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CN102421907A - 使用高甘油浓度的用于1,3-丙二醇生产的连续培养 - Google Patents

使用高甘油浓度的用于1,3-丙二醇生产的连续培养 Download PDF

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CN102421907A CN2010800197749A CN201080019774A CN102421907A CN 102421907 A CN102421907 A CN 102421907A CN 2010800197749 A CN2010800197749 A CN 2010800197749A CN 201080019774 A CN201080019774 A CN 201080019774A CN 102421907 A CN102421907 A CN 102421907A
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P.索凯尔
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Abstract

本发明涉及一种用于产生1，3-丙二醇的新方法，包括在具有高甘油含量的培养基上培养微生物。本发明还涉及新的微生物，或微生物菌株，其经适应用于从包含高甘油含量的培养基产生1，3-丙二醇。本发明还涉及“适应性微生物”，其丙三醇代谢定向于1，3-丙二醇产生，并且允许其在高浓度的工业甘油存在下生长。本发明还涉及通过本发明的方法产生的生物来源的1，3-丙二醇。最后，本发明涉及上述生物来源的1，3-丙二醇作为热塑性聚氨酯中的延伸链，作为聚对苯二甲酸丙二酯中的单体和作为化妆品配制剂中的组分的用途。

Description

使用高甘油浓度的用于1,3-丙二醇生产的连续培养
技术领域
本发明涉及一种用于1，3-丙二醇生产的新方法，包括在具有高甘油含量的培养基上培养微生物。本发明还涉及新的微生物，或微生物的菌株，其经适应用于从包含高甘油含量的培养基产生1，3-丙二醇。本发明还涉及“适应性微生物”，其丙三醇代谢定向于1，3-丙二醇产生，并且允许其在高浓度的工业甘油存在下生长。本发明还涉及通过本发明的方法产生的生物来源的1，3-丙二醇。最后，本发明涉及上述生物来源的1，3-丙二醇作为热塑性聚氨酯中的延伸链(extender chain)，作为聚对苯二甲酸丙二酯中的单体和作为化妆品配制剂中的组分的用途。
背景技术
1，3-丙二醇(PDO)是知晓时间最久的发酵产物之一。其早在1881年就由August Freund在明显含有巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)作为活性生物的丙三醇发酵混合培养中可靠地得到了鉴定。对产生PDO(亚丙基二醇，丙二醇)的不同肠细菌的发酵的定量分析早在1928年就在代尔夫特微生物学院(microbiology school of Delft)开始，并且在20世纪40年代在Ames，Iowa成功地继续。在20世纪60年代，兴趣转移到攻击丙三醇的酶，特别是丙三醇和二醇脱水酶，因为这些酶在需求辅酶B12方面很特殊。形成PDO的梭菌首次记载于1983年，作为从分泌丙三醇的藻类获得特别产物的方法的一部分(Nakas等，1983)。PDO是丙三醇发酵的典型产物，并且尚未在其他有机底物的厌氧转化中发现。只有非常少数的生物(其均为细菌)能够形成PDO。它们包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)(肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))、肠杆菌属(Enterobacter)(成团肠杆菌(E.agglomerans))和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii))的肠细菌，乳杆菌(lactobacilli)(短乳杆菌和布氏乳杆菌(L.buchneri))，和丁酸梭菌和巴氏梭菌类的梭菌。
对发酵产物的分析显示，部分丙三醇转化成与这种不同类型的糖发酵中相同的产物，即乙酸、2，3-丁二醇、丁酸、乳酸、乙醇和琥珀酸。这种转化为生长提供了必需的能量，但是对于许多产物而言，在丙三醇向PDO的还原性转化中所用的还原当量也被释放。降低梭菌中PDO产量的丁酸形成在某种程度上与克雷伯氏菌属中的乙醇形成相当，但是其似乎更依赖于生长速率。丁酸随着稀释率迅速减少，即使是在不存在底物过量的情况下。在任何情况下，乙酸/丁酸比的改变对PDO产量(yield)没有很大影响。
