CN102369211B

CN102369211B - 编码非核糖体肽合酶的生物合成簇的核酸分子及其用途

Info

Publication number: CN102369211B
Application number: CN201080007667.4A
Authority: CN
Inventors: P·克拉斯特尔; B-M·里施帝; C·摩尔; E·施米特
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-02-13
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2030-02-11
Also published as: MX2011008542A; AU2010212851A1; WO2010092109A2; KR20110118811A; JP2012517801A; EP2396344A2; EA201101179A1; WO2010092109A3; AU2010212851B2; CA2751831A1; BRPI1007983A2; CN102369211A; EA020118B1; US20120034650A1

Abstract

本发明涉及多核苷酸的提供，所述多核苷酸包含参与式(I)或(I’)化合物产生的生物合成基因簇的一个或多个功能片段。本发明也提供用于制备式(I)或(I’)化合物或式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)以及(XVII)和(XVIII)化合物的方法。另外，本发明中也提供了此类化合物作为药物组合物的用途。

Description

编码非核糖体肽合酶的生物合成簇的核酸分子及其用途

本发明涉及多核苷酸的提供，所述多核苷酸包含参与式(I)或(I’)化合物产生的生物合成基因簇的一个或多个功能片段。本发明也提供用于制备式(I)或(I’)化合物或式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)以及(XVII)和(XVIII)的化合物的方法。另外，本发明中也提供此类化合物作为药物组合物的用途。

从微生物衍生的许多天然产物具有在高等生物中可观察的生物学活性并且已经因它们的治疗特性而使用了若干世纪。大部分这些天然产物属于聚酮化合物和非核糖体肽类并且由称作聚酮化合物合酶(PKS)和非核糖体肽合酶(NRPS)的模块化酶系统(modular enzymatic systems)合成(Finkering和Marahiel，2004；Staunton和Weissman，2001)。此外，存在这样的途径，其在相同途径中含有PKS基因和NRPS基因并且因此产生作为这两类物质的杂合体的次级代谢物。由这些生物合成途径产生的天然产物从小的相对简单的结构单元如短链羧酸和氨基酸构建而来。但是，从这些途径衍生的最终天然产物是极端多样的并且常常在结构上复杂，通常含有多个立体中心。出于这些原因，产生这些化合物的合成方法常常不实用并且因此发酵仍是产生它们的惯用方法。但是，发酵方法具有与它们依赖于微生物相关的固有问题，其中所述的微生物在代谢上未表征、遗传上常常不易控制并且时常生长不良以及以不充足水平产生其目的化合物。为绕过这些问题，PKS或NRPS途径在不具有这些缺点的充分表征的宿主生物中的异源表达可以是一种选择(2005年Wenzel和Muller综述)。事实上，这种方法可以扩展至表达“沉默的”或“隐藏的”PKS途径和NRPS途径用于发现性努力(discovery effort)(Shen，2004)或用来表达来自不能在实验室中培养的生物中的途径。此外，将PKS途径和NRPS途径转移至异源宿主允许高效地生物工程化次级代谢物途径以产生母体化合物的新类似物。

异源表达利用了以下事实：PKS途径和NRPS途径通常位于基因组上的毗连簇中。因此，这些途径原则上相对容易克隆到标准BAC或粘粒载体中。尽管从一种微生物移动一个途径至另一种微生物这一部分是简单的，但是这两种生物之间调节作用、密码子选择、或代谢的差异对成功的异源表达提出重大挑战。此外，允许这种策略高效应用的分子工具如针对克隆的BAC文库构建和重组方法仅近来变得可获得(Wenzel和Muller，2005)。出于这些原因，文献中仅存在一些成功异源表达的实例。

合适异源宿主的挑选是设计表达策略时的重要考虑。新宿主应当是遗传上易于控制的，在实验室中容易操作并且具有使用PKS途径或NRPS途径的能力。例如，新宿主中存在磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶对于促进所输入的PKS或NRPS的活化是必需的(Pfeifer等人，2001)。此外，重要的是新宿主具有与天然宿主相似的密码子选择谱以允许高效表达所输入的途径。所用的最常见宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)并且较少选择充分表征的链霉菌属(Streptomyces)菌株(在Zhang和Pfeifer，2008中综述)。其他已经利用的宿主包括黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)和丝状真菌。这些宿主菌株中某些已经被修饰，从而主要的天然次级代谢系统已经借助诱变被沉默以移除背景代谢物谱和阻止新入生物合成途径可利用的前体汇集物消耗。

为了转移特定途径，要求在合适的可转移遗传元件上包装该途径。PKS或NRPS系统的序列必须是至少在氨基酸水平并且更优选在核苷酸水平初步已知的。通常，这种序列用来设计从构建自天然宿主的基因组文库中定位BAC或粘粒克隆的探针。由于这些途径簇的大尺寸(通常大于30kb并且常常超过100kb)，使用“鸟枪法”克隆策略时，在单一BAC或粘粒克隆中常常捕获不到它们。因此，所述途径必须常常进行再构建以产生含有完整途径的单一BAC或粘粒载体构建体。当待表达非常大的途径时，可以将它们破拆至两个或多个分别的载体构建体中，以在新宿主中反式表达(Gu等人，2007)。最后，载体构建体还必须具有质粒转移性功能(例如来自RK2的oriT)以将所述途径从携带该构建体的大肠杆菌移动到新宿主中。为保证构建体是在新宿主中稳定的，可建议的是将它整合到宿主染色体中。为实现这一点，该构建体必须含有用于高效染色体整合的位点。例如，链霉菌属(Streptomyces)的噬菌体附着位点ΦC31常常用于该系统中的染色体插入(Binz等人，2008)。此外，常常必需要在生物合成途径前面插入将在新宿主中恰当发挥功能的新启动子。如果所讨论的两种生物是密切相关的并且因此可能共享许多共同的调控元件，则这个步骤可以是可避免的。最后，要求一个选择标记，通常为抗生素抗性盒，以选择新宿主中构建体(经修饰的BAC或粘粒)的成功转移和整合。一般地，这些操作在大肠杆菌中并且常常通过使用Red/ET重组进行(Zhang等人，1998)。这种克隆方法对于涉及大DNA构建体的应用是特别适合的，在所述应用中基于限制酶的操作是极有挑战性的。

一旦构建体已经在新宿主中整合，则进行发酵和后续化学分析以确定是否途径的表达已经成功。当异源表达已经在几乎全部情况下取得成功时，与天然宿主中观察到的那些滴度相比，天然产物已经以较低的滴度产生。即便这种明显的退步，成功的异源表达为传统菌株改良方法学可利用的许多选项提供了表达平台。

本发明涉及鉴定参与生物合成式I酯肽的生物合成簇，

其中酯键存在于A7的羧基和A2的羟基之间，并且，任选地，A5和A6之间的酰胺键的氮原子以甲基取代，

其中X和A₁各自独立地是任选的，

并且其中

X是任一化学残基，特别地是H或是酰基残基，特别地是CH₃CH₂CH(CH₃)CO、(CH₃)₂CHCH₂CO或(CH₃)₂CHCO；

A₁是不为天冬氨酸的标准氨基酸，特别地是谷氨酰胺；

A₂是苏氨酸或丝氨酸，特别地是苏氨酸；

A₃是非碱性的标准氨基酸或其非碱性衍生物，特别地是亮氨酸；

A₄是Ahp、脱氢AHP、脯氨酸或其衍生物，特别地是Ahp或其衍生物，特别地Ahp衍生物3-氨基-2哌啶酮；

A₅是异亮氨酸或缬氨酸，特别地是异亮氨酸；

A₆是酪氨酸或其衍生物，特别地是酪氨酸；

A₇是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，特别地是异亮氨酸或缬氨酸，特别地是异亮氨酸。

和开发用于产生式I非核糖体肽(包括其可药用盐或衍生物)的异源表达系统。特别地，该生物合成基因簇用于式(I’)酯肽的生物合成中

其中

X是CH₃CO、(CH₃)₂CHCO、CH₃S(O)CH₂CO、CH₃CH₂CH(CH₃)CO或C₆H₅CO；

A₁是谷氨酰胺；

A₂是苏氨酸；

A₃是亮氨酸；

A₄是Ahp、脱氢AHP、脯氨酸或5-羟基-脯氨酸；

A₅是异亮氨酸或缬氨酸，特别地是异亮氨酸；

A₆是酪氨酸；

A₇是异亮氨酸或缬氨酸，特别地是异亮氨酸。

特别地，本发明涉及鉴定参与生物合成如图1中所示式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(XI)、(XII)-(XIV)、(XVII)和/或(XVIII)的非核糖体肽的生物合成簇和开发用于产生式(I)或(I’)的非核糖体肽(包括其可药用盐或衍生物)的异源表达系统。

式(I)化合物、特别地式(I’)化合物是属于由粘细菌藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)NPH-MB180产生的酯肽家族的非核糖体多肽。已经显示这些酯肽是高度有效力和选择性的人激肽释放酶7(hK7)抑制剂和弹性蛋白酶抑制剂。人激肽释放酶7是具有丝氨酸蛋白酶活性的酶并且是用于治疗遗传过敏性皮炎的潜在靶。已经在作为WO2009/024527公开的PCT专利申请PCT/EP08/060689中描述了所述新化合物的详细物理化学数据以及发酵和提取方法。

如本文中所用，术语“式(I)化合物”或“式(I)酯肽”将指如上文定义的式(I)化合物，并且特别地指如图1中所述的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)和/或(XVIII)的非核糖体肽，和基本上保留相同的蛋白酶活性的任一衍生物。此类衍生物的实例在作为WO2009/024527公开的PCT专利申请中进一步描述。

如本文中所用，术语“式(I’)化合物”或“式(I’)酯肽”将指如上文定义的式(I)化合物，并且特别地指如图1中所述的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XVII)和/或(XVIII)的非核糖体肽，和基本上保留相同的蛋白酶活性的任一衍生物。

作为本发明基础的技术问题是提供参与生物合成式(I)或(I’)的酯肽的生物合成簇或功能部分。

这个技术问题通过提供在权利要求书中表征的实施方案而解决。

作为本发明基础的另一个技术问题是提供适于异源基因表达(例如适于合成重组目的蛋白)的阻抑型启动子。

本发明在第一实施方案中涉及(1)提供多核苷酸，其包含编码一种非核糖体肽合酶(NRPS)(下文命名为NRPS2)并且参与产生式(I)或(I’)化合物的生物合成基因簇的一个或多个功能片段，所述功能片段包含：

(i)核苷酸序列，其与选自编码NRPS2结构域的SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、46、48、50、52、54、56、58和60的序列具有至少80％、特别地至少85％、特别地至少90％、特别地至少95％、特别地至少98％序列同一性，和/或其互补物；

(ii)核苷酸序列，其与选自编码NRPS2结构域的SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、46、48、50、52、54、56、58或60的核苷酸序列的互补链杂交，和/或其互补物；

(iii)编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述的氨基酸序列与选自代表NRPS2结构域的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、47、49、51、53、55、57、59或61的序列具有至少60％、特别地至少70％、特别地至少80％、特别地至少90％、特别地至少95％序列同一性，和/或其互补物；

(iv)核苷酸序列，其与编码氨基酸的核苷酸序列的互补链杂交，所述的氨基酸选自代表NRPS2结构域的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、47、49、51、53、55、57、59或61，和/或其互补物；

(v)核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：28的序列具有至少80％、特别地至少85％、特别地至少90％、特别地至少95％、特别地至少98％序列同一性，和/或其互补物；或

(vi)核苷酸序列，其与如所述选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：28的核苷酸序列的互补链杂交，和/或其互补物；

其中根据(i)至(vi)的所述核苷酸序列编码了保留由参考序列SEQ IDNOs：2、4、6、8、10、12、14、47、49、51、53、55、59和/或61代表的相应NRPS结构域的活性的表达产物。

在第二实施方案中，根据实施方案(1)提供(2)多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码了保留以下NRPS2结构域中一种或多种结构域的活性的表达产物：

(i)SEQ ID NO：47的巯化结构域；

(ii)SEQ ID NO：49的缩合结构域；

(iii)SEQ ID NO：51的脯氨酸腺苷酰化结构域；

(iv)SEQ ID NO：53的巯化结构域；

(v)SEQ ID NO：2的缩合结构域；

(vi)SEQ ID NO：4的异亮氨酸腺苷酰化结构域；

(vii)SEQ ID NO：6的巯化结构域；

(viii)SEQ ID NO：8的缩合结构域；

(ix)SEQ ID NO：10的酪氨酸腺苷酰化结构域；

(x)SEQ ID NO：12的N-甲基化结构域；

(xi)SEQ ID NO：14的巯化结构域；

(xii)SEQ ID NO：55的缩合结构域；

(xiii)SEQ ID NO：57的异亮氨酸腺苷酰化结构域；

(xiv)SEQ ID NO：59的巯化结构域；和/或，

(xv)SEQ ID NO：61的硫酯酶结构域。

在实施方案(2)的一个具体实施方案中，所述的多核苷酸编码用于产生式(I)或(I’)化合物的NRPS2，其包含编码如SEQ ID NO：29中所述氨基酸序列的核苷酸序列。

在第三实施方案中，(3)本发明涉及多核苷酸，其包含编码NRPS1(一种参与产生式(I)或(I’)化合物的NRPS)的生物合成基因簇的一个或多个功能片段，所述功能片段包含：

(i)核苷酸序列，其与选自编码NRPS结构域的SEQ 30、32、34、36、38、40、42和44的序列具有至少80％、特别地至少85％、特别地至少90％、特别地至少95％、特别地至少98％序列同一性，和/或其互补物；

(ii)核苷酸序列，其与选自编码NRPS结构域的SEQ ID NO：30、32、34、36、38、40、42或44的核苷酸序列的互补链杂交，和/或其互补物；

(iii)编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述的氨基酸序列与选自代表NRPS1结构域的SEQ ID NO：31、33、35、37、39、41、43、45的序列具有至少60％、特别地至少70％、特别地至少80％、特别地至少90％、特别地至少95％序列同一性，和/或其互补物；

(iv)核苷酸序列，其与编码氨基酸的核苷酸序列的互补链杂交，所述的氨基酸选自代表NRPS1结构域的SEQ ID NO：31、33、35、37、39、41、43、45，和/或其互补物；

(v)核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO：26的序列具有至少80％、特别地至少85％、特别地至少90％、特别地至少95％、特别地至少98％序列同一性，和/或其互补物；或

(vi)核苷酸序列，其与如所述选自SEQ ID NO：26的核苷酸序列的互补链杂交，和/或其互补物；

(vii)其中根据(i)至(vi)的所述核苷酸序列仍编码了保留由参考序列SEQ ID NOs：31、33、35、37、39、41、43、45代表的相应NRPS结构域的活性的表达产物。

