CN102458476A - 用于治疗多发性硬化症的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗多发性硬化症(MS)的新组合物和方法，具体涉及治疗MS的包含胞壁酰二肽微粒的免疫刺激组合物。

Description

用于治疗多发性硬化症的组合物及方法

技术领域

本发明涉及用于治疗多发性硬化症(MS)的新型组合物和方法，具体涉及治疗MS的包含胞壁酰二肽微粒的免疫刺激组合物。

背景技术

多发性硬化症(简称MS)是自身免疫性情形，其中，免疫系统袭击中枢神经系统，导致脱髓鞘。经常在青年中发生发病情况，并且在女性中更为常见。其流行率在每十万人中有大约2例与150例之间。

MS影响大脑和脊髓中的神经细胞的彼此通讯的能力。神经细胞通过沿包围在叫作髓磷脂的隔离物质中的被称作轴突的长纤维发送叫作动作电位的电信号来通讯。在MS中，机体的自身免疫系统袭击并损害髓磷脂。当髓磷脂损失时，轴突不能再有效地传导信号。多发性硬化症的名称是指大脑和脊髓的主要包括髓磷脂的白质中的疤痕(硬化-更多地称为斑块或病变)。尽管已经了解很多有关疾病进程的机制，但是疾病的成因仍然未知。理论包括遗传和/或感染。也发现了不同的环境风险因子。

几乎任何神经症状可出现疾病，并往往发展为身体残疾和认知障碍。MS有若干形式，有着发生为不连续发作(复发形式)或随时间推移的缓慢累积(进展形式)的新的症状。在发作之间，症状可完全消失，但是通常发生永久的神经问题，尤其是疾病的恶化。MS往往在对其他原因进行的神经检测过程中被意外地发现。

没有已知的治愈MS的情形。治疗试图在发作之后恢复功能、防止新的发作并防止残疾。MS药物可以产生副作用或耐受性很差，许多患者寻求另类疗法，尽管这缺乏科学研究的支持。预后是难以预期的；这取决于疾病的亚型、每个患者的疾病特点、初期症状以及随着时间推移患者所经历的残疾程度。

患有MS的人的预期寿命，至少前几年，几乎与未受影响的人是相同的。几乎40％的患者达到生命的第七个十年。然而，患有MS的人的死亡的一半与疾病的影响直接相关，而15％以上是由于自杀，比例远高于健康人群。

尽管大多数患者在死亡之前失去行走的能力，但是90％的患者在患病的第10年仍能够独立行走，75％的患者在患病的第15年仍能独立行走。

MS导致髓磷脂变薄或完全损失，并且随着疾病的发展导致轴突或神经元的延伸的切割(横断)。当髓磷脂损失时，神经元不再能有效地传导电信号。髓鞘再生的修复过程发生在疾病的早期阶段，但少突胶质细胞不能完全重建细胞的髓鞘。反复发作导致接下来较少的有效的髓鞘再生，直到疤痕样斑块围绕受损的轴突积聚。

除了髓鞘再生，疾病的其他病理特点是由T细胞引起的炎症。很好地建立了宽范围炎症介质在进展型多发性硬化症中的中心参与。这些因子扮演着包括促进T细胞迁移到中枢神经系统(CNS)、破坏血脑屏障以及在疾病早期阶段加速髓磷脂破坏和轴突变性的多种角色。晚期阶段与暴露在脱髓鞘的斑块中的裸露轴突导致的主要神经轴突损伤有关。

治疗

尽管没有已知的治愈多发性硬化症的情形，但是已经证明一些疗法是有益的。疗法的首要目的在于在发作之后恢复功能、防止新的发作并防止残疾。如伴随任何药物治疗的，用在治疗MS中的药物具有多种副作用。某些患者追求另类治疗，尽管缺乏支持的、可比较的和可重复的科学研究。

目前的治疗策略包括目的在于减少炎症期的免疫调节策略和免疫抑制策略。在对症攻击中，高剂量静脉注射诸如甲泼尼龙的皮质类固醇激素对于急性复发是常规疗法。这种治疗的目的在于尽早结束攻击并给患者留下较少的持续损害。虽然一般在短期内缓解症状有效，但是皮质类固醇激素治疗对于长期的恢复不具有显著的效果。潜在的副作用包括骨质疏松症和记忆力下降，后者是可逆的。

