CN102439162A

CN102439162A - 利用萃取发酵生产丁醇的方法

Info

Publication number: CN102439162A
Application number: CN2010800167118A
Authority: CN
Inventors: M·C·格拉迪; J·W·哈拉姆; M·加希克; R·帕特奈克
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2009-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2012-05-02
Also published as: US20110097773A1; EP2419517A2; ZA201106849B; WO2010119339A2; JP2012523245A; BRPI1006492A2; WO2010119339A3; CA2756538A1

Abstract

提供了通过微生物发酵生产丁醇的方法，该方法中丁醇产物通过向包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂组合物中萃取而被移除。所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物。所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、以及它们的混合物。还提供了从发酵培养基回收丁醇的方法。

Description

利用萃取发酵生产丁醇的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求均于2009年4月13日提交的美国临时申请61/168640、61/168642、和61/168645和均于2009年8月6日提交的美国临时申请61/231,697、61/231698、和61/231699的优先权。以上引用的每一申请全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及生物燃料领域。更具体地讲，本发明涉及通过微生物发酵生产丁醇的方法，其中，丁醇产品通过在发酵期间萃取至一种不能与水混溶的萃取剂组合物而被除去，其中所述萃取组合物包含第一溶剂和第二溶剂。

发明背景

丁醇是一种重要的工业化学品，其具有多种用途，例如用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和食用香料工业中用作食品级的萃取剂。每年，通过石油化工手段生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求可能还会增加。

有若干种化学合成方法是已知的。然而，这些生产丁醇的方法利用来源于石油化工产品的原料，并且普遍成本高昂和有害生态环境。若干种通过发酵生产丁醇的方法同样是已知的，例如ABE方法，这种发酵方法产生一种丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)进行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵是已知最古老的工业发酵之一；负责产生这些溶剂的途径和基因也同样如此。通过ABE方法进行的1-丁醇生产受1-丁醇对丙酮丁醇梭菌的毒性效应限制。已有报导称，利用对细菌无毒的特定萃取剂的原位萃取发酵方法提高了用丙酮丁醇梭菌发酵进行的1-丁醇生产(例如参见Roffler等人，Biotechnol.Bioeng.31：135-143，1988；Roffler等人，Bioprocess Engineering 2：1-12，1987，和Evans等人，Appl.Environ.Microbiol.54：1662-1667，1988)。

与上述野生型的丙酮丁醇梭菌不同，重组的表达宿主菌还被报导表达1-丁醇、2-丁醇和异丁醇的生物合成途径。这些重组的宿主具有以比ABE方法更高的产量生产丁醇的潜能，因为它们不产生诸如丙酮和乙醇这样的副产品。使用这些重组的宿主时，丁醇的生物生产似乎受限于丁醇对发酵中所用宿主微生物的毒性阈值。美国专利公布20090305370公开了从至少一种可发酵的碳源生产丁醇的方法，通过利用一种重组的微生物宿主进行发酵，其中在发酵过程中丁醇被萃取至特定的有机萃取剂中，所述方法克服了毒性问题，导致丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量的提升。

用于从发酵培养基生产和回收丁醇的改进的方法在不断地被寻求。同样期望找到低成本的方法和对工艺可操作性的改进。不断地需要鉴定用于发酵培养基的改良的萃取剂，例如表现出更高的分配系数、更低的粘度、更低的密度、商业上有用的沸点、和充分的微生物生物相容性的萃取剂。

发明概述

本文提供的是从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供发酵培养基，所述发酵培养基包含丁醇、水、至少一种可发酵的碳源、和从包含至少一种可发酵的碳源的发酵培养基生产丁醇的经基因修饰的微生物；

b)使所述发酵培养基与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂组合物接触，其中所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂至C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

c)将所述含丁醇的有机相与所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

还提供了用于生产丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供从包含至少一种可发酵的碳源的发酵培养基生产丁醇的经基因修饰的微生物；

b)在包含水相和不能与水混溶的萃取剂组合物的双相发酵培养基中，使所述微生物生长足以令丁醇被萃取至所述萃取剂组合物中的时间从而形成含丁醇的有机相，其中所述萃取剂组合物包含第一溶剂和第二溶剂，所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂至C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，其中所述双相发酵培养基包含按体积计从约10％至约90％的所述不能与水混溶的萃取剂组合物；

c)将所述含丁醇的有机相与所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

还提供了用于生产丁醇的方法，所述方法包括：

b)使上述微生物在发酵培养基中生长，其中上述微生物将丁醇产生到所述发酵培养基中以制得含丁醇的发酵培养基；

c)使所述含丁醇的发酵培养基的至少一部分与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂组合物接触，其中所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂至C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

d)将所述含丁醇的有机相与所述水相分离；

e)从所述含丁醇的有机相回收丁醇；以及

f)使所述水相的至少一部分返回至所述发酵培养基。

在实施方案中，所述丁醇为1-丁醇。在实施方案中，所述丁醇为2-丁醇。在实施方案中，所述丁醇为异丁醇。

在实施方案中，所述第一溶剂选自油醇，二十二醇，鲸蜡醇，月桂醇，肉豆蔻醇，硬脂醇，油酸，月桂酸，肉豆蔻酸，硬脂酸，肉豆蔻酸甲酯，油酸甲酯，月桂醛，1-十二烷醇，以及它们的组合。在实施方案中，所述第一溶剂包含油醇。

在实施方案中，所述第二溶剂选自1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、2-十一烷醇、1-壬醛，和它们的组合。在实施方案中，所述第二溶剂选自1-壬醇、1-癸醇、1-壬醛、和它们的组合。在实施方案中，所述第二溶剂包含1-癸醇。在实施方案中，所述第一溶剂包含油醇，并且所述第二溶剂包含1-癸醇。

在实施方案中，所述萃取剂包含按所述第一和第二溶剂的总体积计约30％至约90％的第一溶剂。在实施方案中，所述萃取剂包含约50％至约70％的第一溶剂。在实施方案中，所述萃取剂与发酵培养基的比率为从约1∶20至约20∶1的体积∶体积比。

在实施方案中，所述接触进一步包括在使所述发酵培养基和第一溶剂与第二溶剂接触之前，使所述发酵培养基与第一溶剂接触。在实施方案中，所述与第二溶剂的接触和所述与第一溶剂的接触在相同的容器中发生。在实施方案中，所述丁醇的一部分通过包括以下步骤的方法同时从所述发酵培养基中被移除：

a)用气体从所述发酵培养基中汽提丁醇，以形成含丁醇的气相；以及

b)从所述含丁醇的气相回收丁醇。

在实施方案中，所述经基因修饰的微生物选自细菌、蓝细菌、丝状真菌、和酵母。在实施方案中，细菌选自发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、和短杆菌属(Brevibacterium)。在实施方案中，所述细菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌包含：a)编码异丁醇生物合成途径的一组基因；和b)下列基因的删除：pflB、LdhA、adhE，以及frdA，frdB，frdC、和FrdD中的至少一种。在实施方案中，所述一组基因包括：a)如SEQ ID NO：1所示的budB；b)如SEQ ID NO：3所示的ilvC；c)如SEQ ID NO：5所示的ilvD；d)如SEQ ID NO：7所示的kivD；和e)如SEQ ID NO：9所示的sadB。在实施方案中，所述酵母选自伊萨酵母属(Issatchenkia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)。

在实施方案中，所述经基因修饰的微生物包含丁醇生物合成途径。在实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含至少一种对所述微生物是异源的基因。在实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含至少两种对所述微生物是异源的基因。

在实施方案中，所述发酵培养基进一步包含乙醇，并且所述含丁醇的有机相包含乙醇。

还提供了包含发酵培养基的双相混合物，所述发酵培养基包含丁醇、水、至少一种可发酵的碳源、和从发酵培养基生产丁醇的经基因修饰的微生物；和不能与水混溶的萃取剂组合物，所述萃取剂组合物包含第一溶剂和第二溶剂，所述第一溶剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物，并且所述第二溶剂选自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、C12-C22脂肪酰胺以及它们的混合物。

附图简述和序列描述

图1是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中在使发酵培养基与萃取剂在发酵容器中接触之前，组成所述萃取剂的第一溶剂和第二溶剂在容器中被合并。

图2是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中组成所述萃取剂的第一溶剂和第二溶剂被分别添加至发酵容器，发酵培养基在该容器中与所述萃取剂接触。

图3是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中组成所述萃取剂的第一溶剂和第二溶剂被分别添加至用于使发酵培养基与所述萃取剂接触的不同发酵容器中。

图4是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且在使发酵培养基与萃取剂在一个不同容器中接触之前，组成所述萃取剂的第一溶剂和第二溶剂在容器中被合并。

图5是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且组成所述萃取剂的第一溶剂和第二溶剂被分别添加至容器中，发酵培养基在该容器中与所述萃取剂接触。

图6是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且组成所述萃取剂的第一溶剂和第二溶剂被分别添加至用于使发酵培养基与所述萃取剂接触的不同容器中。

图7是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在至少一个分批发酵罐中进行，通过与发酵醪液底部或接近底部处的(使发酵罐充满萃取剂)包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂共流，其中所述萃取剂在该发酵罐的顶部或接近顶部处的一点流出该发酵罐。

下列序列符合37C.F.R.1.821 1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(bis规则)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。

表1

基因和蛋白质SEQ ID号汇总

SEQ ID NO：11至22系用于构建下文的经基因修饰的微生物部分所描述的重组大肠杆菌菌株的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：23系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的pflB基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的ldhA基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的adhE基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdA基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdB基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdC基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdD基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30系pLH475-Z4B8的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31系CUP1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34系CYC1终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35系ILV5启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：38系ILV5终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：39系FBA1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：42系pLH468的核苷酸序列。

SEQ ID NO：47系pNY8的核苷酸序列。

SEQ ID NO：48系GPD1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：49、50、54、55、62-71、73-83和85-86系实施例中所用的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：51系pRS425::GPM-sadB的核苷酸序列。

SEQ ID NO：52系GPM1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：53系ADH1终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：56系pRS423FBA ilvD(链球菌的)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：57系FBA终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：60系GPM-sadB-ADHt片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：61系pUC19-URA3r的核苷酸序列。

SEQ ID NO：72系ilvD-FBA1t片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：84系URA3r2模板DNA的核苷酸序列。

发明详述

本发明提供了通过萃取至不能与水混溶的萃取剂组合物，从微生物发酵培养基中回收丁醇的方法。所使用的方法涉及使发酵培养基与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂组合物接触，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。所述第一和第二溶剂是经过选择的，以使萃取剂具有高的丁醇分配系数，同时减轻生物相容性的任何降低。所述含丁醇的有机相被与所述水相分离并且丁醇被回收。还提供了生产丁醇的方法。

定义

在本公开中使用了下列定义。

术语“不能与水混溶的”是指不能与水溶液如发酵培养基混合形成一种液相的萃取剂或溶剂混合物。

如本文所用，术语“萃取剂”是指被用于萃取任何丁醇异构体的、含有至少两种有机溶剂的混合物。

术语“双相发酵培养基”是指包含一种发酵培养基(即水相)和一种适当量的不能与水混溶的有机萃取剂的双相生长培养基。

如本文所用，术语“有机相”是指通过使含水的发酵培养基与不能与水混溶的有机萃取剂接触获得的双相混合物的相，其包含所述有机萃取剂。

如本文所用，术语“水相”是指通过使含水的发酵培养基与不能与水混溶的有机萃取剂接触获得的双相混合物的包含水的相。

术语“丁醇”是指1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、或它们的混合物。异丁醇也被称为2-甲基-1-丙醇。

术语“可发酵的碳源”是指能被微生物代谢的碳源，所述微生物例如本文所公开的那些。适当的可发酵的碳源包括但不限于：单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉、纤维素、或木质纤维素、半纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。