PDO作为双官能有机化合物，能够潜在地用于许多合成反应，特别是作为产生聚酯、聚醚和聚氨酯的缩聚中的单体。PDO能够通过不同的化学途径产生，但是它们生成含有极具污染性的物质的废料流，因而生产成本高并且化学产生的PDO无法与能够通过石油化学获得的二醇如1，2-乙二醇、1，2-丙二醇和1，4-丁二醇竞争。因此，在过去PDO只能找到市场交易量可以忽略的特殊领域应用(niche application)。这是为何在1995年杜邦(Dupont)起动了葡萄糖生物转化为PDO的研究项目。尽管这种过程是环境友好的，但是其具有如下缺点：i)使用维生素B12，一种非常昂贵的辅因子和ii)因为生产菌株的不稳定性而是一种不连续的过程。由于从生物柴油工业流出的大量丙三醇的可用性，连续的过程、不用维生素B12以及较高碳得率会是有利的。
本领域已知PDO能够从甘油(glycerine)产生，甘油(glycerine)是生物柴油生产的一种不想要副产物，其含有混有盐和水的大约80-85％的丙三醇。
先前描述了丁酸梭菌能够在分批和两阶段连续发酵中生长并从工业丙三醇产生PDO(Papanikolaou等，2000)。然而，在最高丙三醇浓度下，以0.02h-1的稀释率获得的最大PDO效价为48.1g/L，意味着0.9g/L/H的生产率。所述培养以补料培养基中最大丙三醇浓度为90g/L并在酵母提取物(本领域技术人员已知用于帮助增加细菌生物量产生的一种昂贵的含有有机氮的化合物)存在下进行。
WO2006/128381公开了这种甘油用于以使用天然PDO生产生物如肺炎克雷伯氏菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌的分批和补料分批培养产生PDO的用途。另外，WO2006/128381中使用的培养基也含有酵母提取物。如该专利申请中所述，达到的最大生产率为0.8-1.1g.l.h-1(含端值)(comprised between)。
经修饰而含有来自丁酸梭菌(C.butyricum)的维生素B12-非依赖性丙三醇脱水酶和PDO-脱氢酶的丙酮丁醇梭菌菌株(称为丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5)的性能已经在Gonzalez-Pajuelo等，2005中描述。这种菌株在原始状态下(originally)使用含有多至120g.l-1的纯丙三醇的补料培养基生长并产生PDO。此外，使用含有最多60g.l-1的纯的或工业丙三醇的补料培养基的分析没有鉴别出任何差异。当比较丁酸梭菌与丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5时，作者Gonzalez-Pajuelo等，2006观察到了全局性的相似行为。
然而，在不含有机氮的合成补料培养基中使用105g.l-1的工业丙三醇测试的相同丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5菌株不能给出与使用相同浓度的纯丙三醇相同的性能(参见实施例1)。
本发明提供使用高浓度工业甘油产生1，3-丙二醇的方法(means)，并且其中能够达到较高的PDO效价和生产率。
发明简述
本发明涉及一种用于在甘油的连续发酵过程中产生1，3-丙二醇的方法，包括在培养基上培养生产微生物，所述生产微生物允许将丙三醇转化为1，3-丙二醇，和回收1，3-丙二醇，其特征在于所述培养基包含高浓度的工业甘油，所述工业甘油包含丙三醇，并且其中所述生产微生物是预先适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物。
在优选的实施方案中，丙三醇以90-120g/L，优选约105g/L的浓度存在于所述培养基中。
所述培养基优选为合成培养基，不添加任何有机氮源，并且特别是没有酵母提取物。
所述工业甘油具体而言是来自生物柴油生产的副产物。
所述生产微生物优选为细菌，更优选选自梭菌属的成员，特别是丙酮丁醇梭菌。
有利地，所述生产微生物是经遗传修饰而改进1，3-丙二醇从丙三醇的产生的微生物。
在一个优选的实施方案中，所述生产微生物中的丙三醇脱水酶活性不依赖于辅酶B12或其多种前体中的一种的存在，并且源自丁酸梭菌。
优选地，所述生产微生物是之前通过将微生物以低稀释率在包含高浓度工业甘油的培养基上培养并选择适应性微生物而适应于在具有高浓度工业甘油的培养基上生长的微生物。
最后，1，3-丙二醇经进一步纯化。
本发明还涉及一种用于将微生物修饰成适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物的方法，包括将所述微生物以低稀释率在包含高浓度工业甘油的培养基上培养，并选择能够在具有高浓度工业甘油的培养基上生长的适应性微生物。
有利地，将所述微生物以低稀释率培养历时24小时至10天，优选多于2天，更优选约8天的时间。