疾病改善治疗昂贵且这些的大多数需要频繁(每日)注射。其他的需要以1-3个月为间隔静脉输液。诸如干扰素的非特异性药剂具有有限的长期功效且耐受性不好。

如2007年，不同国家的监管机构已经批准了6种用于MS的疾病改善治疗。三种是干扰素：干扰素β-1a的两种制剂(商标名称Avonex、CinnoVex、ReciGen和Rebif)和干扰素β-1b的一种制剂(美国商标名称Betaseron，在欧洲和日本是Betaferon)。第四种药物是醋酸格拉替雷(Copaxone)。第五种药物，米托蒽醌，是一种也被用在癌症化疗中的免疫抑制剂，仅在美国获准并主要用于继发性进展型MS。第六种是那他珠单抗(以Tysabri投放市场)，是阻止免疫细胞的活动并有效地降低CNS的炎症的抗VLA-4的抗体。虽然它们的疗效不同，但是全部六种药物对于减少攻击的数量和减速进展到残疾是温和有效的，而仍然缺乏对它们的长期影响的研究。免疫调节剂(除了米托蒽醌)之间的比较表明，最有效的是那他珠单抗，无论是在降低复发率还是制止残疾进展方面；其还被证明可以降低MS的严重性。米托蒽醌可能是它们中最有效的，但是由于其用途受到严重的心脏毒性的限制，所以一般不考虑将它作为长期疗法。

通过频繁注射来传送干扰素和醋酸格拉替雷，从每天一次醋酸格拉替雷到每周一次Avonex(但为肌肉内注射)而改变。通过每隔一个月静脉输液来给入那他珠单抗和米托蒽醌。进展型MS的治疗比复发缓解型MS的治疗更为困难。米托蒽醌已经表现出对具有继发性进展型和进展复发型病程的病人的积极作用。其适当有效地减慢疾病的进展并降低患者在随后短期内的复发频率。没有治疗已被证明改善原发进展型MS的病程。

正在调查可以减少复发或改善功能的一些治疗。这些治疗的某些包括已经在使用的用于多发性硬化症的药物的组合，例如米托蒽醌与醋酸格拉替雷(Copaxone)的联合用药。然而，已在临床试验中大部分的治疗方法涉及用于其他疾病的药物。最近，已经强烈暗示与神经束蛋白186反应的自身抗体，一种基础神经纤维蛋白质，在神经元变性中与进展型MS相关，并代表潜在的新目标。

如对于任何药物治疗来讲，这些治疗具有若干副作用。最常见的一个是对用于醋酸格拉替雷和干扰素治疗的注射部位的刺激性。随着时间的推移，由于脂肪组织的局部破坏，可发展为在注射部位的可见凹痕，已知为脂肪萎缩。干扰素产生类似流感的症状；一些使用格拉替雷的患者经历通常持续少于30分钟的表现为发热、胸闷、心悸、气短和焦虑的注射后反应。更危险的是：由干扰素和米托蒽醌导致的肝损伤，后者的免疫抑制效果和心脏毒性；公认的那他珠单抗与诸如进行性多灶性白质脑病之类的危及生命的并发症的某些情况之间的联系。

因此，仍然需要有改善治疗并减少副作用的可选的MS治疗方法。

本发明的目的在于克服或改进现有技术疗法中的至少一个缺点或者提供有用的可替换物。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括对需要包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物治疗的对象的施用。

根据第二方面，本发明提供了一种治疗多发性硬化症的症状的方法，所述方法包括对需要包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物治疗的对象的施用。

根据第三方面，本发明提供了一种治疗多发性硬化症的共同疗法的方法，所述方法包括对需要包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物和另外的对多发性硬化症治疗有效的活性药物治疗的对象的施用。

优选的要治疗的多发性硬化症的类型是进展型多发性硬化症。进展型多发性硬化症可以是原发进展型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症或慢性进展型多发性硬化症。可选地，要治疗的多发性硬化症的类型可以是复发-缓解型多发性硬化症。

可以通过任何已知的方法将包含交联到微粒(MIS416)的胞壁酰二肽的组合物施用到对象，但是优选地通过输液或注射来施用。施用的适合模式还可以选自肌肉注射、腹腔给入、静脉注射、皮下注射、直肠给入、鼻给入、口服，经胃给入、经肺给入等。