本文所用术语“脂肪酸”是指具有一条C₇-C₂₂碳原子的长脂肪链的羧酸，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文所用术语“脂肪醇”是指具有一条C₇-C₂₂碳原子的长脂肪链的醇，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文所用术语“脂肪醛”是指具有一条C₇-C₂₂碳原子的长脂肪链的醛，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文所用术语“脂肪酰胺”是指具有一条C₁₂-C₂₂碳原子的长脂肪链的酰胺，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文中所写为K_p的术语“分配系数”，是指一种化合物在两种不能混溶的溶剂的混合物的两相中平衡时的浓度的比率。分配系数是化合物在两种不能混溶的溶剂中不同的溶解度的量度。如本文所用，术语“丁醇的分配系数”是指包含发酵培养基的水相和包含萃取剂的有机相之间丁醇浓度的比率。如本文所用，分配系数与术语分布系数同义。

本文所用术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的酶途径。

本文所用术语“1-丁醇生物合成途径”是指从乙酰-辅酶A(acetyl-CoA)产生1-丁醇的酶途径。

本文所用术语“2-丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。

本文所用术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。

术语“基因”指能够被表达为特定蛋白的核酸片段，任选地包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外源基因”或“异源基因”指宿主生物中通常不存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。

本文所用术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的丁醇的总量。丁醇的总量包括发酵培养基中丁醇的量和从有机萃取剂组合物中，以及当采用了汽提时从气相中所回收的丁醇的量。

本文所用术语“有氧条件”是指有氧气存在下的生长条件。

本文所用术语“微氧条件”是指有低水平的氧气(即低于正常的大气氧气水平)存在的生长条件。

本文所用术语“厌氧条件”是指不存在氧气的生长条件。

本文所用术语“基本培养基”是指包含能容许生长的最低限度的营养物质的生长培养基，其通常不含氨基酸。基本培养基典型地包含一种可发酵的碳源和多种可随微生物和生长条件的不同而不同的盐；这些盐通常提供了必需元素如镁、氮、磷和硫，从而允许微生物合成蛋白质和核酸。

本文所用术语“组合培养基”，是指所有成分的量均已知的生长培养基，例如，微生物所需的碳源、氮源以及痕量元素和维生素均为确定的。

本文所用术语“生物相容性”是指微生物萃取剂的存在下利用葡萄糖的能力的量度。生物可相容的萃取剂允许微生物利用葡萄糖。生物不相容的(即，生物毒性的)萃取剂不允许微生物利用葡萄糖，例如以比当该萃取剂不存在时的速率的25％更高的速率。

术语“℃”是指摄氏度。

术语“OD”是指光密度。

术语“OD₆₀₀”是指波长为600nm时的光密度。

术语ATCC是指美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州。

术语“sec”是指秒。

术语“min”是指分钟。

术语“h”是指小时。

术语“mL”是指毫升。

术语“L”是指升。

术语“g”是指克。

术语“mmol”是指毫摩尔。

术语“M”是指摩尔浓度。

术语“μL”是指微升。

术语“μg”是指微克。

术语“μg/mL”是指微克每升。

术语“mL/min”是指毫升每分钟。

术语“g/L”是指克每升。

术语“g/L/h”是指克每升每小时。

术语“mmol/min/mg”是指毫摩尔每分钟每毫克。

术语“temp”是指温度。

术语“rpm”是指每分钟转数。

术语“HPLC”是指高压液相色谱法。

术语“GC”是指气相色谱法。

申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，它应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。

丁醇生物合成途径

用于生产丁醇的适当的生物合成途径是本领域中已知的，并且某些适当的途径描述于本文中。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含至少一种对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含一种以上对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含异源基因，所述异源基因编码的多肽对应于生物合成途径的每一步骤。

同样地，本文描述了具有催化所指示的底物向产物的转化的能力的某些适当的蛋白质，并且本领域中提供了其他适当的蛋白质。例如，公布的美国专利申请US20080261230和US20090163376(以引用方式并入本文)描述了乙酰羟酸异构还原酶；美国专利申请12/569,636(以引用方式并入本文)描述了二羟酸脱水酶；一种醇脱氢酶描述于公布的美国专利申请US20090269823(以引用方式并入本文)中。

1-丁醇生物合成途径

Donaldson等人在美国专利申请公布US20080182308A1(以引用方式并入本文)中描述了用于生产1-丁醇的一种可被使用的生物合成途径。该生物合成途径包括以下底物至产物的转化：

a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化；

b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA，其可被例如3-羟丁酸-CoA脱氢酶催化；

c)3-羟丁酸-CoA至丁烯酰-CoA，其可被例如巴豆酸酶催化；

d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA，其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化；

e)丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；和

f)丁醛至1-丁醇，其可被例如1-丁醇脱氢酶催化。

在一些实施方案中，所述1-丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因、至少四种基因、或至少五种基因。

2-丁醇生物合成途径

Donaldson等人在美国专利申请公布US20070259410A1和US20070292927A1中，以及在PCT公开WO 2007/130521中描述了可被使用的用于生产2-丁醇的生物合成途径，这些专利均以引用方式并入本文。一种2-丁醇生物合成途径包括以下底物至产物的转化：

a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；

c)乙偶姻至2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；

d)2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如丁二醇脱水酶催化；和

e)2-丁酮至2-丁醇，其可被例如2-丁醇脱氢酶催化。

在一些实施方案中，所述2-丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因、或至少四种基因。

异丁醇生物合成途径

可被使用的用于生产异丁醇的生物合成途径描述于美国专利申请公布US20070092957A1和PCT公开WO 2007/050671中，上述专利以引用方式并入本文。一种异丁醇生物合成途径包括以下底物至产物的转化：

a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸催化；

c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；

d)α-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如支链酮酸脱羧酶催化；和

e)异丁醛到异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。

在一些实施方案中，所述异丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因、或至少四种基因。

经基因修饰的微生物

用于生产丁醇的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。所使用的微生物宿主应能耐受所产生的丁醇产物，以使产量不受产物对宿主的毒性限制。用于丁醇生产的一种微生物宿主的选择详述如下。

在高滴度水平的丁醇存在下具有代谢活性的微生物并不为本领域所熟知。尽管已从产溶剂梭菌(solventogenic Clostridia)中分离了丁醇耐受性突变体，但有关其他潜在可用的细菌菌株的丁醇耐受性方面的信息几乎没有。关于细菌中醇耐受性的比较的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(de Cavalho等人，Microsc.Res.Tech.64：215-22(2004)和Kabelitz等人，FEMS Microbiol.Lett.220：223-227(2003))。Tomas等人(J.Bacteriol.186：2006-2018(2004))报导称丙酮丁醇梭菌在发酵过程中的1-丁醇产量可能受丁醇毒性限制。1-丁醇对丙酮丁醇梭菌的主要影响是破坏膜功能(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.50：1238-1243(1985))。

被选用于丁醇生产的微生物宿主应能耐受丁醇，并应能利用引入的生物合成途径将碳水化合物转化为丁醇，如下所述。选择合适微生物宿主的标准包括如下：对丁醇的内在耐受，高效率的碳水化合物利用，用于基因操作的遗传工具的可用性，以及产生稳定的染色体变化的能力。

对丁醇具有耐受性的适当的宿主菌株，可以通过基于该菌株的内在耐受性的筛选而得到鉴定。微生物对丁醇的内在耐受性，可以通过测定当其于一种基本培养基中生长时，导致生长速率被抑制50％的丁醇浓度(IC50)而得到测量。IC50值可以利用本领域已知的方法来确定。例如，可以在不同量的丁醇的存在下培养所感兴趣的微生物，并通过测量600纳米下的光密度监测生长速率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生长率的量度。导致生长受到50％抑制的丁醇浓度，可以通过生长受抑制的百分比对丁醇浓度的作图而得到测定。优选地，宿主菌株应具有大于约0.5％的丁醇的IC50。更适合的宿主菌株具有大于约1.5％的丁醇的IC50。尤其适合的宿主菌株具有大于约2.5％的丁醇的IC50。

用于丁醇生产的微生物宿主还应以高效率利用葡萄糖和/或其他碳水化合物。大多数微生物都能够利用碳水化合物。但是，某些环境微生物不能有效地利用碳水化合物，因此不是适当的宿主。

在基因方面修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。可使用的转基因技术的模式包括电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标记。用于一种微生物的克隆载体系基于能在该宿主微生物中起作用的抗生素抗性标记的性质而针对该宿主特别设计的。

微生物宿主还可以是经过调控，以通过使多个基因失活而使碳流的竞争性途径失活的。这需要有转座子或染色体整合载体来指导失活作用。此外，能经受化学诱变的生产宿主还可通过进行化学诱变和突变体筛选获得对丁醇的内在耐受性方面的改进。

基于上述标准，用于生产丁醇的适当的微生物宿主包括但不限于发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)的成员。优选的宿主包括：大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、恶臭假单胞菌(Rhodococcus erythropolis)、红串红球菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和啤酒糖酵母(S accharomyces cerevisiae)。

上述微生物可以是用本领域已知的方法进行过基因修饰，以将可发酵的碳源转化为丁醇的，其中所述丁醇具体而言包括1-丁醇、2-丁醇或异丁醇。尤其适合的微生物包括埃希氏菌属、乳杆菌属、和糖酵母属，其中大肠杆菌、植物乳杆菌和啤酒糖酵母是尤其优选的。此外，所述微生物还可以是以上所列微生物之一的用Bramucci等人所述的方法(美国专利申请11/761497；和WO 2007/146377)分离的丁醇耐受的菌株。一种这样的菌株的例子是植物乳杆菌菌株PN0512(ATCC：PTA-7727，于2006年7月12日因美国专利申请11/761497进行生物保藏)。

经基因修饰从而能将可发酵的碳源转化为丁醇的微生物可以是重组的大肠杆菌菌株，该菌株包含：异丁醇生物合成途径；对下列基因的删除以去除限制异丁醇生产的竞争性途径，列为SEQ ID NO：23的pflB(编码丙酮酸甲酸裂解酶)，列为SEQ ID NO：24的IdhA(编码乳酸脱氢酶)，列为SEQ ID NO：25的adhE(编码乙醇脱氢酶)；以及至少一种包含frdABCD操纵子(编码延胡索酸还原酶)的基因，具体而言，列为SEQ ID NO：26的frdA，列为SEQ ID NO：27的frdB，列为SEQ ID NO：28的frdC和列为SEQ ID No：29的frdD。

所述大肠杆菌菌株可包含：(a)由下列基因编码的异丁醇生物合成途径：来自肺炎克雷伯氏菌的budB(列为SEQ ID NO：1)，其编码乙酰乳酸合酶(列为SEQ ID NO：2)，来自大肠杆菌的ilvC(列为SEQ ID NO：3)，其编码乙酰羟酸还原异构酶(列为SEQ ID NO：4)，来自大肠杆菌的ilvD(列为SEQ ID NO：5)，其编码乙酰羟酸脱水酶(列为SEQ ID NO：6)，来自乳酸乳球菌的kivD(列为SEQ ID NO：7)，其编码支链酮酸脱羧酶(列为SEQ ID NO：8)，以及来自木糖氧化无色杆菌的sadB(列为SEQ ID NO：9)，其编码一种丁醇脱氢酶(列为SEQ ID NO：10)；以及(b)对下列基因的删除：pflB(SEQ ID NO：23)，ldhA(SEQ ID NO：24)，adhE(SEQ ID NO：25)，和frdB(SEQ ID NO：27)。所述异丁醇生物合成途径的基因所编码的酶，催化底物向产物的转化，以将丙酮酸转换为异丁醇，如上所述。具体而言，乙酰乳酸合酶催化丙酮酸向乙酰乳酸的转化，乙酰羟酸还原异构酶催化乙酰乳酸向2，3-二羟基异戊酸的转化，乙酰羟酸脱水酶催化2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的转化，支链酮酸脱羧酶催化α-酮异戊酸向异丁醛的转化，丁醇脱氢酶催化异丁醛向异丁醇的转化。所述重组的大肠杆菌菌株可以采用本领域已知的方法(参见美国专利申请公布20090305370A1和20090305369A1)构建，如下文中所述。

