CN102408998B

CN102408998B - 一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌

Info

Publication number: CN102408998B
Application number: CN 201110177763
Authority: CN
Inventors: 郑易之; 吴海强; 黄健子; 刘昀; 邹永东
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: CN102408998A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种从红树树皮中分离的具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌，其保藏编号为CCTCC No.M2011044。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2次生代谢产物及菌体提取物具有显著的抗AD活性。以E.coli细胞模型进行抗A-beta聚集活性筛选和研究，该菌菌体提取物具有很强的A-beta聚集的抑制作用；以体外A-beta聚集模型进行抗A-beta聚集活性测试，该菌菌体提取物具有较强的抗聚集活性。

Description

一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌

技术领域

本发明涉及海洋微生物的应用及神经退行性疾病防治活性成分的研究，具体的说是一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌。

背景技术

神经退行性疾病是一种临床上的多发病和常见病，包括阿尔茨采默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、亨延顿舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等，主要症状包括进行性记忆和认知功能障碍、运动障碍等等。随着人类社会年龄结构老龄化，神经退行性疾病发病率日趋升高，已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大世界性健康问题。

近年来人们对神经退行性疾病的发病机理进行了大量研究，且对发病机理提出了一些不同的假设，如关键蛋白的缠结及聚集、氧化应激、生物金属离子稳态失衡、线粒体功能衰竭等。然而，神经退行性疾病的发病原因及发生机制目前尚不十分明确。已有研究结果显示，作为一大类蛋白质错误折叠病(分子构象病)，神经退行性疾病相关关键蛋白的聚集沉淀在发病过程中具有重要调节作用，如AD的发病即与A-beta(beta-amyloid)等关键蛋白的聚集、沉淀、以及寡聚体产生的细胞毒性直接相关，A-beta蛋白的过量表达和聚集、沉淀可以直接导致线粒体紊乱、氧化应激、神经突触传递中断、轴突运输中断、膜完整性受损破裂等多种AD相关病理变化，而HD的发病与Poly Q的聚集直接相关等。因此，神经退行性疾病相关蛋白的聚集沉淀已成为研究神经退行性疾病发病机理及神经退行性疾病治疗药物和方法最重要的靶标之一。

虽然神经退行性疾病相关蛋白通过β片状折叠交联聚集形成不溶性纤维，最终以块状高聚体形式出现并导致神经细胞的死亡。但最近研究结果证明，在形成不溶性纤维过程中产生的可溶性蛋白寡聚体才是真正体现其神经毒性的物质。因此，与研究纤维或块状高聚体的聚集抑制剂相比，探讨如何筛选研究神经退行性疾病相关蛋白寡聚体的聚集抑制剂对于神经退行性疾病防治活性成分研究具有更重要的理论意义和价值。

与神经退行性疾病治病机理研究的逐渐深入相比，神经退行性疾病防治药物相关研究及应用则明显滞后，迄今为止临床上尚无针对病因的特效治疗药物。现有药物对神经退行性疾病的病情只有一定的辅助效果，在一定程度上能够延缓病情的恶化，但都不能逆转病情，如抗AD药物为例，现有乙酰胆碱酯酶抑制剂(IChEIs)如tacrine、donepezil、huperzine、ENA-713、fuperdin A等及近几年用于临床的非竞争性NMDA受体拮抗剂盐酸美金刚(memantine)等药物都仅有一定的辅助治疗效果，很多情况下还会引起乙酰胆碱相关不良反应。因此，研究发现新的、特殊生境神经退行性疾病防治药用资源并从中发现结构新颖、作用独特的新型活性成分对于神经退行性疾病先导药物的研究极为重要，是解决神经退行性疾病新药研发的核心手段之一。

红树林是介于海洋生态和陆地生态之间的一种非常特殊的生态区域。受红树林高度盐责化、土壤的缺氧、高光辐射及周期性的海水浸淹等独特生长环境的影响，极为丰富又极具特色的红树林微生物资源已成为最独特的海洋药用资源之一。自1993年从太平洋紫杉(短叶红豆杉)中分离得到能够产生新型活性物质的内生真菌Taxamyces andrenae后，红树林植物内生真菌活性物质的研究引起了人们的极大兴趣。目前，国内外已经在红树内生真菌次生代谢产物中分离鉴定了多个结构独特、新颖的化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等活性。其中从Kandelia candel树皮内生真菌菌体中分离鉴定的sporothrins A和Xylaria sp.代谢产物Xyloketal A-D对乙酰胆碱酯酶有较强的抑制作用。这就进一步证明：红树内生真菌及其代谢物作为神经退行性疾病防治新药研究的资源具有极大的开发前景。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种从红树植物黄水皮的根茎部树皮中分离的海洋红树耐盐性内生真菌，该红树内生真菌菌体提取物具有神经退行性疾病防治活性，在A-beta蛋白聚集的E.coli细胞模型中显示出很好的抗A-beta蛋白聚集活性。