所述稀释率通常为0.005-0.1h-1，优选0.005-0.02h-1。所述稀释率在所述适应方法的过程中可以变化，最终具有稀释率为0.005-0.02h-1的第一步和其中稀释率增长至0.1h-1，优选0.06h-1的第二步。
本发明还涉及适应性微生物，即可以通过上文和下文公开的方法获得的适应于在高浓度工业甘油存在下生长的生产微生物。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的生物来源的1，3-丙二醇。
本发明还涉及生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于13C和18O同位素值的组合选自δ13C低于-34‰且δ18O为21.5‰-0.5‰，优选δ13C低于-35‰且δ18O为21.9‰-0.5‰，更优选δ13C为-35.05‰～-36.09‰且δ18O为21.9‰-17.34‰。
在一个优选的实施方案中，所述生物来源的1，3-丙二醇的特征在于δ13C/δ18O同位素比值为-2～0，优选-1～-0.2，且更优选-0.65～-0.4。
本发明还涉及通过本发明方法获得的或如上限定的生物来源的1，3-丙二醇作为热塑性聚氨酯中的延伸链，作为聚对苯二甲酸丙二酯中的单体或作为化妆品配制物中的组分的用途。
发明详述
本发明涉及一种用于在甘油的连续发酵过程中产生1，3-丙二醇的方法，包括在培养基上培养生产微生物，所述生产微生物允许将丙三醇转化为1，3-丙二醇，和回收1，3-丙二醇，其特征在于所述培养基包含高浓度的工业甘油，所述工业甘油包含丙三醇，并且其中所述生产微生物是预先适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物。
术语“微生物”意指选自由细菌、酵母和真菌组成的组的微生物。优选地，所述微生物是优选选自下组的细菌：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，所述细菌选自下组：埃希氏菌属菌种(Escherichia sp.)(优选大肠杆菌)、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella sp)(优选肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)(优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、梭菌属菌种(优选丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum))和棒杆菌属菌种(Corynebacterium sp)(优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))。
术语“埃希氏菌属”、“克雷伯氏菌属”、“芽孢杆菌属”、“梭菌属”(″Clostridium″and″Clostridia″)和“棒杆菌属”是指属于这些科或属的全部细菌种类。
术语“生产微生物”或“微生物的生产菌株”是指其中该微生物的丙三醇代谢定向于1，3-丙二醇生产的微生物或微生物菌株。
“经适应的微生物”是指经修饰而能够在高浓度工业甘油上生长的微生物。
“适当的培养基”或“培养基”是指对于所述生产菌株的生长和二醇生产进行优化的培养基。
术语“高甘油含量”或“高浓度甘油”意指培养基中超过90g/l的丙三醇。在一个优选的实施方案中，所述培养基以90-120g/L，优选约105g/L的浓度包含丙三醇。
“工业甘油”意指从不进行实质性纯化的工业过程获得的甘油产物。工业甘油也可称作“粗甘油”、“粗丙三醇”或“工业丙三醇”。工业甘油含有超过约70％，优选超过约80％的丙三醇，少于15％的水和杂质如无机盐和脂肪酸。无机盐的浓度小于10％，优选小于5％。脂肪酸的浓度小于20％，优选小于5％。工业甘油中最具代表性的脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、亚油酸和花生酸。
获得工业甘油的工业过程为，但不限于，其中将脂肪和油，特别是植物来源的脂肪和油加工成工业产品如洗涤剂或润滑剂的制造方法。在这样的制造方法中，认为工业甘油是副产物。
在一个具体的实施方案中，工业甘油是来自生物柴油生产的副产物并且包括从生物柴油生产获得的甘油的已知杂质，包含约80-85％的丙三醇以及盐、水和一些其他有机化合物如脂肪酸。从生物柴油生产获得的工业甘油未进行进一步的纯化步骤。
术语“合成培养基”意指生物在其上生长的包含化学上确定的底物的培养基。
在本发明的培养基中，有利地，丙三醇是碳的单一来源。优选地，这种培养基不含任何有机氮源。氮是对于植物和动物二者的生长和繁殖关键的天然存在的元素。其存在于氨基酸中和许多其他有机和无机化合物中。根据本发明，“有机氮”意指包含从活的生物获得的包含氮的有机化合物。用于细菌培养的有机氮的常用来源包含酵母提取物。
在一个优选的实施方案中，所述生产微生物是梭菌属菌株，更优选丙酮丁醇梭菌。