在第四实施方案中，根据实施方案(3)的多核苷酸编码了保留以下NRPS1结构域中一种或多种结构域的活性的表达产物：

(i)SEQ ID NO：31的加载结构域(loading domain)；

(ii)SEQ ID NO：33的谷氨酰胺腺苷酰化结构域；

(iii)SEQ ID NO：35的巯化结构域；

(iv)SEQ ID NO：37的缩合结构域；

(v)SEQ ID NO：39的苏氨酸腺苷酰化结构域；

(vi)SEQ ID NO：41的巯化结构域；

(vii)SEQ ID NO：43的缩合结构域；和

(viii)SEQ ID NO：45的亮氨酸腺苷酰化结构域。

在实施方案(4)的一个具体实施方案中，多核苷酸编码用于产生式(I)或(I’)化合物的NRPS1，其包含编码如SEQ ID NO：27中所述氨基酸序列的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及由上文所述的一种或多种多核苷酸编码的多肽。特别地，所述的多肽适用于产生式(I)或(I’)化合物，该多肽包含选自以下的氨基酸序列：

(i)代表NRPS1的SEQ ID NO：27、代表第二种NRPS2的SEQ ID NO：29、代表细胞色素P450的SEQ ID NO：63；和

(ii)(i)中列出的氨基酸序列的功能变体，其与(i)中列出的参考序列具有60％、特别地至少70％、特别地至少80％、特别地至少90％、特别地至少95％序列同一性并且基本上保留相同的催化性功能。

本发明还涉及多核苷酸，其包含以上所描的编码一种或多种所述多肽的核苷酸序列。

仍在另一个实施方案中，本发明提供多核苷酸，其包含

(i)编码SEQ ID NO：27或其功能变体的核苷酸序列；和

(ii)编码SEQ ID NO：29或其功能变体的核苷酸序列。

这种多核苷酸还可以包含编码SEQ ID NO：63或其功能变体的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，该多核苷酸从具有保藏号DSM 19329的藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)菌株NPH-MB180分离。

本发明还提供了包含如任一前述实施方案中所定义的多核苷酸的表达载体，其中可读框与转录性序列和翻译性序列有效连接。

在又一个实施方案中，提供以如任一前述实施方案中定义的多核苷酸或表达载体转染并且表达前者的宿主细胞，特别地提供用于异源产生式(I)或(I’)化合物或式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)和(XVII)及(XVIII)化合物的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明涉及了制备式(I)或(I’)化合物或式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)和(XVII)和(XVIII)化合物的方法，包括在产生所述化合物的条件下培养如前述实施方案中所述的宿主细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及与根据任一前述实施方案的所述多肽或NRPS或NRPS结构域特异性结合的抗体并且涉及该抗体的用途，即，用于纯化所述多肽或NRPS。

在一个实施方案中，提供了包含如任一前述实施方案中定义的多核苷酸、载体、多肽、NRPS或NRPS结构域或抗体的药物组合物。

在一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含通过在合适条件下培养含有如任一前述实施方案中定义的本发明多核苷酸的重组宿主细胞可获得的或如此获得的式(I)或(I’)酯肽。

在一个实施方案中，本发明涉及了用于制备治疗和/或诊断疾病或病况即遗传过敏性皮炎的药物组合物的所述式(I)或(I’)酯肽。在一个特定实施方案中，式(I)或(I’)的酯肽是选择性人激肽释放酶(hK7)抑制剂和弹性蛋白酶抑制剂，特别地选择性人激肽释放酶(hK7)的抑制剂，所述抑制剂具有酶活性，特别地丝氨酸蛋白酶活性。

在本发明的又一个实施方案中，提供了编码参与产生式(I)或(I’)化合物的NRPS的生物合成基因簇，其包含如任一前述实施方案中定义的多核苷酸。

在本发明的另一个实施方案中，提供如任一前述实施方案中定义的多核苷酸序列用于鉴定通过下述方法可获得的本发明生物合成基因簇，所述方法包括(a)构建由藏红花软骨霉状菌菌株或相关菌株的基因组DNA组成的核苷酸文库；(b)培养作为菌落的文库菌株；和(c)用基于如任一前述实施方案中所定义多核苷酸的探针分子分析长出的菌落以鉴定含有NRPS基因簇的克隆，和(d)鉴定NRPS基因簇。

本发明的要点在于提供参与生物合成式(I)或(I’)酯肽、特别地式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)以及(XVII)和(XVIII)酯肽的生物合成簇或其功能部分。特别有利是对式(I)或(I’)酯肽的生物合成簇的鉴定可以用于所述酯肽的异源表达。

“非核糖体肽”意指属于从简单氨基酸单体产生的复杂天然产物家族的一类肽。它们在许多种细菌和真菌中由称作非核糖体肽合成酶(NRPS)的大多功能蛋白质合成。NRPS系统的独特特征是合成含有蛋白质氨基酸以及非蛋白质氨基酸的肽的能力。

“非核糖体肽合酶”(NRPS)意指大多功能蛋白质，其被组织为名为模块的活性部位的协调组，其中每一个模块对于催化一个单轮次产物长度延伸和修饰该官能团是必需的。模块的数目与顺序和存在于每一种NRPS上的模块内部的结构域的类型通过规定数目、顺序、待掺入氨基酸的选择和与特定类型延伸相关的修饰作用决定所得肽产物的结构变异。

术语“结构域”指蛋白质的对催化活性必需的功能部分。此类结构域在携带相同催化活性的来自不同物种的酶之间是保守的。

对延伸循环所需的最小结构域组由具有腺苷酰化(A)作用、巯化(T)作用或肽基载体蛋白(PCP)和缩合(C)结构域的模块组成。

“腺苷酰化结构域(adenylation domain)”负责底物选择且其借助AMP-衍生物中间体作为硫酯共价固定在T结构域的磷酸泛酰巯基乙胺臂上。

C结构域催化肽键在来自上游模块的氨酰基-S-PCP或肽基-S-PCP与相应下游模块中连接于PCP的氨酰基部分之间的形成。结果是因固定至下游模块中PCP结构域的一个残基而延伸肽。任选的修饰结构域可以存在用于底物差向异构化、N-甲基化和杂环化。所述模块可以仍存在于单条或多条多肽链上。

在大多数情况下，在负责终产物释放/环化的最末模块中存在最末C端硫酯酶(TE)结构域。

1.编码用于产生式(I)或(I’)化合物的生物合成基因簇的多核苷酸

下表1描述了式(I)或(I’)化合物的生物合成基因簇的多核苷酸及其各自功能和氨基酸序列的具体实例

表1.酯肽生物合成基因簇可读框和功能域

1在含有生物合成基因簇的框架的核苷酸坐标。

用于合成式(I)或(I’)酯肽的分离的生物合成基因簇由包括编码非核糖体肽合成酶(也称作NRPS1和NRPS2)的ORF6和ORF7的8个可读框(ORF)组成。NRPS1和NRPS2含有NRPS结构域并且表1中列出相应的推测的功能。

术语“多核苷酸“、“多核苷酸序列”和“多肽”的意思是本领域熟知的，并且如果在本文中不另外定义，所述术语因而根据本发明的上下文使用(例如分别是Seq ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62)。例如，如本文中所用的“多核苷酸序列”指天然存在/或重组产生的核酸和/或核苷酸序列类型的全部形式以及指化学合成的核酸/核苷酸序列。该术语也包括核酸类似物和核酸衍生物如，例如，锁DNA、PNA、寡核苷酸硫代磷酸酯和取代的核糖-寡核苷酸。此外，术语“多核苷酸序列”也指包含核苷酸或核苷酸类似物的任意分子。

优选地，术语“多核苷酸序列”指核酸分子，即脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。“多核苷酸序列”在本发明的上下文中可以通过本领域普通技术人员已知的合成化学方法学或通过使用重组技术产生，或可以从天然来源分离，或通过其组合产生。所述DNA和RNA可以任选地包含非天然核苷酸并且可以是单链或双链的。“多核苷酸序列”也指有义和反义DNA和RNA，即，与DNA和/或RNA中特定核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

此外，术语“多核苷酸序列”可以指现有技术中已知的DNA或RNA或其杂合体或其任何修饰(对于修饰的实例，见，例如US 5525711、US4711955、US 5792608或EP 302175)。多核苷酸序列可以是单链或双链的，线形或环状的，天然或合成的，并且没有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA、mRNA、反义RNA、核酶或编码此类RNA的DNA或chimeroplasts(Gamper，Nucleic Acids Research，2000，28，4332-4339)。所述的多核苷酸序列可以是质粒或病毒DNA或RNA的形式。“多核苷酸序列”也可以指寡核苷酸，其中包括任一现有技术的修饰物，如硫代磷酸酯或肽核酸(PNA)。

术语“基因簇”或“生物合成基因簇”指参与生物合成式(I)或(I’)酯肽的一组基因或其变体。基因簇或生物合成基因簇的遗传修饰指可以用来产生式(I)或(I’)化合物的变体的本领域已知的任意遗传重组技术，包括核酸的诱变、失活或替换。基因簇或生物合成基因簇的遗传修饰指可以用来产生式(I)或(I’)化合物的遗传变体的本领域已知的任意遗传重组技术，包括核酸的诱变、失活或替换。

DNA或核苷酸“编码序列”或“编码特定多肽或蛋白质的序列”是当置于适宜调节序列的控制下时被转录并且翻译成多肽或蛋白质的DNA序列。

在一个特定实施方案中，本发明的多核苷酸(例如分别是Seq ID NOs1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62)可以组合地使用。备选地，本发明涉及Seq ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62的片段或功能变体。

在多核苷酸序列的上下文中，术语“其片段”或“其功能片段”特别地指核酸分子的片段或突变变体。“多核苷酸的片段”可以例如编码具有至少一个氨基酸缺失的本发明多肽(例如，如SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12或14中所示的多肽)，其中所述的多肽基本上保留与野生型多肽相同的功能(每种多肽的功能在表1和图2中以更多细节描述)。这种缩短的多肽可以视为(例如，如SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12或14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63中所示的)本发明多肽的功能片段。

“多核苷酸的功能变体”可以例如编码具有至少一个氨基酸置换或添加的本发明多肽(例如，如SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12或14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63中所示的多肽)，其中所述的多肽优选地保留与野生型多肽相同的功能(每种多肽的功能在表1和图2中以更多细节描述)。这种缩短的多肽可以视为(例如，如SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12或14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63中所示的)本发明多肽的功能片段。

本发明多核苷酸/多肽的功能变体与它们如表1中所述的相应原始多核苷酸/多肽序列具有至少50％、55％、60％、优选至少70％、更优选至少80％、85％、90％、95％并且甚至最优选至少99％的序列同一性。例如，多肽与SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63中分别显示的多肽具有至少50％、55％、60％、优选至少70％、更优选至少80％、85％、90％、95％并且最优选至少99％的同一性/同源性。

就表1中描述的非核糖体肽合酶(NRPS)或其他ORF的核苷酸序列而言，如本文中所用的术语“片段”意指在长度上是至少7个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个或至少700个核苷酸的核苷酸序列。

本文中所用的术语“杂交”指在常规杂交条件下、优选在严格条件下的杂交，这在例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA中描述。如果不另外说明，所述条件优选地是非严格性的。所述杂交条件可以根据例如前述引文Sambrook(2001)中描述的常规方案建立。条件的设定完全在技术人员的技能范围内并且可以根据本领域中描述的方案确定。因此，对仅特异性杂交序列的检测通常会要求严格的杂交条件和洗涤条件。作为非限制性实例，高度严格的杂交可以在以下条件下进行：

杂交缓冲液：2 x SSC；10 x Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；

比率1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；

250μg/ml鲱鱼精DNA；50μg/ml tRNA；或

0.25M磷酸钠缓冲液，pH 7.2；

1mM EDTA

7％SDS

杂交温度T：＝60℃

洗涤缓冲液：2 x SSC；0.1％SDS

洗涤温度T：＝60℃。

用于检测同源或不精确互补序列的低严格杂交条件例如可以设置为6x SSC，1％SDS，在65℃。充分已知的是，探针的长度和待确定的核酸的组成构成杂交条件的其他参数。

能够与本文中提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也是本发明的部分并且可以例如从动物的基因组文库或cDNA文库或从微生物的DNA文库分离。优选地，此类多核苷酸是微生物来源的，特别地来自属于变形菌门(Proteobacteria)、特别地δ变形菌门、特别地粘球菌目(Myxococcales)、特别地Sorangiineae、特别地多囊菌科(Polyangiaceae)，但是特别来自软骨霉状菌属(Chondromyces)，如藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)或其改良菌株的微生物。

备选地，本发明的此类变体核苷酸序列可以通过基因工程或化学合成法制备。可以通过使用本文中描述的多核苷酸序列或其部分或其反向互补物，例如根据标准方法通过杂交(见例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold SpringHarbor，NY，USA)，鉴定并且分离能够杂交的此类多核苷酸序列。包含如所列SEQ ID NOs中显示的相同或基本上相同核苷酸序列的核苷酸序列或其部分/片段可以例如作为杂交探针使用。片段也可以用作用于诊断、测序或NRPS基因簇克隆的探针或引物。作为杂交探针使用的片段也可以是通过寻常合成技术制备的合成性片段，其序列与本发明的核苷酸序列基本上相同。

如本文中所用，两个序列之间的同一性百分数是由所述序列共享的相同位置的数值的函数(即，％同一性＝相同位置的数值/位置总数值x100)，同时考虑需要被导入以最佳比对这两个序列的空位数目和每个空位的长度。如下文所述，使用数学算法，可以完成两个序列之间的序列比较和同一性百分数确定。

优选地，通过将各自序列与如所列SEQ ID NO中所示的核苷酸序列比较确定同一性/同源性的程度。当被比较的序列不具有相同的长度时，同源性程度优选地指较短序列中与较长序列中核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分数。同源性的程度可以使用已知的计算机程序如DNASTAR程序采用ClustalW分析常规地确定。该程序可以从DNASTAR，Inc.，1228South Park Street，Madison，WI 53715或从DNASTAR，Ltd.，AbacusHouse，West Ealing，London W13 0AS UK(supportdnastar.com)获得并且在EMBL站外服务器处可访问。

当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列例如80％同一时，设置优选如下：矩阵：blosum 30；开放空位罚分：10.0；延伸空位罚分：0.05；延迟发散(Delay divergent)：40；空位分隔距离：8，用于氨基酸序列的比较。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选地设置至5.0。

如果通过序列比较法待比较的两个核苷酸序列在同一性方面不同，则指较短的序列和较长序列中与较短序列匹配的部分。换句话说，当被比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地指较短序列中与较长序列中核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分数或指较长序列中与较短序列中核苷酸序列相同的核苷酸的百分数。在这种情况下，技术人员轻易地在位置方面确定较长序列中“匹配”较短序列的部分。