重组的大肠杆菌菌株NGCI-031的构建

可如下所述构建重组的大肠杆菌菌株，所述菌株包含异丁醇生物合成途径和对下列基因的删除：pflB(SEQ ID NO：23，编码丙酮酸甲酸裂解酶)，ldhA(SEQ ID NO：24，编码乳酸脱氢酶)，adhE(SEQID NO：25，编码乙醇脱氢酶)，以及frdB(SEQ ID NO：27，编码延胡索酸还原酶的一个亚基)。上述异丁醇生物合成途径中的基因为：来自肺炎克雷伯氏菌的budB(列为SEQ ID NO：1)，来自大肠杆菌的ilvC(列为SEQ ID NO：3)，来自大肠杆菌的ilvD(列为SEQ IDNO：5)，来自乳酸乳球菌的kivD(列为SEQ ID NO：7)，以及来自木糖氧化无色杆菌的sadB(列为SEQ ID NO：9)。上述重组菌株的构建可通过两步完成。首先，构建了一种具有前述基因删除的大肠杆菌菌株。然后，将编码上述异丁醇生物合成途径的基因引入该菌株。

具有pflB、ldhA、adhE和frdB基因删除的重组大肠杆菌菌株的构建。

大肠杆菌的Keio菌株集(Baba等人，Mol.Syst.Biol.，2：1-11，2006)可被用于构建具有目的基因删除的大肠杆菌菌株，所述菌株在本文中称为四重敲除大肠杆菌菌株。Keio菌株集是用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.976640-6645，2000)在大肠杆菌菌株BW25113中构建的一个单基因敲除库。在该菌株集中，每个删除的基因被FRT侧接的卡那霉素标记取代，所述标记可被Flp重组酶移除。通过将上述敲除-卡那霉素标记从Keio供体菌株转移至一种受体菌株，构建了上述四重敲除的大肠杆菌菌株，其中所述转移通过P1转导进行。在每次产生了一个敲除的P1转导之后，通过Flp重组酶移除了上述卡那霉素标记。这种无标记的菌株作为新供体菌株用于接下来的P1转导。

所述四重敲除的大肠杆菌菌株可通过P1_vir转导在Keio菌株JW0886中构建，所述转导用自JW0886以及另外三种Keio菌株制备的P1噬菌体溶菌产物进行。所用的Keio菌株如下：

-JW0886：kan标记被插入至pflB基因

-JW4114：kan标记被插入至frdB基因

-JW1375：kan标记被插入至ldhA基因

-JW1228：kan标记被插入至adhE基因

P1_vir转导可如Miller所述通过一些修改形式进行(Miller，J.H.1992.A Short Course in Bacterial Genetics.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y)。简而言之，供体菌株的细胞在Luria-Bertani(LB)培养基中于37℃振荡培养过夜，以制备转导溶菌产物。在包含0.005M CaCl₂的LB培养基中，并置于不通气的37℃水浴中，对生长过夜的细胞进行继代培养。在加入噬菌体之前一小时，将细胞于37℃振荡孵育。在上述细胞进行最后的生长之后，将一份1.0mL的等分试样分配至14mL管中，并加入大约10⁷P1_vir噬菌体。将上述管在37℃水浴中孵育20min，然后向每管中加入2.5mL的0.8％LB上层琼脂。将上述管中的内容物涂布于一块LB琼脂板上，并于37℃孵育。之后一天将软琼脂层刮到离心管中。用LB培养基清洗板的表面并加入至上述离心管中，加入几滴CHCl₃，然后用涡旋搅拌器剧烈振荡离心管。在4,000rpm离心10分钟后，收集包含P1_vir溶菌产物的上清液。

将受体菌株在1-2mL的LB培养基中于37℃振荡培养过夜，以用于转导。通过在微型离心机中离心使培养物沉淀，例如以10,000rpm室温离心1min。上述细胞沉淀被重悬于等体积的MC缓冲液(0.1MMgSO₄，0.005M CaCl₂)中，并以0.1mL的等分试样被分配至管中，然后加入0.1mL和0.01mL的P1_vir溶菌产物。实验还可包括不含P1_vir溶菌产物的对照管。将上述管于37℃孵育20min，之后加入0.2mL0.1M柠檬酸钠以终止P1感染。向每管中加入1mL LB培养基，然后于37℃孵育1h。孵育之后如上所述使细胞沉淀，再重悬于50-200μL的LB中，然后涂布于含25μg/mL的卡那霉素的LB平板上，于37℃培养过夜。通过菌落PCR能够对转导体进行筛选，所述PCR采用包围了上述卡那霉素标记插入上游和下游区域的染色体特异性引物。

可通过用质粒pCP20(Cherepanov，P.and Wackernagel，W.，Gene，158：9-14，1995)转化上述卡那霉素-抗性菌株，然后涂布于LB氨苄青霉素(100μg/mL)平板并置于30℃孵育，实现上述卡那霉素标记自染色体上的移除。上述pCP20质粒携带受λ_PR启动子控制的酵母FLP重组酶。来自该启动子的表达受位于该质粒上的cI857温度敏感的阻遏子控制。pCP20的复制起点同样是温度敏感的。将氨苄青霉素抗性菌落在LB琼脂板上划线，并于42℃孵育。较高的孵育温度同时诱导FLP重组酶的表达和从细胞中清除pCP20质粒。分离的菌落以网格方式接种至包含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板、LB氨苄青霉素(100μg/mL)平板和LB平板。可通过菌落PCR对得到的卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落进行筛选，以确认从染色体中移除了卡那霉素标记。

菌落PCR扩增可使用HotStarTaq Master Mix(Qiagen，Valencia，CA；目录号71805-3)按照制造商规程进行。在一个25μL Master Mix反应中包含每种染色体特异性PCR引物0.2μM，并加入了少量的一种菌落。扩增可在DNA热循环仪GeneAmp 9700(PE Applied Biosystems，Foster city，CA)中进行。典型的菌落PCR条件为：95℃15min；95℃30sec，50-58℃范围的退火温度30sec，引物在72℃按照约1min/kbDNA的时间延伸，30个循环；72℃10min，然后将温度保持在4℃。PCR产物的大小可通过凝胶电泳和与已知分子量的标准品的比较确定。

可如Ausubel，F.M.等人(Current Protocols in Molecular Biology，1987，Wiley-Interscience，)所述制备电感受态的大肠杆菌细胞，以用于转化。细胞生长于25-50mL的LB培养基中，培养温度为30-37℃，然后可通过在10,000rpm离心10min收集OD₆₀₀在0.5-0.7的细胞。以与上述培养物的初始体积等体积的冰冷无菌水洗涤收集的细胞两遍。在最后一次洗涤后将细胞重悬在无菌水中并加入待转化的DNA。上述细胞和DNA被转移到冷的小皿中，并在一台Bio-Rad Gene Pulser II中按照制造商的说明书进行电转化(Bio-Rad Laboratories，Inc Hercules，CA)。

用质粒pCP20转化菌株JW0886(ΔpflB::kan)，将转化后的菌株涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板并于30℃培养。然后选择氨苄青霉素抗性的转化体，在LB平板上划线并于42℃培养。将分离的菌落接种到氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基板上和LB板上。可通过菌落PCR用引物pflB CkUp(SEQ ID NO：11)和pflB CkDn(SEQID NO：12)筛选卡那霉素敏感和氨苄青霉素敏感菌落。可通过凝胶电泳对一份10μL的PCR反应混合液等分试样进行分析。观察预期的大约0.4kb PCR产物以确认标记的移除并制备“JW0886 markerless”菌株。该菌株缺失pflB基因。

用来自JW4114(frdB::kan)的P1_vir溶菌产物对上述“JW0886markerless”菌株进行了转导，并将其划线接种于包含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物frdB CkUp(SEQ ID NO：13)和frdB CkDn(SEQ ID NO：14)进行菌落PCR，对卡那霉素抗性的转导体进行筛选。如上所述，将产生了所预期的约1.6kb PCR产物的菌落制备为电感受态，并用pCP20对其进行转化以移除标记，如上文所述。转化体首先在30℃被涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，然后选择氨苄青霉素抗性的转化体划线接种至LB平板上并于42℃培养。将分离的菌落接种到氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基板和LB板上。可通过PCR用引物frdB CkUp(SEQ ID NO：13)和frdB CkDn(SEQ IDNO：14)筛选卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落。可观察到大约0.4kb的目的PCR产物，从而确认上述标记的移除和双敲除菌株“ΔpflB frdB”的构建成功。

用来自JW1375(ΔldhA::kan)的P1_vir溶菌产物对上述双敲除菌株进行转导，并将其涂布于包含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物ldhA CkUp(SEQ ID NO：15)和ldhA CkDn(SEQ ID NO：16)进行菌落PCR，对卡那霉素抗性的转导体进行筛选。如上所述，将产生了所预期的约1.1kb PCR产物的菌落制备为电感受态，并用pCP20对其进行转化以移除标记。转导体在30℃被涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，氨苄青霉素抗性的转化体被划线接种至LB平板上并于42℃生长。将分离的菌落接种到氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基板和LB板上。利用引物ldhA CkUp(SEQ ID NO：15)和ldhA CkDn(SEQ ID NO：16)，针对0.3kb的产物进行PCR，对卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落进行筛选。产生了所预期的大约0.3kb的PCR产物的克隆确认了标记的移除，从而构建了称为“三敲除菌株”(ΔpflBfrdB ldhA)的三重敲除的菌株。

用来自JW1228(ΔadhE::kan)的P1_vir溶菌产物对上述三敲除菌株进行转导，并将其涂布于包含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物adhE CkUp(SEQ ID NO：17)和adhE CkDn(SEQ ID NO：18)进行菌落PCR，对卡那霉素抗性的转导体进行筛选。将生产预期的1.6kbPCR产物的克隆制成电感受态并用pCP20转化以移除标记。转导体在30℃被涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。氨苄青霉素抗性的转化体被划线接种至LB平板上并于42℃培养。分离的菌落被接种至氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基平板和LB平板上。通过菌落PCR用引物adhE CkUp(SEQ ID NO：17)和adhE CkDn(SEQ IDNO：18)筛选卡那霉素敏感、氨苄青霉素敏感的菌落。产生了所预期的大约0.4kb的PCR产物的克隆被命名为“四敲除菌株”(ΔpflB frdBldhA adhE)。

向上述四敲除大肠杆菌菌株中引入编码一种异丁醇生物合成途径的一组基因。

如美国专利申请公布2007/0092957的实施例9-14中所述，构建了质粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD，上述专利以引用方式并入本文。该质粒包含下列基因：来自肺炎克雷伯氏菌的编码乙酰乳酸合酶的budB(SEQ ID NO：1)，来自大肠杆菌的编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因(SEQ ID NO：3)，来自大肠杆菌的编码乙酰羟酸脱水酶的ilvD(SEQ ID NO：5)，以及来自乳酸乳球菌的编码支链酮酸脱羧酶的kivD(SEQ ID NO：7)。来自木糖氧化无色杆菌的编码丁醇脱氢酶的sadB基因(SEQ ID NO：9)被亚克隆至pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD质粒中，如下所述。

采用标准条件，从木糖氧化无色杆菌基因组DNA中扩增了来自木糖氧化无色杆菌(公开于美国专利申请公布20090269823中)的编码丁醇脱氢酶的一段DNA片段(DNA：SEQ ID NO：9；蛋白质：SEQID NO：10)。可按照针对革兰氏阴性菌的推荐实验规程，使用GentraPuregene试剂盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；产品目录号D-5500A)制备上述DNA。可分别使用正向和反向引物N473和N469(SEQ ID NO：19和20)，用Phusion high Fidelity DNA聚合酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)完成PCR扩增。可将PCR产物TOPO-Blunt克隆至pCR4 BLUNT(Invitrogen)，从而得到pCR4Blunt::sadB，然后将该质粒转入大肠杆菌Mach-1细胞。随后从四个克隆中分离质粒并确认序列。

然后，sadB编码区被克隆至载体pTrc99a(Amann等人，Gene 69：301-315，1988)。用EcoRI消化上述pCR4Blunt::sadB，释放出sadB片段，将该片段与经EcoRI消化的pTrc99a连接，从而形成质粒pTrc99a::sadB。该质粒被转入大肠杆菌Mach 1细胞，所得到的转化体被命名为Mach1/pTrc99a::sadB。当使用异丁醛作为底物进行分析时，从这些细胞中的sadB基因表达的酶活性可被测定为在细胞游离提取物中3.5mmol/min/mg蛋白。