在本发明的另一实施方案中，所述生产微生物是经遗传修饰的细菌。
短语“经遗传修饰的细菌”意指该菌株经过以改变其遗传特征为目的的转化。可以将内源基因削弱、缺失、或过表达。可将外源基因引入、通过质粒携带、或整合入所述菌株的基因组中，以在细胞中表达。
术语“质粒”或“载体”如用于本文是指通常携带不属于细胞中央代谢的一部分的基因，并且通常为环状双链DNA分子的形式的额外染色体元件。
在本发明的另一实施方案中，所述方法的特征在于所述生产微生物具有丙三醇脱水酶活性，该活性不依赖于辅酶B12或其多种前体之一的存在，并且该活性源自丁酸梭菌。
具体而言，所述生产微生物通过或者由质粒过表达或者整合至所述微生物的染色体中来引入额外拷贝的来自丁酸梭菌的1，3-丙二醇操纵子(编码维生素B12-非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶)而呈现增加的1，3-丙二醇产生流(flux)。例如，pSPD5质粒可以用于1，3-丙二醇操纵子的过表达。
用于将丙三醇代谢定向于1，3-丙二醇的产生的方法是本领域已知的(参见例如WO2006/128381，González-Pajuelo等，2006)。
在本发明的另一实施方案中，所述生产微生物是预先适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物。生产微生物的所述“适应”是通过将该微生物以低稀释率在包含高浓度工业甘油的培养基上培养，并选择能够在具有高浓度工业甘油的培养基上生长的适应性微生物来获得的。
本发明还涉及用于将微生物修饰成适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物的方法。
几种“适应方法”可以由本领域技术人员选择以将生产微生物转化成允许在高浓度工业甘油存在下生长的生产微生物。
根据本发明，将微生物转化成适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物的修饰包括将所述微生物以低稀释率在包含高浓度工业甘油的培养基上培养并选择能够在具有高浓度工业甘油的培养基上生长的适应性微生物。
有利地，将所述微生物以低稀释率培养历时24小时至10天，优选多于2天，更优选约8天的时间。
所述稀释率通常为0.005-0.1h-1，优选0.005-0.02h-1。所述稀释率在所述适应方法的过程中可以变化，最终具有稀释率为0.005-0.02h-1的第一步和其中稀释率增长至0.1h-1，优选0.06h-1的第二步。当在适应方法的过程中改变稀释率时，0.005-0.02h-1的稀释率称为“低稀释率”，而0.02-0.1h-1的稀释率为普通稀释率。
本发明还涉及适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物，其容许通过如上所述的方法获得。
使用本发明的方法适应的微生物优选是进一步适应于在高浓度工业甘油存在下生长的生产微生物。
所述适应性微生物也可以是首先适应于在高浓度工业甘油存在下生长，再修饰为具有其定向于1，3-丙二醇生产的丙三醇代谢的微生物。
根据本发明的“适应性微生物”是适应于在高浓度工业甘油存在下生长并且具有以下两种关键特征的生产微生物：
-其丙三醇代谢定向于1，3-丙二醇产生，和
-允许其在高浓度工业甘油存在下生长。
在本发明的一个特定实施方案中，将丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5菌株使用含有105g.l-1来自生物柴油生产的粗丙三醇的补料培养基在连续培养中以0.005-0.02h-1，优选0.02h-1的稀释率培养。历时最多10天，优选5-8天的时间，使所述菌株适应于补料培养基中存在的高甘油浓度，并且可以将稀释率增长至0.1h-1，优选增长至0.06h-1(参见实施例2)。
稀释率的逐渐增加可以在分批阶段(batch phase)结束-10天，优选在5天之后，5-8天，约7天进行，导致连续培养的生产率改进(参见实施例3)。
有利地，在适应阶段之后，补料培养基中的丙三醇浓度可以增加至120g.l-1。然而，直接尝试使菌株适应于120g.l-1的工业丙三醇不可行，即使对于105g.l-1的丙三醇浓度以0.02h-1的稀释率，再次说明了所述菌株不能在不进行在先适应的情况下在补料培养基中在高甘油浓度存在下生长。
本发明的方法，在其不同的实施例中(使用经遗传修饰的微生物和/或使用不含额外有机氮源的培养基)，导致对于0.05-0.6g.h-1的稀释率而言1，3-丙二醇以0.4-0.6g.g-1的得率和1.8-3.5g.l-1.h-1的生产率产生。优选地，所述得率为0.5-0.56g.g-1，并且所述生产率为2-2.9g.l-1.h-1。
在本发明的一个特定方面，产生的1，3-丙二醇经进一步纯化。
连续发酵方法是本领域技术人员已知的。