通常，本领域技术人员知道怎样可以获得核酸分子，例如，从天然来源产生，或可以合成地产生或通过重组技术如PCR产生核酸分子。这些核酸分子包括如可以通过使用相关文献中所述技术获得的修饰或衍生化的核酸分子。

而且，同一性意指在相应的核苷酸序列或多肽(例如由其所编码的多肽)之间分别存在功能性和/或结构性等价。与本文中所述的特定核苷酸/氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、优选至少70％、更优选至少80％、85％、90％、95％和甚至最优选至少99％同一性的核苷酸/氨基酸序列可以代表这些序列的衍生物/变体，它们优选地具有相同的生物学功能。它们可以是天然存在的变型(例如来自其他生态型、变种、物种等的序列)或是突变，并且所述的突变可能已经天然形成或可能已经通过人为诱变产生。此外，所述变型可以是合成产生的序列。等位变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。可能已经例如通过缺失、置换、添加、插入和/或重组产生自上述多核苷酸的偏离。术语“添加”指添加至少一个核酸残基/氨基酸至给定序列的末端，而“插入”指在给定序列内部插入至少一个核酸残基/氨基酸。

变体多肽，并且，特别地由本发明核苷酸序列的不同变体编码的多肽，优选地显示它们共同具有的某些特征。这些特征例如包括生物学活性、分子量、免疫反应性、构象等，和物理特性，例如在凝胶电泳中的迁移行为、色谱行为、沉降系数、溶解度、波谱特性、稳定性、最适pH、最适温度等。

在一个特定的实施方案中，本发明提供多核苷酸，其编码保留以下NRPS1结构域中一种或多种结构域的活性的一种或多种表达产物：

(i)SEQ ID NO：31的加载结构域；

(ii)SEQ ID NO：33的谷氨酰胺腺苷酰化结构域；

(iii) SEQ ID NO：35的巯化结构域；

(iv)SEQ ID NO：37的缩合结构域；

(v)SEQ ID NO：39的苏氨酸腺苷酰化结构域；

(vi)SEQ ID NO：41的巯化结构域；

(vii)SEQ ID NO：43的缩合结构域；和

(viii)SEQ ID NO：45的亮氨酸腺苷酰化结构域。

在一个具体实施方案中，该多核苷酸编码了保留上述全部NRPS1结构域的活性的一种或多种表达产物。

在一个备选的实施方案中，该多核苷酸编码了保留上述全部NRPS1结构域的活性的一种或多种表达产物，除了用1、2或3个腺苷酰化结构域代替了具有不同氨基酸特异性的一种或多种腺苷酰化结构域之外。

在另一个具体实施方案中，本发明提供多核苷酸，其编码保留以下NRPS2结构域中一种或多种结构域的活性的一种或多种表达产物：

(i)SEQ ID NO：47的巯化结构域；

(ii)SEQ ID NO：49的缩合结构域；

(iii)SEQ ID NO：51的脯氨酸腺苷酰化结构域；

(iv)SEQ ID NO：53的巯化结构域；

(v)SEQ ID NO：2的缩合结构域；

(vi)SEQ ID NO：4的异亮氨酸腺苷酰化结构域；

(vii)SEQ ID NO：6的巯化结构域；

(viii)SEQ ID NO：8的缩合结构域；

(ix)SEQ ID NO：10的酪氨酸腺苷酰化结构域；

(x)SEQ ID NO：12的N-甲基化结构域；

(xi)SEQ ID NO：14的巯化结构域；

(xii)SEQ ID NO：55的缩合结构域；

(xiii)SEQ ID NO：57的异亮氨酸腺苷酰化结构域；

(xiv)SEQ ID NO：59的巯化结构域；和

(xv)SEQ ID NO：61的硫酯酶结构域。

在一个具体实施方案中，该多核苷酸编码了保留上述全部NRPS2结构域的活性的一种或多种表达产物。在一个备选的实施方案中，该多核苷酸编码了保留上述全部NRPS1结构域的活性的一种或多种表达产物，除了用1、2、3或4个腺苷酰化结构域替换了具有不同氨基酸特异性的另一种腺苷酰化结构域之外。

推定编码NRPS1的ORF6、编码NRPS2的ORF7和编码细胞色素P450的ORF8编码用于生物合成式(I)或(I’)酯肽的核心酶。因此，在又一个方面，本发明涉及多核苷酸，其包含

(i)编码SEQ ID NO：27(NRPS1)或其功能变体的核苷酸序列；和，

(ii)编码SEQ ID NO：29(NRPS2)或其功能变体的核苷酸序列。

该多核苷酸还可以包含编码SEQ ID NO：63或其功能变体的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，这些多核苷酸从具有保藏号DSM 19329的藏红花软骨霉状菌菌株NPH-MB180分离。

2.参与产生式(I)或(I’)化合物的NRPS和其他多肽

本发明还涉及由本发明多核苷酸编码的多肽，特别地在表1中描述的那些多肽，例如，NRPS1和NRPS2。本发明还涉及它们的功能片段和功能变体。

本发明也涉及SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽的变体或者包含所述多肽的至少50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的片段的变体。术语“变体”包括这些多肽的衍生物或类似物。特别地，所述变体可以在氨基酸序列方面因1、2、3、4、5个或更多个置换、添加、缺失、融合和截短(它们可以以任何组合存在)而不同于SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽。

所述变体可以是天然存在的或在体外产生。特别地，此类变体可以使用基因工程技术如位点定向诱变、随机化学诱变、核酸外切酶III缺失法和标准克隆技术产生。备选地，可以使用化学合成法或修饰法产生此类变体、片段、类似物或衍生物。

制备变体的其他方法也是本领域技术人员熟悉的。这些方法包括其中修饰从天然分离株获得的核酸序列以产生编码多肽的核酸的方法，其中所述多肽具有增强它们在工业和实验室应用中价值的特征。在此类方法中，产生并表征相对于从天然分离株获得的序列具有一个或多个核苷酸不同的大量变体序列。优选地，这些核苷酸的不同产生相对于由来自天然分离株的核酸编码的多肽而言的氨基酸变化。

例如，可以使用易错PCR产生变体。在易错PCR中，DNA扩增在DNA聚合酶保真性低的条件下进行，从而沿着PCR产物的整个长度获得高的点突变率。易错PCR在Leung，D.W.等人Technique，1：11-15(1989)和Caldwell，R.C.和Joyce G.F.，PCR Methods Applic.，2：28-33(1992)中描述。变体也可以使用在任何克隆的目的DNA节段中产生位点特异性突变的位点定向诱变法产生。寡核苷酸诱变在Reidhaar-Olson，J.F.和Sauer，R.T.等人Science，241：53-57(1988)中描述。使用定向进化策略，如美国专利号6,361,974和6,372,497中描述的那些策略，也可以产生变体。SEQ IDNOs：2、4、6、8、10、12、14的多肽的变体可以是这样的变体，其中SEQID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽的1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基以保守或非保守的氨基酸残基(优选地，保守的氨基酸残基)置换并且此类置换的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码子编码的氨基酸残基。

保守性置换是多肽中的给定氨基酸由另一个具有相似特征的氨基酸置换的那些置换。以下替换一般视为保守性置换：脂族氨基酸如Ala、Val、Leu和Ile替换为另一种脂族氨基酸；Ser替换为Thr或相反替换；酸性残基如Asp或Glu替换为另一种酸性残基；携带酰胺基团的残基如Asn或Gln替换为携带酰胺基团的另一种残基；碱性残基如Lys或Arg与另一种碱性残基交换；和芳族残基如Phe或Tyr替换为另一种芳族残基。

其他变体是其中SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽的一个或多个氨基酸残基包括取代基的那些变体。另外其他的变体是其中多肽与另一种化合物如增加该多肽半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)缔合的那些变体。额外的变体是其中额外氨基酸(如前导序列、分泌序列，前蛋白(proprotein)序列或促进该多肽纯化、富集或稳定的序列)与该多肽融合的那些变体。

在一些实施方案中，所述片段、衍生物和类似物保留与SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽相同的生物学功能或活性。在多肽的上下文中如本文中所用的术语“其片段”指具有与本文中所定义多肽(例如，如Seq ID NOs 2、4、6、8、10、12或14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63中分别所示)基本上相同的(生物学)活性的功能片段，其中所述的多肽可以由本发明多核苷酸(例如分别是Seq ID NOs1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62)编码。

在其他实施方案中，所述片段、衍生物和类似物保留与SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽相同的生物学功能或活性，除了至少1、2、3、4、5、6或7个腺苷酰化结构域被不同的腺苷酰化结构域置换，因而提供不同的氨基酸特异性之外。

在其他实施方案中，片段、衍生物或类似物包括促进该多肽纯化、富集、检测、稳定或分泌的融合异源序列，其中可以从片段、衍生物或类似物完全或部分地酶促切去所述融合异源序列。

本发明的另一个方面是与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽之一或其包含至少50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的片段具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的多肽或其片段。将理解氨基酸“同一性”包括保守性置换，如上文所述的那些保守性置换。

与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽之一或其包含至少50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的片段具有同源性的多肽或其片段可以通过使用上文所述的技术分离编码它们的核酸来获得。

备选地，同源多肽或片段可以借助生物化学富集或纯化方法获得。潜在同源的多肽或片段的序列可以通过蛋白水解消化法、凝胶电泳和/或微量测序法测定。预期的同源多肽或片段的序列可以与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽之一或其包含至少50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的片段比较。

SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽或其包含至少50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的片段、其包含至少40、50、75、100、150、200或300个连续氨基酸的片段可以用于多种应用中。例如，所述多肽或者其片段、衍生物或类似物可以用来催化如本说明书中其他处描述的生物化学反应。

SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63的多肽或者其包含至少50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的片段也可以用来产生与所述多肽或片段、衍生物或类似物特异性结合的抗体。

在一个特定实施方案中，本发明的多肽(例如，如Seq ID NOs 2、4、6、8、10、12或14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63中分别所示)可以组合地使用。

如本文中所用的术语“活性”或“功能性”特别地指多肽或其片段显出酶活性(例如对NRPS1和NRPS2的肽合酶活性)的能力。本领域技术人员会清楚(生物学的)如本文中所述的功能活性常常与表达水平(例如蛋白质/mRNA)相关。如果不另外提及，本文中所用的术语“表达”指编码本发明多肽/蛋白质(或其片段)的核酸分子的表达，而“活性”指所述多肽/蛋白质的活性。用于确定本文中所述多肽活性的方法/测定法是本领域熟知的。

3.制备式(I)或(I’)酯肽的表达载体、重组宿主细胞和方法

本文中所述的本发明多核苷酸用于例如异源表达式(I)或(I’)化合物。在具体实施方案中，它们用于式(I’)化合物的异源表达。

因此，并且在一个进一步的方面，本发明涉及包含本文中所述的核酸分子的载体，更具体地是表达载体，和包含所述核酸分子和/或载体的重组宿主细胞。

如本文中所用的术语“载体”具体地指质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体、病毒、噬菌体和基因工程中常用的其他载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体适用于转化细胞，如真菌细胞、微生物的细胞(如酵母细胞或细菌细胞)或动物细胞。“表达载体”指可以籍此导入核酸至宿主细胞中，从而导致所导入序列表达的运载体(vehicle)。

如本文中讨论，可以通过插入编码多肽的核酸至载体中，从而该编码序列与能够驱动所编码的多肽在合适宿主细胞中表达的序列有效连接而获得所述多肽。例如，表达载体可以包含启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可以包括用于调节表达水平的适宜序列、复制起点和选择标记。适于在细菌中表达所述多肽或其片段的启动子包括大肠杆菌lac或trp启动子、lacl启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子、λPL启动子、来自编码糖酵解酶类如3-磷酸甘油激酶(PGK)的操纵子中的启动子和酸性磷酸酶启动子。真菌启动子包括α因子启动子。适于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中表达的启动子包括但不限于基因组中存在的7个16S rRNA基因(PP 16SA、PP16SB、PP 16SC、PP 16SD、PP 16SE、PP 16SF、PP 16SG)的相应转录启动子、抗生素抗性决定因子的转录启动子、受高铁摄取阻抑物(ferric uptakerepressor；Fur)调节的任意基因的转录启动子。下文进一步提供对受高铁摄取阻抑物(Fur)调节的启动子的更详细描述。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。也可以使用控制基因在原核或真核细胞或者其病毒中表达的其他已知启动子。

哺乳动物表达载体也可以包含复制起点、任意必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体位点和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。在一些实施方案中，从SV40剪接(SV40 splice)和多腺苷酸化位点衍生的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。

用于真核细胞中表达所述多肽或其片段的载体也可以含有增强子以增加表达水平。增强子是作用于启动子以增加其转录的顺式作用DNA元件，通常长度约10至约300bp。实例包括在复制起点后侧第100至270bp上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。

此外，表达载体优选地含有一种或多种选择标记基因以允许选择含有该载体的宿主细胞。可以使用的选择标记的实例包括编码二氢叶酸还原酶的基因或向真核细胞培养物赋予新霉素抗性的基因、在大肠杆菌中赋予四环素或氨苄青霉素抗性的基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。合适标记的实例是庆大霉素抗性盒aacCl。其他选择标记可以包括赋予氨苄青霉素抗性的核苷酸盒(如bla)、赋予氯霉素抗性的核苷酸盒(如cat)、赋予卡那霉素抗性的核苷酸盒(如aacC2、aadB或其他氨基糖甙类修饰酶)或赋予四环素抗性的核苷酸盒(如tetA或tetB)。

适宜的DNA序列可以通过多种方法插入载体中。通常，用适宜的限制性核酸内切酶消化插入物和载体后，将DNA序列连接至载体中的目的位置，随后。备选地，适宜的限制酶位点可以通过PCR被工程化到DNA序列中。多种克隆技术在Ausbel等人Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley 503 Sons，Inc.1997和Sambrook等人MolecularCloning：A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，1989中公开。认为此类方法和其他方法在本领域技术人员的能力范围内。

载体例如可以是质粒、病毒粒子或噬菌体的形式。其他载体包括染色体性、非染色体性和合成性DNA序列的衍生物、病毒、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒。用于原核和真核宿主的多种克隆载体和表达载体由Sambrook等人MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)描述。

可以使用的具体细菌载体包括包含遗传元件的市售质粒，有熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、phiX174、pBluescript^TM II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。具体的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。但是，可以使用任何其他的载体，只要它在宿主细胞中是可复制和稳定的。

使用包括电穿孔转化法、转染、转导、病毒感染、基因枪法或Ti介导的基因转移法的多种技术中的任一项技术，可以将载体导入宿主细胞中。根据需要，工程化的宿主细胞可以在常规的营养培养基中培养，其中将所述的营养培养基根据需要调整为用于激活启动子、选择转化体或扩增本发明的基因。在转化合适的宿主菌株和培育宿主菌株至适宜的细胞密度后，可以通过适宜手段(例如，温度转变或化学诱导)诱导所选择的启动子并且细胞可以培养额外的时间期间以允许它们产生想要的多肽或其片段。