本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌经中国科学院微生物研究所鉴定，命名为：Phomopsis occulta，隐藏拟茎点霉(2011)微鉴字第019号)，其于2011年2月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM2011044。本申请对其命名为SN3-2。

本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌的固体培养特征为：

PDA固体培养基，25℃暗室培养6天，菌落为白色毛状，边缘整齐，成熟时有青灰色小点；菌丝匍匐状生长，分隔，孢子内生。

该菌具有较强的耐盐性：在不含有NaCl的PDA培养基上生长良好，在含有1M、2M、3M NaCl的高盐度PDA培养基上均长势良好，说明该菌具有很强的耐盐性；但该菌不具有嗜盐性，因为在不含NaCl PDA培养基上长势良好。该菌还具有较强的耐渗性：本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌在含有2M、3M山梨糖醇(sorbitol)的PDA固体高渗培养基上长势均非常好，且对不同浓度山梨糖醇PDA培养基的长势基本一致，这说明该菌具有较强的山梨糖醇耐渗性。

本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2在真菌基础培养液中生长良好：在不含有NaCl和分别含有1M、2M、3M NaCl的液体培养基中长势良好；该菌在含不同NaCl浓度的培养基中生长的速度不同，随着NaCl浓度的增大，菌的生长速度持续降低，但菌落形态、菌丝和分生孢子等一致。

本发明海洋红树耐盐性内生真菌的18srDNA的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

从红树根茎部的树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法：

1、将采集到的红树枝条表面洗净，带入无菌室。将枝条表面用火焰灭菌10s～15s。用无菌刀将其剪成3cm～4cm的小段，75％酒精消毒10min，0.1％的升汞浸泡3min。用无菌水洗涤5遍。另设对照组(以最后洗涤的无菌水作为对照)。将枝条小段分别接种于含有浓度1M和3M的NaCl的PDA固体培养基平皿上(每种材料3皿，每皿3段枝条)，放置于25℃恒温箱中培养；

2、待长出菌落后，按无菌操作程序挑出菌丝的尖端，接种于PDA固体培养基平皿上，进行菌种的分离纯化，得到红树内生真菌。

3、将纯种菌株接入沙氏试管斜面保存。每3个月～4个月转接一次。

从本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌中分离基因组DNA的方法：

本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2次生代谢产物及菌体提取物具有显著的神经退行性疾病防治活性。以体外A-beta 42聚集模型、Poly Q模型等进行神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制活性筛选和研究发现，该菌菌体提取物具有很强的A-beta、Poly Q聚集抑制作用，显示出较强的神经退行性疾病防治活性。

本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2菌体提取物中的抗A-beta聚集有效成分具有较好的水溶性，在水溶液、有机溶液、中性条件、弱酸碱条件下都比较稳定，在70℃处理120min后任然保留95％以上的活性。

本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2具有较强的抗AD活性，其次生代谢产物中含有大量以A-beta聚集为靶点的抗聚集类抗AD活性物质，具备从中发现新型抗AD先导药物的巨大潜力，将为新型抗AD药物的研究提供支持。本发明对AD特效药物的研究及我国南海红树资源的深度开发具有极为重要的意义和价值。

附图说明

图1A和图1B分别为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的菌落形态图和显微结构图，显微放大倍数为1000。

图2是为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2和部分相关海洋红树耐盐性内生真菌的基因组DNA核酸琼脂糖电泳图，M：分子量为15000bp的核酸Marker，5为SN3-2基因组DNA，1-4和6分别是部分相关海洋红树耐盐性内生真菌的基因组DNA。

图3为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的菌体提取物体外A-beta42聚集模型研究结果。

图4为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的菌体提取物体外Poly Q聚集模型研究结果。

具体实施方式

本发明整体思路包括以下几点：从红树枝条中分离海洋红树耐盐性内生真菌；从海洋红树耐盐性内生真菌中分离基因组DNA；从海洋红树耐盐性内生真菌基因组中克隆18SrDNA序列；对分离得到的海洋红树耐盐性内生真菌进行耐盐性、嗜盐性和耐渗性进行分析；提取海洋红树耐盐性内生真菌次生代谢物，检测其抗A-beta聚集活性；以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例做进一步详细说明。

