala0，Val3-NMU-8；β-Ala0，Cha3-NMU-8；β-Ala0，Tyr2-NMU-8；β-Ala0，Arg1-NMU-8；和β-Ala0，Prol-NMU-8)和4.0μmol(～120mg)含有醛基的PEG(SUNBRIGHT ME-300AL，Nippon Oil&Fats Co.，Ltd.)在1000μL二甲基甲酰胺中溶解，并对其添加等于40μmol的量的氰基硼氢化钠，于室温反应2小时。

将乙酸添加至反应溶液到终浓度0.1M。然后，将所得的溶液用40mL0.1M乙酸稀释，并加载到SP-Sephadex C50离子交换柱(容量：10mL)中。用0.1M乙酸，然后用10mM甲酸铵/0.1M乙酸漂洗柱后，用2M甲酸铵/20％乙腈，然后用3.2M甲酸铵/20％乙腈从该柱洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。

将获得的洗脱物以30.0mL/分钟的流速注射到CAPCELL PAK柱CN柱(UG120，30×250mm，Shiseido Co.，Ltd.)中，该柱用100％/0％比率的溶液A和溶液B平衡。在将浓度快速提高到溶液A/溶液B：55％/45％后，花费40分钟将浓度进一步线性提高到溶液A/溶液B：15％/85％。由此，洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。将NMU-8衍生物-PEG缀合物(PEG30k-NH-β-Ala0，Gln5-NMU-8(化合物A)、PEG30k-NH-β-Ala0，Gln3-NMU-8(化合物B)、PEG30k-NH-β-Ala0，Arg3-NMU-8(化合物C)、PEG30k-NH-β-Ala0，Val3-NMU-8(化合物D)、PEG30k-NH-β-Ala0，Tyr2-NMU-8(化合物E)、PEG30k-NH-β-Ala0，Cha3-NMU-8(化合物F)、PEG30k-NH-β-Ala0，Arg1-NMU-8(化合物G)、和PEG30k-NH-β-Ala0，Pro1-NMU-8(化合物H))的峰分级，并进一步进行冷冻干燥。

将每种获得的冷冻干燥的NMU-8-PEG缀合物在蒸馏水中溶解，并通过氨基酸分析来测定肽浓度。

实施例2

(合成方法e)：使用PEG-醛来制备NMU衍生物-PEG缀合物(2)

将2.0μmol 2-(哌嗪-1-基)乙酰基-Arg3-NMU8(化合物10)和4.0μmol(～120或80mg)含有醛基的PEG(SUNBRIGHT ME-200AL或SUNBRIGHTME-300AL，Nippon Oil&Fats Co.，Ltd.)在1000μL二甲基甲酰胺中溶解，并对其添加等于40μmol的量的氰基硼氢化钠，于室温反应2小时。将乙酸添加至反应溶液到终浓度0.1M。然后，将所得的溶液用40mL 0.1M乙酸稀释，并加载到SP-Sephadex C50离子交换柱(容量：10mL)中。在用0.1M乙酸，然后用10mM甲酸铵/0.1M乙酸漂洗柱后，用2M甲酸铵/20％乙腈，然后用3.2M甲酸铵/20％乙腈从该柱洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。

将获得的洗脱物以30.0mL/分钟的流速注射到CAPCELL PAK柱CN柱(UG120，30×250mm，Shiseido Co.，Ltd.)中，该柱用100％/0％比率的溶液A和溶液B平衡。在将浓度快速提高到溶液A/溶液B：55％/45％后，花费40分钟将浓度进一步线性提高到溶液A/溶液B：15％/85％。由此，洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。将NMU-8衍生物-PEG缀合物(PEG20k-NpipAc-Arg3-NMU-8(化合物I)和PEG30k-NpipAc-Arg3-NMU-8(化合物J))的峰分级，并进行冷冻干燥。

实施例3

(合成方法f)：使用PEG-醛来制备NMU衍生物-PEG缀合物(3)

