CN102429858B - 缓释bio/igf的复合水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法及其应用，涉及一种缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法及其应用。方法：将由BIO和IGF组成的混合液加入到明胶溶液中，搅拌滴加丙酮，加入戊二醛，离心得纳米微球；向海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠，摇床摇动，加入乙二醇，摇床摇动，加入氯化钠，加入无水乙醇，得到沉淀物，用去离子水溶解沉淀物，透析，冻干，取冻干后的粉末与明胶溶液混匀，制得氧化的海藻酸钠水凝胶；取纳米微球离心，得沉淀物加入到海藻酸钠水凝胶中混匀，即得缓释BIO/IGF的复合水凝胶。缓释BIO/IGF的复合水凝胶可用于治疗心肌梗死。制备的纳米微球为纳米级别的药物包载体，可被细胞吞噬，利于细胞吸收。

Description

缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

心肌梗死及其引起的心衰是全球高发病率且难治愈的顽疾，而且是工业国家高居死亡率榜首的疾病，因此治愈心脏疾病迫在眉睫。

由于心肌缺血后导致的心肌细胞的死亡是导致心肌功能丧失的关键问题，因此补充新的心肌细胞是治疗心肌梗死的首选策略，目前主要有两种心肌细胞补充策略：(一)依靠外源细胞移植的研究策略，例如胚胎干细胞移植等。尽管移植细胞都能够补充受损心脏所缺失的细胞，但是存在伦理道德问题等而限制了其应用前景。(二)通过刺激心肌细胞进行原位增殖修复梗死心肌组织的策略，所采取的方式主要是通过不同的药物(多数是小分子化合物)来激活或者抑制某些分子途径，使得细胞重新进入细胞周期。例如：GSK-3β抑制剂，其中有研究表明小分子物质BIO能抑制GSK-3β(糖元合成酶激3β)而促进哺乳动物心肌细胞增殖。尽管此方法能够促进心肌细胞增殖，但是促进心肌细胞增殖的多为小分子化合物，需要持续维持药物浓度才能够使其发挥作用。

基于此我们探究细胞原位增殖的策略来使心肌组织再生从而修复心功能。所采取的方式是在心肌梗死病患的心肌组织处原位注射包裹BIO(6-溴淀玉红-3肟)和IGF(类胰岛素生长因子)药物的gelatin纳米微球承载于氧化的海藻酸钠可注射水凝胶中的凝胶复合纳米微球的药物缓释系统。另外，药物缓释所存在的burst效应及长效缓释等问题是现在困扰药物治疗心梗的瓶颈，我们通过化学交联的原理使得纳米微球与水凝胶结合稳定性好来避免缓释之初药物浓度不受控制，而且我们所采取的这种化学交联方式能够使得缓释的进行可以根据环境中的pH值变化而受到相应控制，从而实现缓释的可控化。

发明内容

本发明提供一种缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法及其应用。

本发明缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，按以下步骤进行：一、在50℃条件下，将由BIO和IGF组成的混合液加入到质量浓度为4％～6％的明胶溶液中，以5000～6000r/min进行搅拌，同时滴加丙酮，然后加入戊二醛，之后以5000～7000r/min离心5～8h，即得到包覆BIO和IGF的纳米微球；二、在避光条件下，向质量浓度为0.5mg/mL的海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠，高碘酸钠与海藻酸钠溶液的体积比为1∶350～450，溶解后在4℃条件下置于摇床上摇动5～8h，得溶液A，向溶液A中加入乙二醇，乙二醇与溶液A的体积比为1∶150～250，再置于摇床上摇动2～3h，得溶液B，向溶液B中加入氯化钠，氯化钠的质量与溶液B的体积比为1～1.5g∶10mL，溶解后得到溶液C，向溶液C中加入无水乙醇，溶液C与无水乙醇的体积比为1∶1，得到沉淀物X，用去离子水溶解沉淀物X，沉淀物X与去离子水的体积比为1∶9～11，得溶液D，将溶液D放入40KD的透析袋中，在4℃条件下透析24～72h，然后用冻干机冻干，取冻干后的粉末与质量浓度为60％的明胶溶液混匀，冻干后的粉末质量与明胶溶液的体积比为0.5～0.7g∶1mL，制得氧化的海藻酸钠水凝胶；三、取步骤一制得的纳米微球以12000r/min离心，得沉淀物Y，取沉淀物Y加入到步骤二制得的海藻酸钠水凝胶中，混合均匀，即得到缓释BIO/IGF的复合水凝胶；其中步骤一中BIO和IGF的体积比为1∶1，BIO和IGF组成的混合液与明胶溶液的体积比为1∶900～1100，明胶溶液与丙酮的体积比为1∶1～2，明胶溶液与戊二醛的体积比为4～6∶1；步骤三中沉淀物Y的质量与海藻酸钠水凝胶的体积比为1g∶50～55mL。