实施例1从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌

深圳海域红树植物水黄皮采集的水黄皮靠近根部水面上方树皮样品，在实验室中按照以下条件筛选和培养，即可以得到本专利所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2。

(一)培养基及配制：

(1)PDA固体培养基：马铃薯200g洗净去皮，加水800ml，煮沸30min，六层纱布过滤；滤液加入琼脂15g，加入葡萄糖20g、青霉素终浓度为80u/ml、链霉素终浓度为36u/ml。0.1MPa，121℃灭菌30min，葡萄糖、青霉素、链霉素通过过滤的方式灭菌。

青霉素规格：1600u/mg，5g装。配制方法：称取500mg溶入10ml水中，配制成青霉素母液，过滤后保存。配制培养基时每升培养基中加入1ml青霉素母液。青霉素终浓度为80u/ml。

硫酸链霉规格为720u/mg，10g装。配制方法：称取500mg溶入10ml 水中，配制成硫酸链霉素母液，过滤后保存。配制培养基时每升培养基中加入1ml硫酸链霉素母液。硫酸链霉素终浓度为36u/ml。

(2)PDA固体含盐培养基：在PDA固体培养基中加入NaCl，得到含有NaCl浓度为1M和3M的PDA固体含盐培养基。

(3)PDA固体高渗培养基：在PDA固体培养基中加入D-sorbitol，得到含sorbitol浓度为2M，3M，4M的PDA固体高渗培养基。

(4)真菌基础培养液：蛋白胨(peptone)0.3％，硫酸铵0.2％，酵母膏0.05％，磷酸二氢钾0.4％，氯化钙0.03％，七水硫酸镁0.03％，葡萄糖10g/L，分别加入不同量的NaCl，使其NaCl含量分别为0-3M。0.1MPa，121℃灭菌30min。

(5)MS培养基：

大量元素母液(20×1L)：33g NH₄NO₃，38g KNO₃，8.8g CaCl₂·2H₂O，7.4g MgSO₄·7H₂O，3.4g KH₂PO₄。

微量元素母液(200×1L)：4.46g MnSO₄·H₂O，1.72g ZnSO₄·7H₂O，0.005g CoCl₂·6H₂O，0.005g CuSO₄·5H₂O，1.24g H₃BO₃，0.05g Na₂MO₄·2H₂O，0.166g KI。

铁盐母液(200×，1L)：5.74g FeSO4·7H2O，7.46g EDTA。

有机物母液(200×1L)：0.2g烟酸，0.2g盐酸吡哆醇(VB₆)，0.04g盐酸硫胺素，40g肌醇，0.8g甘氨酸。

MS生根培养基(1L)：50ml大量元素(20×)，5ml微量元素(200×)，5ml有机元素(200×)，5ml铁盐(200×)，30g蔗糖，NAA(0.2mg/L)，10g琼脂粉，pH 6.0，高压灭菌。

(二)具体分离方法

从深圳海域红树植物水黄皮中采集水黄皮靠近根部水面上方树皮作为分离材料，将采集到的材料表面洗净，带入无菌室。将枝条表面用火焰灭菌10s～15s。用无菌刀将其剪成3cm～4cm的小段，75％酒精消毒10min，0.1％的升汞浸泡3min。用无菌水洗涤5遍。另设对照组(以最后洗涤的无菌水作为对照)。将枝条小段分别接种于含有浓度1M和3M的NaCl的PDA固体培养基平皿上(每种材料3皿，每皿3段枝条)，放置于25℃恒温箱中培养；待长出菌落后，按无菌操作程序挑出菌丝的尖端，接种于PDA固体培养基平皿上，进行菌种的分离纯化，得到海洋红树耐盐性内生真菌，命名为Phomopsis occulta，隐藏拟茎点霉，本申请简称为SN3-2。

