CN102389438A - 黄芪甲苷的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药领域，公开了黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。试验表明，黄芪甲苷具有抑制SH-SY5Y-APP695sw细胞中Aβ蛋白和β-分泌酶的分泌、β-分泌酶酶活性及β-分泌酶的酶切作用，进而抑制Aβ蛋白积累。同时试验表明，黄芪甲苷可促进寡聚化Aβ降解，从而降低Aβ蛋白的毒性作用，达到预防和治疗阿尔茨海默病的目的，因此本发明提供了黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

Description

黄芪甲苷的应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体的说是涉及黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

背景技术

黄芪是一味常用中药，味甘、性温，有补气升阳、脱毒排脓和生肌等功效。研究发现黄芪中含有的黄芪多糖、皂苷、黄酮等化合物具有较强的生物活性。

黄芪甲苷(Astrogaloside-IV，AGS-IV)是从中药黄芪中提取出来的三萜皂苷类化合物，分子式为C₄₁H₆₈O₁₄，分子量784.97，结构式如下：

现代药理研究表明，黄芪甲苷具有抗炎、抗衰老、抗病毒、清除自由基、促进胰岛素分泌、增强机体免疫力的作用。此外，黄芪甲苷还能改善白细胞变形能力、保护心肌细胞、增强心肌活力，减轻心肌缺血。然而，还未见黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物方面相关研究报道。

阿尔茨海默病，又称老年痴呆(Alzheimer’s Disease，AD)，是一种重要的神经退行性病变，是慢性进行性中枢神经系统变性病变所导致的痴呆，是最常见的老年期痴呆。AD临床特征表现为渐进性的记忆障碍、行为定向能力障碍、语言功能障碍、视空间功能障碍、认知功能障碍以及人格变性等，进而影响日常生活能力、工作能力和社交能力。目前，全球大约有18,000,000人罹患AD。随着世界各国纷纷步入老龄化社会，AD患病人数也在与日俱增，AD已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的人类第四大杀手。

因此，提供黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的新应用，对阿尔茨海默病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供了黄芪甲苷的新应用，即黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

研究发现AD病理改变主要累及前脑、基底、海马和大脑皮质等部位，以出现神经细胞外淀粉样蛋白(extracellualar amyloid protein deposition)沉积或称老年斑(senile plaque，SP)、神经细胞内神经纤维缠结(neurofrbrillarytangles，NFT)以及神经元丧失(Neuronal loss)等为主要病理特征，其中淀粉样蛋白斑块的主要成分是β-淀粉样蛋白(βamyloid protein，Aβ)。

Aβ蛋白是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)经由两次酶切的产物，由于加工剪切过程的不同，Aβ蛋白主要有40和42两种肽段长度形式，即Aβ40和Aβ42，在正常机体中以Aβ40为主，而Aβ42仅约占Aβ总量的5～15％。APP蛋白翻译后可经两种途径被加工剪切，第一种为非产淀粉样蛋白途径(non-amyloidogenic pathway)，APP经由α-分泌酶(α-secretase)剪切产生可溶性α-APP(soluble APPα，sAPPα)和C83片段或α-CTF s(α-C-terminalfragments)，后者再经γ-分泌酶剪切产生p3片段和AICD。由于α-分泌酶酶切位点位于Aβ蛋白区域内部，因此该途径排除了Aβ蛋白的产生。第二种为产淀粉样蛋白途径(amyloidogenic pathway)，APP蛋白在β-分泌酶(β-secretase，BACE1)酶切作用下产生可溶性β-APP(soluble APPβ，sAPPβ)和C99片段或β-CTFs(β-C-terminal fragments)，后者由γ-分泌酶(γ-secretase)剪切产生Aβ蛋白和APP胞内结构域(APP intracellular domain，AICD)。γ-分泌酶由于剪切位点不同，会产生40和42个氨基酸长度两种形式的Aβ蛋白，即Aβ40和Aβ42，在AD脑部的淀粉样蛋白斑块中以Aβ42为主。

AD发病机制复杂，是多因素交互作用的结果。大量研究表明，多种因素参与了AD的病理过程，其中Aβ蛋白的过量累积被人视为是AD的核心病变。Aβ蛋白介导神经退行性病变的毒性，包括破坏线粒体功能、引起氧化应激影响突触信号传递、破坏轴突运输和膜结构等。