然后，上述sadB基因被亚克隆至pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD如下。利用Phusion High Fidelity DNA Polymerase(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和引物N695A(SEQ ID NO：21)和N696A(SEQID NO：22)，从pTrc99a::sadB扩增出sadB编码区。扩增按以下程序进行：首先于98℃变性1min；然后是98℃变性10sec，62℃退火30sec，72℃延伸20sec，30个循环；然后于72℃进行5min最后的延伸，最后将温度保持于4℃。引物N695A包含一个用于克隆的AvrII限制性位点和一个位于sadB编码区的ATG起始密码子上游的RBS(核糖体结合位点)。引物N696A包含一个用于克隆的XbaI位点。1.1kb的PCR产物用AvrII和XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)进行消化，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA))进行凝胶纯化。纯化后的片段使用T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)与用相同限制性酶酶切后的pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD连接。连接混合物被置于16℃孵育过夜，然后按照制造商规程转入大肠杆菌T Mach 1^TM感受态细胞(Invitrogen)。获得的转化体培养于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。来自转化体的质粒DNA用QIAprep Spinminiprep试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)按照制造商的规程制备。得到的质粒称为pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB。用pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB转化了如上文所述制备的电感受态四敲除大肠杆菌细胞。转化体被划线接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。所得到的重组大肠杆菌菌株包含由质粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB编码的异丁醇生物合成途径，和pflB、frdB、ldhA以及adhE基因的删除，并被命名为菌株NGCI-031。

经遗传修饰从而能将可发酵的碳源转化为丁醇的微生物可以是包含异丁醇生物合成途径的重组的啤酒糖酵母菌株。适合的啤酒糖酵母菌株可包含：由下列基因编码的异丁醇生物合成途径：来自枯草芽孢杆菌的alsS编码区(SEQ ID NO：32)，其编码乙酰乳酸合酶(SEQ IDNO：33)，来自啤酒糖酵母的ILV5(SEQ ID NO：40)，其编码乙酰羟酸还原异构酶(KARI；SEQ ID NO：41)和/或一种突变的KARI如Pf5.IlvC-Z4B8(SEQ ID NO：36；蛋白质SEQ ID NO：37)所编码的，来自变形链球菌的ilvD(SEQ ID NO：58)，其编码乙酰羟酸脱水酶(SEQID NO：59)，来自枯草芽孢杆菌的kivD(SEQ ID NO：43)，其编码支链酮酸脱羧酶(SEQ ID NO：44)，以及来自木糖氧化无色杆菌的sadB(SEQ ID NO：9)，其编码丁醇脱氢酶(SEQ ID NO：10)。所述异丁醇生物合成途径的基因所编码的酶，催化将丙酮酸转换为异丁醇所需的底物向产物的转化，如本文所述。

利用本领域已知的方法能够构建重组的啤酒糖酵母菌株。表达异丁醇途径的适合的酵母菌株在其胞质中具有乙酰乳酸合酶(ALS)活性，并包含对内源性丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的删除，如美国专利申请公布20090305363中所述，该专利以引用方式并入本文。

可如下文所述构建适合的菌株。

酵母菌株NGI-049的构建

NGI-049是一种含内源性PDC1、PDC5和PDC6基因的插入失活，并包含表达载体pLH475-Z4B8和pLH468的啤酒糖酵母菌株。PDC1、PDC5和PDC6基因编码丙酮酸脱羧酶的三种主要的同功酶。该菌株表达编码一种异丁醇生物合成途径的酶的基因，所述基因为整合的或者位于质粒上。

表达载体pLH475-Z4B8

可构建pLH475-Z4B8质粒(SEQ ID NO：30)，以在酵母中表达ALS和KARI。pLH475-Z4B8是一种包含下列嵌合基因的pHR81载体(ATCC#87541)：

1)CUP1启动子(SEQ ID NO：31)，来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶编码区(AlsS；SEQ ID NO：32；蛋白质SEQ ID NO：33)和CYC1终止子(SEQ ID NO：34)；

2)ILV5启动子(SEQ ID NO：35)，Pf5.IlvC-Z4B8编码区(SEQ IDNO：36；蛋白质SEQ ID NO：37)和ILV5终止子(SEQ ID NO：38)；和

3)FBA1启动子(SEQ ID NO：39)，啤酒糖酵母KARI编码区(ILV5；SEQ ID NO：40；蛋白质SEQ ID NO：41)和CYC1终止子。

所述Pf5.IlvC-Z4B8编码区是一段编码来自荧光假单胞菌的KARI但包含突变的序列，其被描述于美国专利申请#12/337736中，该专利以引用方式并入本文。上述Pf5.IlvC-Z4B8编码的KARI(SEQ ID NO：37；)与野生型荧光假单胞菌KARI相比，具有下列的氨基酸变换：

C33L：位于位点33的半胱氨酸变为亮氨酸，

R47Y：位于位点47的精氨酸变为酪氨酸，

S50A：位于位点50的丝氨酸变为丙氨酸，

T52D：位于位点52的苏氨酸变为天冬酰胺，

V53A：位于位点53的缬氨酸变为丙氨酸，

L61F：位于位点61的亮氨酸变为苯丙氨酸，

T80I：位于位点80的苏氨酸变为异亮氨酸，

A156V：位于位点156的丙氨酸变为苏氨酸，以及

G170A：位于位点170的甘氨酸变为丙氨酸。

上述Pf5.IlvC-Z4B8编码区是基于针对在啤酒糖酵母中的表达优化的密码子，利用DNA 2.0(Palo Alto，CA；SEQ ID NO：6)合成的。

表达载体pLH468

构建了用于在酵母中表达DHAD、KivD和HADH的质粒pLH468(SEQ ID NO：42)。

基于针对在啤酒糖酵母中的表达优化的密码子，利用DNA2.0合成了枯草芽孢杆菌酮异戊酸脱羧酶(KivD)和马肝脏醇脱氢酶(HADH)的编码区(SEQ ID NO分别为43和45)，并提供于质粒pKivDy-DNA2.0和pHadhy-DNA2.0中。所编码的蛋白质分别为SEQ ID NO：44和46。构建了KivD和HADH单独的表达载体。用AscI和SfiI酶对载体pNY8(SEQ ID NO：47；也称为pRS426.GPD-ald-GPDt，描述于美国专利申请公布US2008/0182308，实施例17，该专利以引用方式并入本文)进行了消化，从而切下上述GPD1启动子和ald编码区，以装配pLH467(pRS426::P_GPD1-kivDy-GPD1t)。用5’引物OT1068和3’引物OT1067(SEQ ID NO：49和50)对来自pNY8的一段GPD1启动子片段(SEQ IDNO：48)进行了PCR扩增，以在5’端加上一个AscI位点，并在3’端加上一个SpeI位点。将上述经AscI/SfiI消化的pNY8载体片段，与经AscI和SpeI消化的GPD1启动子PCR产物，以及分离自载体pKivD-DNA2.0的包含经密码子优化的kivD编码区的SpeI-SfiI片段相连接。这种三方连接产生了载体pLH467(pRS426::P_GPD1-kivDy-GPD1t)。可通过限制性图谱和测序对pLH467进行验证。

pLH435(pRS425::P_GPM1-Hadhy-ADH1t)源自载体pRS425::GPM-sadB(SEQ ID NO：51)，后者描述于美国专利申请公布20090305363A1，实施例3，该专利以引用方式并入本文。pRS425::GPM-sadB是包含了一个嵌合基因的pRS425载体(ATCC#77106)，所述嵌合基因包含GPM1启动子(SEQ ID NO：52)，来自木糖氧化无色杆菌的一种丁醇脱氢酶的编码区(sadB；SEQ ID NO：9；蛋白质SEQ ID NO：10：公开于美国专利申请公布#20090269823A1)，以及ADH1终止子(SEQ ID NO：53)。pRS425::GPMp-sadB在上述sadB编码区的5’和3’端分别包含BbvI和PacI位点。通过利用引物OT1074和OT1075(SEQ ID NO：54和55)进行定点诱变，在上述sadB编码区的5’端加上了一个NheI位点，从而产生载体pRS425-GPMp-sadB-NheI，该载体可通过测序验证。用NheI和PacI消化pRS425::P_GPM1-sadB-Nhe以释放出sadB编码区，并将来自载体pHadhy-DNA2.0的包含经密码子优化的HADH编码区的NheI-PacI片段与上述经消化的质粒连接，从而得到pLH435。

用SacI和NotI消化了酵母载体pRS411(ATCC#87474)，并在一个三方连接反应中，将上述经消化的载体与来自pLH467的包含P_GPD1-kivDy-GPD1t表达盒的SacI-SalI片段和来自pLH435的包含P_GPM1-Hadhy-ADH1t表达盒的SalI-NotI片段相连接，以将KivD和HADH表达盒联合于同一载体中。这样就产生了载体pRS411::P_GPD1-kivDy-P_GPM1-Hadhy(pLH441)，该载体可通过限制性图谱鉴定。

为了构建下游的异丁醇途径ilvD、kivDy和Hadhy中的全部三种基因的一种共表达载体，可使用描述于PCT公开WO/2010/037112中的pRS423FBAilvD(链球菌的)(SEQ ID NO：56)作为IlvD基因的来源。这种穿梭载体包含一个在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(nt 1423至1879)和一个在酵母中复制所需的2微米起点(nt 8082至9426)。该载体含有一个FBA启动子(nt 2111至3108；SEQ ID NO：39)和FBA终止子(nt 4861至5860；SEQ ID NO：57)。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 7092至7949)。来自变形链球菌UA159(ATCC#700610)的ilvD编码区(nt 3116至4828；SEQ ID NO：58；蛋白质SEQ ID NO：59)位于上述FBA启动子和FBA终止子之间，从而构成了一个用于表达的嵌合基因。此外，上述ilvD编码区还融合了一个lumio标签(nt 4829-4849)。

第一步是用SacI和SacII将pRS423FBA ilvD(Strep)(也叫做pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(Streptococcus mutans)-Lumio)线性化(并利用T4DNA聚合酶将SacII位点平末端化)，从而得到一种全长为9,482bp的载体。第二步是用SacI和KpnI从pLH441分离出kivDy-hADHy盒(并利用T4DNA聚合酶将KpnI位点平末端化)，以得到6,063bp的片段。将该片段与来自pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(Streptococcus mutans)-Lumio的9,482bp载体片段相连接。如此产生了载体pLH468(pRS423::P_FBA1-ilvD(Strep)Lumio-FBA1t-P_GPD1-kivDy-GPD1t-P_GPM1-hadhy-ADH1t)，该载体可通过限制性图谱和测序确认。

pdc6::GPMp1-sadB整合盒和PDC6删除的构建：

通过将来自pRS425::GPM-sadB(如上所述)的GPM-sadB-ADHt片段(SEQ ID NO：60)，与来自pUC19-URA3r的URA3r基因相联，构建了一种pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t-URA3r整合盒。pUC19-URA3r(SEQ ID NO：61)包含来自pRS426(ATCC#77107)的URA3标记，该标记两翼为75bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记的移除。以pRS425::GPM-sadB和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，利用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，BeverlY，MA；目录号F-540S)和引物114117-11A至114117-11D(SEQ ID NO：62，63，64和65)以及114117-13A和114117-13B(SEQ ID NO：66和67)，通过重叠延伸PCR(SOE PCR)(如Horton等人(1989)Gene 77：61-68所述)将上述两种DNA片段相连。

SOE PCR的外侧引物(114117-13A和114117-13B)包含5’和3’～50bp分别与PDC6启动子和终止子的上游和下游区域同源的区域。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将完整的盒PCR片段转入了BY4700(ATCC#200866)，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。可利用引物112590-34G和112590-34H(SEQ ID NO：68和69)，以及112590-34F和112590-49E(SEQ ID NO：70和71)，通过PCR对转化体进行筛选，以验证PDC6编码区的删除在PDC6基因座处的整合。可通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2％葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，可通过验证其不再生长从而确认标记的移除。得到的经过鉴定的菌株具有下列基因型：BY4700pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1t。

pdc1::PDC1-ilvD整合盒PDC1删除的构建：

利用SOE PCR(如Horton等人(1989)Gene 77：61-68所述)，通过将来自pLH468(参见上文)的ilvD-FBA1t片段(SEQ ID NO：72)与来自pUC19-URA3r的URA3r基因相连，构建了pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t-URA3r整合盒，其中所述SOE PCR用pLH468和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，利用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-540S)和引物114117-27A至114117-27D(SEQ ID NO：73，74，75和76)进行。