考虑到多发性硬化症的类型、疾病的严重性及其症状以及患者的整体状况，医学从业者可以容易地确定MIS416的剂量。典型的给入剂量将在50μg至1500μg的范围并且可以以每日、每周、每两周或每月给入。合适的剂量方案的示例可以从100μg的起始MIS416剂量开始，接着按例如每周或每两周50μg至200μg增大剂量，直到在患者中观察到适当的有益的治疗效果，而没有显著的副作用。该剂量可以作为单次大药丸剂量给入或随着时间输液给入，或者以分割的剂量给入。

当作为共同治疗施用时，可以将MIS416组合物与例如类固醇、干扰素、抗体等的其他用在MS治疗中的活性药物一起施用。

可以与MIS416组合物联合施用的用在治疗MS中的其他活性药物可以选自于例如甲基强的松龙的皮质类固醇激素、例如干扰素β-1a和干扰素β-1b的干扰素、醋酸格拉替雷、米托蒽醌、例如那他珠单抗的抗体或者它们的组合。

可以将MIS416组合物与其他在治疗MS中有效的药物同时给入，或者可顺序给入。

根据第四方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化症的交联到微粒的胞壁酰二肽或者包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物。

根据第五方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化症的症状的交联到微粒的胞壁酰二肽或者包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物。

根据第六方面，本发明提供了在多发性硬化症的治疗中用于共同治疗的交联到微粒的胞壁酰二肽或者包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物。

在本发明的上下文中，将在这里对包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物(MDP-微粒)可互换地称作MIS或MIS416。

附图说明

图1：MIS416诱导抗炎细胞因子。

图2：在MIS416的单次静注之后MS患者中的血清Th2细胞因子的抑制。

图3：长达12周的对进展型MS患者的MIS416疗法致使对于白细胞迁移重要的细胞粘附分子的血清水平下降。

图4：MIS416通过作为最有潜力的IFNα分泌免疫细胞的浆细胞样树突状细胞诱导IFNα。IFNα对于一些形式的多发性硬化症的具有临床有效性。

图5：MIS416抑制T细胞响应于非自身MHC抗原(同种异型抗原)的增殖。可以抑制T细胞增殖的试剂具有用来减少与多发性硬化症相关的自身反应T细胞激活的能力。

图6：当在疾病诱导时施用时，MIS416诱导复发-缓解型多发性硬化症的小鼠模型中的发病率和发生率的延迟的机制。

图7：用MIS416的预冶疗诱导改善多发性硬化症的复发-缓解型小鼠模型中的疾病自发恢复阶段的机制。

图8：进展型MS患者中的长期MIS416疗法致使对白细胞的运输重要的可溶性粘附分子的升高水平持续降低。

图9：重复研究(实验#2)表明，在多发性硬化症的小鼠模型中的变态反应性脑脊髓炎(EAE)诱导时施用的MIS416延缓疾病的发病率和严重程度。

图10：在实验#2中，小鼠EAE模型中疾病诱导时用MIS416治疗也显著降低了最大疾病得分。

图11：在小鼠EAE模型中疾病诱导时用MIS416治疗显著增大了外周血血清中存在的IFN-γ水平。

图12：在小鼠EAE模型中疾病诱导时用MIS416治疗显著增大了EAE诱导后第22天的外周血单核细胞的绝对数量。

具体实施方式

现在，已经意外地发现包含DNA片段的微粒形式的胞壁酰二肽可以对包括进展型和复发-缓解型的MS的治疗更为有效，其中，胞壁酰二肽可以同时调节免疫系统的多个方面。不希望受到任何理论的限制，本发明的微粒还包含可以同时调节免疫系统的多个方面的DNA片段。通过对患有进展型MS的患者和复发-缓解型MS的动物模型的病例分析的方法在这里表明，使用包含交联到微粒(MDP微粒或MIS416)的胞壁酰二肽的组合物的多剂量治疗作为独立的疗法是有效的，而不引起显著的副作用。

·MIS416是多形态免疫应答调节剂，其激活MS治疗所涉及的宽范围免疫调节途径。这些包括诸如IL-10和PGE2的天然抗炎症调节剂的诱导，这也起到抑制不受控制的T细胞和B细胞的反应的作用。

·进展型MS患者的MIS416治疗表现为对白细胞运输重要的粘附分子的血清水平降低。具体来讲，MIS416有效地降低了与白细胞整合素VLA-4相互作用的sVCAM-1。这表明MIS416疗法下调了与这些分子的上调相关的MS。已经通过那他珠单抗证实了通过调节该VLA-4依赖的运输途径的疗法的有效，但是MIS416是无毒的。MIS416疗法还表现出ICAM-I和E-选择素水平升高的调节。