发酵方法通常在反应器中进行，所述反应器具有适应于所用细菌的具有已知确定的组成的无机培养基，所述培养基至少含有甘油，一种含有丙三醇的来自生物柴油生产的副产物，并且视需要含有用于代谢物产生的共底物。
本发明的这种方法优选在连续工艺中实现。本领域技术人员知晓如何掌控这些实验条件中的每一种，和如何限定用于本发明的微生物的培养条件。具体而言，梭菌在20℃-60℃，优选25℃-40℃(对于丙酮丁醇梭菌而言)的温度发酵。
用于从发酵培养基回收并最终纯化1，3-丙二醇的方法是技术人员已知的。1，3-丙二醇可以通过蒸馏分离。在大多数实施方案中，1，3-丙二醇与副产物如乙酸一起从发酵培养基中蒸馏，然后通过已知方法进一步纯化。
本发明还涉及根据上述方法获得的生物来源的1，3-丙二醇。
本发明还涉及以其同位素比为特征的生物来源的1，3-丙二醇。对氢(D/H)和碳(13C/12C)的同位素比分析为特定产品如蜂蜜(Grenier-Loustalot等，2006)或葡萄酒(Guillou等，2001)提供可靠的指标(indicator)。13C/12C同位素比为来源的区分提供指示并反映特定产物的生物合成代谢途径和使用的原料。使用Calvin-Benson光合循环的C3植物和使用Hatch-Slack光合循环的C4植物之间确实可以产生差异。专利申请WO 01/11070描述了产生自葡萄糖的生物来源的1，3-丙二醇的13C/12C同位素比为-10.9～-15.4；产生自丙三醇的生物来源的1，3-丙二醇的13C/12C同位素比为-22.41～-22.60，而化学产生的1，3-丙二醇的13C/12C同位素比为-17.95至-18.33。
根据本发明，1，3-丙二醇D/H比(记录为δD)、13C/12C比(记录为δ13C)、18O/16O比(记录为δ18O)在燃烧之后通过质谱测定。同位素13C/12C比参照国际标准品(PDB＝Pee Dee Belemite(Pee Dee箭石))作为δ按千分比(per mill)计算。同位素18O/16O比参照国际标准平均海洋水(SMOW)作为δ按千分比计算。同位素D/H比与国际标准平均海洋水(SMOW)比较按ppm计算。
尽管D/H比和13C/12C比公知用于给定产品的表征，18O/16O比却主要用于水分析作为古气候指标(paleoclimatic indicator)。
不同类型的1，3-丙二醇之间的比较显示δD没有差别。来自丙三醇的生物来源的1，3-丙二醇(本发明的目的)的δD为147.38ppm-145.84ppm，而来自葡萄糖的生物来源的1，3-丙二醇为145ppm，且对于化学1，3-丙二醇为150.19ppm-139.37ppm。
本发明涉及容许根据上述方法获得的生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于δ13C同位素值低于-34‰，优选低于-35‰，并且更优选为-35.05‰～-36.09‰。
本发明还涉及容许根据上述方法获得的生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于δ18O同位素值为21.5‰-0.5‰，优选21.9‰-15‰，并且更优选21.9‰-17.34‰。
本发明还涉及生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于以下特征之一或其组合：
-13C和18O同位素值选自低于-34‰的δ13C和21.9‰-0.5‰的δ18O，
-优选δ13C低于-35‰且δ18O为21.9‰-0.5‰，
-更优选δ13C为-35.05‰～-36.09‰且δ18O为21.9‰-17.34‰(参见实施例4)。
在本发明的一个实施方案中，所述生物来源的1，3-丙二醇的特征在于18O/13C同位素比值为-2～0；优选-1～-0.2，并且更优选-0.65～-0.4。
优选地，以前述同位素比为特征的生物来源的1，3-丙二醇是通过以作为原料的丙三醇为基础的发酵获得的。更优选地，以前述同位素比为特征的生物来源的1，3-丙二醇是从用于产生1，3-丙二醇的本发明的方法获得的。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的或如上限定的生物来源的1，3-丙二醇作为热塑性聚氨酯中的延伸链，作为聚对苯二甲酸丙二酯中的单体或作为化妆品配制物中的组分的用途。生物来源的1，3-丙二醇可以用于化学1，3-丙二醇的所有已知应用。本领域技术人员知晓如何从1，3-丙二醇获得这些终产物。
本发明涉及使用根据本发明的生物来源的1，3-丙二醇作为延伸链制备热塑性聚氨酯的方法。其还涉及制备含有根据本发明的生物来源的1，3-丙二醇的化妆品组合物的方法。其还涉及使用根据本发明的生物来源的1，3-丙二醇作为单体合成聚对苯二甲酸丙二酯的方法。
附图说明
