CN102409092B - 转基因玉米nk603结构特异定量pcr精准检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物Construct603-F、下游引物Construct603-R、荧光探针Construct603-P、与NK603品系的DNA稀释液以及TaqmanMastermix和水配制成PCR反应体系；进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因NK603品系生物成分检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术
国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法已成为必要。
并且目前关于转基因玉米NK603的检测技术，主要集中在普通定性PCR分析方法和标准，尚无关于扩增检测转基因玉米NK603及产品的结构特异性某特定位点（基因序列）的定量PCR精准检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米NK603及产品的品系特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
本发明通过下述技术方案实现：
转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法，主要包括以下步骤：
合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，Construct603-F: 5'-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'
下游引物序列，Construct603-R: 5'-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3'
荧光探针序列，Construct603-P: 5'-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3'；
（2）制备NK603品系的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
进一步，步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度都为10μmol/l，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
为了达到最好的检测效果，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将3μl的DNA稀释液加入到25μl反应体系中，所述25μl的反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix 12.5μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
荧光探针 0.5 μl
水 10ul。
作为最优的反应条件，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，59℃退火60s，45个循环。
本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明打破了欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒。
2、本发明弥补和完善了我国转基因生物及产品定量检测技术体系。
3、本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权。
4、本发明扩增效率高、准确度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法，主要包括以下步骤：
（1）合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，Construct603-F: 5'-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'
下游引物序列，Construct603-R: 5'-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3'
荧光探针序列，Construct603-P: 5'-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度都为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米NK603及产品的结构特异性某特定位点，即目的基因与调控元件特异位点设计；通过该设计就可以精准检测转基因玉米中NK603的转化事件。
（2）制备NK603品系的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米NK603中提取出浓度为50ng/μl的DNA稀释液。
（3）配制PCR反应体系；即将3ul制备好的DNA稀释液加入25ul反应体系中即可。
以上25ul反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix 12.5μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
荧光探针 0.5 μl
水 10μl。
Taqman Master mix采用的是ABI公司生产的Taqman Master mix。
（4）定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，59℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
对本实施例的方法数据连续重复做13个平行样品，对该13个样品进行了检测，其检测数据如表1。
表1
采用本发明能够精准检测转基因玉米中NK603结构特异片段及其含量，获得标准曲线斜率，在-3.6～-3.1之间，相关系数大于0.99，扩增效率为98.1%，在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果（1.6%）非常接近真实值（2%），检测结果的偏差率小于国际认可的25%，检测结果的不确定度小于10%。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院分析测试中心
<120> 转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法
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<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 上游引物（Construct603-F）
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<223> 荧光探针（Construct603-P）
<400> 3
agtgtgtcgc gtggtaccaa gcttga 26
Claims (4)
1.转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
（1）合成以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，Construct603-F: 5'-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'
下游引物序列，Construct603-R: 5'-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3'
荧光探针序列，Construct603-P: 5'-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3'；
（2）制备NK603品系的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
2. 根据权利要求1所述的转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法，其特征在于：步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度都为10μmol/l，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将3μl的DNA稀释液加入到25μl反应体系中，所述25μl的反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix 12.5μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
荧光探针 0.5 μl
水 10ul。
4. 根据权利要求1或3所述的转基因玉米NK603结构特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，59℃退火60s，45个循环。
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