·MIS416可以改变复发-缓解型多发性硬化症模型(EAE)鼠的发病率和疾病的严重性。在这些研究中，已经确定了MIS416作用的一些潜在机制。特别需要注意的是，在该鼠模型中对EAE起保护的高水平IFN-γ的MIS416介导诱导。MIS416疗法还增大循环单核细胞的绝对计数，表明它们已经被有效地调动。单核细胞是已知的抗炎症细胞因子IL-10的细胞来源。

·与其他已经批准的用于治疗MS的药物相比，MIS416无毒且无免疫原性，并且适合长期治疗。

可以以任何适合的方式来使用包含MIS416的组合物。施用的示例性方法是肌肉注射、皮下注射、静脉注射、腹腔内注射、滴眼剂、通过饮水、气溶胶或喷鼻剂。当施用到动物时，可以使用任何适合的兽医配方。除了以上描述的以外，配方可以以粉末或糊剂的形式并且可被添加到饲料或以通常的方式口服。可以在诸如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19^thEd，1995(Mack Publishing Co.Pennsylvania，USA)，British Pharmacopoeia，2000等标准文本中找到适合的配方流程和赋形剂。

医学从业者可以基于在这里提供的指导、MS的性质和严重性及其症状以及患者对治疗的反应来容易地确定合适的MDP微粒组合物的单次剂量、施用的总量和施用时间。作为示例，有用的单次剂量可以从50μg至1000μg的范围选择，并且可以根据患者的状况、症状、耐受性和对治疗的反应而以每日、每周或每月施用。MDP微粒组合物可以以选自于大约50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、425μg、450μg、475μg、500μg、525μg、550μg、575μg、600μg、625μg、650μg、675μg、700μg、725μg、750μg、775μg、800μg、825μg、850μg、875μg、900μg、925μg、950μg、975μg或1000μg的剂量来施用。根据需要也可以使用更大范围的剂量，例如，50μg至1500μg范围的剂量。施用的MDP微粒的总量将取决于患者的反应和对治疗的耐受性。可以根据患者的反应来每日、每周、每两个星期或每月使用组合物而达总的周期。

不希望受到任何具体作用机制的限制，认为MIS416的影响至少部分地涉及短暂的炎症期、1-3级发热和与治疗剂量有关的畏寒。因此，可以预期MIS416的50μg至100μg的初始剂量激发很少的反应或根本没有反应，因此可以构成在剂量递增治疗方案中的适合的初次剂量，目的在于最终引发轻微的发烧及畏寒的反应。在没有这样的反应的情况下，可以提高剂量，例如，每周或每两个星期50μg，直到患者报告预期的轻度(1级至2级)发热和畏寒反应。给药间隔可根据患者的反应和对治疗的耐受性改变并可包括用较少量的MDP微粒组合物更频繁地用药(例如，每周或每两星期用药可分为更小的剂量并且可以以每天、每周两次或其他合适的间隔来给药)。这可以根据患者的反应由医学从业者来容易地确定。

本领域技术人员将清楚，MIS416治疗可形成MS治疗中的联合疗法的组分。因此，可以连同其他已知的诸如干扰素、类固醇、抗体等的MS治疗来施用MIS416。在联合疗法治疗中，可以与其他治疗同时或者与其他治疗顺序地施用MIS416。

现在将参照非限制性示例更具体地描述本发明。

示例

示例1-MDP微粒的准备

从丙酸杆菌属腺体(Propionibacterium acini)中分离多个重复的胞壁酰二肽(MDP)，这形成了该示例的MDP微粒免疫刺激剂的核心结构。优选的单体亚单位的化学构成如下所示：

MDP具有公知的免疫刺激特性，这已经在所设计的为确定其对提高免疫功能的研究中被广泛评估。迄今为止，当施用到动物时，从天然来源分离的MDP和合成的MDP已经与显著的毒性相关。该毒性限制了MDP作为辅助剂的有效性。