在又一个方面，本发明的重组宿主细胞能够表达或表达由本发明的多核苷酸序列编码的多肽。在一个具体实施方案中，包含于宿主细胞中的“多肽”可以相对于初始宿主细胞是异源的。对待用于产生本发明宿主细胞(例如上述的一种具体宿主细胞)的不同表达系统的实例的综述例如包含于Glorioso等人(1999)，Expression of Recombinant Genes in EukaryoticSystems，Academic Press Inc.，Burlington，USA，Paulina Balbas undArgelia Lorence(2004)，Recombinant Gene Expression：Reviews andProtocols，第二版：Reviews and Protocols(Methods in Molecular Biology)，Humana Press，USA中。

可以通过例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA中描述的标准方法实施用本发明的核苷酸序列或载体转化或基因工程化宿主细胞。另外，本发明的宿主细胞在满足所用具体宿主细胞要求(特别地在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、痕量元素等方面)的营养培养基中培养。

通常，本发明的宿主细胞可以是包含本发明核苷酸序列、载体和/或多肽的原核或真核细胞或是从这种细胞衍生并含有本发明核苷酸序列、载体和/或多肽的细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞例如因基因工程而以这样的方式包含本发明的核苷酸序列或载体，从而它含有整合到基因组中的本发明核苷酸序列。本发明的这种宿主细胞的非限制实例(但通常也是本发明的宿主细胞)可以是细菌、酵母、真菌、植物、动物或人细胞。

术语“宿主细胞”或“分离的宿主细胞”指微生物，其携带为产生式(I)化合物或式(I’)化合物所必需的遗传信息，无论该生物是否已知产生所述化合物。如本文中所用，该术语同等地适用于这样的生物，其中产生例如式(I)或(I’)化合物的遗传信息如该遗传信息在其天然环境中存在那样存在于该生物中，并且同等地适用于其中该遗传信息由重组技术导入的生物。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任一宿主细胞，包括原核细胞或真核细胞。作为适宜宿主的代表性实例，可以提到：细菌细胞，如大肠杆菌、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、灰褐链霉菌(Streptomyce griseofuscus)、产二素链霉菌(Streptomyce ambofaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)、纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)、藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)、以及在假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyce)、芽孢杆菌属(Bacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个物种、真菌细胞如酵母、昆虫细胞如果蝇(Drosophila)S2和斜纹夜蛾(Spodoptera)Sf9、动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤和腺病毒。适宜宿主的选择处于本领域技术人员的能力范围内。

作为本文中构思的来源生物，生物包括变形菌门(Proteobacteria)、优选δ变形菌门、更优选粘球菌目(Myxococcales)、更优选Sorangiineae、更优选多囊菌科(Polyangiaceae)，最优选软骨霉状菌属(Chondromyces)，其中藏红花软骨霉状菌或其改良菌株是最优选的。

如本文中所用，术语“重组宿主细胞”涉及用本发明核苷酸序列遗传工程化的或包含本发明载体或多肽或其片段的宿主细胞。本发明允许待在异源重组宿主细胞(即，非天然产生菌株，而是另一种菌株)中表达的式(I)或式(I’)酯肽产生。虽然所述实例显示了使用细菌菌株，但是如本文中所述，可以使用任何生物或表达系统。生物的选择取决于技术人员的需求。例如，可以使用顺应于遗传操作的菌株旨在利于酯肽化合物的修饰和产生。

在一个具体实施方案中，宿主细胞选自粘球菌属或假单胞菌属，例如，恶臭假单胞菌。在一个更具体的实施方案中，重组宿主细胞，例如，恶臭假单胞菌，包含编码NRPS1(SEQ ID NO：27)和NRPS2(SEQ ID NO：29)或其功能变体的核苷酸。它还可以包含编码SEQ ID NO：63的细胞色素P450或其功能变体的核苷酸序列。它也可以包含SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27之一者或多者。有利地，每个可读框处于有功能的转录性和翻译性序列控制下，从而这些ORF在合适的条件下由重组宿主细胞表达。在下文实施例中进一步描述恶臭假单胞菌中异源表达的具体实例。

根据上文，本发明在又一个实施方案中涉及用于产生式(I)或式(I’)化合物的方法，包括在此类条件下培养重组宿主细胞，从而合成式(I)或式(I’)的化合物，例如，式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)以及(XVII)和(XVIII)的化合物，以及回收所述化合物。

如本文中所用，术语“此类条件”指旨在表达和回收式(I)化合物或式(I’)化合物的重组宿主细胞培养条件。在一个具体实施方案中，重组宿主细胞是恶臭假单胞菌。在另一个具体实施方案中，重组宿主细胞是恶臭假单胞菌并且所述细胞在小于30℃，例如，在10和20℃之间，例如约15℃的温度培育。

在另一个具体实施方案中，生长培养基含有异丁酸，例如1g/l和5g/l之间的异丁酸，例如约2g/l异丁酸。

例如，本发明的重组宿主细胞可以特别适合于强化的或增加的式(I)或式(I’)酯肽产生。

4.使用铁调节型启动子用于异源基因表达

本发明的另一个方面涉及在宿主细胞中(例如在假单胞菌宿主细胞如恶臭假单胞菌中)的异源基因表达或重组目的蛋白合成。在一些情况下，特别地重组蛋白表达可能损害细菌生长的情况下，需要控制异源基因表达，从而它受到抑制，直至生长转换期或直至宿主细胞达到健康群体密度或用于异源基因表达的最适宜阶段。本发明人已经显示可以通过Fur调节型启动子在重组宿主细胞中(例如在恶臭假单胞菌中)成功调节异源基因表达。虽然在本申请中描述了使用此类启动子用于酯肽生物合成基因簇的异源表达，但是本发明的Fur调节性启动子可以在异源基因表达或重组目的蛋白合成领域具有广泛得多的用途。

本发明因此提供用于重组宿主细胞、优选细菌宿主细胞中，例如，在假单胞菌属物种如恶臭假单胞菌中调节和增强异源基因表达的手段。

在一个实施方案中，本发明涉及用于异源基因表达或用于重组目的蛋白合成的表达盒。这种表达盒是至少包含与铁调节型启动子有效连接的编码成熟重组目的蛋白的可读框(下文称作编码序列)的多核苷酸序列。

在“异源基因表达”的上下文中如本文中所用，术语“重组目的蛋白”指在铁调节型启动子控制下不天然表达的蛋白质。在优选的实施方案中，重组目的蛋白可以是酶、治疗性蛋白质，包括但不限于激素、生长因子、抗凝血剂、受体激动剂或拮抗剂或诱饵受体)、抗体(包括诊断用或治疗用抗体)或备选性靶结合支架，例如但不限于纤连蛋白衍生的蛋白质、单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体(nanobody)等。

在表达盒的上下文中如本文中所用，术语“有效连接的”指包含启动子的多核苷酸序列，其中所述的启动子以如此方式连接至编码蛋白质的多核苷酸序列，从而该启动子控制编码蛋白质的核苷酸序列的表达。

本发明的表达盒还可以包含在宿主细胞中适合表达重组目的蛋白所需的其他调节序列，例如，5’非翻译区、信号肽、多腺苷酰化区和/或其他3’非翻译区。

4.1 铁调节型启动子和Fur调节型启动子

在一个具体实施方案中，可以在本文第4段中描述的本发明表达盒中使用的所述铁调节型启动子可以是部分或完全受下述蛋白质以转录方式阻抑的任何细菌启动子，其中所述的蛋白质选自应答于培养基中铁可用性而发挥作用的高铁上游阻抑物(Fur)或Fur阻抑蛋白同源物。它进一步包括含有Fur阻抑物结合位点的任意启动子，其中所述的启动子可以与编码序列有效地连接，从而它控制该编码序列以Fur依赖性方式并且应答于培养基中的铁可用性而表达。细菌性Fur阻抑蛋白的实例是本领域已知的并且例如在Carpenter等人(2009)中描述。

如本文中所用，如果阻抑条件下(即在阻抑物或阻抑刺激物和/或阻抑物结合位点存在下)的某启动子活性低于去阻抑条件下(即在阻抑物或阻抑刺激物和/或阻抑物结合位点不存在下)的启动子活性至少5倍，则该启动子应答于外部刺激或顺式元件或阻抑物被阻抑，这一点用报道基因测定法如lacZ报道基因测定法测量。

Fur-阻抑物结合位点本领域是已知的并且已经在许多细菌物种如大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌中找到(Carpenter等人(2002)。其他Fur阻抑物结合位点可以因与SEQ ID NO：64的Fur阻抑物结合位点共有序列的同源性检索到。在优选的实施方案中，Fur-阻抑物结合位点选自任一SEQ ID NOs：64-68。

Fur调节型启动子是本领域已知的并且已经在许多细菌物种如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylorii)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、天蓝色链霉菌(Streptomyce coelicolor)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中鉴定到(Carpenter等人(2002))。Fur调节型启动子的实例包括但不限于任一SEQ ID NOs：69-71。

在优选的实施方案中，Fur调节型启动子是选自以下的多核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：69，

(b)基本上保留与SEQ ID NO：69相同的启动子活性的SEQ ID NO：69片段，

c)与SEQ ID NO：69具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的SEQ ID NO：69的变体启动子。

在一个实施方案中，SEQ ID NO：69的片段是含有SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66的至少一个Fur阻抑物结合位点和SEQ ID NO：69的任意3’下游序列的片段。

在一些实施方案中，所述的变体启动子可以是含有与SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66相同的Fur-阻抑物结合位点或具有在Fur-阻抑物结合位点SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66任一者中不多于1、2、3、4或5个核苷酸改变的核酸。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO：69的所述变体启动子是保留与SEQ ID NO：69基本上相同活性的功能变体。在一个具体实施方案中，所述的变体启动子是这样的功能变体，它保留与SEQ ID NO：69基本上相同的活性并且与SEQ ID NO：69至少50％同一，但是包含分别与SEQ IDNO：65和SEQ ID NO：66相同的2个阻抑物结合位点或与SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66分别比对时，具有不多于1、2、3、4或5个核苷酸改变。

为确定启动子的启动子活性并且与SEQ ID NO：69的启动子活性比较，可能使用任何合适的报道基因测定法，如lacZ报道基因测定法，并且直接地测量报道基因表达，例如，通过测量mRNA水平，或通过在阻抑条件和去阻抑条件下测量报道酶活性(如β-半乳糖苷酶活性)间接地测量报道基因表达。如果在阻抑条件和去阻抑条件下的此类活性在受试验启动子与SEQ ID NO：69的启动子之间没有显著差异，则称所述的试验启动子保留与SEQ ID NO：69基本上相同的启动子活性。

4.2 包含带铁调节型启动子的表达盒的表达载体和重组宿主细胞

表达盒可以插入任何合适的表达载体中。在使用Fur调节型启动子合成重组目的蛋白的情况下，表达载体意指可以籍此导入核酸至宿主细胞中，从而导致编码重组目的蛋白的基因异源表达的运载体(vehicle)。

表达载体可以衍生自例如质粒、噬菌体或粘粒或其他人工染色体、或常用于宿主细胞中重组蛋白产生的其他载体。除表达盒之外，此类表达载体还包含用于进入宿主细胞中和/或在所述宿主细胞中复制的手段和/或用于分泌多肽在细胞的表面或细胞外部的手段。表达载体也可以包括用于在多于一个细胞类型中(例如在至少2个细胞类型(一个原核细胞类型和一个真核细胞类型)中)复制或增殖的手段。

使用包括电穿孔转化法、转染、转导、病毒感染、基因枪法或Ti介导的基因转移法的多种技术中的任一项技术，可以将表达载体导入宿主细胞中。根据需要，工程化的宿主细胞可以在常规的营养培养基中培养，其中将所述的营养培养基根据需要调整为用于激活启动子、选择转化体或扩增编码重组目的蛋白的基因。

在又一个方面，本发明的重组宿主细胞能够表达或表达重组目的蛋白。对待用于产生本发明宿主细胞(例如上述的一种具体宿主细胞)的不同表达系统的实例的综述例如包含于Glorioso等人(1999)，Expression ofRecombinant Genes in Eukaryotic Systems，Academic Press Inc.，Burlington，USA，Paulina Balbas und Argelia Lorence(2004)，Recombinant Gene Expression：Reviews and Protocols，第二版：Reviewsand Protocols(Methods in Molecular Biology)，Humana Press，USA中。

可以通过例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA中描述的标准方法实施用本发明的核苷酸序列或表达载体转化或基因工程化的宿主细胞。另外，本发明的重组宿主细胞在满足所用具体宿主细胞要求(特别地在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、痕量元素等方面)的营养培养基中培养。

通常，本发明的重组宿主细胞可以是包含本发明表达盒和/或表达载体的原核或真核细胞或是从这种细胞衍生并含有本发明表达盒和/或本发明表达载体的细胞。

本发明因此涉及用于异源基因表达或用于在适宜生长培养条件下合成重组目的蛋白的重组宿主细胞，所述的重组宿主细胞包含整合于该细胞基因组中或作为自主复制子的如上所述的本发明表达盒或表达载体。

“重组宿主细胞”可以是用于适宜生长培养条件下异源表达重组目的蛋白的任何合适的细胞。优选地，这种重组宿主细胞是细菌细胞。

在一个优选的实施方案中，重组宿主细胞是已经用表达载体转化或转染的细菌宿主细胞，其中所述的表达载体包含与如上文段落中所述的铁调节型启动子有效连接的编码成熟重组目的蛋白的可读框。在一个更具体的实施方案中，重组宿主细胞选自包含本发明表达载体的假单胞菌属物种例如恶臭假单胞菌、最优选恶臭假单胞菌KT2440，其中所述铁调节型启动子选自任一SEQ ID NO：69-71或其任意功能变体启动子。

本发明还涉及使用如上文所述的表达盒、表达载体和/或重组宿主细胞用于异源基因表达，例如用在合成重组目的蛋白中。

4.3 用于异源基因表达的方法

含有铁调节型启动子的本发明重组宿主细胞可以有利地用于异源基因表达，例如用于合成重组目的蛋白。在转化合适的宿主细胞和培育宿主细胞至适宜的细胞密度后，可以通过适宜手段(例如，Fe螯合剂、Fe饥饿)去阻抑Fur调节型启动子并且细胞可以培养额外的时间期间以允许它们产生目的蛋白。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于异源基因表达或用于在宿主细胞中、优选在细菌宿主细胞中并且更优选在假单胞菌属物种中合成重组目的蛋白的方法，所述方法包括a)在阻抑条件下培养包含带有铁调节型启动子的表达盒的所述宿主细胞，

b)在适宜的生产阶段改变生长条件用于去阻抑铁调节型启动子，

c)在去阻抑条件下培育细胞，用来允许异源基因表达和/或重组目的蛋白合成。

在一个具体实施方案中，通过在生长培养基中提供充足浓度的铁获得阻抑条件并且通过创造铁不充足的条件获得去阻抑条件。此类条件可以通过生长相期间铁的天然使用和饥饿而达到。备选地，可以通过在培养基中添加铁螯合剂获得此类条件。