将4.0μmol NMU-8衍生物(β-Ala0，Asp8-NMU-8；β-Ala0，NMeArg5-NMU-8；β-Ala0，Arg(Me)7-NMU-8；β-Ala0，NMeLeu3，NMeArg7-NMU-8；β-Ala0，NMeTyr1，NMeLeu3，NMeArg5-NMU-8；β-Ala0，Trp2，NMeAla6-NMU-8；和β-Ala0，Glu2，NMeAla6-NMU-8)和6.0μmol(～180mg或120mg)含有醛基的PEG(SUNBRIGHT ME-300AL或ME-200AL，Nippon Oil&Fats Co.，Ltd.)在1000μL二甲基甲酰胺中溶解，并对其添加等于80μmol的量的氰基硼氢化钠，于室温反应2小时。将乙酸添加至反应溶液到终浓度0.1M。然后，将所得的溶液用40mL 0.1M乙酸稀释，然后加载到SP-Sephadex C50离子交换柱(容量：10mL)中。在用0.1M乙酸，然后用10mM甲酸铵/0.1M乙酸漂洗该柱后，用2M甲酸铵/20％乙腈，然后用3.2M甲酸铵/20％乙腈从该柱洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。

将获得的洗脱物以30.0mL/分钟的流速注射到CAPCELL PAK柱CN柱(UG120，30×250mm，Shiseido Co.，Ltd.)中，该柱用100％/0％比率的溶液A和溶液B平衡。在将浓度快速提高到溶液A/溶液B：60％/40％后，花费40分钟将浓度进一步线性提高到溶液A/溶液B：20％/80％。由此，洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。将NMU-8衍生物-PEG缀合物(PEG30k-NH-β-Ala0，Asp8-NMU-8(化合物L)，PEG30k-NH-β-Ala0，NMeArg5-NMU-8(化合物M)， PEG30k-NH-β-Ala0，Arg(Me)7-NMU--8(化合物N)，PEG20k-NH-β-Ala0，NMeLeu3，NMeArg7-NMU-8(化合物O)，PEG20k-NH-β-Ala0，NMeTyr1，NMeLeu3，NMeArg5-NMU-8(化合物P)，PEG20k-NH-β-Ala0，Trp2，NMeAla6-NMU-8(化合物Q)、和PEG20k-NH-β-Ala0，Glu2，NMeAla6-NMU-8(化合物R))的峰分级，并进行冷冻干燥。

实施例4

(合成方法g)：使用PEG-醛来制备NMU衍生物-PEG缀合物(4)

将4.0μmol 2-(哌嗪-1-基)乙酰基-[Phe1，Trp2，Ala6]-NMU-8、2-(哌嗪-1-基)乙酰基-[Glu2，Ala6]-NMU8、2-(哌嗪-1-基)乙酰基-[Trp2，Ala6]-NMU8、2-(哌嗪-1-基)乙酰基-[Glu2，NMeAla6]-NMU8、和2-(哌嗪-1-基)乙酰基-[Nal(2)2，NMeAla6]-NMU8、和6.0μmol(～120mg)含有醛基的PEG(SUNBRIGHT ME-200AL，Nippon Oil&Fats Co.，Ltd.)在1000μL二甲基甲酰胺中溶解，并对其添加等于80μmol的量的氰基硼氢化钠，于室温反应2小时。将乙酸添加至反应溶液到终浓度0.1M。然后，将所得的溶液用40mL 0.1M乙酸稀释，然后加载到SP-Sephadex C50离子交换柱(容量：10mL)中。在用0.1M乙酸，然后用10mM甲酸铵/0.1M乙酸漂洗柱后，用2M甲酸铵/20％乙腈，然后用3.2M甲酸铵/20％乙腈从该柱洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。

将获得的洗脱物以30.0mL/分钟的流速注射到CAPCELL PAK柱CN柱(UG120，30×250mm，Shiseido Co.，Ltd.)中，该柱用100％/0％比率的溶液A和溶液B平衡。在将浓度快速提高到溶液A/溶液B：60％/40％后，花费40分钟将浓度进一步线性提高到溶液A/溶液B：20％/80％。由此，洗脱出NMU-8衍生物-PEG缀合物。将NMU-8衍生物-PEG缀合物(PEG20k-NPipAc-Phe1，Trp2，Ala6-NMU-8(化合物K)、PEG20k-NpipAc-Glu2，Ala6-NMU8(化合物S)、PEG20k-NpipAc-Trp2，Ala6-NMU8(化合物T)、PEG20k-NpipAc-Glu2，NMeAla6-NMU8(化合物U)、和PEG20k-NpipAc-Nal(2)2，NMeAla6-NMU8(化合物V))的峰分级，并进一步进行冷冻干燥。