在其同在审的国际专利申请PCT/NZ2009/000049中描述了分离没有毒性组分的MDP的方法，该申请通过引用包含于此。简单来讲，痤疮丙酸杆菌生长到中期平稳增长阶段并采用本领域技术人员公知的技术进行洗涤以将细菌培养物的污染物去除。通过使用增大浓度的乙醇/异丙醇/水(10％∶10％∶80％，25％∶25％∶50％和40％∶40％∶20％)在高温下的连续洗涤来顺序地提取包含在细胞壁和细胞质中的疏水组分。然后，用减小浓度的乙醇(80％，50％，40％和20％)在高温下的连续洗涤来去除异丙醇。然后在6M盐酸胍中悬浮所得的MDP微粒然后用水冲洗，并且通过使其在540nm处的吸光度与标准浊度的吸光度相关而测量其浓度。

该制备的分析表明，胞壁酰二肽广泛交联并具有主要在1微米至3微米范围的微粒尺寸。MDP微粒包含具有氨基相连的L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺二肽的胞壁酸和细菌的DNA片段。不希望受到任何特定理论的限制，认为DNA片段可能是微粒的生物活性组分。可以从如上所述的天然来源分离这样的微粒，或者使用已知的合成方法(例如，Liu G.；Zhang S.-D.；Xia S.-Q.；Ding Z.-K.Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，10(12)，2000，pp.1361-1363(3)；Schwartzman S.M.，Ribi E.，Prep Biochem.1980；10(3)：255-67；Ohya et alJournal of Bioactive and Compatible Polymers，1993；8：351-364)来合成这样的微粒。由当前方法产生的MDP微粒可具有宽范围的尺寸(例如，0.01微米-30微米)，但是最常见的尺寸范围在1微米至7微米范围。优选的尺寸在0.5微米至3微米的范围。

将MDP-微粒的浓度在氯化钠中调整为10mg/mL用来静脉注射并分配为含有1.5mL的单剂量小瓶。这里，该氯化钠中的MDP-微粒配方称作MIS或MIS416。当患者受用MIS416时，优选地当使用剂量小于1000μg(1mg)时，将MIS416预先稀释到用以施用的更方便的浓度。这可以通过使用胰岛素注射器从药物小瓶中取出适当体积的MIS416并将该剂量注入到含有用于注射的1mL-2mL生理盐水的第二个注射器中来完成。

示例2-MIS416刺激人PBMC导致抗炎细胞因子IL-10和PGE2的产生

(A)用起到检验阳性对照作用的LPS(大肠杆菌；100ng/mL)或者以50μg/mL、20μg/mL和5μg/mL的MIS416培养人PBMC(10⁶/mL)达55小时的总培养时间。在22小时和55小时收获无细胞上清液并使用根据制造者标准流程(Bender MedSystems GmbH，维也纳，奥地利)的流式细胞仪细胞因子珠阵列技术来分析分泌的IL-10。(B)用MIS以10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL培养人PBMC(10⁶/mL)达总96小时。PMA(1nM)+离子霉素(100ng/mL)共刺激物起到检验阳性对照的作用。在24小时、48小时和72小时收集无细胞上清液并根据制造者推荐(R&D Systems Inc.明尼阿波利斯市，USA)而准确使用的市售PGE2 ELISA来分析PGE2。结果在图1中提供。

示例3-MIS416疗法降低已知的参与体液免疫和自身抗体生产的细胞因 子的血清水平

在用稀释于生理盐水的MIS416的单次静注之后的24小时和48小时，在体恤使用之前的情况下从受用单剂量MIS416的患者收获外周血血清。使用根据制造者介绍(Bender MedSystems GmbH，Vienna，Austria)的流式细胞仪珠阵列技术来确定血清中的IL-4和IL-5。结果在图2中提供。

示例4-MIS416疗法降低对白细胞运输重要的细胞粘附分子的血清水平

在MIS疗法的第1、2、3、4和12星期的MIS416用药前收集来自进展型多发硬化患者YV的肝素抗凝固外周血。从血液中收获血清并保存在-80℃直到分析。使用流式细胞仪珠阵列技术(Bender MedSystems GmbH，维也纳，奥地利)来同时分析血清样本的可溶性粘附分子sE-选择素、sICAM-1和sVCAM-1。结果在图3中提供。

示例5-用于治疗进展型多发性硬化症的MIS416疗法致使抑制疾病恶化 并改善现有的疾病症状并提高生命质量

在新西兰根据药品法，以体恤使用为基础患者可受用非授权的药物。在下面描述的进展型多发性硬化症患者的示例中，通过在生理盐水中“推注”稀释，通过单次静注作为单独的疗法而施用MIS416。受用的剂量时间表在表1中详细示出。所有的MIS416药剂在生理盐水中稀释为2ml的终体积。