上述缓释BIO/IGF的复合水凝胶可用于治疗心肌梗死。

本发明为了促进病患自身的心肌细胞增殖和血管增殖而通过将纳米微球与氧化的海藻酸钠水凝胶交联形成的缓释系统注射到心肌梗死部位使其原位缓释BIO和IGF-1，且可以根据环境条件的改变而自行调整缓释的速度和强度，可用于治疗心肌梗死。

本发明制备的包载有BIO和IGF药物的纳米微球个体均匀，且体积较小，为纳米级别的药物包载体，可以被细胞吞噬，利于细胞吸收。而且其制备材料为生物相容性好的明胶，不会对细胞造成毒性和炎症反应。

本发明中纳米微球和水凝胶交联的原理是：明胶上的游离氨基与海藻酸钠水凝胶中的醛基形成的腙键，腙键不稳定，对其所处环境中的pH值极其敏感，当pH值改变时，腙键或断裂或形成。例如当受损后心脏微环境中的pH值降低时，腙键断裂而大量缓释微球，则可以大量缓释药物作用于受损的心肌细胞。

附图说明

图1为具体实施方式十一制备的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的力学性能图；图2为具体实施方式十一制备的缓释BIO/IGF的复合水凝胶在4℃下的缓释曲线；图3为具体实施方式十一大鼠原代心肌细胞实验中缓释BIO/IGF的复合水凝胶的心肌细胞共聚焦显微照片；图4为具体实施方式十一大鼠原代心肌细胞实验中没有包覆BIO和IGF的复合水凝胶的心肌细胞共聚焦显微照片；图5为具体实施方式十一超声检测SD大鼠的测左心室的射血分数图表；图6为具体实施方式十一超声检测SD大鼠的短轴缩短率图表；图7为具体实施方式十一超声检测SD大鼠的心脏膨大指数图表；图8为具体实施方式十一超声检测SD大鼠的左心室壁厚度图表。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，按以下步骤进行：一、在50℃条件下，将由BIO和IGF组成的混合液加入到质量浓度为4％～6％的明胶溶液中，以5000～6000r/min进行搅拌，同时滴加丙酮，然后加入戊二醛，之后以5000～7000r/min离心5～8h，即得到包覆BIO和IGF的纳米微球；二、在避光条件下，向质量浓度为0.5mg/mL的海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠，高碘酸钠与海藻酸钠溶液的体积比为1∶350～450，溶解后在4℃条件下置于摇床上摇动5～8h，得溶液A，向溶液A中加入乙二醇，乙二醇与溶液A的体积比为1∶150～250，再置于摇床上摇动2～3h，得溶液B，向溶液B中加入氯化钠，氯化钠的质量与溶液B的体积比为1～1.5g∶10mL，溶解后得到溶液C，向溶液C中加入无水乙醇，溶液C与无水乙醇的体积比为1∶1，得到沉淀物X，用去离子水溶解沉淀物X，沉淀物X与去离子水的体积比为1∶9～11，得溶液D，将溶液D放入40KD的透析袋中，在4℃条件下透析24～72h，然后用冻干机冻干，取冻干后的粉末与质量浓度为60％的明胶溶液混匀，冻干后的粉末质量与明胶溶液的体积比为0.5～0.7g∶1mL，制得氧化的海藻酸钠水凝胶；三、取步骤一制得的纳米微球以12000r/min离心，得沉淀物Y，取沉淀物Y加入到步骤二制得的海藻酸钠水凝胶中，混合均匀，即得到缓释BIO/IGF的复合水凝胶；其中步骤一中BIO和IGF的体积比为1∶1，BIO和IGF组成的混合液与明胶溶液的体积比为1∶900～1100，明胶溶液与丙酮的体积比为1∶1～2，明胶溶液与戊二醛的体积比为4～6∶1；步骤三中沉淀物Y的质量与海藻酸钠水凝胶的体积比为1g∶50～55mL。