下文的表1显示了上文合成的每种化合物的结构、物理化学特性等。

表中标题为“合成方法”的栏显示了通过合成方法a～c来合成参考例1～3中所描述的化合物，及基于“合成方法”的栏所述的合成方法来合成未在参考例1～3中所描述的化合物。

表中题目为“分析条件”的栏显示了下列HPLC分析条件h～n：

h：Wakosil-II 5C18HG 4.6×100mm；梯度：0-50％B(A：DW/0.1％TFA，B：100％AcCN/0.1％TFA)，0-25分钟，1mL/分钟

i：CAPCELL PAK UG120，CN 30×250mm；梯度：20-60％B (A：DW/0.1％TFA，B：80％AcCN/0.1％TFA)，3-43分钟，30mL/分钟

j：Merck Chromolith Performance RP-18e 4.6×100mm；梯度：5-65％B(A：DW/0.1％TFA，B：100％AcCN/0.1％TFA)，0-10分钟，3mL/分钟

k：CAPCELL PAK UG120，C130×250mm；梯度：40-80％B (A：DW/0.1％TFA，B：80％AcCN/0.1％TFA)，6-46分钟，30mL/分钟

1：CAPCELL PAK UG120，CN 30×250mm；梯度：40-80％B (A：DW/0.1％TFA，B：80％AcCN/0.1％TFA)，3-43分钟，30mL/分钟

m：CAPCELL PAK UG120，CN 30×250mm；梯度：45-85％B (A：DW/0.1％TFA，B：80％AcCN/0.1％TFA)，3-43分钟，30mL/分钟

n：CAPCELL PAK UG120，CN 50×250mm；梯度：40-80％B(A：DW/0.1％TFA，B：80％AcCN/0.1％TFA)，10-50分钟，60mL/分钟

表1-1

表1-2

试验例1

NMU-8衍生物和PEG缀合物的受体结合测试

将表达人FM3的CHO细胞(dhfr-)和表达人TGR1的CHO细胞(dhfr-)在含有10％透析的FBS的MEMα(Invitrogen)培养基中在5％二氧化碳的条件下于37℃C培养。将贴壁细胞用10mL含有0.1mM EDTA的D-PBS(Invitrogen)剥离，并以1000rpm于4℃离心10分钟，由此收集细胞。将15mL均质化缓冲液(10mM NaHCO₃(pH 7.4)、5mM EDTA、蛋白酶抑制剂＝0.5mM PMSF、10μg/mL胃酶抑素A(Pepstatin A)、20μg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)、4μg/mL E-64)添加至获得的细胞沉淀物，使用Polytron匀浆器(Kinematica GmbH)来破坏细胞膜，以1000g于4℃将离心进行10分钟，并收集上清液。将此过程再重复两次，并以30000rpm于4℃超速离心60分钟。此后，将8mL均质化缓冲液添加至沉淀物，从而制备均匀悬浮的膜级分。表达FM3的CHO细胞膜级分的蛋白质浓度是1.2mg/mL，而表达TGR1的CHO细胞膜的蛋白质浓度是1.1mg/mL。

基于对经¹²⁵I-NMU8标记的配体与FM3膜级分或TGR1膜级分的结合的抑制来评估表2(表2-1、表2-2)中的各NMU-8衍生物和PEG缀合物与每种受体的亲和力。具体地，将每种NMU衍生物和PEG缀合物在DMSO中溶解，从而制备2μL每种稀释系列的NMU衍生物和PEG缀合物。然后，对其添加100μL反应缓冲液(50mM HEPES、1mM EDTA、蛋白酶抑制剂(0.5mM PMSF、10μg/mL胃酶抑素A(Pepstatin A)、20μg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)、4μg/mLE-64)，pH 6.8、0.1％BSA)稀释的膜级分溶液，接着再添加100μL用反应缓冲液类似地稀释的经标记的配体(终浓度：135pM)。将所得的产物彻底混合，然后于25℃反应70分钟。依照上文所描述的操作，使用顶部计数(top count)(PerkinElmer)通过液体闪烁法来测量滤器中剩余的经标记的配体的结合量，并使用Graph Pad Prism来计算IC₅₀值(图1(FM3受体结合)、图2(TGR1受体结合)、表2)。在图1和2中，横轴表示每种衍生物的浓度的对数值，而纵轴表示通过NMU-8的结合算出的通过0％～100％残留放射活性归一化的各衍生物的结合抑制率。表2显示了在NMU-8的亲和力是1时IC₅₀值的比率。