SOE PCR的外侧引物(114117-27A和114117-27D)包含5’和3’～50bp与PDC1启动子的下游区域和PDC1编码区的下游区域同源的区域。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将完整的盒PCR片段转入了BY4700 pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1t，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。可利用引物114117-36D和135(SEQ ID NO：77和78)，以及112590-49E和112590-30F(SEQ ID NO：70和79)，通过PCR对转化体进行筛选，以验证PDC1编码序列的删除在PDC1基因座处的整合。可通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2％葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，可通过停止生长的验证确认标记的移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA67”具有下列基因型：BY4700pdc6::GPM1p-sadB-ADH1tpdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t。

HIS3删除

为了删除内源的HIS3编码区，从URA3r2模板DNA(SEQ ID NO：84)PCR扩增了his3::URA3r2盒。URA3r2包含来自pRS426(ATCC#77107)的URA3标记，该标记两翼为500bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记的移除。PCR利用Phusion DNA聚合酶和引物114117-45A和114117-45B(SEQ ID NO：85和86)进行，以产生～2.3kb的PCR产物。每种引物的HIS3部分来源于HIS3启动子上游的5’区域和编码区下游的3’区域，如此URA3r2标记的整合导致HIS3编码区的置换。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将上述PCR产物转入了NYLA67，并在30℃于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上对转化体进行选择。可通过在30℃利用复制平板培养法在不含组氨酸且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上对转化体进行筛选，以验证正确的整合。可通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2％葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，可通过停止生长的验证确认标记的移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA73”具有下列基因型：BY4700pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1tΔhis3。

pdc5::kanMX整合盒以及PDC5删除的构建：

利用Phusion DNA聚合酶和引物PDC5::KanMXF和PDC5::KanMXR(SEQ ID NO：80和81)，从菌株YLR134W染色体DNA(ATCC No.4034091)PCR扩增了pdc5::kanMX4盒，产生了～2.2kb的PCR产物。每种引物的PDC5部分来源于PDC5启动子上游的5’区域和编码区下游的3’区域，如此kanMX4标记的整合导致PDC5编码区的置换。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将上述PCR产物转入了NYLA73，并在30℃于补充了1％乙醇和遗传霉素(geneticin)(200μg/ml)的YP培养基上对转化体进行选择。利用引物PDC5kofor和N175(SEQ ID NO：82和83)，可通过PCR对转化体进行筛选，以验证PDC5编码区的删除在PDC基因座处的整合。经鉴定的正确的转化体具有下列基因型：BY4700pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t Δhis3pdc5::kanMX4。

利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，将质粒载体pLH468和pLH475-Z4B8同时转入了菌株BY4700pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t Δhis3pdc5::kanMX4，并在30℃培养于不含组氨酸和尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成的完全培养基上。

有机萃取剂

在本文所述的方法中有用的萃取剂组合物是不能与水混溶的，并且包含第一溶剂和第二溶剂，二者均为不能与水混溶的。适当的有机萃取剂组合物应符合一种用于商业化地生产或回收丁醇的双相萃取发酵的理想溶剂的标准。具体而言，所述萃取剂组合物应(i)对微生物，例如大肠杆菌、植物乳杆菌和啤酒糖酵母，是生物可相容的，(ii)充分地与发酵培养基不能混溶，(iii)对于丁醇的萃取具有高的分配系数(K_P)，(iv)对于营养素的萃取具有低的分配系数，(v)具有低的与发酵培养基形成乳剂的趋势，和(vi)为低成本和无毒害的。此外，为了提高方法的可操作性和经济性，所述萃取剂应(vii)具有低的粘度(μ)，(viii)相对于含水的发酵培养基，具有低的密度(ρ)，和(ix)具有适合对萃取剂和丁醇的下游分离的沸点。萃取剂的粘度影响体系的传质特性，例如丁醇溶质能够从堆积水相被萃取至萃取剂相的效率。萃取剂的密度影响相分离发生的速度和干净程度。沸点能够影响成本和回收丁醇的方法。例如，当丁醇通过蒸馏而从萃取剂中被回收时，萃取剂的沸点应当充分地低，以在使萃取剂的任何热降解或副反应、或在蒸馏过程中对真空的需求最小化的同时，允许丁醇的分离。

萃取剂应当是与微生物生物可相容的，即，对微生物是无毒的，或者毒性仅至于这样的程度：微生物所受的损害为可接受的水平，使得微生物继续向发酵培养基中生产丁醇产物。萃取剂的生物形容性的程度，能够通过在萃取剂和丁醇产物的存在下微生物的葡萄糖利用率确定，如在所定义的发酵条件下所测量的(参见实施例)。生物可相容的萃取剂允许微生物利用葡萄糖，而生物不相容的萃取剂不允许微生物利用葡萄糖，例如以比当该萃取剂不存在时的速率的25％更高的速率。由于发酵产物丁醇的存在能够影响微生物对萃取剂的敏感度，在对萃取剂的生物相容性的测试过程中应存在发酵产物。附加的发酵产物例如乙醇的存在可类似地影响萃取剂的生物相容性。可以合理地预期，如果在萃取过程中存在较少的附加的发酵产物，则该萃取剂的生物相容性将提高。通过将葡萄糖利用率表示为相对于参考萃取剂的葡萄糖利用率的百分比，能够比较不同萃取剂在丁醇产物的存在下的生物相容性。

应当选择组成萃取剂的第一和第二溶剂，以使所期望的萃取剂的特性，如上文中所讨论的，在丁醇发酵产物的存在下最大化。如实施例中所表明的，包含较长碳链的第一溶剂和较短碳链的第二溶剂的萃取剂的使用，能够提供优于仅包含该第一溶剂的萃取剂的使用的有益效果。较长碳链的第一溶剂可具有所期望的高生物相容性特性，但也具有相对低的丁醇分配系数、较高的粘度、和/或较高的沸点这些不那么合乎期望的特性。与此相反，较短碳链的第二溶剂可能具有不那么合乎期望的较低生物相容性的特性，但也具有相对较高的丁醇分配系数、较低的粘度、和/或较低的沸点这些更加合乎期望的特性。具体而言，如本文所述的第一溶剂和第二溶剂的适当组合，可提供具有足够的丁醇分配系数和足够的与微生物的生物相容性，使得其能够被经济地用于从发酵过程除去丁醇的萃取剂。

第一溶剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物。适当的第一溶剂进一步选自：油醇(CAS No.143-28-2)，二十二醇(CASNo.661-19-8)，鲸蜡醇(CAS No.36653-82-4)，月桂醇，也被称为1-十二烷醇(CAS No.112-53-8)，肉豆蔻醇(CAS No.112-72-1)，硬脂醇(CASNo.112-92-5)，油酸(CAS No.112-80-1)，月桂酸(CAS No.143-07-7)，肉豆蔻酸(CAS No.544-63-8)，硬脂酸(CAS No.57-11-4)，肉豆蔻酸甲酯(CAS No.124-10-7)，油酸甲酯(CAS No.112-62-9)，十二醛(CAS No.112-54-9)，油酰胺(CAS No.301-02-0)，亚油酰胺(CAS No.3999-01-7)，棕榈酸酰胺(CAS No.629-54-9)和硬脂酰胺(CAS No.124-26-5)，以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述第一溶剂包含油醇。

第二溶剂选自C₇-C₁₁脂肪醇、C₇-C₁₁脂肪酸、C₇-C₁₁脂肪酸的酯、C₇-C₁₁脂肪醛、以及它们的混合物。在一个实施方案中，第二溶剂可选自C₇-C₁₀脂肪醇、C₇-C₁₀脂肪酸、C₇-C₁₀脂肪酸的酯、C₇-C₁₀脂肪醛、以及它们的混合物。适当的第二溶剂进一步选自：1-壬醇(CAS No.143-08-8)、1-癸醇(CAS No.112-30-1)、1-十一烷醇(CAS No.112-42-5)、2-十一烷醇(CAS No.1653-30-1)、1-壬醛(CAS No.124-19-6)、以及它们的组合物。在一个实施方案中，所述第二溶剂选自1-壬醇、1-癸醇、1-壬醛、以及它们的混合物。在一个实施方案中，所述第二溶剂包含1-癸醇。

在一个实施方案中，所述第一溶剂包含油醇并且所述第二溶剂包含1-癸醇。

如文本所用，术语“它们的混合物”既包括这些组的成员内部的混合物，也包括这些组的成员之间的混合物，例如C₁₂-C₂₂脂肪醇内部的混合物，以及C₁₂-C₂₂脂肪醇和C₁₂-C₂₂脂肪酸之间混合物。

组成萃取剂的第一和第二溶剂的相对量能够在适当的范围内变化。在一个实施方案中，按第一和第二溶剂的总体积计，所述萃取剂可包含约30％至约90％的第一溶剂。在一个实施方案中，所述萃取剂可包含约40％至约80％的第一溶剂。在一个实施方案中，所述萃取剂可包含约45％至约75％的第一溶剂。在另一个实施方案中，所述萃取剂可包含约50％至约70％的第一溶剂。最佳的范围反映了萃取剂特性的最大化，例如相对高的丁醇分配系数与可接受水平的生物相容性之间的平衡。就用于生产或回收丁醇的双相萃取发酵而言，温度、接触时间、发酵培养基中的丁醇浓度、萃取剂和发酵培养基的相对量、具体使用的第一和第二溶剂、第一和第二溶剂的相对量、其他有机溶质的存在、以及微生物的量和类型是相关的；因此必要时可在适当的范围内调整这些变量以使如本文所述的萃取过程最优化。

第一和第二溶剂可从多种来源，例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，以多种等级商购获得，它们中的许多可适用于通过本文所公开的方法生产或回收丁醇的萃取发酵。工业级的溶剂可包含化合物的混合物，包括所期望的组分以及较高和较低分子量的组分或异构体。例如，一种可商购获得的工业级油醇包含约65％的油醇和一种高级和低级脂肪醇的混合物。

发酵

可于一个适当的发酵罐内在一种适当的发酵培养基中培养所述微生物以生产丁醇。可使用任何适当的发酵罐，包括搅拌槽发酵罐，气升式发酵罐，气泡发酵罐，或它们的任何组合。用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法，为微生物学或发酵科学领域的技术人员所熟知(例如参见Bailey等人Biochemical Engineering Fundamentals，第二版，McGraw Hill，New York，1986)。基于所述的微生物、发酵和方法的具体要求，必须考虑适当的发酵培养基、pH、温度以及对有氧、微需氧和厌氧条件的需求。对所使用的发酵培养基要求并不严格，但其必须支持所使用的微生物的生长并活化生产所期望的丁醇产品所必需的生物合成途径。可使用常规的发酵培养基，包括但不限于，包含有机氮源如酵母提取物或蛋白胨和至少一种可发酵的碳源的复合培养基；基本培养基；以及组合培养基。适当的可发酵的碳源包括但不限于：单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。除上述适当的碳源之外，所述发酵培养基还可包含适当的氮源如铵盐，酵母提取物或蛋白胨，矿物质，盐，辅因子，缓冲液以及其他组分，如本领域的技术人员所已知(Bailey等人，见上文)。所述萃取发酵的适当条件依赖于所使用的具体微生物，并且本领域的技术人员可采用常规实验方便地予以确定。

利用萃取发酵回收丁醇的方法

可自一种发酵培养基回收丁醇，所述发酵培养基包含丁醇，水，至少一种可发酵的碳源，以及一种经基因修饰以通过一种生物合成途径从至少一种碳源生产丁醇的(即遗传工程的)微生物。此类经基因修饰的微生物可选自：大肠杆菌，植物乳杆菌和啤酒糖酵母。所述方法的第一步是令发酵培养基与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的有机萃取剂组合物接触，如上文所述，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。“接触”是指所述发酵培养基与有机萃取剂组合物或其溶剂组分在发酵过程的任何时间发生物理接触。在一个实施方案中，所述发酵培养基进一步包含乙醇，并且所述含丁醇的有机相可包含乙醇。

