CN102356879A

CN102356879A - 一种功能肽强化的保健食品

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Publication number: CN102356879A
Application number: CN2011103224405A
Authority: CN
Inventors: 周世宁; 邱志琦
Original assignee: SHENZHEN LISI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shanghai, Li Weikang Biotechnology Co. Ltd.
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: CN102356879B

Abstract

本发明涉及一种功能肽强化的保健食品，各成分的重量配比为：谷胱甘肽制备物2~5份，海参或海鱼蛋白肽制备物2~5份，右旋硫辛酸0.04~0.1份，叶酸1~3×10^-5份，原花青素0.2~0.5份，食品级L-瓜氨酸2~5份；赋形剂或填充剂4~8份。本发明提供了一种谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母，可降低谷胱甘肽生产成本，使它成为更普遍应用的营养品，并以谷胱甘肽为重要原料，配合有重要生理功能的小分子量肽、瓜氨酸以及其他具有协同作用的生理活性物质，提供了具有强化抗氧化、抗衰老和保护心血管功能的保健食品。

Description

一种功能肽强化的保健食品

技术领域

本发明属于保健食品领域，尤其是涉及以谷胱甘肽( Glutathione, GSH）为重要原料制备的功能肽强化的保健食品。

背景技术

谷胱甘肽（L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）是由谷氨酸（L-Glutamic acid）、半胱氨酸（L-cysteine）和甘氨酸（Glycine）通过肽键缩合而成的三肽化合物。广泛存在于动物、植物和微生物细胞内，其中以酵母、动物肝脏等含量较为丰富。谷胱甘肽在生物体中具有多种重要的生理功能，是细胞内重要的抗氧化剂，维持细胞还原状态，是参与细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一，其中抗氧化功能和协助氨基酸跨膜转运功能尤其引人注意。

生命活动中需要很多正常的氧化反应，此过程不可避免的产生自由基；此外，细胞在代谢外源物质，如毒素、药物、或应对极端环境因素（如紫外线等等）时，细胞也会产生自由基。这些自由基对生物细胞产生极大的危害，如攻击生物大分子脂类、蛋白质、DNA等，导致细胞膜损伤、生物酶失活及DNA破坏和突变，甚至引起恶性肿瘤等重要病变。正常的机体或细胞具有消除自由基、防止和修复损伤的能力，即保持细胞内的氧化还原平衡的能力，保证生命活动的正常。谷胱甘肽是具有这种能力的重要生物小分子肽。

谷胱甘肽的半胱氨酸含有巯基（-SH），该基团在氧化还原反应中为活性基团，可作为电子供体，向机体内产生的各种自由基、过氧化物、过氧化氢等提供电子而将其灭活，从而维护细胞内氧化还原动态平衡状态（Valko M, Izakovic M., Mazur M., Rhodes C., Telser J., Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. Molecular & Cellular Biochemistry, 2004; 266:37-56）；谷胱甘肽通过胞内代谢循环参与氨基酸跨膜转运，在ATP的协助下，将结合的氨基酸转运至细胞的内部，完成吸收过程（郑云郎. 谷胱甘肽的生物学功能. 生物学通报. 1995. 30 (5): 22-24）。这一反应是氨基酸吸收利用的重要步骤。谷胱甘肽还参与蛋白质和DNA合成，此过程中需要谷胱甘肽向谷氧还原蛋白提供原动力。有文献报道谷胱甘肽还具有抑制细胞凋亡的功能（Filomeni G, Rotilio G, Ciriolo M R. Cell signalling and the glutathione redox system. Biochemical Pharmacology. 2002, 64, 1057-1064），谷胱甘肽的不足将导致细胞的程序死亡（Marengo, B., De Ciucis, C.,Verzola, D., Pistoia, V., Raffaghello, L., Patriarca, S., Balbis, E., Traverso, N., Cottalasso, D., Pronzato, M.A., Marinari, U.M., Optimization of production. Acta Microbiol Pol 2008，46:105-114）。

