CN102409102A

CN102409102A - 一种鉴别牛分枝杆菌的pcr引物及方法

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Publication number: CN102409102A
Application number: CN201110391925XA
Authority: CN
Inventors: 周向梅; 赵德明; 李华; 林敬钧; 杨利峰; 尹晓敏; 杨春华
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-11-30
Also published as: CN102409102B

Abstract

本发明提供了牛分枝杆菌PCR鉴别用5对引物及鉴别方法，5对引物分别针对分枝杆菌属细菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群(MTBC)Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的Rv1970，牛分枝杆菌pncA基因和RD1区基因进行扩增，生成特异扩增片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1～5所示。本发明的鉴别方法是以样品总DNA为模板，利用上述5对引物分别进行PCR扩增，根据扩增条带的大小判定结果。本发明引物能特异性地鉴别出分枝杆菌属，MTBC，结核分枝杆菌，牛分枝杆菌及牛分枝杆菌BCG，检测方法灵敏度好，方法简便，操作简单，能实现牛分枝杆菌快速、大通量的检测。

Description

一种鉴别牛分枝杆菌的PCR引物及方法

技术领域

本发明涉及生物检测鉴别技术，具体地说涉及对牛分枝杆菌进行PCR鉴别用引物及使用该引物的PCR鉴别方法。

背景技术

牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性传染病，该病可通过病畜或其产品传染给人类或其他动物。感染牛结核分枝杆菌的大多数牛不呈显性感染或仅到晚期才出现临床症状，故早期临床诊断不易获得准确结果。病原学检查是最确实的方法之一，病理学检查可以根据特征病变确诊，但必须在动物死亡或宰杀后进行且所需确诊周期长，需3-8周，所以常常不被实际工作所采用。由于牛奶、牛肉等食品与人类生活息息相关，结核杆菌可侵犯人和动物的全身各器官，以肺结核最常见。因此及时确定病原菌，合理进行牛结核病的防控有利于保障公共卫生安全。

结核分枝杆菌复合群(MTBC)包括结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌I型和II型、牛分枝杆菌、卡介苗、田鼠分枝杆菌、caprae分枝杆菌以及canettii分枝杆菌。目前临床上鉴别牛结核杆菌的方法最广泛的是变态反应诊断，但该法存在着极强的非特异性反应，即在相当数量的结核变态反应阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核杆菌，或仅仅分离出非典型的分枝杆菌，而且妊娠母牛仍然检出率低，在重复检疫时阳性率下降，因此在实际工作中用于诊断牛结核病并不十分理想。

近年来，以聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR为代表的分子生物学技术在结核或副结核病原菌快速检测鉴别方面发展较快，但均为针对结核分枝杆菌复合群，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌单独菌种的方法，也有直接通过基因分型方法直接鉴别出分枝杆菌各种型的，然而这些方法有的只给出了鉴别单独菌株的引物，有的给出了很多信息，却没有进行灵敏度试验，这对于临床运用是不够完善的，有的不够经济，成本较高，如荧光定量PCR。例如2002年Richard C.Huard等建立了鉴别分枝杆菌复合群中各菌株的PCR方法，能特异性的鉴别出MTBC中的各种菌；2007年张鹭等根据牛分枝杆菌MPB70的特异性基因序列进PCR扩增，检测牛奶中的MTBC，阳性率达到40.9％，灵敏度达到40ng/L；2007年孟祥红等人建立了多重PCR技术可以快速鉴别结核分枝杆菌和非分结核分枝杆菌，应用多重PCR法与BACTEC培养的结果有很高的一致性，为临床结核病和分枝杆菌病的鉴别诊断提供了有效的手段；2010年贾广乐等根据IS1081序列设计荧光定量PCR引物及探针，建立了牛结核病TaqMan荧光定量PCR检测方法。上述方法，都只是单独的给出了鉴别某一种菌的PCR相关方法，有的采用探针杂交，荧光定量等经济成本较高的方法，这些都不利于临床检测样品，目前还没有系统地使用整套引物对分枝杆菌属类的主要细菌进行鉴别的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别牛分枝杆菌的PCR用引物及PCR鉴别方法。