表2-1

试验例2

NMU-8衍生物PEG缀合物在小鼠中的食物摄取抑制活性

将购自Charles River Laboratories Japan Inc.的7周龄雄性C57BL/6J小鼠导入，然后在5～10天的过程中，在温度、湿度和照明时间受到调节(25℃，12小时光周期和12小时黑暗周期，在8:00时亮灯)的饲养环境下，以每笼4只动物进行群体饲养。在处理5～8天后，将每一个小鼠分别在具有网孔底板的笼中单独饲养，在施用肽(缀合物)之前的3天，对其进行皮下施用的驯化。在肽(缀合物)施用前一天自18:00将经驯化小鼠禁食16小时；然而，小鼠可以自由获得饮水。随后，在施用当天在10:00时对小鼠皮下施用各100μL通过在生理盐水中溶解每种PEG-NMU8衍生物缀合物，即PEG30k-NH-β-Ala0，Gln5-NMU-8(化合物A)、PEG30k-NH-β-Ala0，Gln3-NMU-8(化合物B)、PEG30k-NH-β-Ala0，Arg3-NMU-8(化合物C)、PEG30k-NH-β-Ala0，Val3-NMU-8(化合物D)、PEG30k-NH-β-Ala0，Tyr2-NMU-8(化合物E)、PEG30k-NH-β-Ala0，Cha3-NMU-8(化合物F)、PEG30k-NH-β-Ala0，Arg1-NMU-8(化合物G)、PEG30k-NH-β-Ala0，Pro1-NMU-8(化合物H)、PEG20k-NpipAc-Arg3-NMU8(化合物I)、和PEG30k-NpipAc-Arg3-NMU8(化合物J)获得的溶液，使得施用量为100nmol/kg。在施用肽(缀合物)溶液后立即给小鼠随意喂食已经称重过的MF饲料(Oriental Yeast Co.，Ltd.)，并在3、6、24小时后对饲料的剩余量称重。通过从最初给予的饲料的量中分别扣除在3、6、和24小时后称重的饲料的剩余量来计算3、6、24小时的食物摄取量。图3～6显示了结果。图6显示了在对小鼠皮下施用各100μL的化合物C和J的溶液，使得施用量是30nmol/kg时获得的结果。

在图3中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物A、化合物B。通过2组样本检验来检验各NMU-PEG化形式施用组的食物摄取量和生理盐水施用组的食物摄取量。如下所示用星号的个数来表示显著性水平(危険率)：

显著性水平小于0.01(P＜0.01)时：^**

显著性水平小于0.001(P＜0.001)时：^***

在图4中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物C、化合物D、化合物E。通过2组样本检验来检验各NMU-PEG化形式施用组的食物摄取量和生理盐水施用组的食物摄取量。如下所示用星号的个数来表示显著性水平：

显著性水平小于0.05(P＜0.05)时：^*

显著性水平小于0.01(P＜0.01)时：^**

显著性水平小于0.00l(P＜0.001)时：^***

在图5中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物F、化合物G、化合物H、化合物I、化合物J。通过2组样本检验来检验各NMU-PEG化形式施用组的食物摄取量和生理盐水施用组的食物摄取量。如下所示用星号的个数来表示显著性水平：

显著性水平小于0.05(P＜0.05)时：^*

显著性水平小于0.01(P＜0.01)时：^**

显著性水平小于0.001(P＜0.001)时：^***

在图6中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物C(30nmol/kg)、化合物C(100hmol/kg)、化合物J(30nmol/kg)、化合物J(100nmol/kg)。