谷胱甘肽已在医药、食品方面应用。由于谷胱甘肽生产成本高，产品昂贵，因而目前主要是在医药方面的应用。谷胱甘肽常常于解毒、辐射病防治、保护肝脏，以及抗过敏，养颜、美容、护肤、增加视力及眼科病的治疗；谷胱甘肽对进入体内的有毒化合物和重金属起中和、排解作用，临床用于丙烯腈、氟化物、一氧化碳、重金属、酒精等中毒的治疗；也可作为抗癌、抗肿瘤及治疗艾滋病的辅助药物，它对抗癌治疗引起的白细胞减少等症状具有很强的保护作用。谷胱甘肽还用于治疗糖尿病神经损伤。高血糖影响谷胱甘肽代谢，降低了H₂O₂ 的消除能力因而导致神经受损。用谷胱甘肽治疗糖尿病神经病变患者总有效率93 %（姚民秀，徐倩，李盈等. 谷胱甘肽治疗糖尿病神经病变. 中国新药与临床杂志. 2000. 19 : 66 - 67）。

在食品方面，谷胱甘肽可用于面制品、乳品及婴儿食品、肉类、禽类、鱼类及海鲜类及面包等食品的加工，但重要的是作为保健品的应用。已经证明谷胱甘肽在很多酶促反应及消除自由基方面均起重要作用，若体内谷胱甘肽不足，一些酶促反应将不能有效进行，代谢过程产生的自由基不能及时被清除，自由基积累即促进机体衰老，并诱发肿瘤、心脑血管动脉硬化等病变，因此谷胱甘肽具有抗病防衰老功能（孙洪刚，吕义珍. 谷胱甘肽的代谢和应用. 卫生职业教育. 2004, 22(10):126-127）。

总的来说，虽然谷胱甘肽的生理重要性已经早就被认识，但用于食品尚未普遍，日本、美国等发达国家在上世纪就开始将谷胱甘肽应用于保健食品。在国内，目前直接添加谷胱甘肽的保健品极少。其重要原因是谷胱甘肽不容易生产，其价格甚高。

谷胱甘肽制备方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、发酵法和酶转化法四种。萃取法主要是以富含谷胱甘肽的动、植物组织和酵母等为原料；化学合成方法的缺点是繁琐复杂、反应步骤较多、时间长、成本高、污染环境、可能产生消旋而影响生物活性及产率较低等情况，限制了谷胱甘肽的化学合成工艺的应用。酶转化法需要两个酶催化（GCS及GS），三种氨基酸作原料，并需要ATP等，这些因素直接导致其工艺成本较高。综合考虑各方面因素，发酵法是目前生产GSH 最具潜力的方法。

发酵法是利用谷胱甘肽含量较高的菌株进行大规模发酵获得细胞，从中提取谷胱甘肽。然而，目前发酵所用的酵母菌其合成谷胱甘肽的机制均为两步催化机制，第一步L谷氨酸与L半胱氨酸经过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase, γ-GCS) 的催化生成L谷氨酰半胱氨酸；第二步反应由谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase, GS) 催化L-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。上述第一步反应的酶（γ-GCS）受终产物谷胱甘肽反馈抑制调控，因此，此步属于限速反应。目前生产菌株很难摆脱这种反馈调控的制约，谷胱甘肽含量提升受到限制。

近来Verena Liedschulte等（Verena Liedschulte1, Andreas Wachter1,3†, An Zhigang2 and Thomas Rausch1*　 Exploiting plants for glutathione (GSH) production:Uncoupling GSH synthesis from cellular controls results in unprecedented GSH accumulation. Plant Biotechnology Journal, 2010, 8: 1–14）从细菌Streptococcus thermophilus strain ATCC 19258（DSMZ，德国微生物与细胞培养物保藏中心，德国不伦瑞克）的基因组克隆到一个具有双功能的谷胱甘肽合成酶基因，称为GCL-GS，其序列在国际Genbank数据库编号为GQ848551；该基因产物具有上述GCS酶和GS酶两种催化功能，而且该基因对谷胱甘肽的反馈抑制不敏感。因此，该基因已被该文作者引进烟草植物中获得了谷胱甘肽高产。但未见该基因的其他应用报道。