接触可以在萃取剂组合物的第一和第二溶剂事先已被合并的情况下进行。例如，可以在例如混合槽的容器中将第一和第二溶剂合并以形成萃取剂，然后将萃取剂加入包含发酵培养基的容器中。作为另外一种选择，接触可以以第一和第二溶剂在接触过程中合并的方式进行。例如，第一和第二溶剂可以分别地被加入含有发酵培养基的容器。在一个实施方案中，使发酵培养基与有机萃取剂组合物接触进一步包括，在使发酵培养基和第一溶剂与第二溶剂接触之前，先使发酵培养基与第一溶剂接触。在一个实施方案中，所述与第二溶剂的接触和所述与第一溶剂的接触在相同的容器中发生。在一个实施方案中，所述与第二溶剂的接触和所述与第一溶剂的接触在不同的容器中发生。例如，第一溶剂可以在一个容器中与发酵培养基接触，然后内容物被转移至另一个容器，在后者中发生与第二溶剂的接触。

有机萃取剂组合物可以在发酵开始的时候与发酵培养基接触，从而形成一种双相的发酵培养基。作为另外一种选择，有机萃取剂组合物可以在当微生物达到一个期望的生长量之后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可以通过测定培养物的光密度而确定。在一个实施方案中，所述萃取剂组合物的第一溶剂可以在一个容器中与发酵培养基接触，所述萃取剂组合物的第二溶剂可以在同一容器中与发酵培养基和第一溶剂接触。在另一个实施方案中，所述萃取剂组合物的第二溶剂可以在与第一溶剂与发酵培养基在其中相接触的容器不同的容器中，与发酵培养基和第一溶剂接触。

进一步地，所述有机萃取剂组合物可以在当发酵培养基中的丁醇水平达到一个预先确定的水平时与发酵培养基接触，例如在丁醇浓度达到有毒水平之前。所述丁醇浓度可以利用本领域已知的方法，例如通过气相色谱法或高效液相色谱法，在发酵期间加以监测。

发酵可以在有氧条件下进行一段足以使培养物达到一个预先选定的生长水平的时间，如通过测量光密度确定生长水平。然后可加入诱导剂以在所述经修饰的微生物中诱导丁醇生物合成途径的表达，并将发酵条件转至微需氧或厌氧条件，以刺激丁醇的生产，如美国专利申请公布2009-0305370A1的实施例6中所详述。所述萃取剂于转至微需氧或厌氧条件之后加入。在一个实施方案中，所述萃取剂的第一溶剂可以在发酵培养基和第一溶剂与第二溶剂接触之前与发酵培养基接触。例如，在分批发酵过程中，在使发酵培养基与第一和第二溶剂接触之间可以允许经过一段适当的时间。在连续发酵过程中，发酵培养基与第一溶剂的接触可以在一个容器中进行，而该容器的内容物与第二溶剂的接触可以在第二个容器中进行。

通过使发酵培养基与有机萃取剂接触，丁醇产物分配至有机萃取剂，降低了在包含微生物的水相中的浓度，从而限制了生产丁醇的微生物在抑制性的丁醇产品中的暴露。所使用的有机萃取剂的体积依赖于多种因素，包括所述发酵培养基的体积，所述发酵罐的尺寸，丁醇产物在所述萃取剂中的分配系数，以及发酵模式的选择，如下所述。有机萃取剂的体积可以是发酵罐工作容积的约3％至约60％。萃取剂对发酵培养基的比率是从约1∶20至约20∶1的体积：体积比，例如从约1∶15至约15∶1，或从约1∶12至约12∶1，或从约1∶10至约10∶1，或从约1∶9至约9∶1，或从约1∶8至约8∶1。

下一步为利用本领域已知的方法，包括但不限于虹吸、滗析、离心、利用重力分离器以及膜辅助的相分裂等等，将所述含丁醇的有机相与所述水相分离。丁醇从所述含丁醇的有机相中的回收可以用本领域已知的方法进行，这些方法包括但不限于蒸馏、树脂吸附、通过分子筛分离以及全蒸发等等。具体而言，可以采用蒸馏从所述含丁醇的有机相中回收丁醇。任选地，萃取剂的第一和第二溶剂可以彼此分离。所述萃取剂或溶剂可以被循环至丁醇的生产和/或回收过程。

可以与有机萃取剂组合物的溶剂同时地采用气提从发酵培养基中除去丁醇产物。汽提可以通过将一种气体，如空气、氮气或二氧化碳，通过所述发酵培养基，从而形成一种含丁醇的气相。丁醇产物可以用本领域已知的方法，如利用冷却水装置或用溶剂洗涤所述气相，从所述含丁醇的气相中得到回收。

发酵过程完成之后存在于发酵培养基中的任何丁醇均可通过用新鲜的或循环利用的有机萃取剂持续萃取而得到回收。作为另外的选择，丁醇可以用本领域已知的方法，如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、汽提、膜蒸发以及全蒸发等等，从发酵培养基中得到回收。

所述双相萃取发酵方法可于搅拌槽发酵罐中以连续模式进行。在这种模式中，发酵培养基和含丁醇的有机萃取剂组合物的混合物被从发酵罐中除去。通过本领域已知的方法，包括但不限于虹吸、滗析、离心、利用重力分离器以及膜辅助的相分裂等等，将此两相分离，如上所述。分离之后，发酵培养基可放回发酵罐中回收利用，或者也可用新鲜的培养基取而代之。然后，对萃取剂进行处理以回收丁醇产物，如上所述。萃取剂接下来可被放回发酵罐中回收利用，用于进一步萃取产物。作为另外一种选择，可持续地将新鲜的萃取剂加入至发酵罐中，以替换被移除的萃取剂。这种连续的运行模式具有若干优点。由于产物被不断地从反应器中除去，只需较小体积的有机萃取剂组合物就能允许较大体积的发酵培养基的使用。结果带来较高的产品收率。有机萃取剂的体积可以为发酵罐工作容积的约3％至约50％；为发酵罐工作容积的3％至约20％；或为发酵罐工作容积的3％至约10％。使用尽可能最小量的萃取剂以使所述水相的体积最大化，从而使所述发酵罐内细胞的量最大化，是有利的。所述过程可以以一种完全连续的模式运行，在这种模式中，萃取剂在发酵罐和一种分离设备之间连续循环利用，而发酵培养基被连续地从所述发酵罐中除去并由新鲜的培养基补足。在这种完全连续的模式中，丁醇产物不被允许达到毒性临界浓度，并且新鲜的营养物质被连续地提供，因此发酵可以长时间进行。可用于进行这些模式的双相萃取发酵的设备为本领域所熟知。例如，实例由Kollerup等人描述于美国专利4,865,973中。

也可以采用分批发酵模式。为本领域所熟知的分批发酵系一种封闭系统，其中发酵培养基的组成设定于发酵开始的时候，并且在发酵过程中不受人为的调整。在这种模式中，一定体积的有机萃取剂组合物被加入发酵罐中，并且这些萃取剂在发酵过程中不被除去。有机萃取剂组合物可以通过分别地添加第一和第二溶剂而在发酵罐中形成，或者可以合并上述溶剂以形成萃取剂组合物，然后再将所述萃取剂组合物添加至发酵罐。虽然这种模式比上述连续的或者完全连续的模式更简单，但它需要更大体积的有机萃取剂组合物，以使发酵培养基中抑制性的丁醇产物的浓度最小化。因此，发酵培养基的体积相对更少，所生产的产物的量也比采用上述连续模式时所获得的更少。在分批模式中，有机萃取剂组合物的体积可以为发酵罐工作容积的约20％至约60％；或者为发酵罐工作容积的30％至约60％。基于上文所述原因，在发酵罐中使用尽可能最小体积的萃取剂是有利的。

还可采用分批补料发酵模式。分批补料发酵是标准的分批系统的一种变型，在这种模式中，营养物质如葡萄糖在发酵期间被分批加入。营养物质加入的量和速率可通过常规实验确定。例如，可以在发酵期间监测发酵培养基中关键营养物质的浓度。作为另外的选择，可以对更易测量的因素，如pH、溶解氧以及废气(如二氧化碳)的分压，加以监测。从这些测量参数可以确定营养物质添加的速率。在这种模式中使用的有机萃取剂组合物的量及其添加方法与在分批模式中所使用的相同，如上文所述。

产物的萃取可以在发酵罐的下游，而不是在原位进行。在这种外部模式中，丁醇产物向有机萃取剂组合物中的萃取，是采用已自发酵罐中移出的发酵培养基进行。所使用的有机溶剂的量为发酵罐工作容积的约20％至约60％；或者为发酵罐工作容积的30％至约60％。发酵培养基可以连续地或者间歇地从发酵罐中移除，并且用有机萃取剂组合物对丁醇产物进行的萃取可以在从发酵培养基中去除或者不去除细胞的情况下进行。细胞可以通过本领域已知的方法从发酵培养基中去除，所述方法包括但不限于过滤或离心。在用上述方法将发酵培养基与萃取剂分离之后，所述发酵培养基可放入发酵罐中回收利用，或者被丢弃，或者处理以移除任何残余的丁醇产物。类似地，分离出的细胞也可放入发酵罐中回收利用。在进行回收丁醇产物的处理之后，萃取剂、第一溶剂、和/或第二溶剂可被回收利用于萃取过程中。作为另外一种选择，也可以使用新鲜的萃取剂。在这种模式中，萃取剂不存在于发酵罐中，因此萃取剂的毒性远不是一个问题。如果在使发酵培养基与萃取剂接触之前即将细胞从所述发酵培养基中分离，则进一步减小了萃取剂毒性的问题。此外，采用这种外部模式时，形成乳液的可能性更小，并且萃取剂的蒸发被最小化，减轻了环境问题。

用包含第一溶剂和第二溶剂的萃取剂通过萃取发酵生产丁醇的方法

提供了生产丁醇的改进的方法，其中经基因修饰以通过生物合成途径从至少一种碳源生产丁醇的微生物在双相发酵培养基中生长。此类经基因修饰的微生物可选自：大肠杆菌，植物乳杆菌和啤酒糖酵母。双相发酵培养基包含水相和不能与水混溶的萃取剂组合物，其中所述萃取剂组合物包含第一溶剂和第二溶剂，所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂至C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，并且所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、以及它们的混合物，其中所述双相发酵培养基包含按体积计从约10％至约90％的有机萃取剂组合物。作为另外一种选择，双相发酵培养基可包含按体积计从约3％至约60％的有机萃取剂组合物，或者从约15％至约50％。使微生物在双相发酵培养基中生长一段足以使丁醇被萃取至萃取剂中的时间从而形成含丁醇的有机相。在一个实施方案中，所述发酵培养基进一步包含乙醇，并且含丁醇的有机相能够包含乙醇。然后，含丁醇的有机相被与含水相分离，如上文所述。随后，从所述含丁醇的有机相回收丁醇，如上文所述。

还提供了生产丁醇的改进的方法，其中经基因修饰以通过生物合成途径从至少一种碳源生产丁醇的微生物在发酵培养基中生长，所述微生物在其中向发酵培养基中生产丁醇，从而产生含丁醇的发酵培养基。此类经基因修饰的微生物可选自：大肠杆菌，植物乳杆菌和啤酒糖酵母。含丁醇的发酵培养基的至少一部分与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的有机萃取剂组合物接触，所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺、以及它们的混合物，并且所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。在一个实施方案中，所述发酵培养基进一步包含乙醇，并且含丁醇的有机相能够包含乙醇。然后，含丁醇的有机相被与含水相分离，如上文所述。随后，从所述含丁醇的有机相回收丁醇，如上文所述。所述水相的至少一部分被返回至发酵培养基。