本发明通过酶联免疫吸附剂测定技术鉴定了所述黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞分泌Aβ蛋白的影响。结果显示，黄芪甲苷剂量依赖的方式抑制SH-SY5Y-APP695sw细胞中Aβ蛋白的分泌，其中20μM黄芪甲苷可以使SH-SY5Y-APP695sw细胞Aβ40和Aβ42的分泌量分别减少58.96±8.65％和59.60±9.37％，表明黄芪甲苷具有抑制SH-SY5Y-APP695sw细胞中Aβ蛋白分泌的作用。

本发明通过Western blot检测技术鉴定了所述黄芪甲苷对APP蛋白加工剪切作用的影响。结果显示，黄芪甲苷处理后sAPPβsw的分泌量减少了58.9％±6.02％，SH-SY5Y-C99细胞经黄芪甲苷处理48hr后，Aβ的浓度没有变化，表明黄芪甲苷具有抑制β-分泌酶酶切的作用，而对γ-分泌酶的酶切作用没有影响。黄芪甲苷通过抑制β-分泌酶酶切作用，干预APP的加工，进而降低Aβ的生成。

因此本发明提供了黄芪甲苷在制备β-淀粉样蛋白生成和分泌抑制剂中的应用。

本发明通过Western blot检测技术酶活检测试剂盒检测了所述黄芪甲苷对β-分泌酶APP蛋白表达和酶活的影响。结果显示，与对照相比20μM黄芪甲苷使成熟BACE1和非成熟BACE1分别减少77.22±4.13％和58.13±4.09％。同时黄芪甲苷还以剂量依赖的方式抑制β-分泌酶酶活，20μM黄芪甲苷使β-分泌酶酶活降低65.79±1.71％。结果表明黄芪甲苷可抑制β-分泌酶的表达和β-分泌酶酶活性。因此本发明提供了黄芪甲苷在制备抑制β-分泌酶生成药物中的应用。

本发明通过硫磺素T法测定黄芪甲苷对Aβ蛋白聚集体解聚作用。结果显示，黄芪甲苷以剂量依赖的方式促进聚集态Aβ蛋白解聚，35μM黄芩苷使聚集态Aβ蛋白减少54.33±2.91％，结果表明黄芪甲苷可以促进寡聚化Aβ解聚，降低寡聚化Aβ蛋白毒性作用。因此本发明提供了黄芪甲苷在制备β-淀粉样蛋白解聚剂中的应用。

综上所述，黄芪甲苷具有抑制SH-SY5Y-APP695sw细胞中Aβ蛋白和β-分泌酶的分泌、β-分泌酶酶活性及β-分泌酶的酶切作用，进而抑制Aβ蛋白积累，同时黄芪甲苷可促进寡聚化Aβ降解，从而降低Aβ蛋白的毒性作用，达到预防和治疗阿尔茨海默病的目的。因此本发明提供了黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明还提供了一种预防或治疗阿尔茨海默病的药物制剂，由有效量的黄芪甲苷和药学上可接受的辅料组成。本领域技术人员可将所述黄芪甲苷直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成预防或治疗阿尔茨海默病的常用制剂如口服液、注射液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、滴丸剂等。

附图说明

图1示实施例1黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞Aβ40蛋白分泌量影响的统计结果图；

图2示实施例1黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞Aβ42蛋白分泌量影响的统计结果图；

图3示实施例2黄芪甲苷对sAPP、sAPPα和sAPPβsw蛋白分泌量影响的Western blot检测图；

图4示实施例2黄芪甲苷对sAPP、sAPPα和sAPPβsw蛋白分泌量影响的统计结果图；

图5示实施例2黄芪甲苷对Aβ40蛋白分泌量影响的统计结果图；

图6示实施例2黄芪甲苷对Aβ42蛋白分泌量影响的统计结果图；

图7示实施例3黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞中β-分泌酶(BACE1)蛋白表达影响的Western blot检测图；

图8示实施例3黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞中β-分泌酶(BACE1)蛋白表达影响的统计结果图；

图9示实施例3黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞中β-分泌酶(BACE1)酶活影响的统计结果图；

图10示实施例4黄芪甲苷对寡聚化Aβ蛋白解聚作用影响的统计结果图。

具体实施方式

本发明实施例公开了黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。本发明中使用的黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所，HPLC检测含量＞98％。