海参属棘皮动物，是一种古老的海洋软体生物。海参的营养价值极高，其主要成分为胶原蛋白、粘多糖和海参皂甙，胶原蛋白约占海参体壁蛋白含量的74. 15%（李翠翠, 董秀萍, 高杨等. 海参体壁酶促溶性胶原的提取工艺，大连工业大学学报, 2008, 27( 4) : 1~ 4）。海参还有硫酸软骨素、多种维生素、及各种氨基酸等50多种活性成分，是不可多得的不含胆固醇和极低嘌呤的高级滋补品。研究表明, 胶原蛋白水解得到小分子量的胶原肽具有抗氧化、降血压、抑制血小板聚集活性、抗肿瘤及免疫调节等生理活性, 同时还具有补钙、减肥、美容护肤及延缓衰老等功能特性。（张新如. 胶原蛋白食品倍受青睐. 中国保健营养, 2003( 7) : 32；谢渝湘, 丁琳. 胶原蛋白与衰老的相关性 . 中国老年学杂志,2002, 6( 22) : 518~ 520）海参中成分还具有扩张血管，增加血液流量；增强纤维蛋白的溶解，改善微循环的功能。海参经过用蛋白酶水解获得的海参肽制备物，既完整保留了海刺参特有的营养成份，又将大分子蛋白质转变为更易吸收、功能更强的小分子肽，比传统海参制品更容易吸收利用。近年证明小分子短肽在人体肠道内的吸收速度和吸收率比氨基酸还要快，而且很多短肽具有生理活性。

另一方面，海参是天然L-精氨酸含量最丰富的动物之一，诺贝尔奖获得者L.J.Ignarro指出精氨酸和瓜氨酸在体内能增加一氧化氮的产生，因此促进血液循环、增强内皮细胞活力（Louis J. Ignarro "No More Heart Disease",Published 2005 by Broadway books, New York）。

大豆蛋白肽是大豆蛋白经酶降解制得，产物富含生理活性小分子肽和各种氨基酸，富含精氨酸和瓜氨酸，具有抗高血压、抑制胆固醇、促进脂质代谢、提高免疫力、促进有益菌群生长等功能以及低抗原性特点。

发明内容

本发明的目的是提供了一种新型保健食品，它富含有重要生理功能的小分子量肽、瓜氨酸、精氨酸以及具有协同作用的生理活性物质，它们的组合将强化抗氧化、抗衰老和心血管保护功能。

本发明所述的一种功能肽强化的保健食品，各成分的重量配比为：谷胱甘肽制备物2~5份，海参或海鱼蛋白肽制备物2~5份，右旋硫辛酸0.04~0.1份，叶酸1~3×10^-5份，原花青素0.2~0.5份，食品级L-瓜氨酸2~5份；赋形剂或填充剂4~8份。

本发明所述保健食品的制备方法如下：将谷胱甘肽、海参或海鱼蛋白肽制备物、右旋硫辛酸、叶酸、原花青素、L-瓜氨酸与赋形剂或填充剂按上述重量比例混匀，以常规药物加工工艺压成片剂或制成粉状冲剂，干燥，包装得成品。

可替代地，本发明所述的一种功能肽强化的保健食品，各成分的重量配比为：谷胱甘肽制备物2~5份，大豆蛋白肽制备物2~5份，右旋硫辛酸0.04~0.1份，叶酸1~3×10^-5份，原花青素0.2~0.5份，食品级L-瓜氨酸2~5份；赋形剂或填充剂4~8份。

本发明所述保健食品的制备方法如下：将上述谷胱甘肽制备物、大豆蛋白肽制备物、右旋硫辛酸、叶酸、原花青素、L-瓜氨酸与赋形剂或填充剂按上述重量比例混匀，以常规药物加工工艺压成片剂或制成粉状冲剂，干燥，包装得成品。