图1：以国际标准的‰表示的PDOδ13C和δ18O：PDO1：根据描述的方法产生的PDO；PDO2：从作为底物的葡萄糖产生的PDO；PDO3：通过化学方法产生的PDO。
图2：PDO的δ18O/δ13C比：PDO1：根据描述的方法产生的PDO；PDO2：从作为底物的葡萄糖产生的PDO；PDO3：通过化学方法产生的PDO。
实施例
实施例1
用于梭菌属分批培养的合成培养基每升去离子水含有：丙三醇，30g；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5g；MgSO4，7H2O，0.2g；CoCl2 6H2O，0.01g，H2SO4，0.1ml；NH4Cl，1.5g，生物素，0.16mg；对氨基苯甲酸，32mg和FeSO4，7H2O，0.028g。将该培养基的pH使用NH4OH 3N调节至6.3。对于分批培养，使用购自Sigma(纯度99.5％)的商业丙三醇。用于连续培养的补料培养基每升自来水(tap water)含有：粗丙三醇，105g；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5g；MgSO4，7H2O，0.2g；CoCl2 6H2O，0.026g；NH4Cl，1.5g，生物素，0.16mg；对氨基苯甲酸，32mg；FeSO4，7H2O，0.04g，消泡剂，0.05ml；ZnSO4，7H2O，8mg；CuCl2，2H2O，4mg；MnSO4，H2O，40mg，H3BO3，2mg；Na2MoO4，2H2O，0.8mg。在此情况下不调节培养基pH。产生自生物柴油生产的酯交换过程的粗丙三醇由SAIPOL(Le Meriot，France)供应并且含有83％丙三醇(w/w)。
连续培养在2L生物反应器Tryton(Pierre Guerin，France)中进行，工作容积为1000ml。通过自动调整培养水平将培养容积保持恒定在1000ml。在35℃的温度以200RPM搅拌培养物，并且通过自动添加NH4OH 3N将pH维持在6.5。在实验期间控制并记录以mV表示的培养基的氧化-还原力(Oxido-Reductive Power)。为了创造厌氧条件，将容器中经灭菌的培养基用不含O2的无菌氮气在60℃冲洗1小时，并再次冲洗直至达到35℃。所述生物反应器的气体出口通过连苯三酚(pyrogallol)的布置保护其免于氧气(Vasconcelos等，1994)。在灭菌之后，将补料培养基也用不含O2的无菌氮气冲洗直至达到室温，并维持在200mbar的氮气压下以避免O2进入。
以浊度计在620nm测量细胞浓度并与直接评估的细胞干重相关联。丙三醇、1，3-丙二醇、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸以及其他痕量水平的酸的浓度通过HPLC分析来测量。在Biorad Aminex HPX087H柱上进行分离，并通过折射率实现检测。操作条件如下：流动相硫酸0.5mM；流速0.5ml/min，温度，25℃。
使用于指数生长期结束时取得的100ml烧瓶中合成培养基(与上述分批培养基相同，但是不添加乙酸，2.2g.l-1和MOPS，23.03g.l-1)上的生长中的培养物作为接种物(5％v/v)。首先将培养物分批(batch-wise)培养。在指数生长早期，加入商业丙三醇的脉冲(pulse)：将脉冲定义为在3小时期间以50ml.h-1的流速添加含商业丙三醇120g.l-1的合成培养基(与对分批培养描述的相同)(即添加18g丙三醇)。然后生长继续分批进行，并且在指数生长期结束之前，以0.06h-1的稀释率和含105g.l-1的粗丙三醇的补料培养基开始连续补料。
表1：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在105g.l-1的粗丙三醇上的连续培养(D＝0.06h-1，pH 6.5且T℃＝35℃)。给出的值代表在3次容积变化之后获得的稳态条件下7个点的平均值。
Figure BDA0000105539360000111
Y1，3-PDO：PDO产率(g/g的消耗的丙三醇)
Q1，3PDO：PDO容积生产率(volumetric productivity)
对于碳回收率的计算，从终产物浓度估计二氧化碳浓度。
实施例2
使用的合成培养基与实施例1中描述的相同。预培养、接种和分批生长在与上文所述相同的条件下进行。
以0.02h-1的稀释率和含有105g.l-1的粗丙三醇的补料培养基开始连续补料。在这些条件下数天之后(即在相当于至少3次容积变化的生物反应器接种之后8-10天)将稀释率根据以下方案从0.02h-1增加至0.05h-1：i)在48小时内增加0.01h-1单位并且ii)24-48小时的静止步骤，重复3次。培养物的稳定性通过使用先前描述的HPLC方案的产物分析来追踪。值得注意的是，我们等到残余丙三醇尽可能低时将稀释率在48小时内最终增加至0.06h-1。