#：表示食物摄取量通过William氏检验来检测，显著性水平小于0.025(P＜0.025)。

如根据图3～6清楚的是，各NMU-8-PEG缀合物显著抑制小鼠的食物摄取。

试验例3

NMU-8衍生物PEG缀合物在小鼠中的食物摄取抑制活性(2)

将购自Charles River Laboratories Japan Inc.的6～7周龄雄性C57BL/6J小鼠导入，然后在9～12天的过程中，在温度、湿度和照明时间受到调节(25℃，12小时光周期和12小时黑暗周期，在8:00时亮灯)的饲养环境下，以每笼4只动物进行群体饲养。在处理5～8天后，将每一个小鼠分别在具有网孔底板的笼中单独饲养，在施用肽(缀合物)之前的3天，对其进行皮下施用的驯化。在肽(缀合物)施用前一天自18:00将驯化小鼠禁食16小时；然而，小鼠可以自由获得饮水。随后，在施用当天在10:00时对小鼠皮下施用各100μL通过在生理盐水中溶解每种PEG-NMU8衍生物缀合物，即PEG20k-NPipAc-Phe1，Trp2，Ala6-NMU-8(化合物K)、PEG30k-NH-β-Ala0，Asp8-NMU-8(化合物L)、PEG30k-NH-β-Ala0，NMeArg5-NMU-8(化合物M)、PEG30k-NH-β-Ala0，Arg(Me)7-NMU-8(化合物N)、PEG20k-NH-β-Ala0，NMeTyr1，NMeLeu3，NMeArg5-NMU-8(化合物P)、PEG20k-NH-β-Ala0，Trp2，NMeAla6-NMU-8(化合物Q)、PEG20k-NH-β-Ala0，Glu2，NMeAla6-NMU-8(化合物R)、PEG20k-NpipAc-Glu2，Ala6-NMU8(化合物S)、PEG20k-NpipAc-Trp2，Ala6-NMU8(化合物T)、PEG20k-NpipAc-Glu2，NMeAla6-NMU8(化合物U)、和PEG20k-NpipAc-Nal(2)2，NMeAla6-NMU8(化合物V)获得的溶液，使得施用量为100nmol/kg。在施用肽(缀合物)溶液后立即给小鼠随意喂养已经称重过的MF饲料(Oriental Yeast Co.，Ltd.)，并在3、6、24小时后对饲料的剩余量称重。通过从最初给予的饲料的量中分别扣除在3、6、24小时后称重的饲料的剩余量来计算3、6、24小时的食物摄取量。图7～11显示了结果。

在图7中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物K(10nmol/kg)、化合物K(30nmol/kg)、化合物K(300nmol/kg)、和化合物K(3000nmol/kg)。#：表示食物摄取量通过William氏检验来检测，显著性水平小于0.025(P＜0.025)。

小鼠为10周龄，具有24.5g的平均重量，并且其数目是5～6只。

在图8中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物L(100mol/kg)、化合物M(30nmol/kg)、化合物M(100nmol/kg)、化合物N(30mol/kg)、化合物N(100nmol/kg)。#：表示食物摄取量通过William氏检验来检测，显著性水平小于0.025(P＜0.025)。^**：表示显著性水平小于0.01(P＜0.01)，其是基于在化合物L (100nmol/kg)施用组的食物摄取量和生理盐水组的食物摄取量的2组样本检验测定的。

小鼠为9周龄，具有23.6g的平均重量，并且其数目是5～6只。

在图9中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物P(10mol/kg)、化合物P(100nmol/kg)、化合物P(1000nmol/kg)、化合物Q(10mol/kg)、化合物Q(100nmol/kg)、和化合物Q(1000nmol/kg)。#：表示食物摄取量通过William氏检验来检测，显著性水平小于0.025(P＜0.025)。

小鼠为10周龄，具有24.8g的平均重量，并且其数目是5只。

在图10中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物T(10nmol/kg)、化合物T(100nmol/kg)、化合物T(1000nmol/kg)、化合物V(10mol/kg)、化合物V(100nmol/kg)、化合物V(1000nmol/kg)。#：表示食物摄取量通过William氏检验来检测，显著性水平小于0.025(P＜0.025)。