根据本发明所述的保健食品的进一步特征，所述的谷胱甘肽制备物是从谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母的细胞中提取获得的，该提取物的制备方法如下：将所述酿酒酵母接种于YPD培养基或含蛋白胨和氨基酸的培养基，于30℃振荡或搅拌培养48～70小时，收集酵母细胞，用乙醇或同类有机溶剂抽提，离心取上清，去溶剂，得到谷胱甘肽制备物。

根据本发明所述的保健食品的进一步特征，所述的谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母是保藏号为CGMCC No.5153的谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母BY-GSW（Saccharomyces cerevisiae BY-GSW）。

根据本发明所述的保健食品的进一步特征，所述的谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母BY-GSW中含有序列如SEQ ID NO.1所示的负责谷胱甘肽合成的双功能基因GSW，该基因编码一个同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶功能和γ-谷胱甘肽合成酶功能的双功能合成酶。

根据本发明所述的保健食品的进一步特征，所述的海参或海鱼蛋白肽制备物是通过以下方法制备的：将干净的鲜海参或鲜海鱼组织经匀浆后，98^oC保温10分钟，冷却至65^oC，调pH约7.0，加入木瓜蛋白酶，保温搅拌约3小时，然后冷却至50^oC，调整pH至8.5，加入氨基肽酶保温3小时，酶解反应液加热至沸，保持10分钟，喷雾干燥，得到海参或海鱼蛋白肽制备物。

根据本发明所述的保健食品的进一步特征，所述的酶解大豆蛋白肽制备物是通过以下制备方法制备的：大豆蛋白粉悬浮或溶解于无菌水中（约1:10），加热至95 ^oC保持10 分钟，冷却至65^oC，调pH约7.0，加入木瓜蛋白酶，保温搅拌约3小时，然后冷却至50^oC，调整pH至8.5，加入氨基肽酶保温3小时，酶解反应液加热至沸，保持10分钟，喷雾干燥，得到酶解大豆蛋白肽制备物。

本发明的一个优势是提供了一种谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母，向酿酒酵母细胞导入了一个具有双功能的谷胱甘肽合成酶基因序列GSW，该序列与已知的GCL-GS基因高度相似，所得工程酵母的谷胱甘肽含量大大提高，这样可降低谷胱甘肽生产成本，使它成为更普遍应用的营养品。

从原理上，谷胱甘肽除本身作为重要抗氧化功能参与多种代谢反应外，还具有协助氨基酸吸收利用功能，而海洋动物肽制备物和大豆蛋白肽中富含精氨酸等重要氨基酸、活性肽及其他生理活性物质；谷胱甘肽是极重要的抗氧化剂而且与叶酸、硫辛酸等具有协同增效作用，而此种增效的抗氧化作用大大增强自由基的消除能力，促进了一氧化氮的生成。一氧化氮作为机体内重要的信号分子与心血管疾病、阳痿、记忆衰退、肿瘤形成等都有密不可分的关系。因此，本发明以谷胱甘肽为重要原料，配合有重要生理功能的小分子量肽、瓜氨酸以及其他具有协同作用的生理活性物质，如原花青素（一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂）等，从而提供了具有强化抗氧化、抗衰老和保护心血管功能的保健食品。

附图说明

图1显示用于同源重组的整合片段构建，其中，Trp=同源重组序列，loxp-KanMX4=筛选标记及敲除系统，ADH=启动子，gene X= GSW基因，term= 终止序列。

图2是GSW表达产物的SDS-PAGE图谱，其中，M泳道为预染蛋白质Marker III，1泳道为GSW产物(~ 86 kDa)。

图3显示酵母转化子BY-GSW与出发菌株BY谷胱甘肽含量变化，其中，□：出发菌株BY； ■：转化子BY-GSW。

图4 显示H₂O₂对转化子BY-GSW和出发菌株BY生长的影响，其中，△出发菌株BY（无H₂O₂）；▲: 转化子BY-GSW（无H₂O₂）；◇：出发菌株BY（H₂O₂胁迫）；◆转化子BY-GSW（H₂O₂胁迫）。