本发明用于PCR鉴别牛分枝杆菌的特异性引物组合，用于鉴别分枝杆菌属、结核分枝杆菌复合群、结核杆菌、牛分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG株。其分别能对分枝杆菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群(MTBC)Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的Rv1970，牛分枝杆菌pncA基因和RD1区基因进行扩增，生成特异性扩增片段。

本发明提供的牛分枝杆菌PCR鉴别用引物组合，包括：

1 16SrRNA-F 5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’；

16SrRNA-R 5’-TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’；

2MTBC-F 5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’；

MTBC-R 5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’；

3MT-F 5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’；

MT-R 5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’；

4PncA-F 5’-CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’；

PncA-R 5’-CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’；

5RD1-F 5’-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’；

RD1-R 5’-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。

本发明提供一种牛分枝杆菌PCR鉴别方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物组合分别进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

本发明提供一种鉴别牛分枝杆菌的PCR方法，还包括：当待测菌为未知菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第1～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为分枝杆菌属细菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第2～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为结核分枝杆菌复合群细菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第3～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为结核分枝杆菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第4～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为牛分枝杆菌细菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第5对引物，进行PCR扩增；反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

含有16SrRNA、MTBC、PncA引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min；或

含有MT引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，61℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min；或

含有RD1引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min。

上述PCR扩增反应体系，其中20μl反应液的具体配置为：

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具。

使用本发明的引物以及方法进行鉴别的样品来源包括分离的菌种资源或动物组织，但并不局限于此。

本发明提供了上述5对引物在制备用于检测及鉴别牛分枝杆菌的试剂中的用途。

应用本发明的PCR鉴别方法能鉴别出减毒的牛结核分枝杆菌，如BCG，而减毒牛结核分枝杆菌常常作为制备预防结核病的疫苗的种子来源，因此本发明还提供了上述5种引物或本发明的PCR鉴别分枝杆菌的方法在制备预防结核病疫苗中的应用。

本发明提供的5对引物是经过筛选优化获得的，可以逐步缩小待检分枝杆菌所属范围，获得准确的相关检测结果，一旦在整套反应方向上某对引物出现阴性结果，就立即可以确定待检分枝杆菌所属范围，这是与分枝杆菌属、种群分类复杂性相关的。分枝杆菌属、结核杆菌复合群MTBC、结核杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG株关系图见图17。

通过使用本发明的5对引物，分别对所测菌种的DNA进行PCR扩增，生成特异扩增片段，从而能够简单且精确地对分枝杆菌进行鉴别。并且，本发明的引物仅针对目的片段特异扩增，不会扩增其它区域，并且，本研究建立了牛分枝杆菌的检测方法，可以将临床未知样品从分枝杆菌属开始进行鉴别，逐步鉴别出结核分枝杆菌复合群，结核杆菌，牛分枝杆菌以及牛分枝杆菌经过传代获得的减毒株BCG株，形成一套鉴别牛分枝杆菌的完整的PCR方法。该方法简便，操作简单，一台PCR仪就可以完成，实现快速、大通量诊断和检测。比采用一对引物鉴别出单独菌株的方法更可靠，降低了鉴别时易造成假阴性或假阳性结果的概率，也可以对实验室保存的菌株进行监测，确保菌株保存过程中没有被别的杂菌污染。研究表明本研究建立的这一套PCR方法体系，特异性达到100％，灵敏度达到pg级。

附图说明

图1为1％琼脂糖凝胶电泳检测16S rRNA引物PCR产物结果，产物条带大小为543bp；M：分子量标准为2K plus DNA marker，1：结核分枝杆菌参考株C68503；2：牛分枝杆菌参考株C68001；3：BCG；4：耻垢分枝杆菌标准株cm²155；5：禽分枝杆菌参考株C68201；6：葡萄球菌(CAU0411)；7：大肠杆菌(CAU0439)；8：空白对照；