表1 用于治疗患者YV的剂量方案

在6剂之后进行MRI扫描，以提供用来确定速率的任何后续改变的基础，并且进展的本质或任何其他改善可以通过MRI扫描技术来记录。最初的MRI扫描显示典型的长期进展型MS的脑和脊髓病变。患者没有知觉，并且已经超过一年无法移动她的腿和脚。获取常规的血液样本以监测患者的CPC(白细胞计数、酶等)。

治疗进展的日记

(i)在初始高剂量(1500μg)MIS416组合物之后，患者经历某些副作用，这需要再次评估生理盐水中的MIS416在未来每周施用的剂量方案。如果需要，则在使用MIS416药物时施用止痛药。

对于初始高剂量治疗的任何其他作用来讲，在施用初始剂量的MIS416组合物之后的一个星期，要求患者摇动她的脚趾并且发现她居然能做到这一点-这是一年来的首次。

(ii)第二剂以100μg的MIS416组合物施用。

患者在治疗过程中坚持做了详细的日记。

(iii)在250μg的MIS416组合物的第三剂之后，没有明显的副作用。患者在脚的顶部有更多的感觉，并且能感觉到她的脚的骨头并且觉得她的背部和腹部(她的躯干)更加有力。

原来的症状回来了-患者晚上在床上脚跟非常疼痛。

(iv)在她的第四剂MIS416组合物(350μg)之后，患者在同日遭受非常严重的头痛但是在次日感觉非常好并能感觉到她的膝盖。此外，她现在能够将她的胳膊抬过她的头。患者感到这是巨大的进步。

患者还报告说，在以前是紫色和寒冷的双手现在是温暖的和粉色的。她的脸也不再总是潮红。

(vii)在用MIS416治疗的第七剂之后，一位已经大约6个月没有见过该患者的外地亲戚深刻地感受到她的身体和精神的改善。此时患者正尝试在将近一年中首次站立！患者说，她的脚趾有不断的刺痛感，并且她能再次感觉到她的双脚上的骨头。

患者的手和脚的血液循环好多了，并且现在都一直是粉色和温暖的而不是紫色和寒冷的。患者也不再经常感冒。

她恢复了她的背上的感觉并且现在可以感觉到她的轮椅的靠背抵住了她的背。患者仍然食欲不振，并且任何原来对食物的渴望都消失了。

(viii)在MIS416的第八剂之后，患者非常激动地报告，她已经尝试全凭自己坐起来(从床上的俯卧位)，她和她的理疗师都感到惊喜。

患者继续坚持每天站立(只用一根拐杖来支撑她)，并且注意到，她站得更直了。她还不能迈步但是感觉到站得更稳了。她的脚跟还有刺烧的感觉-尤其在一只脚上。

患者还发展了背痛(因为她现在可以实实在在地感受到她的背，这在以前是她无法做到的)。她现在可以在床上伸展她的腿，这在以前是不可能的，但是仍不能在床上翻滚，尽管她经常试着这样做。

(ix)除了睡眠模式得到了改善并且她的胃口恢复了但没有特别的食物渴望以外，在MIS416的第九至第十八剂使用之后，无重要的其他变化的报告。患者继续感觉到她的脚的知觉增强并注意到她开始时刻感觉良好，特别是在施用治疗药物的随后一天。上身力量不断提高。

(x)在施用第十九剂MIS416之后，治疗方案从每周使用改变为每两周使用，以有助于进一步减少诸如头痛和腿部震颤等副作用。在第二十和第二十一剂施用之后，患者持续感觉良好并且改变后的方案似乎缓解了头痛。她睡眠很好并仍能感觉到她穿到床上的护具(harness)(她保持着背部的知觉)。当她上床时，她仍能够控制自己。

(xi)在MIS416的最后三剂之后，患者注意到她的脚的进一步改善：她能够感受到诸如冷和热的在她脚上的适当知觉。此前她感到麻木并没有什么知觉，然后感觉恢复了，在刺烧的脚跟之后是刺痛，现在她对局部条件具有响应的全脚知觉。

患者感觉到她站立得稍微更稳并觉得比以前站得更好。继续感觉她的上身有力。因为她有足够的力量来抬起双臂，所以她现在可以自己烘干头发。她可以在“不跌入水槽”的情况下洗碗。她仍有上身虚弱的问题但改善了很多。