图5显示高温对转化子BY-GSW和出发菌株BY生长的影响，其中，○：出发菌株BY，30℃；●：转化子BY-GSW，30℃；△：出发菌株BY，35℃；▲：转化子BY-GSW，35℃；◇：出发菌株BY，40℃；◆：转化子BY-GSW，40℃；□：出发菌株BY，45℃；■：转化子BY-GSW，45℃。

图6 显示Cu²⁺ 对转化子BY-GSW和出发菌株BY生长的影响，其中，○：出发菌株BY4741，0mM Cu²⁺；●：转化子BY-G，0mM Cu²⁺；△：出发菌株BY4741，0.1mM Cu²⁺；▲：转化子BY-G，0.1mM Cu²⁺；◇：出发菌株BY4741， 0.5mM Cu²⁺；◆：转化子BY-G，0.5mM Cu²⁺；□：出发菌株BY4741，1mM Cu²⁺；■：转化子BY-G，1mM Cu²⁺。

图7 显示Cd²⁺对转化子BY-GSW和出发菌株BY生长的影响，其中，○：出发菌株BY4741，0mM Cd²⁺；●：转化子BY-G，0mM Cd²⁺；△：出发菌株BY4741，0.1mM Cd²⁺；▲：转化子BY-G，0.1mM Cd²⁺；◇：出发菌株BY4741，0.5mM Cd²⁺；◆：转化子BY-G，0.5mM Cd²⁺；□：出发菌株BY4741，1mM Cd²⁺；■：转化子BY-G，1mM Cd²⁺。

具体实施方式

实施例一：谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母BY-GSW（Saccharomyces cerevisiae BY-GSW）的构建

1、双功能谷胱甘肽合成酶基因GSW的克隆与酵母菌株BY-GSW构建

1.1 构建同源重组片段：根据Genbank数据库序列GQ848551合成并克隆获得GSW序列（见序列表SEQ ID NO.1），从Invitrogen公司的Yeast Deletion Clones系列产品中获得DNA作为模版，通过PCR技术分别获得以下片段：启动子ADH1、终止序列term、标记基因KanMX4以及同源重组序列Trp1，把来源于P1噬菌体的loxP序列连接于KanMX4片段的两端，应用预设内切酶位点和连接酶，按图1设计构建重组片段，将该片段插入载体pBlueScriptIISK中得到重组质粒pBlueScript-KanMX-GSW，采用醋酸锂转化法转化酿酒酵母BY，用G418（200ug/ml）筛选获得阳性克隆子。根据序列GQ848551两端设计引物，以阳性克隆子基因组DNA为模板进行PCR扩增，所得产物经测序，结果序列为SEQ ID NO.1。

1.2 转化子筛选标记基因KanMX4的敲除：CRE酶能够切除两端有loxP序列的片段，将带有CRE酶基因的无害载体p416-MET转化上述1.1所得GSW阳性克隆子中，所得菌落如果对G418(200ug/ml)检验敏感以及在PCR检测中GSW基因条带为阳性而KanMX4基因为阴性即为目的克隆子，本实验获得多个目的克隆子，其中一个命名为Saccharomyces cerevisiae BY－GSW。

2、双功能谷胱甘肽合成酶在酵母中的表达

取Saccharomyces cerevisiae BY－GSW接种于YPD培养基，30培养60小时，离心收集菌体，缓冲液悬浮细胞，100℃煮沸裂解，裂解物经SDS-PAGE电泳分离蛋白，Western blot技术检测，证明GSW蛋白已成功表达。（结果见图2）。