图2为1％琼脂糖凝胶电泳检测MTBC引物PCR产物结果，产物条带大小为786bp，M：分子量标准为2K plus DNA marker，1：结核分枝杆菌参考株C68503；2：牛分枝杆菌参考株C68001；3：BCG；4：耻垢分枝杆菌；5：禽分枝杆菌参考株C68201；6：空白对照；

图3为1％琼脂糖凝胶电泳检测MT引物PCR产物结果，产物条带大小分别为1116bp，M：分子量标准为2K plus DNA marker，1：结核分枝杆菌参考株C68503；2：牛分枝杆菌参考株C68001；3：BCG；4：空白对照；

图4为1％琼脂糖凝胶电泳检测pncA引物PCR产物结果，产物条带大小为294bp，M：分子量标准为2K plus DNA marker，1：牛分枝杆菌参考株C68001；2：BCG；3：结核分枝杆菌参考株C68503；4：空白对照；

图5为1％琼脂糖凝胶电泳检测RD1引物PCR产物结果，产物条带大小分别为200bp，M：分子量标准为2K plus DNA marker，1：BCG；2：牛分枝杆菌参考株C68001；3：空白对照；

图6为16S rRNA引物敏感性检测1：4ng，2：400pg，3：40pg，4：4pg，5：阴性对照，M：分子量标准为2K plus DNAmarker；

图7MTBC引物敏感性检测1：4ng，2：400pg，3：40pg，4：4pg，5：400fg，6：阴性对照M：分子量标准为2K plus DNA marker；

图8MT引物敏感性检测1：12ng，2：1.2ng，3：240pg，4：48pg，5：9.6pg，6：1.92pg，7：阴性对照M：分子量标准为2K plus DNAmarker；

图9pncA引物敏感性检测1：4ng，2：400pg，3：40pg，4：4pg，5：400fg，6：阴性对照M：分子量标准为2K plus DNA marker；

图10RD1引物敏感性检测1：25ng，2：4.7ng，3：470pg，4：47pg，5：4.7pg，6：470fg，7：阴性对照M：分子量标准为2K plus DNAmarker；

图1116S rRNA引物鉴别结果1～7：编号分别为1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M：分子量标准为2K plus DNA marker；

图12MTBC引物鉴别结果1～7：编号分别为1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M：分子量标准为2K plus DNA marker；

图13MT引物鉴别结果1～7：编号分别为1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M：分子量标准为2K plus DNA marker；+：阳性对照；-：阴性对照；

图14pncA引物鉴别结果1～7：编号分别为1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M：分子量标准为2K plus DNA marker；+：阳性对照；-：阴性对照；

图15RD1引物鉴别结果1～5：编号分别为1，2，4，6，7，的保存菌株；M：分子量标准为2K plus DNA marker；+：阳性对照；-：阴性对照。

图16临床上对疑似结核杆菌感染的猫皮肤结节组织液PCR鉴别；

M：分子量标准为2K plus DNA marker，1：16SrRNA引物PCR结果；2：MTBC引物PCR结果；3：MT引物PCR结果；4：PncA引物PCR结果；5：RD1引物PCR结果；

图17本PCR鉴别方法可检测的分枝杆菌属、结核杆菌复合群MTBC、结核杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG株关系示意图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所用菌株为：牛分枝杆菌参考株C68001，结核分枝杆菌参考株C68503，牛分枝杆菌BCG参考株C68017，禽分枝杆菌参考株C68201购自中国兽医药品监察所；耻垢分枝杆菌标准株cm²155以及非结核分枝杆菌临床分离株C68203，由本实验保存；葡萄球菌、大肠杆菌，本实验室保存，编号为CAU0411，CAU0439)。

实施例1PCR特异性引物的设计

16SrRNA所对应的16S rDNA基因在细菌基因组中具有高度保守性，可以鉴别属的细菌的原理，首先根据分枝杆菌属16Sr RNA保守区设计引物，目的片段大小为543bp序列，利用软件和Primer 3设计引物，引物序列为：