表2：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在105g.l-1的粗丙三醇上的连续培养(D＝0.05h-1和0.06h-1，pH 6.5且T℃＝35℃)。给出的值代表在稳态条件下3或4个点的平均值。
Y1，3-PDO：PDO产率(g/g的消耗的丙三醇)
Q1，3PDO：PDO容积生产率
对于碳回收率的计算，从终产物浓度估计二氧化碳浓度。
在相同条件下进行的另一培养产生了相同的结果。
实施例3
使用与实施例1中描述的相同的合成培养基，只是补料培养基含有120g.l-1的粗丙三醇。预培养、接种和分批生长在与上文所述相同的条件下进行。
A)以0.02h-1的稀释率和直接含有120g.l-1的粗丙三醇的补料培养基开始连续补料。
表3：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在120g.l-1的粗丙三醇上的连续培养(D＝0.02h-1，pH 6.5且T℃＝35℃)。给出的值代表在3次容积变化之后获得的稳态条件下7个点的平均值。
Figure BDA0000105539360000122
Figure BDA0000105539360000131
Y1，3-PDO：PDO产率(g/g的消耗的丙三醇)
Q1，3PDO：PDO容积生产率
对于碳回收率的计算，从终产物浓度估计二氧化碳浓度。
B)以0.02h-1的稀释率和最初含有105g.l-1的粗丙三醇的补料培养基开始连续补料。在这些条件下数天之后(对应于至少3次容积变化)，将稀释率根据之前描述的方案从0.02h-1增加至0.06h-1。然后将补料转换至0.05h-1的稀释率和含有120g.l-1的粗丙三醇的补料培养基。
表4：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在以D＝0.06h-1、105g.l-1的粗丙三醇补料之后在120g.l-1的粗丙三醇上的连续培养(D＝0.05h-1，pH 6.5且T℃＝35℃)。给出的值代表在至少20次容积变化之后获得的3个点的平均值。
Y1，3-PDO：PDO产率(g/g消耗的丙三醇)
Q1，3PDO：PDO容积生产率
对于碳回收率的计算，从终产物浓度估计二氧化碳浓度。
实施例4
用于δ13C和δ18O值计算的方法
按照惯例将13C和18O水平表示为相对值。通常当与两种国际参照比较时将它们以百分比的形式(δ)表示。
对于13C，参照为“Vienna.PD箭石”，其为从中知晓13C值的化石碳酸盐。
用于计算δ的公式如下：
对于18O，参照为具有已知的18O值的“标准平均海洋水”(SMOW)。公式与13C的公式相同，使用18O参照值。
使用的材料和样品制备
13C
PDO的13C/12C同位素比基于实验测量的二氧化碳样本计算。为此目的，将样品在元素分析仪中燃烧，并将获得的二氧化碳注入与元素分析仪(CARLO ERBA NA 2100)偶联的质谱仪(Finnigan MAT DELTA)以供测定同位素比。以这种方式将44、45和46质量的二氧化碳分开并定量。然后通过将结果与事先相对于国际标准校准的工作参照(谷氨酸)之一相比，按δ千分数计数法(delta per thousand scale)计算。
18O
18O/16O同位素比的测量在有机化合物的连续流中进行。为此目的，将样品在微量分析烘箱的水平通过热解燃烧并将产生的一氧化碳输送至质谱仪(与元素分析仪Fisons NA1500 2型偶联的OPTIMA，或，来自Thermoelectron的与元素分析仪TC/EA偶联的质谱仪Delta V)。测定通过热解产生的一氧化碳中的28、29、30的不同同位素。然后将18O/16O同位素比通过将结果与SMOW比较按δ千分数计数法计算。
结果
对于产生自粗丙三醇的PDO，我们获得了-35.57±0.52‰的平均δ13C值，产生自葡萄糖的PDO具有-12.6‰的平均δ13C值，而化学产生的PDO具有-30.05±5.02‰的平均δ13C值。
产生自粗丙三醇的PDO具有19.76±2.42‰的平均δ18O值，产生自葡萄糖的PDO具有22.0‰的平均δ18O值，而化学产生的PDO具有-0.80±1.27‰的平均δ18O值。
如此，δ13C的测量允许区分通过发酵方法从不同原料产生的PDO。化学产生的PDO的δ13C显示高度可变性(-30.05±5.02)并且仅仅稍高于产生自丙三醇的PDO的δ13C。化学产生的PDO的δ18O具有非常低的值(-0.8±1.27)，其使得区分化学产生的PDO和来自生物来源(基于葡萄糖或丙三醇)的PDO成为可能(图1)。
显然δ18O/δ13C值允许鉴别不同的PDO(图2)，其中对于基于丙三醇的PDO的δ18O/δ13C比为-0.56，对于基于葡萄糖的PDO为-1.75，而对于化学产生的PDO为0.03。结论是产生自丙三醇的PDO能够通过测量δ13C和δ18O然后确定δ18O/δ13C来鉴定。