实施例1：黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞分泌Aβ蛋白的影响

试验材料：SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞由北京师范大学教育部天然药物工程研究中心保藏；黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所，HPLC检测含量＞98％；G418购自Ameresco公司；细胞培养试剂、Aβ40Colorimetric ELISA试剂盒和Aβ42Colorimetric ELISA试剂盒购自Invitrogen公司。

细胞培养：SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12完全培养基在37℃，5％CO₂，相对湿度90％的培养箱中培养。在培养基中另加入500μg/mL G418以维持外源基因的表达。

试验方法：将SH-SY5Y-APP695sw细胞以2.5×10⁴细胞/mL接种于24孔板，培养至细胞融合率达到80％，将培养液换成分别含5μM、10μM、20μM、35μM、50μM黄芪甲苷的无血清培养液，继续培养48hr。收集细胞培养液，用Amicon Ultra-0.5mL超滤离心管浓缩培养液，ELISA测定Aβ40和Aβ42浓度，以不加黄芪甲苷处理的细胞为对照。试验结果见图1和图2

由图1和2可见，黄芪甲苷可以剂量依赖的方式抑制SH-SY5Y-APP695sw细胞中Aβ蛋白的分泌，其中20μM黄芪甲苷可以使SH-SY5Y-APP695sw细胞Aβ40和Aβ42的分泌量分别减少58.96±8.65％和59.60±9.37％。

实施例2黄芪甲苷对APP蛋白剪切作用的影响

试验材料：SH-SY5Y-APP695sw和SH-SY5Y-C99转基因细胞由北京师范大学教育部天然药物工程研究中心保藏；黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所，HPLC检测含量＞98％；G418购自Ameresco公司，细胞培养试剂购自Invitrogen公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自赛驰生物技术公司；抗sAPPα单克隆抗体2B3、抗sAPPβsw单克隆抗体6A1和抗APP多克隆抗体购自IBL公司；抗总sAPP单克隆抗体22C11购自Millipore公司；抗β-actin单克隆抗体C4购自Santa Cruz公司；Amersham ECL plus显色试剂购自GE公司。

细胞培养：见实施例1。

试验方法：将SH-SY5Y-APP695sw和SH-SY5Y-C99转基因细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，在含500μg/mL G418的DMEM/F12培养基中培养至融合率为85％，换成含20μM黄芪甲苷的无血清培养液，继续培养48hr。收集培养液，用

蛋白超滤浓缩管浓缩，-80℃保存。以BCA法测定样品蛋白浓度，以确定上样量。制备10％SDS-PAGE，浓缩胶浓度5％。100V电泳1.5hr，295mA转膜1.5hr。PVDF膜用含5％脱脂奶粉的PBST封闭液封闭1～2hr。加入用封闭液稀释的第一抗体4℃孵育过夜。PBST清洗膜4次，5min/次。加入第二抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠和羊抗兔IgG，室温反应1.5～2hr，进行ECL显色，采用X光片曝光，扫描后图像用Image J软件(NIH image，MD)分析。以不加黄芪甲苷处理的细胞为对照。试验结果图3～6。

如图3和图4所示，黄芪甲苷处理前后对sAPPα和sAPP水平没有明显变化，但sAPPβsw的分泌量减少了58.9％±6.02％，表明黄芪甲苷不影响α-分泌酶，而抑制β-分泌酶的酶切作用。如图5和6所示SH-SY5Y-C99细胞经5μM、10μM、20μM、35μM、50μM的黄芪甲苷处理48hr后，Aβ的浓度没有变化，表明黄芪甲苷对γ-分泌酶的酶切作用没有影响。由此可见，黄芪甲苷可抑制β-分泌酶干预APP的加工，进而降低Aβ的生成。

实施例3.黄芪甲苷对SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞中β-分泌酶(BACE1)蛋白表达和酶活的影响

试验材料：SH-SY5Y-APP695sw转基因细胞由北京师范大学教育部天然药物工程研究中心保藏；黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所，HPLC检测含量＞98％；抗BACE1多克隆抗体购自Merck公司、抗β-actin单克隆抗体C4购自Santa Cruz公司；Amersham ECL plus显色试剂购自GE公司；β-分泌酶酶活测定试剂盒购自Biovision公司；酶标仪(Thermo Labsystems Multiskan MK3型)。