患者报告说，MIS治疗前她存在的用一只眼睛聚焦的困难似乎在MIS的第一剂之后得到解决，现在这只眼睛聚焦正常。

患者感觉非常积极并确信她正在慢慢改善。

表2：MIS416治疗之后的改善概括

在疗法开始之后的6个月进行后续的MRI扫描。注意到的是，在以前的扫描中记录的大量的MS病变稳定，没有发现进一步的病变。

示例6-在用MDP微粒体外刺激之后的浆细胞样树突状细胞的免疫调节I 型干扰素的诱导

利用BDCA-2+细胞的磁珠选择性从PBMC中纯化人pDC-有效的产生INF-α的细胞。用MDP微粒或TLR9 A型配体作为检测阳性对照来培养(完全培养基+5％Ab血清)分选的细胞(10⁶/ml)。使用流式细胞仪细胞因子珠阵列方法来检测培养上清物中的INFα成分。图4所示的结果表明INFα的Pdc剂量-应答诱导，INFα是为某些多发性硬化症提供疗效的细胞因子。

示例7-通过MDP微粒共培养的同种异型抗原诱导T细胞增殖的抑制

为了模拟抗原诱导T细胞增殖，建立了双向混合的淋巴细胞反应。获得来自MHCI和MHCII错配供体的PBMC。使用被称作CFSE染料(Invitrogen，美国)的细胞分裂荧光指示剂染料来标记一群(应答者)，而另一群保持为未标记(刺激者)。在存在或不存在已知的T细胞共刺激因子-可溶性CD40L的情况下在存在10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mLMDP微粒时将相等细胞数量的刺激者和应答者其同培养5天。用活性染料(碘化丙啶；Invitrogen，美国)来标记细胞，并且荧光抗体与CD3细胞(Sigma-Aldrich NZ Ltd，奥克兰，新西兰)反应。用流式细胞仪分析细胞并且基于CFSE/CD3荧光来识别活着的应答T细胞。由于与非增殖对照进行比较通过减少的CFSE荧光指示，所以可以确定划分的百分比。如图5所示，在没有或存在T细胞共刺激因子的情况下MDP微粒抑制同种异型抗原诱导的T细胞增殖。这表明MDP微粒还可能够调节与多发性硬化症相关的自体抗原诱导T细胞增殖。

示例8-疾病诱导时MDP微粒治疗延缓了复发-缓解型多发性硬化症鼠模 型中的疾病的发病率和发生率

用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽(Sigma-Aldrich NZ Ltd，奥克兰，新西兰)和弗氏佐剂皮下注射(s.c.)免疫小鼠(n＝5)，之后在第二天腹腔注射(i.p.)百日咳毒素。在MOG+弗氏佐剂免疫的同时静脉注射(i.v)施用MDP微粒(250μg)。对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)发病率(图6A)和疾病得分进行测定(图6B)。用疾病评分来计算疾病负担(曲线下面积；AUC；图6B)和最大的疾病的得分(图6C)。这些结果表明，在用弗氏佐剂中的MOG肽皮下注射免疫的同时静脉注射MDP微粒随后在第二天腹腔注射百日咳毒素延缓了发作并减小了疾病的发生率。作为总的疾病负担的或者“承受”的指标的AUC测定表明未治疗的动物的值为31，该值对于MDP微粒治疗动物降低到11.9。最大疾病得分在治疗组中也显著降低。

示例9-在EAE诱导前的MDP微粒治疗提高了复发-缓解型多发性硬化症 的鼠模型中的自发恢复期

在如示例8中描述的复发-缓解型模型中，在EAE诱导前三天，用静脉注射250μgMDP微粒来治疗小鼠(n＝5)，并且确定疾病得分。在从发生的峰值得分由a＞1.0的下降并且保持稳定的那天被定义为恢复。如图7所示，用MDP微粒的预治疗表现出与未治疗的小鼠相比的自发恢复期的发生率的显著增大，未治疗的小鼠在所监测的时间周期中未表现出恢复。这些结果表明MDP微粒疗法具有调节与正在发生的、活性疾病相关的多发性硬化症的严重性或限制症状的能力。