小鼠为10周龄，具有24.8g的平均重量，并且其数目是4～5只。

在图11中，从左侧起，各栏表示生理盐水、化合物S(100nmol/kg)、化合物S(1000nmol/kg)、化合物U(10nmol/kg)、化合物U(100nmol/kg)、化合物U(1000nmol/kg)、化合物K(100nmol/kg)。#：表示食物摄取量通过William氏检验来检测，显著性水平小于0.025(P＜0.025)。

小鼠为10周龄，具有24.6g的平均重量，并且其数目是5只。

如根据图7～11清楚的是，各NMU-8-PEG缀合物显著抑制小鼠的食物摄取。

工业实用性

本发明的化合物可以作为食物摄取抑制剂，或作为肥胖症的预防/治疗剂来使用。

序列表文本

[SEQ ID NO.：2]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：3]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：4]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：5]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：6]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第3位的丙氨酸被环己基取代。即，第3位是β-环己基丙氨酸。

[SEQ ID NO.：7]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：8]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：9]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：10]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：11]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：12]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：13]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第7位的精氨酸被甲基取代，第7位变为N^α-甲基精氨酸。

[SEQ ID NO.：14]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第3位的亮氨酸被甲基取代。即，第3位是N^α-甲基亮氨酸。

第7位的精氨酸被甲基取代，第7位变为N^ω-甲基精氨酸。

[SEQ ID NO.：15]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第1位的酪氨酸被甲基取代。即，第1位是N^α-甲基酪氨酸。

第3位的亮氨酸被甲基取代。即，第3位是N^α-甲基亮氨酸。

第5位的精氨酸被甲基取代。即，第5位是N^α-甲基精氨酸。

[SEQ ID NO.：16]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第6位是N^α-甲基丙氨酸。

[SEQ ID NO.：17]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第6位是N^α-甲基丙氨酸。

[SEQ ID NO.：18]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：19]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

[SEQ ID NO.：20]

NMU-8的变体

第8位(C端)被酰胺化。

第2位是2-萘基丙氨酸。

第6位是N^α-甲基丙氨酸。

Claims

1.一种下式表示的化合物或其盐，

上式中，Y表示由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列为SEQ IDNO.:1所表示的氨基酸序列中具有2个氨基酸取代的氨基酸序列，

所述氨基酸取代选自：

(1)用Nal(2)取代第2位的Phe；和

(2)用NMeAla取代第6位的Pro；

X表示甲氧基聚乙二醇；

X’是不存在的或者表示甲氧基聚乙二醇；

La是下式表示的二价或三价基团：

上式中，R表示键；

且

n是整数0；

Lb表示-(CH₂)_i-，式中，i表示1～5的整数；

Lc是式(i)：-NH-Q^c-C^b-表示的二价基团，

上式(i)中，Q^c是式：-(CH₂)_m1-表示的二价基团，

式中，m1表示0～15的整数，且

C^b表示键、-CO-、或-SO₂-，或

Lc是式(ii)：-Q^c’-C^b’-表示的二价基团，

在上式(ii)中，Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-的二价基团，

上式中，m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示：

且m2’表示0～15的整数，且

C^b’表示键、-CO-或-SO₂-；且

j表示1～3的整数。

2.权利要求1所述的化合物或其盐，其中Y是由SEQ ID NO.:20所表示的氨基酸序列组成的多肽。

3.权利要求1所述的化合物或其盐，其中从所述Lc中的与Lb最接近的氮原子到在式(I)中Y所述多肽的N端的氮原子之间的距离是

4.权利要求1所述的化合物或其盐，其中Lc是式(ii)：-Q^c’-C^b’-表示的二价基团，

上式(ii)中，Q^c’为式：-(CH₂)_m1’-Z^c’-(CH₂)_m2’-表示的二价基团，

上式中，m1’表示0～15的整数，

Z^c’表示

且m2’表示0～15的整数，且

C^b’表示键、-CO-或-SO₂-。

5.PEG20k-NpipAc-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH₂或其盐。

6.包含权利要求1所述的化合物或其盐的食物摄取抑制剂。

7.一种用于预防或治疗肥胖症的药剂，其包含权利要求1所述的化合物或其盐。

8.权利要求1所述的化合物或其盐用于生产供预防或治疗肥胖症用的药剂的用途。