3、高谷胱甘肽水平转化子BY-GSW的生理功能试验

3.1 高谷胱甘肽水平转化子BY-GSW对H₂O₂氧化胁迫的抗性：

挑取酵母转化子BY-GSW及出发菌株BY单菌落于3mlYPD中30℃摇床（230rpm）培养过夜，接种至25ml YPD培养基（250ml三角瓶）中，调节OD600为0.5，加入H₂O₂至终浓度3mM，30℃摇床（230rpm）培养，于12、24、36、48、60、72、84、96hr取样测OD600，以不加H₂O₂的作为空白对照。结果显示在过氧化氢氧化压力胁迫下，高谷胱甘肽水平细胞生长比低谷胱甘肽水平细胞快得多，其达到最大生长量的时间和最大生长量几乎没有受到强氧化剂的大影响（图4）。

3.2高谷胱甘肽水平转化子BY-GSW对温度的耐受力：

挑取酵母转化子BY-GSW及出发菌株BY单菌落于3mlYPD中30℃摇床（230rpm）培养过夜，接种至25ml YPD培养基（250ml三角瓶）中，调节OD600为0.5，分别置于30℃、35℃、40℃和45℃培养，于12、24、36、48、60、72、84、96小时取样测OD600。结果：培养温度超过35℃，原菌株的生长受抑制程度明显比高谷胱甘肽的转化子严重，表明后者耐受高温的能力得到了提高（图5）。

3.3 高谷胱甘肽水平转化子BY-GSW对重金属离子的抗性：

挑取酵母转化子BY-GSW及出发菌株BY单菌落于3mlYPD中30℃摇床（230rpm）培养过夜，接种至25ml YPD培养基（250ml三角瓶）中，调节OD600为0.5，分别加入0、0.1、0.5、1mM的Cu²⁺（CuSO₄•5H₂O）、Cd²⁺（CdCl₂）置于30℃摇床培养，于12、24、36、48、60、72、84、96小时取样测OD600。结果表明，高谷胱甘肽水平的转化子耐受高浓度Cu²⁺（CuSO₄•5H₂O）或Cd²⁺（CdCl₂）的能力明显高于出发菌株（图6、图7）

通过上述实验表明，本发明获得了一株谷胱甘肽合成酶高表达的、抗胁迫能力强的酿酒酵母BY-GSW（Saccharomyces cerevisiae BY-GSW），其谷胱甘肽含量在非优化条件下接近20mg/克细胞，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.5153。

实施例二：谷胱甘肽制备物的制备例一

将转化子酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY－GSW 接种于YPD培养基，于30℃摇瓶过夜进入对数期，作为种子以2％接种量接入，100ml YPD培养基（500ml大三角瓶）中，30℃摇床（230rpm）培养，于12、24、36、48、60、72小时各取30ml菌液，6000rpm离心5分钟收集菌体，无菌水洗涤2次，于60℃烘箱中干燥至恒重。以0.05g干细胞1ml无菌水的比例重悬细胞，先放-20℃12小时，然后沸水浴5分钟，冷却后12000rpm离心1分钟，取上清按DTNB法检测谷胱甘肽含量。以同样条件培养出发菌株和检测其谷胱甘肽。结果表明，培养60小时，菌株BY-GSW谷胱甘肽含量为16.7mg/g(细胞干重)，比出发菌株高4倍以上（图3）。

实施例三：谷胱甘肽制备物的制备例二

以转化子酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY－GSW的过夜菌种，接种于50升罐内已灭菌的蛋白胨、酵母粉和葡萄糖等组成的30升培养基中，30 ℃搅拌培养55小时，离心分离得细胞，细胞被悬于42%乙醇（细胞干重:乙醇＝1: 8），于25℃抽提1.5小时，离心取上清，减压去除溶剂，得到谷胱甘肽制备物35g。

实施例四：海参蛋白肽制备物的制备例

称取去内脏干净的鲜海参1000g，切成小块，加入缓冲液1升，机械匀浆，98℃,保温10分钟，冷却至65℃，调pH约7.0，加入木瓜蛋白酶2 x 10⁶ U保温搅拌约3小时，然后冷却至50℃,调整pH至8.5，加入氨基肽酶1.0 x 10⁸ U,保温3小时，酶解反应液加热至沸， 10分钟，喷雾干燥，得到海参蛋白肽制备物约198g。该海参蛋白肽制备物富含海参胶原蛋白肽及氨基酸，肽得率约31%, 60%的肽分子分布于1000 ~5000 Da。