试验方法：

β-分泌酶(BACE1)蛋白表达测定：将SH-SY5Y-APP695sw细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，在含500μg/mL G418的DMEM/F12培养基中培养至融合率为85％，换成含20μM黄芪甲苷的无血清培养液，继续培养48hr，提取细胞蛋白，以BCA法测定样品蛋白浓度，以确定上样量。制备10％SDS-PAGE，以实施例2方法进行Western blot检测。

β-分泌酶(BACE1)酶活测定：SH-SY5Y-APP695sw细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，在含500μg/mL G418的DMEM/F12培养基中培养至融合率为85％，换成含20μM黄芪甲苷的无血清培养液，继续培养48hr，提取细胞蛋白，采用β-secretase Activity Assay Kit(Biovision Research)，测定细胞中β-分泌酶酶活，具体操作参照试剂盒说明书进行。结果见图7～9。

由图7和图8可见，Western blot检测显示，与对照相比20μM黄芪甲苷使成熟BACE1和非成熟BACE1分别减少77.22±4.13％和58.13±4.09％。由图9可见，酶活测定结果显示，黄芪甲苷以剂量依赖的方式抑制β-分泌酶酶活，20μM黄芪甲苷使β-分泌酶酶活降低65.79±1.71％。结果表明黄芪甲苷可抑制β-分泌酶的表达和β-分泌酶酶活性，从而抑制β-分泌酶生成。

实施例4黄芪甲苷对寡聚化Aβ蛋白解聚作用的影响

试验材料：黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所，HPLC检测含量＞98％；硫磺素T和Aβ42购自Sigma公司。

试验方法：采用硫磺素T法测定黄芪甲苷对Aβ蛋白聚集体解聚作用。

Aβ聚集：1mg的固体Aβ42溶于2mL PBS(pH＝7.4)中，得0.5mg/mL的Aβ溶液，再向Aβ溶液中加入EDTA溶液至终浓度为1mM，37℃，300rmp，孵育72hr，将Aβ溶液稀释5倍，-80℃冰箱中保存待用。

硫磺素T配制：将硫磺素T固体溶于PBS(pH＝7.4)中，配成300μM的硫磺素T溶液，4℃保存备用。

药物作用：取黄芪甲苷溶液2uL于Ep管中，再加入20uLAβ稀释液，充分混匀后，37℃，300rmp，孵育30min。同时，在另一个Ep管中单独加2uLPBS和20uLAβ稀释液作为空白对照。

硫磺素T处理：取适量配好的300uM的硫磺素T，用PBS(pH＝7.4)稀释到3uM。取1500uL的3uM的四氢噻吩(Tht)于新的Ep管中，分别加入15uL药物共孵育和未共孵育的Aβ样品，充分混匀。

荧光检测：将上述混合液室温下孵育30min，取325uL样品于比色皿中，将比色皿擦拭干净，用荧光分光光度计(RF-5301PC，日本岛津公司)测量，激发波长442.0nm，发射波长450.0nm，测量范围是起始460.000nm，终止700.000nm。结果见图10。

由图10可见，黄芪甲苷以剂量依赖的方式促进聚集态Aβ蛋白解聚，35μM黄芩苷使聚集态Aβ蛋白减少54.33±2.91％，结果表明黄芪甲苷可以通过促进寡聚化Aβ解聚，降低寡聚化Aβ蛋白毒性作用。

综上所述，黄芪甲苷具有抑制SH-SY5Y-APP695sw细胞中Aβ蛋白和β-分泌酶的分泌、β-分泌酶酶活性及β-分泌酶的酶切作用，进而抑制Aβ蛋白积累，同时黄芪甲苷可促进寡聚化Aβ降解，从而降低Aβ蛋白的毒性作用，达到预防和治疗阿尔茨海默病的目的。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.黄芪甲苷在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

2.黄芪甲苷在制备β-淀粉样蛋白生成和分泌抑制剂中的应用。

3.黄芪甲苷在制备抑制β-分泌酶生成药物中的应用。

4.黄芪甲苷在制备β-淀粉样蛋白解聚剂中的应用。

5.一种预防或治疗阿尔茨海默病的药物制剂，其特征在于，由有效量的黄芪甲苷和药学上可接受的辅料组成。

6.根据权利要求5所述药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂或滴丸剂。

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