示例10-长期MDP微粒(MIS416)疗法将对于白细胞输送重要的细胞粘 附分子保持在降低的血清水平

如示例4中所述获得患者YV的样本并且进行持续的MIS416治疗达32周。评估包括第1周到第32周的样本，以确定在第12周检测的可溶性粘附分子sE-选择素、sICAM-1和sVCAM-1的下降的水平是否在MIS416疗法中保持。使用流式细胞仪珠阵列技术(Bender MedSystems GmbH，维也纳，奥地利)来同时分析血清样本的可溶性粘附分子sE-选择素、sICAM-1和sVCAM-1。结果在图8中提供。这些结果显示32周的长期MIS416疗法导致白细胞运输分子的先前升高的水平持续下降。

示例11-在重复实验中EAE疾病诱导时MDP微粒治疗延缓了疾病的发作 和严重性并降低了疾病的发生率

与示例8完全相同地在小鼠(n＝5)中诱导EAE。在MOG+弗氏佐剂免疫来诱导EAE的同时静脉注射(i.v)施用MDP微粒(250μg)。对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)发病率和疾病得分进行测定(图9A)。示出了累计发病率的百分比(图9B)。用疾病评分来计算最大的疾病得分(图10)。这些结果进一步表明，在用弗氏佐剂中的MOG肽皮下注射免疫的同时静脉注射施用MDP微粒随后在第二天腹腔注射百日咳毒素延缓了发作并减小了疾病的发生率，与未治疗的动物相比，还显著降低了治疗组中的最大疾病得分。

示例12-EAE疾病诱导时的MDP微粒治疗提高了外周血血清中的IFN-γ 水平

从在示例8和示例9研究的小鼠中于第0、4、8、16和30天通过小鼠眼窝采血获得血液样本。通过离心来分离血清。使用对小鼠IFN-γ特异的流式细胞仪珠阵列(Bender MedSystems)来确定IFN-γ的水平。如图11A和图11B所示，MDP微粒疗法诱导高水平的IFN-γ，已知高水平的IFN-γ降低鼠复发-缓解型EAE模型中的疾病的严重性。

示例13-EAE疾病诱导时的MDP微粒治疗增大了疾病诱导后22天的外 周血单核细胞的绝对数量

在EAE诱导后的第22天通过眼窝采血从小鼠获得血液样本。使用具有痕量的龙胆紫(Sigma Aldrich)的2％的醋酸在血球计上对准备的样本进行总白血细胞(WBC)计数。使用在载玻片上你散的血滴和随后的姬姆萨染色(Sigma Aldrich)来确定单核细胞的百分比(白血细胞差)。使用显微镜来观察载玻片并确定总WBC中单核细胞的百分比。为了计算实际的单核细胞的绝对数量，用WBC乘以单核细胞的百分比。与未治疗的小鼠相比，MDP微粒治疗的动物中的单核细胞的绝对数量显著增大(图12)。

尽管参照优选的实施例和特定的示例描述了本发明，但是要理解的是，在这里描述的本发明要旨和精神内的修改和改变是可以构思出的并落入本发明的范围。

Claims (14)

1.一种治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括对需要包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物治疗的对象的施用。

2.一种治疗多发性硬化症的症状的方法，所述方法包括对需要包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物治疗的对象的施用。

3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括一种或多种其他在治疗多发性硬化症中有效的活性剂的施用。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，要治疗的多发性硬化症的类型选自于进展型多发性硬化症和复发-缓解型多发性硬化症。

5.如权利要求4所述的方法，其中，进展型多发性硬化症选自于原发进展型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症或慢性进展型多发性硬化症。

6.如权利要求4所述的方法，其中，要治疗的多发性硬化症的类型是复发-缓解型多发性硬化症。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，通过选自于肌肉注射、腹腔给入、静脉注射、皮下注射、直肠给入、鼻给入、口服，经胃给入、经肺给入的方法来将所述组合物施用到对象。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，通过输液或注射将所述组合物施用到对象。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，施用到对象的组合物的剂量范围在50μg至1500μg。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，每日、每周、每两周或每月将所述组合物施用到对象。

11.如权利要求3所述的方法，其中，将一种或多种用在治疗多发性硬化症中的其他活性剂与包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物同时施用，或者以任意顺序顺序地施用。

12.如权利要求11所述的方法，其中，用在治疗多发性硬化症中的一种或多种其他活性剂选自于皮质类固醇激素、干扰素、醋酸格拉替雷、米托蒽醌、抗体或者它们的组合。

13.用于治疗多发性硬化症及其症状的交联到微粒的胞壁酰二肽或包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物。

14.用于协同治疗多发性硬化症的交联到微粒的胞壁酰二肽或者包含交联到微粒的胞壁酰二肽的组合物。

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