本发明所采用的海参蛋白肽制备物也可用海鱼蛋白肽制备物来替代，采用鲜海鱼或其组织来提取，提取方法参照本实施例的制备方法。

实施例五：大豆蛋白肽制备物的制备例

称取大豆蛋白粉1000g，溶解于10公斤无菌水中，加热至98 ℃保持20 分钟，冷却至65 ℃，调pH约7.0，加入木瓜蛋白酶2 x 10⁶U，保温搅拌约3小时，然后冷却至50℃，调整pH至8.5，加入广谱氨基肽酶1 x 10⁸ U，保温3小时，酶解反应液加热至沸，保持10 分钟，喷雾干燥，得到酶解大豆蛋白制备物富约940g。该酶解大豆蛋白制备物富含小分子肽及氨基酸，肽含量> 70%,肽平均分子量< 3000。

实施例六：本发明所述的保健食品的配制

配方1：谷胱甘肽制备物2 g，海参或海鱼蛋白肽制备物2 g，右旋硫辛酸0.04 g，叶酸1×10^-5 g，原花青素0.2 g， L-瓜氨酸2 g，糊精（作为赋形剂）4 g。

配方2：谷胱甘肽制备物3.5 g，海参或海鱼蛋白肽制备物3.5 g，右旋硫辛酸0.07 g，叶酸2×10^-5 g，原花青素0.35 g，L-瓜氨酸3.5g，糊精（作为赋形剂）6 g。

配方3：谷胱甘肽制备物5 g，海参或海鱼蛋白肽制备物5 g，右旋硫辛酸0.1 g，叶酸3×10^-5 g，原花青素0.5g，L-瓜氨酸5g，糊精（作为赋形剂）8 g。

将上述配方称取原料，以常规药物加工工艺压成片剂，并以羟丙甲纤维素（占3%）作包衣剂，得口服片，每片约0.4g。也可以常规药物加工工艺制成粉状冲剂，干燥，包装得成品。所用原料均为食品级或医药级。

成品如溶于水中，溶液显淡棕褐色，略带淡苦甘味和极淡的鱼腥味。片剂直接吞服，每天服用量6~8片。

本保健食品试制成功后，多批试验人员服用，普遍效果是可以使血压、胆固醇、血小板聚集力等血液指标保持或趋向正常、体质增强、肤色改善。

实施例七：本发明所述的保健食品的配制

配方1：谷胱甘肽制备物2 g，大豆蛋白肽制备物2 g，右旋硫辛酸0.04 g，叶酸1×10^-5 g，原花青素0.2 g，L-瓜氨酸2 g，糊精（作为赋形剂）4 g。

配方2：谷胱甘肽制备物3.5 g，大豆蛋白肽制备物3.5 g，右旋硫辛酸0.07 g，叶酸2×10^-5 g，原花青素0.35 g， L-瓜氨酸3.5g，糊精（作为赋形剂）6 g。

配方3：谷胱甘肽制备物5 g，大豆蛋白肽制备物5 g，右旋硫辛酸0.1 g，叶酸3×10^-5 g，原花青素0.5g，L-瓜氨酸5g，糊精（作为赋形剂）8 g。

成品如溶于水中，溶液显淡棕褐色，略带淡苦甘味。片剂直接吞服，每天服用量6~8片。

序列表

<110> 深圳市俪斯生物科技有限公司；周世宁

<120> 一种功能肽强化的保健食品

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgacattaa accaactgct tcaaaaactg gaagctacca gccctattct ccaagctaat 60