16SrRNA-F 5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’；

16SrRNA-R 5’-TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’；

Rv0577为MTBC限定基因，根据这段基因设计引物，PCR扩增的目的片段大小为786bp。引物序列为：

MTBC-F 5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’；

MTBC-R 5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’；

由于缺失区7(deleted region7，RD7)不存在于其他MTBC菌种中，只有结核分枝杆菌具有这个基因区，根据这段区域中的Rv1970(lprM)设计引物，PCR扩增的目的片段大小为1116bp。引物序列为：

MT-F 5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’；

MT-R 5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’；

试验证明，人结核分枝杆菌与牛分枝杆菌在吡喹酰胺编码基因pncA上存在SNP现象，利用基因点突变的特点，设计引物，可以特异性的鉴别出牛分枝杆菌(包括BCG株)，牛分枝杆菌(以及BCG株)能特异性的扩增出298bp的条带，而结核分枝杆菌没有条带。。引物序列为：

PncA-F 5’-CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’；

PncA-R 5’-CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’；

NCBI基因分析结果表示，RD1区仅仅存在于致病性的分枝杆菌中，RD1区基因全长9.5kb，共9个开放阅读框(Rv3871-3879)，因此我们可以以此来区分牛分枝杆菌与BCG，BCG株缺少基因RD1区，根据这段基因设计引物，对牛分枝杆菌而言，不能有效的扩增出全长为9.5kb的RD1序列，而BCG只能扩增出200bp的产物，故可以特异性的鉴别出这两者。引物序列为：

RD1-F 5’-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’；

RD1-R 5’-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。

实施例2PCR扩增方法的建立

1、PCR反应体系以细菌总DNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系为：

2、PCR反应条件

含有16SrRNA、MTBC、PncA引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min；

含有MT引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，61℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min；

反应结束后扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果。

实施例3PCR方法的特异性检验

分别以结核分枝杆菌C68503、牛分枝杆菌C68001、牛分枝杆菌BCGC68017、耻垢分枝杆菌cm²155、禽分枝杆菌C68201、葡萄球菌CAU0411、大肠杆菌CAU0439的DNA为模板，以水为空白对照，分别用本发明的5对引物，通过本发明建立的PCR方法进行检验，PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳的特异性扩增条带判定结果。

试验结果：

16SrRNA 引物的PCR结果：分枝杆菌属的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它菌株和空白对照均没有目的扩增片段出现，结果见图1。

MTBC 引物的PCR结果：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和BCG出现阳性扩增，耻垢分枝杆菌、禽分枝杆菌和空白对照没有目的扩增片段出现，结果见图2。

MT引物的PCR结果：结核分枝杆菌出现阳性扩增，牛分枝杆菌、BCG和空白对照没有目的扩增片段出现，结果见图3。

pncA 引物的PCR结果：牛分枝杆菌和BCG出现阳性扩增，结核分枝杆菌和空白对照没有目的扩增片段出现，结果见图4。

RD1引物的PCR结果：BCG出现阳性扩增，牛分枝杆菌和空白对照没有目的扩增片段出现，结果见图5。

反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后，与pGEM-T easy载体连接，转化DH5α感受态细胞；再用OMEGA的质粒提取试剂盒纯化重组质粒，送测序公司测序。结果表明：本发明设计的5对引物具有很好的特异性，能特异性的鉴别出分枝杆菌属，结核分枝杆菌复合群，结核分枝杆菌，牛分枝杆菌及BCG。