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Claims (22)

1.一种用于在甘油的连续发酵过程中产生1，3-丙二醇的方法，包括在培养基上培养生产微生物，所述生产微生物允许将丙三醇转化为1，3-丙二醇，和回收1，3-丙二醇，其特征在于所述培养基包含高浓度的工业甘油，所述工业甘油(glycerine)包含丙三醇(glycerol)，并且其中所述生产微生物是预先适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于在所述培养基中丙三醇以90-120g/L，优选约105g/L的浓度存在。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述工业甘油是来自生物柴油生产的副产物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述培养基是未添加有机氮源，特别是未添加酵母提取物的合成培养基。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述生产微生物选自梭菌属(genus Clostridium)的成员。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述生产微生物是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述生产微生物是经遗传修饰的细菌。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于所述生产微生物中的丙三醇脱水酶活性不依赖于辅酶B12或其多种前体中的一种的存在并且源自丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述生产微生物通过将该微生物以低稀释率在包含高浓度工业甘油的培养基上培养并选择能够在具有高浓度工业甘油的培养基上生长的适应性微生物而适应成为生产微生物。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于1，3-丙二醇经进一步纯化。
11.一种用于将微生物修饰成适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物的方法，包括将所述微生物以低稀释率在包含高浓度工业甘油的培养基上培养，并选择能够在具有高浓度工业甘油的培养基上生长的适应性微生物。
12.权利要求11的方法，其特征在于将所述微生物以低稀释率培养历时范围从24小时至10天的时间。
13.权利要求11或12的方法，其特征在于所述稀释率为0.005-0.1h-1。
14.一种适应于在高浓度工业甘油存在下生长的微生物，其容许(susceptible to be obtained by)通过如权利要求11-13中之一所述的方法获得。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法获得的生物来源的1，3-丙二醇。
16.容许根据权利要求1-10中任一项的方法获得的生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于δ13C同位素值低于-34‰，优选低于-35‰，并且更优选为-35.05‰～-36.09‰。
17.容许根据权利要求1-10中任一项的方法获得的生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于δ18O同位素值为21.5‰-0.5‰，优选21.9‰-15‰，并且更优选为21.9‰-17.34‰。
18.容许根据权利要求1-10中任一项的方法获得的生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于δ13C和δ18O同位素值选自以下值：
a)δ13C值低于-34‰且δ18O为21.5‰-0.5‰；
b)δ13C值低于-35‰且δ18O为21.9‰-15‰；或
c)δ13C值为-35.05‰至-36.09‰且δ18O为21.9‰-17.34‰。
19.容许根据权利要求1-10中任一项的方法获得的生物来源的1，3-丙二醇，其特征在于18O/13C同位素比值为-2～0，优选-1～-0.2，更优选-0.65～-0.4。
20.根据权利要求15-19中任一项的1，3-丙二醇作为热塑性聚氨酯合成中延伸链的用途。
21.根据权利要求15-19中任一项的1，3-丙二醇作为化妆品配制物中的组分的用途。
22.根据权利要求15-19中任一项的1，3-丙二醇作为聚对苯二甲酸丙二酯合成中的单体的用途。
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