本实施方式所述BIO为6-溴淀玉红-3肟，所述IGF为类胰岛素生长因子。BIO和IGF为购买得到。

本实施方式制备的缓释BIO/IGF的复合水凝胶在室温条件下为液体状，放置30分钟后凝固为类固体，其粘性模量和弹性模量均在100000MPa。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中BIO和IGF组成的混合液与明胶溶液的体积比为1∶1000。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中明胶溶液与戊二醛的体积比为5∶1。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中高碘酸钠与海藻酸钠溶液的体积比为1∶400。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中乙二醇与溶液A的体积比为1∶200。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中氯化钠的质量与溶液B的体积比为1.5g∶10mL。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中沉淀物X与去离子水的体积比为1∶10。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二冻干后的粉末质量与明胶溶液的体积比为0.6g∶1mL。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中沉淀物Y的质量与海藻酸钠水凝胶的体积比为1g∶50mL。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，按以下步骤进行：一、在50℃条件下，将由10μL BIO和10μL IGF组成的混合液加入到10mL质量浓度为5％的明胶溶液中，以6000r/min进行搅拌，同时滴加10mL丙酮，然后加入200μL戊二醛，之后以6000r/min离心6h，即得到包覆BIO和IGF的纳米微球；二、在避光条件下，向10mL质量浓度为0.5mg/mL的海藻酸钠溶液中加入0.25g高碘酸钠，溶解后在4℃条件下置于摇床上摇动6h，得溶液A，向溶液A中加入200μL乙二醇，再置于摇床上摇动2h，得溶液B，向溶液B中加入0.5g氯化钠，溶解后得到溶液C，向溶液C中加入10mL无水乙醇，得到沉淀物X，用10mL去离子水溶解沉淀物X，得溶液D，将溶液D放入40KD的透析袋中，在4℃条件下透析54h，然后用冻干机冻干，取0.12mg冻干后的粉末与200μL质量浓度为60％的明胶溶液混匀，制得氧化的海藻酸钠水凝胶；三、取200μL步骤一制得的纳米微球以12000r/min离心，得沉淀物Y，取沉淀物Y加入到200μL步骤二制得的海藻酸钠水凝胶中，混合均匀，即得到缓释BIO/IGF的复合水凝胶。

本实施方式步骤一得到的纳米微球的直径为50nm左右，水凝胶的力学性能为100000MPa，凝固时间为30分钟。

本实施方式制备的缓释BIO/IGF的复合水凝胶在室温条件下为液体状，放置30分钟后凝固为类固体。缓释BIO/IGF的复合水凝胶的力学性能如图1所示。图中-●-表示粘性模量，-■-表示弹性模量。横坐标为频率，单位赫兹；纵坐标为压强，单位帕斯卡。当压强逐渐增大时，弹性模量和粘性模量都没有过多的变化，表明物质没有发生相的变化，说明水凝胶的结构稳定。水凝胶的粘性模量高于100000Pa，说明其力学性能比较好。

本实施方式制备的缓释BIO/IGF的复合水凝胶在4℃下的缓释曲线如图2所示，◇表示包覆BIO和IGF的纳米微球，■表示缓释BIO/IGF的复合水凝胶。本实施方式制备的缓释BIO/IGF的复合水凝胶可缓慢释放BIO和IGF。

具体实施方式十一：本实施方式缓释BIO/IGF的复合水凝胶的应用在于缓释BIO/IGF的复合水凝胶可用于治疗心肌梗死。

实验一：大鼠原代心肌细胞实验

取105个乳鼠(即出生1～2天的大鼠)的原代心肌细胞，用质量浓度为0.25％的胰酶充分消化后，将心肌细胞与海藻酸钠溶液混合均匀，然后向此溶液中逐滴加入氯化钙溶液，滴加瞬间即可形成微囊，即制得了包覆有细胞的海藻酸钠微囊。细胞可以在此微囊中生长和增殖，将此微囊置于DMEM培养基中培养7天，然后将1mL缓释BIO/IGF的复合水凝胶加入到培养瓶中进行共培养，培养7天后的心肌细胞共聚焦显微照片如图3所示。并以没有包覆BIO和IGF的复合水凝胶加入到另一培养瓶中共培养作为对照，培养7天后的心肌细胞共聚焦显微照片如图4所示。

由图3和图4可知加入缓释BIO/IGF的复合水凝胶共培养的心肌细胞数量明显增加，说明缓释BIO/IGF的复合水凝胶释放出的药物可以促进原代心肌细胞增殖。

实验二：SD大鼠实验

1、缓释BIO/IGF的复合水凝胶的注射和多普勒超声

取200μL缓释BIO/IGF的复合水凝胶，用1mL的普通注射器，在16只心肌梗死后的SD大鼠的心肌梗死部位分为三点进行等量的注射，只注射一次，之后不对SD大鼠做任何实验处理，只是饲养，作为缓释BIO/IGF的复合水凝胶组。同时设置空白组和假手术组，空白组使用的水凝胶为没有包覆BIO和IGF的复合水凝胶，假手术组是只对大鼠做开胸手术，而不作心梗模型。6周后，对SD大鼠做多普勒超声检测左心室的射血分数、左心室的容积面积、整个心室的面积、梗死区厚度、短轴缩短率和前壁厚度等表征心功能的指标。