任何合适的铁螯合剂可以用于导致铁调节型启动子的去阻抑。此类铁螯合剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐或充当铁摄取的化合物铁载体(例如去铁胺、肠杆菌素或bacillibactin)。在一个优选的实施方案中，这种铁螯合剂是2’2’联吡啶。可以在培养基中例如以至少等于或优选至少3倍高于生长培养基中铁浓度的浓度添加该螯合剂。

4.4 与使用铁调节型启动子用于异源基因表达相关的本发明的具体实施方案

实施方案1：适于宿主细胞、优选细菌宿主细胞、更优选假单胞菌宿主细胞中异源基因表达的表达盒，包含与不是天然受所述铁调节型启动子调节的基因有效连接的铁调节型启动子。

实施方案2：根据实施方案1的表达盒，其中所述的铁调节型启动子是受选自高铁摄取调节阻遏蛋白的蛋白质阻抑的细菌启动子或受Fur阻抑蛋白转录阻抑的任意同源启动子序列。

实施方案3：根据实施方案2的表达盒，其中受Fur阻抑蛋白阻抑的所述启动子是选自以下的多核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：69，

(c)与SEQ ID NO：69具有至少50％同一性的多核苷酸序列，基本上保留与SEQ ID NO：69相同的启动子活性。

实施方案4：包含任一实施方案1-3的表达盒的重组宿主细胞。

实施方案5：实施方案4的重组宿主细胞，其选自细菌物种。

实施方案6：实施方案5的重组宿主细胞，其选自假单胞菌属物种例如恶臭假单胞菌。

实施方案7：铁调节型启动子用于宿主细胞中合成重组目的蛋白的用途。

实施方案8：根据实施方案7的用途，其中所述的铁调节型启动子是受选自高铁摄取调节阻遏蛋白(Fur)的蛋白质阻抑的细菌启动子或受Fur阻抑蛋白转录阻抑的任意同源启动子序列。

实施方案9：根据实施方案7的用途，其中受Fur阻抑蛋白阻抑的所述启动子是选自以下的多核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：69，

实施方案10：根据任一实施方案7-9的用途，其中通过调节生长培养物中的铁浓度控制所述的重组目的蛋白合成。

实施方案11：根据任一实施方案7-10的用途，其中在细菌宿主细胞、优选在假单胞菌属物种例如恶臭假单胞菌中实施所述的重组目的蛋白合成。

实施方案12：根据任一实施方案7-11的用途，其中通过在培养基中以足以螯合铁并且使所述铁调节型启动子去阻抑的浓度添加铁螯合剂而诱导所述的重组目的蛋白合成。

实施方案13：实施方案12的用途，其中所述的铁螯合剂是2’2’联吡啶。

5.通过异源表达获得的酯肽和它们的用途

本发明还涉及通过上述方法可获得或获得的式(I)或(I’)化合物，例如式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)以及(XVII)和(XVIII)的化合物。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含通过上述方法可获得或获得的式(I)或(I’)化合物，例如式(II)至(VII)、(XI)至(XIV)以及(XVII)和(XVIII)的化合物。

该药物组合物将会以符合良好医学实践的方式配制和给药，同时考虑个体患者的临床状况、药物组合物的递送部位、施用方法、施用计划和执业医师已知的其他因素。该药物组合物用于本文中目的的″有效量″因此由此类考虑决定。

技术人员知道施用至个体的药物组合物的有效量特别地将取决于所述化合物的本质。例如，如果所述的化合物是(多)肽或蛋白质，每次给药的肠胃外施用的药物组合物的总药学有效量将在约1μg蛋白质/kg患者体重/日至10mg蛋白质/kg患者体重/日范围内，虽然，如上指出，这将服从于治疗考虑。更优选地，该剂量是至少0.01mg蛋白质/kg/日，并且例如，对于人而言，在约0.01和1mg蛋白质/kg/日之间。如果连续给予，则该药物组合物通常以约1μg/kg/小时至约50μg/kg/小时的剂量速率施用，通过每日1-4次注射或通过连续皮下输注，例如，使用小型泵。也可以使用静脉内袋溶液剂。观察到改变所需要的治疗时长和治疗后应答出现的间隔期似乎根据需要的效果变动。具体的量可以通过本领域技术人员熟知的常规试验确定。

本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、脑池内(intracisternally)、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂、滴剂或透皮贴剂)、颊部施用或作为口或鼻喷雾剂施用。

本发明的药物组合物优选地包含可药用载体。“可药用载体”意指任何类型的无毒固体、半固体、液体填料、稀释剂、包囊材料或制剂辅料。如本文中所用的术语“肠胃外”指施用模式，其包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。

药物组合物也适当地通过持续释放系统施用。持续释放组合物的合适实例包括成型物品(例如薄膜或微胶囊)形式的半通透性聚合物基质。持续释放基质包括聚交酯(美国专利号3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物(Sidman，U.等人Biopolymers 22：547-556(1983))、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(R.Langer等人J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)和R.Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯-乙酸乙烯酯(R.Langer等人Id.)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放药物组合物也包括脂质体包封的化合物。含有该药物组合物的脂质体通过本身已知的方法：DE 3,218,121；Epstein等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：3688-3692(1985)；Hwang等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4030-4034(1980)；EP52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；和EP 102,324制备。通常，脂质体是其中脂质含量大于约30mol百分数胆固醇的小(约200-800埃)单层类型，为最佳治疗调整所选比例。

对于肠胃外施用，通常通过这样的方式制剂药物组合物为单位剂量可注射形式(溶液剂、混悬剂或乳剂)：将具有所需纯度的药物组合物与可药用载体(即在所用的剂量和浓度对接受者无毒并且与该制剂的其他成分兼容的一种可药用载体)混合。

通常，通过将药物组合物的组分与液态载体或精细分散的固态载体或这两者均匀且密切地接触来制备制剂。随后，根据需要，将产物成型为想要的制剂。优选地，该载体是肠胃外载体，更优选地是与接受者血液等渗的溶液。此类载体运载体的实例包括水、盐水、林格液和葡萄糖溶液。非水的运载体如固定油和油酸乙酯以及脂质体也用于本文中。载体适当地含有少量的添加物如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类材料在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)(多)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；反荷离子如钠；和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯类、泊洛沙姆或PEG。

待用于治疗性施用的药物组合物的组分必须是无菌的。通过经无菌滤膜(例如，0.2微米膜)过滤轻易地实现无菌性。通常将药物组合物的治疗性组分置入具有无菌接口的容器中，例如，静脉内输液袋或具有皮下注射针头可穿透的塞子的小药瓶。

作为水溶液或作为用于重构的冻干制剂，药物组合物的组分通常贮存在单位容器或多剂量容器(例如，密封的安瓿或小药瓶)中。作为冻干制剂的实例，10-ml小药瓶充以5ml无菌过滤的1％(w/v)水溶液，并且将所得的混合物冻干。通过使用抑菌性注射用水重构冻干的化合物制备输注溶液剂。

本发明也涉及上述酯肽及其衍生物作为药物的用途。例如用于治疗癌症、特别地卵巢癌，或用于治疗炎症和/或过度增生性疾病和瘙痒皮肤病如瘢痕疙瘩、肥大性疤痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、Netherton综合征或其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人不明性搔痒以及其他伴有上皮屏障机能失调的疾病，如老化的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎、以及胰腺炎、或用于治疗癌症、特别地卵巢癌、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、成人呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿关节炎、IBD、银屑病、哮喘。

在一个实施方案中，本发明涉及上述酯肽及其衍生物作为药物用于治疗炎性和/或过度增生性疾病和瘙痒性皮肤病如瘢痕疙瘩、肥大性疤痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、Netherton综合征或其他瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人不明性搔痒以及其他伴有上皮屏障机能失调的疾病如老化的皮肤(aged skin)、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎或者用于治疗癌症、特别地卵巢癌的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及上述酯肽及其衍生物作为药物用于治疗囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、成人呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿关节炎、IBD、银屑病、哮喘的用途。

在又一个实施方案中，本发明涉及上述酯肽及其衍生物作为药物用于炎性和/或过度增生性疾病和瘙痒性皮肤病如瘢痕疙瘩、肥大性疤痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、Netherton综合征或其他瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人不明性搔痒的用途。

6.针对本发明多肽的抗体

在一个具体实施方案中，本发明涉及与如本文中描述和定义的本发明多肽或其片段特异性结合的抗体及其用途。另外，该抗体可以用于纯化所述的多肽、特别地非核糖体肽和/或非核糖体肽合酶(NRPS)。术语“抗体”是本领域熟知的。

在本发明的上下文中，如本文中所用的术语“抗体”特别地涉及完整的免疫球蛋白分子以及涉及基本上保留结合特异性的此类免疫球蛋白分子的部分。而且，该术语涉及修饰和/或改变的抗体分子，如嵌合抗体和人源化抗体、重组或合成产生的/合成的抗体并且涉及完整抗体以及其抗体片段，如分离的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)₂。术语“抗体”也包含双功能抗体、三功能抗体和抗体构建体，如单链Fvs(scFv)或抗体-融合蛋白。

用于产生抗体的技术是本领域熟知的并且例如在Howard和Bethell(2000)抗体产生和表征的基本方法(Basic Methods in Antibody Productionand Characterization)，Crc.Pr.Inc.中描述。针对本发明多肽的抗体可以例如通过直接注射该多肽(或其片段)至动物中或通过施用该多肽(或其片段)至动物来获得。如此获得的抗体将结合多肽(或其片段)本身。以这种方式，甚至该多肽的片段可以用来产生结合完整多肽的抗体，只要所述的结合是如上文所定义的″特异性″的。

在本发明的上下文中特别优选的是单克隆抗体。为制备单克隆抗体，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任意技术。此类技术的实例包括产生人单克隆抗体的杂交瘤技术、三体瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(Shepherd和Dean(2000)，单克隆抗体：实用方法，Oxford University Press，Goding和Goding(1996)，单克隆抗体：原理与实践-细胞生物学、生物化学和免疫学中单克隆抗体的产生和应用(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice-Production andApplication of Monoclonal Antibodies in Cell Biology，Biochemistry andImmunology)，Academic Pr Inc，USA)。

抗体衍生物也可以通过肽模拟物产生。另外，描述用于产生单链抗体的技术(特别地见美国专利4,946,778)可以适应于产生特异性识别本发明多肽的单链抗体。另外，转基因动物可以用来表达针对本发明多肽的人源化抗体。

如本文中所用，术语“特异性结合”指在蛋白质和其他生物物质的异质性群体存在下由非核糖体肽和/或非核糖体肽合酶(NRPS)和抗体的存在决定的结合反应。因此，在指定的测定条件下，特定抗体和多肽相互结合并且不以明显的量与样品中存在的其它组分结合。在此类条件下与靶分析物的特异性结合可能需要因其针对特定靶分析物的特异性而被选择的结合部分。多种免疫测定法可以用来选择与特定抗原特异性反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法常规地用来选择与分析物特异性发生免疫反应的单克隆抗体。对于可以用来确定特异性免疫反应性的免疫测定法形式和条件的描述，见Shepherd和Dean(2000)，单克隆抗体：实用方法，OxfordUniversity Press和/或Howard和Bethell(2000)抗体产生和表征的基本方法(Basic Methods in Antibody Production and Characterization)，Crc.Pr.Inc.)。一般而言，特异性或选择性反应具有至少两倍于背景噪音信号并且更典型地超过10至100倍地大于背景。

如本文中所用，术语“纯化”指意图从复杂混合物中分离出单一类型蛋白质的一系列方法。蛋白质纯化对于表征目的蛋白质的功能、结构和相互作用是重要的。作为非限制性实例，原材料可以是生物组织或微生物培养物。纯化方法中的多个步骤可以将蛋白质从禁锢它的基质中释放、将混合物的蛋白质和蛋白质部分分开并且最后将想要的蛋白质与全部其他蛋白质分开。分离步骤利用了蛋白质大小、物理化学特性和结合亲和力方面的差异。

本发明参考以下非限制性图、序列和实施例进一步描述。

所述图显示了：

图1显示由软骨霉状菌NPH-MB180产生的经证实的结构物的目录，其中所述的结构物从本发明的NRPS簇生物合成。

图2显示编码式(I)或(I’)化合物的NRPS生物合成基因簇的结构域结构，由针对式(II)、(III)、(VI)和(VII)-(XVII)化合物所提出的生物合成途径示例。L，加载结构域；AQ，腺苷酰化结构域(Gln)；T，巯化结构域；C，缩合结构域；NM，N-甲基化结构域；TE，硫酯酶结构域，AP，腺苷酰化结构域(Pro)；AT，腺苷酰化结构域(Thr)；AL，腺苷酰化结构域(Leu)；AE，腺苷酰化结构域(Glu)；AI，腺苷酰化结构域(Ile)；AY，腺苷酰化结构域(Tyr)。

图3显示与定义的腺苷酰化结构域具有最密切匹配的10个氨基酸残基的比对结果，其中所述的氨基酸残基排列于NRPS节段F 10517242中的2个腺苷酰化结构域的结合袋。

图4显示来自壳酯酰胺(Chondromide)N-甲基化结构域针对软骨霉状菌NPH-MB180的BLASTp比对的结果，其中所述结果揭示了位于NRPS节段F 10517242中的N-甲基化结构域。N-甲基化结构域基序用粗体显示颜色。

图5显示含有羟脯氨酸的化合物形成ahp残基的推测的互变。在含水条件下，在式(XVIII)示例的羟脯氨酸与式(II)示例的含有ahp的化合物之间存在平衡。

图6通过LC-MS分析来自恶臭假单胞菌KT2440异源表达培养物的提取物对式II化合物的检测。通过MS显示正(左侧分图)和负(右侧分图)离子检测的HPLC色谱图：A)式II参考化合物；B)第6日LB_D培养基；C)第6日恶臭假单胞菌阴性对照。MS谱图：D)来自A中所示HPLC运行的式II参考化合物；E)在3.2分钟处的来自B中所示HPLC运行的第6日LB_D培养基峰。