将纯种菌株接入沙氏试管斜面保存。每3个月～4个月转接一次。

SN3-2为拟茎点霉属(Phomopsis)，25℃暗室，培养7天，观察其形态特征和显微特征，描述详见表1和图1A、图1B。

表1本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的培养特征

实施例2海洋红树耐盐性内生真菌耐盐性、嗜盐性和耐渗性分析

将分离到的海洋红树耐盐内生真菌菌种分别接种到含NaCl浓度为1M，2M，3M的PDA固体高盐培养基，在25℃暗室培养，7天后记录其生长状况，见表2。

表2海洋红树耐盐性内生真菌对NaCl的耐盐度鉴定结果

注：一个“+”表示菌落长满1/4平板，“-”表示菌落不生长。

将纯化后的海洋红树耐盐内生真菌菌种分别接种在含有1M NaCl/无盐的PDA固体培养基平板上，在25℃暗室培养，记录生长情况，检测是否有嗜盐菌。结果见表3，可知SN3-2为非嗜盐菌。

表3海洋红树耐盐内生真菌嗜盐性检测结果

注：“+”表示菌落有生长，“-”表示菌落不生长。

将分离到的海洋红树耐盐内生真菌菌种分别接种到含Sorbitol浓度为2M，3M，4M的PDA固体高渗培养基，在25℃暗室培养，记录其生长状况，测定其耐渗度，结果见表4。

表4海洋红树耐盐性内生真菌耐渗性鉴定结果

注：“+”表示菌落长满1/4平板，“-”表示菌落不生长。

实施例3从海洋红树耐盐性内生真菌中分离基因组DNA

海洋红树耐盐性内生真菌中分离基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图2。

从海洋红树耐盐性内生真菌基因组DNA中分离18SrDNA，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例4海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2神经退行性疾病防治活性次生代谢产物分析

(一)本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2次生代谢产物的提取制备：

(1)本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2首先由含不同浓度NaCl的PDA固体培养基接种至真菌基础培养液，2天后分别转接到含0、1、2、3M NaCl的真菌基础培养液各50L中进行胁迫培养，25℃静置培养40天；

(2)不同浓度NaCl真菌基础培养液分别过滤，发酵液合并浓缩至1L，使用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，低温(45℃)减压整除溶剂得SN3-2菌发酵液提取物；

(3)菌体分别低温真空干燥，用3L甲醇超声、浸渍提取3次，提取液合并，低温(45℃)减压整除溶剂得SN3-2菌菌体提取物；

(4)根据不同种类成分的特性，采用TLC、SGCC、HPLC、HPCE、FS等方法对粗提物进行反复分离、纯化，并最终获得代谢产物单体。

(二)本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌次生代谢产物体外A-beta42聚集模型研究：

ThT分析使用合成Aβ42多肽，37℃静置2小时，加入终浓度100μg/mL各样品，用荧光酶标仪测试反应体系的荧光强度，激发波长为444nm，发射波长为485nm。以DMSO为阴性对照，EGCG为阳性对照，根据体系荧光强度的差异即可判断组分对A-beta聚集的抑制活性。实验结果参见图3。实验结果说明：多个样品相对荧光强度较低，对A-beta42聚集具有显著抑制作用，部分样品抑制作用强于阳性对照样品EGCG或与之接近。

(三)本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌次生代谢产物体外Poly Q聚集模型研究：

ThT分析使用纯化Poly Q蛋白，37℃静置2小时，加入终浓度100μg/mL各样品，用荧光酶标仪测试反应体系的荧光强度，激发波长为444nm，发射波长为485nm。以DMSO为阴性对照，EGCG为阳性对照，根据体系荧光强度的差异即可判断组分对Poly Q聚集的抑制活性。实验结果参见图4。实验结果说明：多个样品相对荧光强度较低，对Poly Q聚集具有显著抑制作用，部分样品抑制作用与阳性对照样品EGCG接近。

Claims

1.一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌，其保藏编号为CCTCC M2011044。

2.根据权利要求1所述的一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌，其特征在于：其18srDNA的碱基序列如SEQ IDNO:1所示。

3.从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法，包括以下步骤：

1）取红树树皮，洗净，带入无菌室灭菌；

2）将灭菌红树树皮分别接种于含有浓度1M和3M的NaCl的PDA固体培养基平皿上，放置于25℃恒温箱中培养；

3）待长出菌落后，按无菌操作程序挑出菌丝的尖端，接种于PDA固体培养基平皿上，进行菌种的分离纯化，得到海洋红树耐盐性内生真菌。

4.根据权利要求3所述的从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法，其特征在于：所述红树树皮为靠近根部水面上方的树皮。

5.根据权利要求3或4所述的从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法，其特征在于：所述红树树皮经表面灭菌后，用无菌刀将其剪成3cm～4cm的小段，再用酒精和升汞浸泡灭菌。