超声结果以心梗(MI)建模后所测得的超声值作为基线。

超声检测SD大鼠的测左心室的射血分数图表如图5所示，图中■为心梗(MI)建模后所测得的超声值，□为经过空白组、缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、假手术组处理后所测得的超声值。图中A1为空白组、A2为缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、A3为假手术组。左心室的射血分数，是表征心功能射血的能力，越高说明心功能越好。

超声检测SD大鼠的短轴缩短率图表如图6所示，图中■为心梗(MI)建模后所测得的超声值，□为经过空白组、缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、假手术组处理后所测得的超声值。图中B1为空白组、B2为缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、B3为假手术组。短轴缩短率是心脏在射血的时候形变的表征量，短轴缩短率变化越大说明心脏形变越大，射血越多，心功能越好。

心脏膨大指数的计算公式为：膨大指数＝(左心室的容积面积-整个心室的面积)/梗死区厚度。超声检测SD大鼠的心脏膨大指数图表如图7所示，图中■为心梗(MI)建模后所测得的超声值，□为经过空白组、缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、假手术组处理后所测得的超声值。图中C1为空白组、C2为缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、C3为假手术组。心室膨大指数的变化表明心脏在梗死后的形变情况。膨大指数越大，心脏的形变越大。

超声检测SD大鼠的左心室壁厚度图表如图8所示，图中■为心梗(MI)建模后所测得的超声值，□为经过空白组、缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、假手术组处理后所测得的超声值。图中D1为空白组、D2为缓释BIO/IGF的复合水凝胶组、D3为假手术组。在心脏梗死后，梗死区是细胞死亡缺失而变薄，所以梗死区厚度越厚说明心功能越好。

由图5至图8可以看出，缓释BIO/IGF的复合水凝胶对于心功能修复有着积极的促进作用，可以促进梗死区的细胞再生，修复心功能。

Claims (10)

1.缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，按以下步骤进行：一、在50℃条件下，将由BIO和IGF组成的混合液加入到质量浓度为4%～6%的明胶溶液中，以5000～6000r/min进行搅拌，同时滴加丙酮，然后加入戊二醛，之后以5000～7000r/min离心5～8h，即得到包覆BIO和IGF的纳米微球；二、在避光条件下，向质量浓度为0.5mg/mL的海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠，高碘酸钠与海藻酸钠溶液的体积比为1:350～450，溶解后在4℃条件下置于摇床上摇动5～8h，得溶液A，向溶液A中加入乙二醇，乙二醇与溶液A的体积比为1:150～250，再置于摇床上摇动2～3h，得溶液B，向溶液B中加入氯化钠，氯化钠的质量与溶液B的体积比为1～1.5g:10mL，溶解后得到溶液C，向溶液C中加入无水乙醇，溶液C与无水乙醇的体积比为1:1，得到沉淀物X，用去离子水溶解沉淀物X，沉淀物X与去离子水的体积比为1:9～11，得溶液D，将溶液D放入40KD的透析袋中，在4℃条件下透析24～72h，然后用冻干机冻干，取冻干后的粉末与质量浓度为60%的明胶溶液混匀，冻干后的粉末质量与明胶溶液的体积比为0.5～0.7g:1mL，制得氧化的海藻酸钠水凝胶；三、取步骤一制得的纳米微球以12000r/min离心，得沉淀物Y，取沉淀物Y加入到步骤二制得的海藻酸钠水凝胶中，混合均匀，即得到缓释BIO/IGF的复合水凝胶；其中步骤一中BIO和IGF的体积比为1:1，BIO和IGF组成的混合液与明胶溶液的体积比为1:900～1100，明胶溶液与丙酮的体积比为1:1～2，明胶溶液与戊二醛的体积比为4～6:1；步骤三中沉淀物Y的质量与海藻酸钠水凝胶的体积比为1g:50～55mL；其中，所述的BIO为6-溴淀玉红-3肟，所述IGF为类胰岛素生长因子。

2.根据权利要求1所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤一中BIO和IGF组成的混合液与明胶溶液的体积比为1:1000。

3.根据权利要求1或2所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤一中明胶溶液与戊二醛的体积比为5:1。

4.根据权利要求3所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤二中高碘酸钠与海藻酸钠溶液的体积比为1:400。

5.根据权利要求4所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤二中乙二醇与溶液A的体积比为1:200。

6.根据权利要求5所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤二中氯化钠的质量与溶液B的体积比为1.5g:10mL。

7.根据权利要求6所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤二中沉淀物X与去离子水的体积比为1:10。

8.根据权利要求7所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤二冻干后的粉末质量与明胶溶液的体积比为0.6g:1mL。

9.根据权利要求8所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤三中沉淀物Y的质量与海藻酸钠水凝胶的体积比为1g:50mL。

10.权利要求1所述的缓释BIO/IGF的复合水凝胶的应用，其特征在于缓释BIO/IGF的复合水凝胶可用于制备治疗心肌梗死的药物。

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