利用经修饰的大肠杆菌菌株结合使用油醇作为有机萃取剂，可以通过萃取发酵生产异丁醇，如美国专利申请公布2009-0305370A1中所公开的。与使用常规的发酵技术相比，该方法产生更高的异丁醇有效滴度(即，37g/L)，(参见美国专利申请公布2009-0305370A1的实施例6)。例如，Atsumi等人(Nature 451(3)：86-90，2008)报导了用经过基因修饰从而包含异丁醇生物合成途径的大肠杆菌进行发酵时，最高22g/L的异丁醇滴度。用美国专利申请公布2009-0305370A1所公开的萃取发酵方法获得的较高的丁醇滴度，部分地是由于有毒的丁醇产物从发酵培养基中的移除，从而保持了其水平低于对微生物有毒的水平。可以合理地认为，本发明的使用包含如本文所定义的第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的有机萃取剂组合物的萃取发酵方法，将以类似的方式被使用并得到类似的结果。

用本文所公开的方法生产的丁醇可具有大于22g每升发酵培养基的有效滴度。或者，用本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少25g每升发酵培养基的有效滴度。或者，用本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少30g每升发酵培养基的有效滴度。或者，用本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少37g每升发酵培养基的有效滴度。

本发明的方法概述于下述对图1至图7的描述中。

现在参见图1，显示的是采用原位萃取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图。含至少一种可发酵的碳源的水流10被引入发酵罐20，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰从而能将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。第一溶剂的流12和第二溶剂的流14被引入容器16，上述溶剂在该容器中合并形成萃取剂18。上述萃取剂18的流被引入发酵罐20，发酵培养基在其中与萃取剂发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流26被引入一个容器38，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相40和一种水相42。

现在参见图2，显示的是采用原位萃取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图。含至少一种可发酵的碳源的水流10被引入发酵罐20，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰从而能将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。组成萃取剂的第一溶剂的流12和第二溶剂的流14被分别引入发酵罐20，在该发酵罐中，发生发酵培养基与萃取剂的接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流26被引入一个容器38，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相40和一种水相42。

现在参见图3，显示的是采用原位萃取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图。含至少一种可发酵的碳源的水流10被引入第一发酵罐20，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰从而能将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。组成萃取剂的第一溶剂的流12被引入上述发酵罐20，并且包含由上述第一溶剂和发酵罐20的内容物组成的混合物的流22被引入第二发酵罐24。组成萃取剂的第二溶剂的流14被引入上述第二发酵罐24，在该发酵罐中，发生发酵培养基与萃取剂的接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流26被引入一个容器38，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相40和一种水相42。

现在参见图4，显示的是生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图，其中对产物的萃取在发酵罐的下游，而不是在原位进行。含至少一种可发酵的碳源的水流110被引入发酵罐120，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰从而能将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。第一溶剂的流112和第二溶剂的流114被引入容器116，上述溶剂在该容器中合并形成萃取剂118。发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分，显示为流122，被引入容器124。上述萃取剂的流118也被引入容器124，发酵培养基在其中与萃取剂发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流126被引入容器138，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生含丁醇的有机相140和水相142。

现在参见图5，显示的是生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图，其中对产物的萃取在发酵罐的下游，而不是在原位进行。含至少一种可发酵的碳源的水流110被引入发酵罐120，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰从而能将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。组成萃取剂的第一溶剂的流112和第二溶剂的流114被分别引入容器124，上述溶剂在该容器中合并形成萃取剂118。发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分，显示为流122，也被引入容器124，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流126被引入容器138，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生含丁醇的有机相140和水相142。

现在参见图6，显示的是生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图，其中对产物的萃取在发酵罐的下游，而不是在原位进行。含至少一种可发酵的碳源的水流110被引入发酵罐120，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰从而能将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。组成萃取剂的第一溶剂的流112被引入容器128，并且发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分，显示为流122，也被引入容器128。包含由上述第一溶剂和发酵罐120的内容物组成的混合物的流130被引入第二容器132。组成萃取剂的第二溶剂的流114被引入上述第二容器132，在该容器中，发生发酵培养基与萃取剂的接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流134被引入一个容器138，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相140和一种水相142。

本文所述的萃取过程可以作为分批过程运行，或者可以以连续模式运行，其中新鲜的萃取剂被加入而使用过的萃取剂被泵出，使得发酵罐中的萃取剂的量在整个发酵过程中保持不变。如此对发酵培养基中产物和副产物的连续萃取能提高有效滴度、有效速率和有效产量。

在另一个实施方案中，还可以在柔性顺流中，或者作为另外一种选择，以逆流方式进行液-液萃取，其中当使用一系列分批发酵罐时，所述逆流方式是导致分批操作模式的差异的原因。在这种方案中，只要设备在运行，提供了至少一种可发酵的碳源和微生物的发酵醪液就会以连续方式一个接一个地充满发酵罐。参见图7，一旦发酵罐F100被醪液和微生物填满，所述醪液和微生物就进一步填入发酵罐F101，继而填入发酵罐F102，然后回到发酵罐F100形成一个连续循环。在任何一个发酵罐中，一旦醪液和微生物同时存在，发酵即开始，并持续至发酵完全。醪液和微生物的充填时间等于发酵罐的数量除以总的循环时间(填充，发酵，排空和清洗)。若总的循环时间为60小时且有3个发酵罐，则充填时间为20小时。若总的循环时间为60小时且有4个发酵罐，则充填时间为15小时。

适合的顺流萃取所根据的发酵模式假定，以较高的肉汤相滴度运行的发酵罐能够利用丁醇浓度最高的萃取溶剂，而以最低的肉汤相滴度运行的发酵罐能受益于丁醇浓度最低的萃取溶剂流。例如，再次参见图7，考虑此种情况，即发酵罐F100位于一次发酵的启始并以相对低的丁醇肉汤相(B)滴度运行，发酵罐F101位于发酵的中部并以相对中等的丁醇肉汤相滴度运行，并且发酵罐F102靠近发酵的末端并以相对高的丁醇肉汤相滴度运行。这种情况下，不含或仅含极少的萃取的丁醇的贫萃取溶剂(S)，可被供给发酵罐F100，来自发酵罐F100的含有萃取的丁醇组分的“流出溶剂”(S’)可作为“流入溶剂”被供给发酵罐F101，而来自F101的流出溶剂可继而作为流入溶剂供给发酵罐F102。然后，来自F102的流出溶剂可接受处理以回收该溶剂流中存在的丁醇。绝大多数丁醇已被除去的经过处理的溶剂流，可作为贫萃取溶剂加回到体系中，并作为供给上述发酵罐F100的流入溶剂。

随着发酵以一种有序方式进行，可重置萃取溶剂多歧管的阀门，以将最贫的萃取溶剂供给以最低的丁醇肉汤相滴度运行的发酵罐。例如，假定(a)发酵罐F102完成了其发酵过程，已被重新装料并重新开始发酵，(b)发酵罐F100处于其发酵过程的中期，正以中等的丁醇肉汤相滴度运行，以及(c)发酵罐F101接近其发酵过程的末期，正以相对较高的丁醇肉汤相滴度运行。在这种情形中，最贫的萃取溶剂将会供给F102，自F102流出的萃取溶剂将会供给发酵罐F100，而自发酵罐F100流出的萃取溶剂将会供给发酵罐F101。

以这种方式运行的好处在于可在尽量长的时间里保持肉汤相丁醇滴度尽可能地低，从而实现生产率的提升。此外，在已进一步进入以较高的丁醇肉汤相滴度运行的发酵过程的其他发酵罐中，是有可能降低温度的。温度的降低能允许对较高丁醇肉汤相滴度的耐受力的提升。

本发明的方法的优点

本发明的萃取发酵法提供丁醇，已知其具有与汽油相似的能含量，并能与任何化石燃料混合。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成CO₂并且几乎不产生或根本不产生SO_X或NO_X。另外，丁醇的腐蚀性不及乙醇，是目前为止最优选的燃料添加剂。

除了用作生物燃料或燃料添加剂之外，根据本发明的方法所生产的丁醇还具有冲击燃料电池工业中的氢分配问题的潜在可能。如今，由于氢的运输和分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。此外，本发明的方法从植物来源的碳源生产丁醇，避免了标准的石油化学的丁醇生产工艺所涉及的对环境的负面影响。

本发明的方法的优点之一，是可通过如本文所述的第一和第二溶剂的适当组合获得的较高的丁醇分配系数。具有较高分配系数的萃取剂可以提供更有效的从发酵培养基中对丁醇的萃取。本发明的方法的另一个优点，是使用包含较短碳链的溶剂-具有合乎期望的较高分配系数但不合乎期望地具有较低的生物相容性的溶剂-的萃取剂，和通过与较长碳链的溶剂相结合而减轻较低的生物相容性的能力。其结果是，获得了更加有效的萃取剂，在微生物的存在下，该萃取剂能够伴随着所述微生物的持续生存而被使用。

本发明的方法进一步的优点包括相对于较长碳链的萃取剂如油醇的方法可操作性特征，该萃取剂的改进了的方法可操作性特征。与油醇相比，本发明的方法的萃取剂具有较低的粘度、较低的密度、和较低的沸点，这为使用这样的萃取剂的萃取方法提供了改进。萃取剂的粘度和密度的改良可带来萃取效率的提高和相分离的便利。较低的沸点可减少蒸馏分离所需的能量并可降低将丁醇从萃取剂分离的蒸馏塔的底部温度。这些特性的集合可以为使用如本文所公开的萃取剂的萃取发酵提供经济上的优势。

实施例

本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。

材料

以下材料用于实施例中。所有商购试剂均按原样使用。

所有溶剂均从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得，并在未经进一步纯化的情况下被使用。所使用的油醇为工业级，其包含油醇(65％)以及高级和低级脂肪醇的混合物。所使用的其他溶剂的纯度如下：1-壬醇，98％；1-癸醇，98％；1-十一烷醇，98％；2-十一烷醇，98％；十二烷醇，98％；1-壬醛，98％。异丁醇(纯度99.5％)自Sigma-Aldrich获得，并在未经进一步纯化的情况下被使用。

野生型啤酒糖酵母菌株BY4741自ATCC获得。

一般方法

用于测量微生物细胞浓度的光密度读数使用Thermo ElectronCorporation Helios Alpha分光光度计进行。测量通常采用600纳米的波长进行。

培养物肉汤中的葡萄糖浓度使用2700 Select Biochemistry分析仪(YSI Life Sciences，Yellow Springs，OH)快速测量。培养物肉汤样品在1.8mL Eppendorf管中以13,200rpm于室温离心2分钟，然后对含水的上清液分析葡萄糖浓度。在检测每组发酵罐样品之前，分析仪用已知的葡萄糖标准品进行了自我校准；此外，周期性地检测了外部标准品以保证培养物肉汤检测的真实性。分析仪用于上述分析的技术参数如下：

样品大小：15μL

黑色探头化学品：右旋糖

白色探头化学品：右旋糖

水相中的异丁醇和葡萄糖浓度使用带有适当保护柱的7.8mm×300mm BioRad Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad laboratories，Hercules，CA)，用0.01N硫酸水溶液作为洗脱剂等强度洗脱，通过HPLC(WatersAlliance Model，Milford，MA或Agilent 1200系列，Santa Clara，CA)测量。样品经过0.2μm离心过滤器(Nanosep MF改性尼龙)进入HPLC样品瓶。HPLC运行条件如下：

注射体积：10μL

流量：0.60mL/分钟

运行时间：40分钟

柱温：40℃

检测器：折射率

检测器温度：35℃

UV检测：210nm，8nm带宽

运行结束后，根据标准曲线测定每个化合物在样本中的浓度。异丁醇和葡萄糖的保留时间分别为32.6和9.1分钟。

比较实施例A-G

包含单一溶剂的萃取剂的筛选

使用表1中列出的不能与水混溶的有机萃取剂，完成了一系列比较实施例。使每种萃取剂与发酵培养基和异丁醇接触，如下文所述，以测定该萃取剂的分配系数。此外，通过萃取过程中微生物的葡萄糖利用率，评估了萃取剂的生物相容性。