本发明参考以下核苷酸序列和氨基酸序列。

SEQ ID NO：1描述了编码代表Val/Ile缩合结构域的结构域1的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2描述了代表Val/Ile缩合结构域的结构域1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3描述了编码代表Val/Ile腺苷酰化结构域的结构域2的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4描述了代表Val/Ile腺苷酰化结构域的结构域2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5描述了编码代表Val/Ile巯化结构域的结构域3的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6描述了代表Val/Ile巯化结构域的结构域3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7描述了编码代表Tyr缩合结构域的结构域4的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8描述了代表Tyr缩合结构域的结构域4的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9描述了编码代表Tyr腺苷酰化结构域的结构域5的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10描述了代表Tyr腺苷酰化结构域的结构域5的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11描述了编码代表Tyr 6-N-甲基化结构域的结构域6的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12描述了代表Tyr 6-N-甲基化结构域的结构域6的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13描述了编码代表Tyr巯化结构域的结构域7的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14描述了代表Tyr巯化结构域的结构域7的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15描述了编码NRPS片段的核苷酸序列，所述的NRPS片段包含腺苷酰化结构域、缩合结构域和分别用于Val/Ile和Tyr的巯化结构域、以及Tyr 6-N-甲基化结构域。

本申请中所述核苷酸和氨基酸序列的功能和推定的作用进一步在上表1和下文实施例中描述。

实施例

以下实施例阐述了本发明：

实施例1：NPH-MB180的基因组序列；组装与分析。

使用产生“草图”序列的454测序方法(基于焦磷酸酯的测序平台)，将NPH-MB180的完整基因组测序。进行一个鸟枪测序操作，随后是2个配对末端测序操作。使用配对末端操作作为更传统的鸟枪法的补充技术。简而言之，它们是对连接到短DNA衔接头区上的物理破碎并环化的染色体DNA片段的测序操作。这允许来自衔接头的发散测序(divergentsequencing)，产生彼此相距约3kb存在的2个短读数(约150-200bp)(破碎环化的DNA的平均大小)。两个独立毗连群上的这2个短读数的重叠(同源性)允许非重叠毗连群连接在一起并且由具有基于3kb近似值估计的近似长度的成段未定义核苷酸(N)接合。以这种方式连接的毗连群命名为框架(scaffolds)。总体而言，进行了1,295,834个独立读数，导致310,674,400个碱基测序。平均读数长度是239个碱基；对于这种类型的测序方法是常见的。组装这些读数以基于读数之间的序列重叠形成毗连群。这种努力产生占据15,449,316个碱基的4,038个毗连群，平均毗连序列长度是8,931bp。使用产生框架的配对末端操作重叠产生96个框架的装配物，其包含15,029,556个碱基。平均框架大小是1,227,671个碱基并且平均框架大小是156,557个碱基。

分析基因组数据，目的是鉴定负责生物合成式(I)或(I’)酯肽的NRPS基因簇。整体方法是使用NRPS结构域作为搜索查询项，使用针对这96个框架的BLAST搜索(Altschul等人1990；Gish，W.和States，D.J.1993)。所依赖的NRPS结构域是腺苷酰化结构域，因为这些结构域指明将哪个氨基酸掺入非核糖体肽中并且因此是鉴定特异性NRPS簇的良好标记(Marahiel，M.A.等人1997)。通常期望找到在其结构内部以如下特异性和相对顺序：Gln-Thr-Val-Glu-Ile-Tyr+(N-meth.)-Ile含有腺苷酰化结构域的NRPS簇。此外，期望该基因簇始于能够以羧酸如异丁酸启动生物合成的加载结构域并且进一步预计该簇将以硫酯酶结构域结束。也存在这样的可能性：可能存在促进谷氨酸残基氧化以形成3-氨基-6-羟基哌啶酮残基(Ahp)的其他生物合成单元。如果在该簇中存在，则这些附属基因的相对位置是不可预测的。此外，定义该区域中存在的一个或多个转录物的转录起始和终止位置在此阶段是不可预测的。

实施例2：通过BLAST分析法鉴定NPH-MB180基因组序列中的全部NRPS腺苷酰化结构域。

依赖于鉴定NRPS簇的该方法将首先鉴定NPH-MB180基因组序列中的全部NRPS腺苷酰化结构域。NRPS腺苷酰化结构域对它们利用的氨基酸是特异的，并且因此分析这些结构域以基于构成式(I)或(I’)酯肽的氨基酸的含量和相对顺序鉴定正确的NRPS簇。为此目的，利用环孢菌素缬氨酸腺苷酰化结构域作为我们使用的通用腺苷酰化结构域的实例来鉴定该基因组序列数据中全部可能的NRPS簇。通过进行该基因组的tBLASTn(Altschul等人1990；Gish，W.和States，D.J.1993)分析以通过氨基酸序列同源性鉴定全部NRPS腺苷酰化结构域，实现了这个目的。该方法鉴定到14个可能的NRPS簇(表2)并且含有这些簇的框架连同原始BLAST命中的起点的核苷酸编号一起标记为A-N(例如A 12171827)。从该名单中鉴定了每个腺苷酰化结构域并且通过分析定义结构域特异性的保守氨基酸残基确定每一结构域的特异性(详见实施例3)。

表2.含有NRPS的框架和腺苷酰化结构域预测结果的描述

这个首次分析没有鉴定到具有正确腺苷酰化结构域组成和编码该生物合成途径的预期簇的总体大小(约30kb)的任何NRPS簇。事实上，未鉴定到如我们本来期望在目的途径中找到的含有7个腺苷酰化结构域的NRPS途径。但是，注意到了F 10517242含有异亮氨酸腺苷酰化结构域和酪氨酸腺苷酰化结构域(表2)。偶然地，该框架(框架#72)是相当短的(约7.4kb)，但是假定这是目的NRPS簇的一部分并且该簇的其余部分仍未测序(位于测序空位区中)。位于酪氨酸腺苷酰化结构域和部分T结构域之间的N-甲基化结构域的发现为这种假设提供了额外支持(详见实施例4)。

基于这些数据，得出结论：该基因组序列整体上不含有所述生物合成基因簇。确实可以预测5’方向上的大约20kb和3’方向上的大约6kb仍未说明。

实施例3：NRPS腺苷酰化结构域特异性的预测

使用以下一般方案，预测了本文中所述的腺苷酰化结构域特异性。使用tBLASTn(Altschul等人1990；Gish，W.和States，D.J.1993)搜索鉴定腺苷酰化结构域，其中所述的tBLASTn检索将环孢菌素合酶(CssA)的缬氨酸腺苷酰化结构域的氨基酸序列针对软骨霉状菌的目的基因组DNA比对。使用ClustalX多重序列比对软件(Higgins等人1996)，将翻译的软骨霉状菌腺苷酰化结构域针对GrsA(PheA)(短杆菌肽S合成酶)在Marahiel等人(1997)定义的2个核心基序(A3和A6)之间的氨基酸水平比对。在这种比对中鉴定出由Marahiel等人报道的定义腺苷酰化结构域的结合袋并且因此决定氨基酸特异性的10个氨基酸。使用由Rausch等人(2005)和Stachelhaus等人(1999)报道的数据，随后将这10个氨基酸与定义的腺苷酰化结构域氨基酸代码比较。

在生物合成簇的节段中鉴定到的这两个腺苷酰化结构域显示与定义异亮氨酸和酪氨酸结合袋的10个氨基酸高度同源(图3)。这些氨基酸特异性不是绝对的，并且具有相似化学特征的氨基酸常常替换定义该结构域的氨基酸。这解释了由一个NRPS操纵子合成的诸结构的变异性。在这种情况下，假设该异亮氨酸腺苷酰化结构域也可以接受缬氨酸至其结合袋中，这是一个已经对其他“异亮氨酸”腺苷酰化结构域显示的特征(Rausch等人(2005))。实际上，可用的NRPS预测工具(例如http://www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/-software/NRPS-predictor)通常不能断定某腺苷酰化结构域为异亮氨酸特异性或缬氨酸特异性的。

实施例4：NRPS N-甲基化结构域的预测

使用以下方法，预测N-甲基化结构域的存在直接在3’方向毗邻于酪氨酸腺苷酰化结构域。使用tBLASTn(Altschul等人1990；Gish，W.和States，D.J.1993)，藏红花软骨霉状菌NPH-MB180壳酯酰胺NRPS簇的N-甲基化结构域的氨基酸序列用来针对相似的结构域搜索基因组。使用这种方法，在NRPS节段内部鉴定到具有期望值5e-43和46％氨基酸序列同一性的N-甲基化结构域(图4)。此外，应当指出来自该NRPS节段的N-甲基化结构域具有在功能性N-甲基化结构域中通常存在的期望的氨基酸基序(von Dohren，H.等人1997；Marahiel，M.A.等人1997)。为证实这个数据，来自鱼腥藻(Anabaena)株90鱼腥藻肽内酯(abaenopeptilide)生物合成簇的N-甲基转移酶Apsy-6(Rouhiainen等人2000)与上文所述的N-甲基转移酶比较。这种比较的BLASTp结果揭示这些结构域是以期望值2e-65高度同源的，从而证实初步鉴定到这种结构域。该结构域直接毗邻于酪氨酸腺苷酰化结构域的存在与NRPS基因簇的期望结构一致。此外，N-甲基化结构域是相对罕见的，并且因此这个结构域在该NRPS节段内部的存在提供了该节段属于NRPS簇的有力证据。

实施例5：完整生物合成NRPS基因簇的鉴定

鉴定并表征了负责产生式(I’)酯肽的完整非核糖体肽生物合成基因。将所述生物合成基因组装到由插入框架D942267中的框架F 10517242组成的框架(表1)上。在直接毗邻于框架F 10517242的核苷酸的序列分析表明对原始基因组装配的这种插入性调整得到证明后，进行这些框架的组合。已经通过PCR和贯通框架接合区的后续DNA测序证实了这种组装。在该框架内部是8个连续可读框，它们可能负责式(I’)酯肽的生物合成、修饰和胞外输出。此外，一种可能的分泌蛋白酶位于这些可读框内部，其中所述的分泌蛋白酶可能最后是酯肽(已证实的蛋白酶抑制剂)的天然细胞靶。这些ORF和相应NRPS结构域的排列在图2中显示。

直接在核心非核糖体肽可读框(ORF6和ORF7)之前的是5个ORF。ORF1和ORF2各自与据报道来自纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的2种不同的未表征蛋白质同源。这些蛋白质没有假设的功能，但是，值得注意的是它们似乎仅存在于多囊菌科(Polyangiaceae)中。此外，在纤维堆囊菌基因组中至少5次找到与ORF2同源的堆囊菌蛋白。基于它们几乎完美的核苷酸序列接近，这些蛋白质似乎与ORF3共转录。ORF3与丝氨酸蛋白酶、特别地属于枯草杆菌蛋白酶组的那些丝氨酸蛋白酶具有高度序列同源性。我们已经生物化学地确定酯肽是高度特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且因此合理的是酯肽为ORF3丝氨酸蛋白酶的抑制剂。相反，ORF3可能涉及向软骨霉状菌菌株赋予酯肽抗性。ORF4和ORF5与ABC转运蛋白类型的铁载体通透酶和通用环状肽通透酶同源。有可能这种通透酶系统参与酯肽跨胞质膜输出。事实上，有可能的是所有这五个ORF均涉及胞质膜转运过程并且“丝氨酸蛋白酶样”ORF3仅与丝氨酸蛋白酶家族共享相似性，因为就实际的蛋白酶而言，它结合蛋白酶抑制剂。

核心酯肽生物合成簇始于ORF6并且延续贯通ORF7。这两个ORF合计长度超过15kb。就全部NRPS生物合成簇而言，它们可以分解成具有以下总体布局的功能结构域，其中所述的总体布局由后接腺苷酰化结构域的缩合结构域组成，所述的腺苷酰化结构域后接巯化结构域(Marahiel等人1997)。这三个结构域模块通常在NRPS簇中重复多次，对于掺入肽中的每一个氨基酸重复一次。酯肽生物合成簇遵循这种模式，具有7个这种模块重复序列解释了肽核心中所含有的7个氨基酸。多个腺苷酰化结构域向正在增长的肽赋予氨基酸特异性并且可以被分析以鉴定它们接受并随后掺入的氨基酸。

ORF 6和7中存在的这七个腺苷酰化结构域的预测氨基酸特异性通常符合酯肽的最终结构，只有一个例外。预测第四腺苷酰化结构域(结构域7.3)在这个位置接受和掺入脯氨酸至正在增长的肽中，而最终肽在该位置中含有非标准的氨基酸，是3-氨基-6-羟基-哌啶酮(ahp)。Ahp存在于几种酯肽中，包括由鱼腥藻株90产生的相关的鱼腥藻肽内酯(anabaenapeptolide)(Rouhiainen等人2000)。已经推测在该链第四位置处掺入谷氨酰胺(其随后对前面氨基酸的胺再发生反应以形成ahp)后，ahp形成在鱼腥藻肽内酯中发生(Rouhiainen等人2000)。然而也已经在文献中描述了ahp特异性腺苷酰化结构域(Rausch等人2005)。在分离自菌株MB180的含有ahp的式II-VII、XI至XIII和XVII酯肽中，我们现在设想ahp形成的新过程，其中脯氨酸起初在第四位置掺入正在增长的肽中并且ahp随后在一种氧化还原酶的辅助下形成。实际上，已经出人意外地在酯肽生物合成簇中找到细胞色素P450基因(ORF8)，该基因紧邻NRPS生物合成簇之后存在并且可能通过羟化脯氨酸残基而催化该转化过程。

值得注意的是在该位置含有脯氨酸的酯肽似物已经从菌株MB180分离(式XIV)。也证实在含水的环境中孵育几日时，具有5-羟脯氨酸的类似物(式XVIII)从含有ahp的酯肽(例如式II)自发形成(图5)。这种5-羟脯氨酸形式和ahp形式之间的互变也已经由我们证实是可逆的。尽管不清楚其他酯肽是否也遵循这种策略，然而这可能是我们的菌株MB180使用的ahp形成策略。

酯肽生物合成簇在伴有加载结构域的ORF6中开始，所述的加载结构域以起动单元(starter unit)启动该生物合成。基于式(I’)的酯肽中X残基的结构变异性，可以推测羧酸如CH₃CH₂CH(CH₃)COOH、(CH₃)₂CHCOOH、C₆H₅COOH、CH₃S(O)CH₂COOH或CH₃COOH作为起动单元。

尽管对于非核糖体肽而言常见用小的酸残基启动，然而残基的选择在肽与肽之间明显不同。但是，复杂羧酸起动单元在非核糖体肽类之间是相对不常见的。用来启动酯肽生物合成的加载结构域在结构上和所用起动单元方面均不同于鱼腥藻肽内酯加载结构域。事实上，酯肽加载结构域与标准缩合结构域极密切地相关，而鱼腥藻肽内酯的甲酰基加载结构域密切类似于先前描述的甲酰基转移酶(Rouhiainen等人2000)。在羧酸起动单元缩合到结构域6.2指定的氨基酸谷氨酰胺的α氨基上后，该链在其依次经过NRPS生物合成装置前进时继续一次伸长一个氨基酸(图2)。