实施例4PCR方法的灵敏度检验

以牛分枝杆菌参考株，人结核分枝杆菌参考菌株，牛分枝杆菌BCG参考株为模板，分别检测其DNA浓度为4ng/μl，12ng/μl和47ng/μl，并进行梯度稀释，最后牛分枝杆菌参考株每个稀释度含400fg、4pg、40pg、400pg、4ng的DNA；人结核分枝杆菌参考菌株每个稀释度含1.2pg、9.6pg、48pg、240pg、1.2ng、12ng的DNA；牛分枝杆菌BCG参考株每个稀释度含470fg、4.7pg、47pg、470pg、4.7ng、25ng的DNA；按照上述PCR体系和条件分别进行扩增，检验其敏感性。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳(见图6，7，8，9，10)。结果表明，16S rRNA引物、MTBC引物、pncA引物灵敏度可以检测到40pg的DNA；MT引物灵敏度可以检测到9.6pg的DNA；ET引物灵敏度可以检测到470fg的DNA，说明本发明PCR方法具有很好的灵敏度。

实施例5PCR方法的应用

使用所建立的PCR方法，对实验室保存的7株分枝杆菌进行鉴别。这7株分枝杆菌分别是：

1：C68021，牛分枝杆菌，来自英国中央兽医实验室，AN5；

2：C68004，牛分枝杆菌，来自哈尔滨兽研所，北京系；

3：C68501，结核分枝杆菌，保存于中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室；

4：C68006，牛分枝杆菌，分离于结核病牛，北京，1953，保存于中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室；

5：C68203，鸟分枝杆菌，分离于结核病鸡，保存于中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室；

6：C68017，来自卫生部检定所的BCG；

7：3003-13，来自中国疾病预防控制中心的BCG。

首先将7株分枝杆菌进行增菌培养，提取细菌DNA，以该DNA为模板，分别用上述5对引物以及PCR体系和条件，对7株分枝杆菌进行扩增，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳(见图11，12，13，14，15)。结果如表1所示。

表1实验室保存菌株鉴别结果

结果表明：用本发明建立的PCR鉴别方法对本实验保存的7株已知菌株进行检测，包括1株环境分枝杆菌，1株结核分枝杆菌，3株牛分枝杆菌，2株BCG，检测结果与预期一致，说明本发明建立的PCR鉴别方法能够对分枝杆菌进行逐步鉴别，且结果可靠。

实施例6本发明PCR方法的临床应用

中国农业大学动物医院接收一例疑似结核分枝杆菌感染的猫，因之前主人给该猫饲喂生牛肉，故怀疑为牛分枝杆菌感染。采用本发明的PCR方法进行鉴别。具体是从该猫的皮肤结节中抽取组织液，直接提取样品的DNA，用本发明建立的PCR方法进行鉴别，结果见图16。鉴别结果如表2所示：

表2本发明方法检测猫皮肤样品结果

由鉴别结果可知，该猫感染了牛分枝杆菌。

Claims

1.一种用于PCR鉴别牛分枝杆菌的特异性引物组合，其特征在于，其分别能对分枝杆菌属细菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群MTBC的Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的Rv1970，牛分枝杆菌pncA基因和RD1区基因进行扩增，生成特异性扩增片段。

2.如权利要求1所述的PCR鉴别用引物组合，包括：

116SrRNA-F 5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGT T TC-3’；

16SrRNA-R 5’-TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’；

2MTBC-F 5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’；

MTBC-R 5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’；

3MT-F 5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’；

MT-R 5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’；

4PncA-F 5’-CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’；

PncA-R 5’-CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’；

5RD1-F 5’-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’；

RD1-R 5’-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。

3.一种鉴别牛分枝杆菌的PCR方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物分别进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

4.如权利要求3所述的方法，还包括：当待测菌为未知菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第1～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为分枝杆菌属细菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第2～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为结核分枝杆菌复合群细菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第3～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为结核分枝杆菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第4～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为牛分枝杆菌细菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第5对引物，进行PCR扩增；反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

5.如权利要求3或4所述的PCR方法，其特征在于，

6.如权利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系，其中20μl反应液的具体配置为：

7.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自分离的菌种资源或动物组织。

8.一种鉴别牛分枝杆菌的试剂盒，其包括，权利要求1或2所述的引物组合。

9.权利要求1或2所述的引物对在制备用于检测及鉴别牛分枝杆菌试剂中的用途。

10.权利要求1～2所述的引物或权利要求3～4所述的方法在制备预防结核病疫苗中的应用。