表1：比较实施例A-G中使用的萃取剂的组成。

比较实施例	萃取剂
		A	油醇
B	1-壬醇
		C	1-十一烷醇
D	2-十一烷醇
		E	1-壬醛
F	1-癸醇
		G	1-十二烷醇

使用了下列的实验程序。在这些实验中，乙醇的量取决于葡萄糖的消耗量，不过典型的乙醇值在10-15g/L范围内。在这些浓度内的乙醇的存在预期不会影响葡萄糖的消耗和丁醇向萃取剂中的分配。用150μL啤酒糖酵母BY4741接种物接种了包含250mL酵母提取物/蛋白胨/右旋糖(YPD)培养基的种子摇瓶，并将它们于30℃在桌面摇床(Innova 4230，New Brunswick scientific，Edison，NJ)中以250rpm摇动孵育了约14小时。当OD₆₀₀达到约0.4时，用Select Biochemistry分析仪迅速分析了培养物肉汤中的葡萄糖浓度，并额外加入葡萄糖直到终浓度为约25g/L。培养物肉汤被分装进125mL烧瓶中，每一烧瓶包含75mL的培养物肉汤。萃取剂(25mL)被加至适当的烧瓶中，如表1中所示。于30℃以200rpm摇动孵育一小时后，向每一烧瓶中加入了3.75mL异丁醇，以使水相中初始的异丁醇浓度达到40g/L。对由水相和含丁醇的有机相组成的双相发酵培养基的孵育在30℃以100rpm摇动下继续进行了8小时。通过滗析分离了每一烧瓶中的水相和有机相。离心水相(2分钟，13,000rpm，使用Eppendorf 5415R型离心机)以除去细胞，通过HPLC对上清液进行了葡萄糖、乙醇、和异丁醇的分析。

通过记录样品之间葡萄糖浓度的差异和样品之间的时间差并计算相应的比率，计算了葡萄糖利用率，例如(葡萄糖]_t2-[葡萄糖]_t1)/(t2-t1)，其中t1指早于t2的时间而[葡萄糖]是指葡萄糖的浓度。

关于异丁醇在有机相和水相之间分布的分配系数，是从加入烧瓶的已知量的异丁醇和对水相测得的异丁醇浓度数据计算得出。萃取剂相中的异丁醇浓度通过质量平衡确定。分配系数被定为有机相和水相中异丁醇浓度的比率，即，K_p＝[异丁醇]_有机相/[异丁醇]_水相。

比较实施例A重复了三次，并对结果取平均值。就比较实施例A-G而言，异丁醇的分配系数和葡萄糖利用率以相对于油醇(比较实施例A)的平均测量值的百分比显示于下文的表3中。大于100％值表示该结果数值上大于油醇的结果。小于100％值表示该结果数值上小于油醇的结果。等于100％的值表示该结果与油醇的结果相同。如美国专利申请公布2009-0305370A1中所公开的，油醇在用于异丁醇生产的单一溶剂萃取发酵中表现良好。

实施例1-15

包含第一和第二溶剂的萃取剂的筛选

评估了表2中列出萃取剂，所述评估使用了上文所述的程序，不过有下列的改变。在培养物肉汤被分装进125mL烧瓶中，每一烧瓶包含75mL的培养物肉汤之后，油醇以表2中所显示的量作为第一溶剂被加入每一烧瓶中。于30℃以200rpm摇动孵育一小时后，相应的第二溶剂，如表2中所示，被加入每一烧瓶中，以完成萃取剂的形成，然后向每一烧瓶中加入了3.75mL异丁醇，以使水相中初始的异丁醇浓度达到40g/L。从这一点起，附加的孵育、分离、和测量均如上文所述进行。

表2：实施例1-15中使用的萃取剂的组成

注解：*“vol％”是指按所使用的每种溶剂的总毫升数计，所指示的溶剂的体积占萃取剂的百分比。

就实施例1-15的萃取剂而言，异丁醇的分配系数和葡萄糖利用率以相对于油醇(比较实施例A)的平均测量值的百分比，与比较实施例A-G的结果一起显示于下文的表3中。大于100％值表示该结果数值上大于油醇的结果。小于100％值表示该结果数值上小于油醇的结果。等于100％的值表示该结果与油醇的结果相同。

表3：比较实施例A-G和实施例1-15中使用的萃取剂的葡萄糖利用率和异丁醇分配系数，以相对于油醇(比较实施例A)的对应值的百分比表示。

实施例	％葡萄糖利用率	％K_P
			比较实施例A	100	100
1	48	117.9
			2	22	131.8
比较实施例B	0	152.1
			3	62	102.2
4	82	118.6
			5	65	114.9
比较实施例C	0	127.0
			6	68	100.0
7	60	114.7
			比较实施例D	0	139.0
8	42	98.6
			9	50	132.0
比较实施例E	0	132.6
			10	71	112.7
11	72	128.3
			12	35	149.4
比较实施例F	0	139.0
			13	98	119.0
14	107	118.5
			15	95	127.4
比较实施例G	84	129.9

注解：“Comparative Ex.”是指比较实施例

表3中的数据显示，所有包含所指示的单一溶剂(比较实施例A-G)的萃取剂具有比油醇更高的异丁醇分配系数，表明这些萃取剂在萃取发酵过程中的使用将是有利的。然而，除了油醇和1-十二烷醇之外，上述单一溶剂萃取剂具有等于零的葡萄糖利用率百分比，这表明与微生物的生物相容性的严重不足。如果上述萃取剂在发酵过程中被用于原位的产物移除，生物相容性不足的程度将抵消分配系数的潜在优势。

表3中的数据还显示，比较实施例B、C、D、E、和F的萃取剂对所研究的啤酒糖酵母菌株的生物毒性效应，能够通过将选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、以及它们的混合物的这些较短碳链的溶剂与选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物的较长碳链的溶剂合并，以形成如上文所述的包含第一溶剂和第二溶剂的萃取剂，而被减轻。溶剂的组合还提供了通常提高的异丁醇分配系数。可以合理地预期，本文所公开的萃取剂能被用于减轻异丁醇以及其他丁醇对包括重组菌株在内的其他啤酒糖酵母菌株的毒性，同时还提供提高的丁醇分配系数。还可以合理地预期，上述减轻效应能被扩展至经基因修饰从而能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的大肠杆菌和植物乳杆菌。

来自实施例1和2的数据显示，由70/30的油醇/1-壬醇(体积/体积比)或50/50的油醇/1-壬醇组成的萃取剂，尽管具有比油醇更低的葡萄糖利用率百分比，依然是与微生物生物可相容的，允许其在所述萃取剂的存在下生产丁醇。上述油醇/1-壬醇萃取剂还具有提高的异丁醇分配系数，这对于原位产物移除方法是有利的。

类似的，来自实施例3-5的数据显示，由70/30、50/50、或30/70的油醇/1-十一烷醇组成的萃取剂，具有比1-十一烷醇显著更好的与微生物的生物相容性和比油醇更高的异丁醇分配系数。

来自实施例6和7的数据显示，由70/30或50/50的油醇/2-十一烷醇组成的萃取剂，具有比2-十一烷醇显著更好的与微生物的生物相容性和与油醇相同或比油醇更高的异丁醇分配系数。

来自实施例8和9的数据显示，由70/30或50/50的油醇/1-壬醛组成的萃取剂，具有比1-壬醛更好的生物相容性和与油醇大致相同或比油醇更高的异丁醇分配系数。

来自实施例10-12的数据显示，由70/30、50/50、或30/70的油醇/癸醇组成的萃取剂，具有比癸醇更高的生物相容性和比油醇更高的异丁醇分配系数。

类似的，来自实施例13-15的数据显示，由70/30、50/50、或30/70的油醇/1-十二烷醇组成的萃取剂，具有比1-十二烷醇更高的生物相容性和比油醇更高的异丁醇分配系数。

表4显示相对于油醇的对应值，实施例1-15和比较实施例A-G的萃取剂的计算的粘度、密度、和沸点数据。物理特性的计算按照例如Properties of Gases and Liquids(Reid，Prausnitz，和Poling，McGraw-hill，1987)中所述的标准方法进行。纯的组分的数据可以，例如，从物理特性数据库或从公开文献获得。

表4：比较实施例A-G和实施例1-15中使用的萃取剂的计算的粘度、密度、和沸点，以相对于油醇(比较实施例A)的对应值的百分比表示。

实施例	沸点^*	密度	粘度
				比较实施例A	100％	100％	100％
1	80％	99％	70％
				2	67％	98％	65％
比较实施例B	33％	97％	61％
				3	85％	99％	81％
4	75％	99％	76％
				5	65％	98％	73％
比较实施例C	50％	97％	71％
				6	85％	99％	81％
7	75％	99％	76％
				比较实施例D	50％	97％	71％
8	72％	99％	66％
				9	53％	98％	61％
比较实施例E	6％	96％	56％
				10	82％	99％	75％
11	70％	98％	71％
				12	59％	98％	68％
比较实施例F	41％	97％	66％
				13	87％	99％	86％
14	78％	98％	81％
				15	70％	98％	78％
比较实施例G	57％	96％	75％

^*在大气压下

表4中的数据显示，相对于油醇的基准情况，上述实施例的萃取剂能够具有显著降低的沸点和粘度以及略微降低的密度。因此，从方法的可操作性方面而言，上述实施例的萃取剂可以提供优于仅包含单一溶剂的萃取剂的优点。

尽管在以上描述中已用具体实施方案来描述了本发明，但本领域的技术人员将会理解，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下能够作出许多修改、替代和重新排列。指明本发明范围的基准是所附权利要求书而不是上述说明书。

Claims

1.从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供发酵培养基，所述发酵培养基包含丁醇、水、至少一种可发酵的碳源和经基因修饰的微生物，所述微生物从包含至少一种可发酵的碳源的发酵培养基生产丁醇；

b)使所述发酵培养基与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂组合物接触，其中所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

c)将所述含丁醇的有机相与所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

2.用于生产丁醇的方法，所述方法包括：

b)在包含水相和不能与水混溶的萃取剂组合物的双相发酵培养基中，使所述微生物生长足以令丁醇被萃取至所述萃取剂组合物中的时间从而形成含丁醇的有机相，其中所述萃取剂组合物包含第一溶剂和第二溶剂，所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，并且所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，其中所述双相发酵培养基包含按体积计从约10％至约90％的所述不能与水混溶的萃取剂组合物；

c)将所述含丁醇的有机相与所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

3.用于生产丁醇的方法，所述方法包括：

b)使所述微生物在发酵培养基中生长，其中所述微生物将丁醇产生到所述发酵培养基中，从而制得含丁醇的发酵培养基；

c)使所述含丁醇的发酵培养基的至少一部分与包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的萃取剂组合物接触，其中所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物，所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

d)将所述含丁醇的有机相与所述水相分离；

e)从所述含丁醇的有机相回收丁醇；以及

f)使所述水相的至少一部分返回至所述发酵培养基。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述丁醇为异丁醇。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述萃取剂组合物包含按所述第一和第二溶剂的总体积计约30％至约90％的第一溶剂。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述萃取剂组合物与所述发酵培养基的比率为从约1∶20至约20∶1的体积∶体积比。

7.权利要求1的任一项方法，所述方法进一步包括在使所述发酵培养基与萃取剂组合物接触之前使所述发酵培养基与第一溶剂接触的步骤。

8.权利要求7的方法，其中所述与萃取剂组合物的接触和所述与第一溶剂的接触在相同的容器中发生。

9.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述丁醇的一部分通过包括以下步骤的方法同时从所述发酵培养基中被移除：

b)从所述含丁醇的气相回收丁醇。

10.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述发酵培养基还包含乙醇。

11.权利要求10的方法，其中所述乙醇存在于所述含丁醇的有机相中。

12.双相混合物，所述双相混合物包含：

a)发酵培养基，所述发酵培养基包含异丁醇、水、至少一种可发酵的碳源、和从发酵培养基生产异丁醇的经基因修饰的微生物；和

b)包含第一溶剂和第二溶剂的不能与水混溶的有机萃取剂组合物，所述第一溶剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，所述第二溶剂选自C₇-C₁₁醇、C₇-C₁₁羧酸、C₇-C₁₁羧酸的酯、C₇-C₁₁醛、C₁₂-C₂₂脂肪酰胺以及它们的混合物。