酯肽生物合成装置以一次一个氨基酸方式合成肽而不背离简单的NRPS肽，直至它遇到使肽键的仲胺甲基化的相对稀有的甲基转移酶结构域(结构域7.10)。在这种情况下，这在酪氨酸衍生的氨基上产生叔胺。这种甲基化假设地在添加酪氨酸至正在增长的肽之后但在添加下一个和最末氨基酸之前发生。这一点由紧邻酪氨酸特异性腺苷酰化结构域之后的N-甲基酶结构域的位置有力提示。

最后，该肽从终末巯化结构域中移走并环化，从而在苏氨酸醇和末端异亮氨酸的α酮基之间形成酯键。这由作为位于ORF7中的终末结构域的标准硫酯酶结构域(结构域7.15)执行。不清楚ahp形成是否在这个硫酯酶步骤之前或之后发生。无论如何，该生物合成簇内部所含有的基因足以负责式(I’)酯肽的完整结构。

实施例6：酯肽在恶臭假单胞菌KT2440中的异源表达。

这里，我们描述了实现式(I)或(I’)酯肽在恶臭假单胞菌KT2440中异源表达的方法的一个例子。该宿主具有胜过天然生产菌株藏红花软骨霉状菌的几个优点，包括快速及可预测的生长、遗传工具可用性和在大规模发酵中经验证的用途。此外，该宿主具有与藏红花软骨霉状菌相似的基因组GC％并且具有天然NRPS系统；这是设计异源表达策略时重要考虑的2个性状。

将所述生物合成基因簇克隆至能够接受大插入物(在生物合成基因簇长度超过30kb的条件下一种必需品质)的粘粒pWEB-TNC(EpicenterBiotechnologies，Madison WI，USA)中。通过首先鉴定将在该生物合成簇的边界外侧切割以产生大约30-40kb线性DNA片段的适宜限制酶来进行生物合成基因簇的克隆。对基因组序列数据的分析揭示酶XmnI适合这项任务并且当进行完整基因组DNA消化时，会产生处于该大小范围内的15个不同DNA片段。这15个DNA片段中，预测一个39kb片段含有所述生物合成簇。通过琼脂糖凝胶电泳将这15个DNA片段与其他染色体消化片段分离。使用适宜大小的DNA标准品作为指示，将处于想要的大小范围内的15个DNA片段从凝胶中切下并且根据制造商的说明克隆至粘粒pWEB-TNC中。含有完整生物合成簇的粘粒克隆通过菌落PCR鉴定并且通过DNA测序证实。备选方法可以是使用粘粒或BAC载体产生完整基因组的随机鸟枪法文库，随后使用放射性标记探针对该克隆文库做菌落杂交以鉴定含有目的生物合成簇的克隆文库成员。

在获得克隆的生物合成途径后，需要几个遗传组件插入该粘粒克隆中以允许成功的异源表达。这些组件包括i)允许鉴定成功转移入异源宿主中的选择标记、ii)在该异源宿主中发挥作用的启动子、iii)用于染色体型整合入该异源宿主中的位点和iv)由pRK2013 oriT序列赋予的质粒接合转移功能(随RK2转移功能一起使用)。我们为该实施例选择的用于恶臭假单胞菌KT2440中的选择标记是庆大霉素抗性盒aacCI(Blondelet-Rouault等人1997)。其他选择标记可以包括赋予氨苄青霉素抗性的核苷酸盒(如bla)、赋予氯霉素抗性的核苷酸盒(如cat)、赋予卡那霉素抗性的核苷酸盒(如aacC2、aadB或其他氨基糖甙类修饰酶)或赋予四环素抗性的核苷酸盒(如tetA和tetB)。作为驱动恶臭假单胞菌KT2440中异源表达的启动子，我们在此描述延胡索酸酶C-1(PP 0944)基因启动子(也见实施例8)的使用。转录启动子的选择可以包括在恶臭假单胞菌KT2440中有功能的上文所列抗生素抗性决定因素中任意者的转录启动子，包括但不限于在恶臭假单胞菌KT2440基因组中存在的七个16S rRNA基因的转录启动子(PP 16SA、PP16SB、PP 16SC、PP 16SD、PP 16SE、PP 16SF、PP 16SG)、任何恶臭假单胞菌KT2440高铁摄取阻抑物(Fur)调节基因的转录启动子(包括fagA(PP 0943)或另一个fumC同源物fumC-2[PP 1755]的启动子)、参与生物合成和运输铁载体或铁载体样化合物的启动子(包括pvdE[PP 4216]、fpvA[PP 4217])或基因PP 4243或PP 0946的转录启动子。来自恶臭假单胞菌的启动子，包括使用此处描述的延胡索酸酶C-1启动子，在我们的策略中用于第二个目的，提供了通过RecA介导的染色体整合事件进行至恶臭假单胞菌宿主的染色体整合的位点。为促进高效的染色体整合，在粘粒构建体中包括1046bp的启动子区。启动子元件位于预期插入物的3’端以允许推进转录进入下游生物合成簇基因。通过并入来自pSET152的oriT核苷酸序列促进质粒接合。当反式提供RK2转移功能时，oriT序列对于允许粘粒的成功接合转移是必需和足够的。使用pUC19作为主链，依次克隆这3种遗传组件(5’-庆大霉素抗性-oriT-fumC1启动子-3’)。使用标准分子生物学实践产生这个异源表达盒。

一旦完成，该异源表达盒从pUC19转移到含有生物合成基因簇的粘粒克隆中。如此进行这种插入，从而含有启动子元件的插入物的3’末端距离生物合成基因簇的第一可读框的翻译起始密码子20个碱基对存在，因而导致启动子元件与生物合成基因簇的转录性融合。该启动子意图驱动此基因簇的转录并且依赖位于生物合成基因簇内部的天然核糖体的结合位点来启动生物合成性蛋白质的翻译。通过使用由Chaveroche等人2000的λRED重组酶功能所介导的同源重组进行这种插入。简而言之，产生由带有(设计到PCR引物中的)100nt侧翼区的上文所述构建体组成的PCR产物，其中所述的侧翼区与生物合成基因簇中的预期插入位点具有同源性。这些100nt侧翼区通过长侧翼同源性PCR添加PCR所产生的长度600nt的侧翼区至现有100nt侧翼区被进一步延伸(Moore等人2005)。将带有600nt同源性侧翼区的异源表达盒电穿孔至已经事先从质粒pKOBEGhyg(克隆至HindIII限制位点中的含有潮霉素盒的pKOBEG质粒的构建体)表达λRED蛋白的大肠杆菌EPI100电感受态细胞中。在补充有15μg/ml庆大霉素的Lauria肉汤琼脂上选择已经成功整合至粘粒中的转结合子。如此产生的异源表达构建体由PCR和DNA测序证实。虽然效率较低，但是仍可以通过常规的基于限制酶的克隆策略备选地进行异源表达盒插入粘粒克隆中。

使用依赖大肠杆菌辅助菌株HB101(pRK2013)来提供RK2转移功能的已建立方法(Stanisich和Holloway，1969)，通过三亲株接合(tri-parentalconjugation)将异源表达构建体接合转移至恶臭假单胞菌KT2440中。在Lauria肉汤琼脂上选择恶臭假单胞菌转结合子，其中所述的Lauria肉汤琼脂补充有选择恶臭假单胞菌转结合子的75μg/ml庆大霉素以及阻止大肠杆菌供体和辅助菌株生长的25μg/ml三氯生(irgasan)。通过PCR、Southern杂交和DNA序列分析法证实已经在fumC-1上游启动子区成功整合至恶臭假单胞菌染色体中的转结合子。

通过在含有2g/L异丁酸和100μM2，2-联吡啶(培养基pH调节至7.0)的Lauria培养液中在15℃伴以200转/分钟恒定旋转振摇下培育的生长证实式II化合物的产生。化学提取在第6日用1∶1乙酸乙酯对5mL粗发酵培养液实施，随后在30℃浓缩至干并且随后在甲醇中重构至20X终浓度。使用与在线DAD、MS和MS/MS检测偶联的C-18柱，通过HPLC分离进行分析。使用MS和MS/MS检测明确地鉴定式II化合物(图6)。

实施例7：5-羟脯氨酸重排成3-氨基-6-羟基-2-哌啶酮(ahp)的机制。

式(I’)酯肽的核心生物合成途径表明脯氨酸在第4氨基酸位置掺入该酯肽链中。这与含有脯氨酸而非ahp或脱氢ahp的式(XIV)化合物一致。我们已经鉴定到细胞色素P450酶(orf 8)，其中我们假设所述的细胞色素P450酶羟化脯氨酸，因而产生由式(XVIII)示例的带5-羟脯氨酸的化合物。在含水的环境中孵育几日时，式(XVIII)的化合物从含有ahp的酯肽(例如式II)中自发形成(图5)。这种5-羟脯氨酸形式和ahp形式之间的互变也已经由我们显示是可逆的并且在50℃于水中10日后实现大约9∶1(ahp∶5-羟脯氨酸)摩尔比平衡。

实施例8：来自恶臭假单胞菌KT2440的Fur调节型fumC-1启动子用于酯肽生物合成基因簇异源基因表达的用途

为了能够成功地在宿主恶臭假单胞菌KT2440中异源表达酯肽生物合成基因簇，需要找到置于该异源宿主中此基因簇前方的合适启动子。选择来自异源宿主恶臭假单胞菌KT2440的fur-调节型启动子(SEQ IDNO：69)。在许多(如果并非大多数)细菌中，当使用标准的复杂生长培养基(如LB)时，生长转变期与生长培养基中的铁限制作用发动同时出现。我们相信延迟异源宿主中酯肽生物合成基因簇的转录直至生长转变期以使该宿主能够达到健康群体密度将是有利的，并且因为已知大部分次级代谢物通常在这个生长时期产生。应答于铁限制作用激活的基因常常受高铁摄取阻抑物(Fur)调节。这种代谢调节物(metaloregulator)充当Fe传感蛋白，其中所述的Fe传感蛋白在Fe充足条件下通过与受调节基因的启动子区直接结合，因而物理地阻碍RNA聚合酶结合而阻抑一组基因(Barton等人1996)。在铁不充足的条件下，Fur从启动子区释放，因而允许所述基因的转录发生。因此，Fur调节型启动子的使用将允许我们阻抑异源基因的表达直至转变期。

我们从相对于充足铁水平时应答于低铁水平而表达的基因的已公布蛋白质组(Heim等人2003)中鉴定了恶臭假单胞菌KT2440中的潜在Fur调节型基因并且使用铜绿假单胞菌Fur阻抑物共有位点“gataatgataatcattatc”(SEQ ID NO：64)Barton等人1996)，搜索在那些基因前方的启动子区。通过研究来自Barton等人的铁调节型蛋白质组所确定，恶臭假单胞菌KT2440中上调最高的基因产物之一是编码两种恶臭假单胞菌延胡索酸酶之一的fumC-1的基因产物。进一步研究揭示先前已经显示该基因受Fur调节(Hassett等人1997)。基于公布的数据，我们因此希望该启动子区是强有力的并且会以铁依赖性方式起作用，即铁水平在细胞中低时开启。这些特征使fumC-1启动子区成为用于恶臭假单胞菌KT2440中异源基因表达的理想候选者。如上文实施例6和图6中所示的完整生物合成基因簇成功的异源基因表达证实了这种假设。

可以通过以等于或大于发酵生长培养基中3X铁浓度的摩尔水平添加铁螯合剂2’2’-联吡啶在发酵培养物中获得铁不充足条件。这允许Fur调节型基因以受控方式因添加2’2’-联吡啶而上调。例如，我们已经在使用生长培养基LB的异源表达发酵培养物中使用300μM 2’2’-联吡啶。其他的铁螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐或充当铁摄取的化合物铁载体(如去铁胺、肠杆菌素或bacillibactin)也可以按相似方式用来创立发酵培养基中的铁不充足条件。备选地，可以通过使用定义的发酵培养基仔细地控制铁水平。

可以按照与此处对成功使用fumC-1启动子所描述的相同方式使用其他Fur调节型启动子。例如，控制FpvA和OmpR-1表达的启动子可以因可能包含Fur阻抑物结合位点而使用。此类启动子在下文实施例9中进一步详述。使用本文中所述的生物信息学方法或通过使用如Baichoo等人(2002)已经描述的纯化Fur蛋白相对于启动子区DNA的电泳迁移率变动测定法，可以鉴定在Fe不充足条件下上调的任何基因前方的其他Fur结合位点。Fur家族广布于细菌结构域和启动子区中，它们各自的Fur结合位点通常是属特异性并且常常是物种特异性。因而，预计恶臭假单胞菌KT2440Fur调节型启动子区在其它假单胞菌属物种中也有功能。

实施例9：Fur调节型启动子

来自恶臭假单胞菌KT2440的Fur调节型启动子。Fur阻抑物结合位点加下划线并且通过针对铜绿假单胞菌Fur阻抑物共有位点gataatgataatcattatc(SEQ ID NO：64)的共有核苷酸相似性搜索被鉴定(Barton等人1996)。

fumC-1 Fur调节型启动子区(Fur阻抑物位点加下划线)

atcaggccgcgctgattcgccgtatggggcgcgggctgctggtgaccgaactgatggggcatggcttgaa

catggtgacgggggactattcccgtggtgcggcggggttctgggtcgagaatggcgagattcagcatgcc

gtacaggaagtcaccatcgccggaaacatgaaggacatgttccagcagattgtcgcgatcggtagcgatc

ttgaaacccgtagcaatattcatacgggctcggtgttgatcgagcggatgaccgttgctggtagctgatc

tttagcctgcgccggccctttcgcgggtaaacccgctcctacacggtggtggacgtacatcggggttgga

cacaggccgttgtaggagcgggttcacccgcgaagaggccggaacagcactacacctttccctgcaaatc

cgaagacccggccctcgcgccgggtttttatttcatcacctttttcttgaagtgattctatttatcactt

aataatgaatatcattatccagtaacccggcgatgatgttcatgaaatccgtcctccgcgaactgcccta

cctggaaaactggcgctggctcagccggcgcattcgctgtgcgctcgaccccgacgagccgcgcctgatc

gagcattacctggccgaaggccgctatctggtgtgctgcaccgaaacctcgccatggacggtggcgctga

cagcgtttcgcctgctgctggataccgcctgcgatcgcatgctcccctggcattggcgttgtctgtgcct

ggaccaggcgtggcgccctctgctggacctgcgcaacctcgaccgccaggaacagaaccaacgctggcaa

ccctacgccttgcagttggccaattgccgtctgctgccttcgatttctcccgatgaactgatgcaaggat

ttgatgatgagtgatacccgtatcgagcg(SEQ ID NO：69)

FpvA Fur调节型启动子区(Fur阻抑物位点加下划线)

tccggcgaattttctacacagagctgctgccggacctcaagcgcctgggcaagaccatca

tcgtgataagccacgacgaccgctacttcgacgtcgccgaccagctcatccacatggcgg

caggcaaggtccaacaggagaaccgcgtcgcagattgcatttaatttttccggttttggc

cgatgagtgcgtcccaatcaataacaagaattaatactattaacatctgacactcaaggg

ctttgaaaaa(SEQ ID NO：70)

OmpR-1 Fur调节型启动子区(Fur阻抑物位点加下划线)

caggtagcgcaggcgctcttccaggtggcgcaactgagtgtcgtcaaggctaccggtcac

ttccttgcgatagcgggcgatgaagggcacggtcgagccttcgtccaacaggctcacggc

cgcctcgacctgctgcgggcgtacgcccagttcctcggcgatacggctgttgatgctgtc

catgtaaaccacctgacatttgtgaatacgggggtcgcctgtgggctttttgcccggcgg

cgctggatgaaagccgcgcattatacccatcgcaaacggcttgcggtgatggcgcccggc

cagccggaactggcgccgggggaaaaatctgctaacaatgctcacgcaacgtgcagcaat

ggctacgccataatgcgcggcgatatcagaggagttattc(SEQ ID NO：71)

fumC-1启动子的Fur阻抑物结合位点

aaacatgaaggacatgttc(SEQ ID NO：65)

aataatgaatatcattatc(SEQ ID NO：66)

fpvA启动子的Fur阻抑物结合位点

aataacaagaattaatact(SEQ ID NO：67)

ompR-1启动子的Fur阻抑物结合位点

cataatgcgcggcgatatc(SEQ ID NO：68)

已经描述和表征了来自许多非假单胞菌属物种的Fur调节型启动子和它们的Fur阻抑物位点并且它们由Carpenter等人(2009)列出和综述。Fur结合位点可以在不同属之间大幅度变动。例如，大肠杆菌的共有Fur结合位点是GATAATGATAATCATTATC(de Lorenzo等人1987)，而枯草芽孢杆菌的共有Fur结合位点是TGATAATTATTATCA(Baichoo和Helmann，2002)。

参考文献：

Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.(1990)″基本局部比对搜索工具(Basic local alignment search tool)″J.Mol.Biol.215：403-410.

Baichoo N，Helmann JD.(2002)通过Fur识别DNA：Fur盒共有序列的再解释(Recognition of DNA by Fur：a reinterpretation of the Fur boxconsensus sequence).J Bacteriol.184(21)：5826-32.

Baichoo N，Wang T，Ye R，Helmann JD.(2002)枯草芽孢杆菌Fur调节子的总体分析与铁饥饿刺激(Global analysis of the Bacillus subtilis Furregulon and the iron starvation stimulon).Mol Microbiol.45(6)：1613-29.

Barton HA，Johnson Z，Cox CD，Vasil AI，Vasil ML.(1996)在需氧和微需氧环境中外毒素A和铁载体的铁依赖性阻抑作用明显改变的铜绿假单胞菌高铁摄取调节蛋白突变体(Ferric uptake regulator mutants ofPseudomonas aeruginosa with distinct alterations in the iron-dependentrepression of exotoxin A and siderophores in aerobic and microaerobicenvironments).Mol Microbiol.21(5)：1001-17.

Binz，T.M.，Wenzel，S.C.，Schbell，H.，Bechthold，A.，，R.(2008)借助使用Red/ET重组工程的phenalinolactone生物合成基因簇异源表达和基因工程(Heterologous expression and genetic engineering of thephenalinolactone biosynthetic gene cluster by using Red/ETrecombineering).ChemBioChem.9：447-454.

Carpenter BM，Whitmire JM，Merrell DS.(2009)这不是你母亲的阻抑物：fur在发病机制中的复杂作用(This is not your mother′s repressor：the complex role of fur in pathogenesis).Infect Immun.77(7)：2590-601.

de Lorenzo V，Wee S，Herrero M，Neilands JB.(1987)结合高铁摄取调节(fur)阻抑物的质粒ColV-K30的产气菌素操纵子的操纵基因序列(Operator sequences of the aerobactin operon of plasmid ColV-K30binding the ferric uptake regulation(fur)repressor).J Bacteriol.169(6)：2624-30.

Garrity，P.A.，连接介导的PCR(Ligation-Mediated PCR)，在PCR 2A Practical Appraoch中，McPherson，M.J.等人(编著)第309-322页Oxford UniversityPress，New York(1995).

Gish，W.和States，D.J.(1993)″通过数据库相似性搜索鉴定蛋白质编码区(Identification of protein coding regions by database similaritysearch).″Nature Genet.3：266-272.

Gu，J.Q.，Nguyen，K.T.，Gandhi，C.，Rajgarhia，V.，Baltz，R.H.，Brian，P.，Chu，M.(2007)由重组玫瑰孢链霉菌(Streptomyce roseosporus)菌株产生的达托霉素类似物A21978C1-3(d-Asn11)的结构性表征(Structuralcharacterization of daptomycin analogues A21978C1-3(d-Asn11)producedby a recombinant Streptomyces roseosporus strain).J.Nat.Prod.70：233-240.

Hassett DJ，Howell ML，Ochsner UA，Vasil ML，Johnson Z，Dean GE.(1997)铜绿假单胞菌中含有编码延胡索酸酶C和锰超氧化物歧化酶的fumC和sodA的操纵子受高铁摄取调节物控制：fur突变体产生升高的藻酸盐水平(An operon containing fumC and sodA encoding fumarase C andmanganese superoxide dismutase is controlled by the ferric uptakeregulator in Pseudomonas aeruginosa：fur mutants produce elevatedalginate levels).J Bacteriol.179(5)：1452-9.

Heim S，Ferrer M，Heuer H，Regenhardt D，Nimtz M，Timmis KN.(2003)用于基因组表达谱的恶臭假单胞菌菌株KT2440的蛋白组参考图：KT2440和铜绿假单胞菌菌株PAO1对铁缺乏的不同应答和新形式的超氧化物歧化酶(Proteome reference map of Pseudomonas putida strainKT2440 for genome expression profiling：distinct responses of KT2440 andPseudomonas aeruginosa strain PAO1 to iron deprivation and a new formof superoxide dismutase).Environ Micro biol.5(12)：1257-69.

Higgins D.G.，Thompson J.D.，Gibson T.J.(1996).使用CLUSTAL用于多重序列比对(Using CLUSTAL for multiple sequence alignments).Methods Enzymol.，266，383-402.

Finking，R.，Marahiel，MA.，(2004)非核糖体多肽的生物合成(Biosynthesis of nonribosomal polypeptides ).Annu Rev.Microbiol.58：453-488.

Marahiel，M.A.，Stachelhaus，T.，Mootz，H.D.(1997)参与非核糖体肽合成的模块肽合成酶(Modular peptide synthetases involved innonribosomal peptide synthesis).Cem.Rev.97：2651-2673.

Pfeifer，B.A.，Admiraal，S.J.，Gramaj o，H.，Cane，D.E.，Khosla，C.(2001)复杂聚酮化合物在大肠杆菌代谢工程化菌株中的生物合成(Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strainof E.coli).Science.291：1790-1792.

Rausch，C.，Weber，T.，Kohlbacher，O.Wohlleben，W.，Huson，D.H.(2005)使用直推式支持向量机(TSVMs)对非核糖体肽合成酶(NRPS)中腺苷酰化结构域的特异性预测(Specificity prediction of adenylation domainsin nonribosomal peptide synthetases(NRPS)using transductive supportvector machines(TSVMs)).Nuc.Acids Res.33：5799-5808.

Rouhiainen，L.，Paulin，L.，Suomalainen，S.，Hyytiainen，H.，Buikema，W.，Haselkorn，R.，Sivonen，K.(2000)鱼腥藻90株中编码环状酯肽anabaenopeptilides的合成酶的基因(Genes encoding synthetases of cyclicdepsipeptides，anabaenopeptilides，in Anabaena strain 90).Mol.Microbiol.37：156-167.

Sambrook，J.，Maniatis，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor NY.

Shaying Zhao(编著)，Marvin Stodolsky，Marvin Stodolsky(编著)(2003)细菌人工染色体(《分子生物学方法》系列丛书v255-256)：文库构建、物理作图和测序，第1卷(Bacterial Artificial Chromosomes(Methods inMolecular Biology Series v255-256)：Library Construction，PhysicalMapping，and Sequencing)Springer-Verlag New York，LLC.

Shen，B.(2004)通过组合生物合成法获得天然产物(Accessing naturalproducts by combinatorial biosynthesis).Sci STKE.Pe14.

Stachelhaus，T.Mootz，H.D.，Marahiel，M.A.(1999)非核糖体肽合成酶中腺苷酰化结构域的特异性赋予代码(The specificity-conferring code ofadenylation domains in nonribosomal peptide synthetases).Chem.Biol.6：493-505.

Staunton，J.，Weissman，K.J.(2001)聚酮化合物生物合成：千年述评(Polyketide biosynthesis：a millennium review).Nat.Prod.Rep.18：380-416.

Wenzel，S.C.，R.(2005)复杂细菌天然产物生物合成途径的异源表达最新进展(Recent developments towards the heterologous expressionof complex bacterial natural product biosynthetic pathways).Curr.Op.Biotechnol.16：594-606.

Von Dohren，H.，Keller，U.，Vater，J.，和Zocher，R.(1997)多功能肽合成酶(Multifunctional peptide synthetases).Chem.Rev.97：2675-2705.

Zhang，Y.，Muyrers，J.Testa，G.，Stewart，F.(1998)利用大肠杆菌中重组用于DNA工程化的新逻辑(A new logic for DNA engineering usingrecombination in Escherichia coli).Nat.Genet.20：123-128.

Zhuang，H.，Yong，W.，Pfeifer，B.A.(2008)用于天然产物生产的细菌宿主(Bacterial hosts for natural product production).MolecularPharmaceuticals.5：212-225.

Claims

1.分离的多核苷酸，其编码用于产生式(II)化合物的生物合成基因簇：

所述多核苷酸包含：

(i)SEQ ID NO:16的核苷酸序列或其完全互补物；

(ii)SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其完全互补物；

(iii)SEQ ID NO:20的核苷酸序列或其完全互补物；

(iv)SEQ ID NO:22的核苷酸序列或其完全互补物；

(v)SEQ ID NO:24的核苷酸序列或其完全互补物；

(vi)代表NRPS1的SEQ ID NO:26的核苷酸序列或其完全互补物；

(vii)代表NRPS2的SEQ ID NO:28的核苷酸序列或其完全互补物；和

(viii)代表细胞色素P450的SEQ ID NO:62的核苷酸序列或其完全互补物。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其编码了

(a)保留以下NRPS2结构域中一种或多种结构域的活性的表达产物：

(i)SEQ ID NO:47的巯化结构域；

(ii)SEQ ID NO:49的缩合结构域；

(iii)SEQ ID NO:51的脯氨酸腺苷酰化结构域；

(iv)SEQ ID NO:53的巯化结构域；

(v)SEQ ID NO:2的缩合结构域；

(vi)SEQ ID NO:4的异亮氨酸腺苷酰化结构域；

(vii)SEQ ID NO:6的巯化结构域；

(viii)SEQ ID NO:8的缩合结构域；

(ix)SEQ ID NO:10的酪氨酸腺苷酰化结构域；

(x)SEQ ID NO:12的N-甲基化结构域；

(xi)SEQ ID NO:14的巯化结构域；

(xii)SEQ ID NO:55的缩合结构域；

(xiii)SEQ ID NO:57的异亮氨酸腺苷酰化结构域；

(xiv)SEQ ID NO:59的巯化结构域；

(xv)SEQ ID NO:61的硫酯酶结构域；

或者

(b)保留以下NRPS1结构域中一种或多种结构域的活性的表达产物：

(xvi)SEQ ID NO:31的加载结构域；

(xvii)SEQ ID NO:33的谷氨酰胺腺苷酰化结构域；

(xviii)SEQ ID NO:35的巯化结构域；

(xix)SEQ ID NO:37的缩合结构域；

(xx)SEQ ID NO:39的苏氨酸腺苷酰化结构域；

(xxi)SEQ ID NO:41的巯化结构域；

(xxii)SEQ ID NO:43的缩合结构域；和

(xxiii)SEQ ID NO:45的亮氨酸腺苷酰化结构域。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO:29所述氨基酸序列的核苷酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO:27所述氨基酸序列的核苷酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其分离自保藏号DSM 19329的藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)菌株NPH-MB180。

6.分离的多肽，其由权利要求1-5任一项所述的多核苷酸编码。

7.用于产生式(II)化合物的分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

(i)由权利要求1-5任一项所述的多核苷酸编码的氨基酸序列；和

(ii)所述氨基酸序列的功能变体，其基本上保留相同的催化性功能。

8.包含权利要求1-5任一项所述的多核苷酸的表达载体，其中可读框与转录性序列和翻译性序列有效连接。

9.权利要求8所述的表达载体，其还包含一种或多种选择标记以允许选择含有所述载体的宿主细胞。

10.权利要求9所述的表达载体，其中所述选择标记是编码二氢叶酸还原酶的基因、或赋予新霉素、四环素、氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素抗性的基因、或酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。

11.用权利要求1-5任一项所述的一种或多种多核苷酸或权利要求8-10任一项所述的表达载体遗传工程化的重组宿主细胞。

12.权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸整合到基因组中。

13.权利要求11所述的重组宿主细胞，用于产生式(II)化合物。

14.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中重组多核苷酸已经为了优化的基因表达而进行了修饰。

15.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中多核苷酸的密码子选择已经调整成该宿主细胞的丰富蛋白质的密码子选择。

16.根据权利要求11-15任一项所述的重组宿主细胞，其选自大肠杆菌、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、灰褐链霉菌(Streptomycegriseofuscus)、产二素链霉菌(Streptomyce ambofaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)、藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)、假单胞菌属(Pseudomonas)中的物种、链霉菌属(Streptomyce)、芽孢杆菌属(Bacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)、酵母、果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9、CHO、COS或Bowes黑素瘤和腺病毒。

17.根据权利要求16任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自粘球菌目(Myxococcales)或假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的物种。

18.根据权利要求16所述的重组宿主细胞，其中所述细胞是藏红花软骨霉状菌。

19.制备式(II)化合物的方法，其包括在产生所述化合物的条件下培养根据权利要求11-18任一项所述的宿主细胞。

20.权利要求19所述的方法，其还包括回收所述化合物的步骤。

21.权利要求19或20所述的方法，其中将宿主细胞在含有异丁酸的生长培养基中培养。