tttggaatcg agcgcgagag tctacgtgtc gataggcaag gacaactggt gcatacacct 120

cacccatcct gtctaggagc tcgtagtttc cacccctata ttcagactga tttttgcgag 180

tttcagatgg aactcatcac accagttgcc aaatctacta ctgaggctcg ccgatttctg 240

ggagctatta ctgatgtagc tggccgctct attgctacag acgaggttct ctggccttta 300

tccatgccac ctcgtctaaa ggcagaggag attcaagttg ctcaactgga aaatgacttc 360

gaacgccatt atcgtaacta tttggctgaa aaatacggaa ctaaactaca agctatctca 420

ggtatccact ataatatgga actgggtaaa gatttagttg aggccttgtt ccaagaaagt 480

gatcagaccg atatgattgc cttcaaaaac gccctctatc ttaagctggc tcagaactac 540

ttgcgctacc gttgggtgat tacctatctc tttggggcct cacccatcgc cgaacaaggt 600

ttctttgacc aggaagttcc agaacctgtg cgttccttcc gtaacagtga ccacggctat 660

gtcaataagg aagagattca agtatccttt gtaagtctag aagattatgt ctcagccatt 720

gaaacctata tcgaacaagg agatttgaat gcagagaaag aattttactc agctgttcgt 780

ttccgtggac aaaaggttaa tcgttccttc cttgacaaag gaatcaccta cctagagttc 840

cgtaatttcg accttaaccc ttttgagcgt atcggtatta gtcagactac tatggacact 900

gtgcacttac tcattttagc cttcctttgg cttgatagcc ctgaaaatgt cgaccaagct 960

cttgcacaag gccacgcgtt aaatgagaaa attgccctct ctcatcctct agaacctcta 1020

ccttcggagg ctaaaactca ggacattgta actgccctag accaactggt gcaacacttt 1080

ggacttggtg actatcatca agatctggtt aagcaagtta aggcagcctt tgcggatcca 1140

aatcaaacgc tctctgccca gctcttaccc tatatcaaag acaaatctct agccgaattt 1200

gctttaaaca aggctcttgc ctatcatgat tacgactgga ctgcccacta tgctctcaag 1260

ggctatgaag agatggaact ctccacccag atgttgctct ttgatgccat ccaaaagggg 1320

attcactttg aaatattgga tgagcaagat caattcctaa aactttggca ccaagaccat 1380

gttgaatacg tcaaaaacgg taacatgacc tcaaaagaca actacgtggt tccccttgct 1440

atggctaata agaccgtaac caagaagatt ctagcagatg ctggctttcc agttccttca 1500

ggagacgaat ttaccagtct tgaggaagga cttgcctact accctcttat caaggataag 1560

caaattgttg tcaaacccaa gtcaactaac tttggtctgg gaatttccat tttccaagaa 1620

cctgccagtc ttgacaacta tcaaaaagcc cttgaaattg ctttcgcaga agatacctct 1680

gtccttgttg aagaatttat tccaggaacc gaataccgtt tcttcatctt ggatgggcgt 1740

tgtgaggctg ttcttctgcg tgtcgctgcc aatgttattg gtgatggcaa acacaccatt 1800

cgtgaactag tcgctcagaa aaatgctaat ccattgcgtg gccgtgatca ccggtcacct 1860

ctggaaatca ttgagctagg agacatcgaa caactaatgt tagctcaaca gggttacaca 1920

cctgatgata ttctcccaga aggaaaaaag gtcaatctgc gtcgtaattc caacatctct 1980

acaggtggtg actctattga tatcactgag accatggatt cctcttacca agaattagcc 2040

gcagccatgg caactagcat gggcgcctgg gcttgcgggg ttgatctgat aattccagat 2100

gaaactcaaa ttgccaccaa ggaaaatcct cattgcacct gcattgagct caactttaac 2160

ccttcgatgt atatgcacac ctactgtgct gagggtcctg gccaagctat cactactaaa 2220

atcctagata aactttttcc agaaatagtg gctggtcaaa cttaa 2265

Claims

1.一种功能肽强化的保健食品，其特征在于，各成分的重量配比为：谷胱甘肽制备物2~5份，海参或海鱼蛋白肽制备物2~5份，右旋硫辛酸0.04~0.1份，叶酸1~3×10^-5份，原花青素0.2~0.5份，食品级L-瓜氨酸2~5份；赋形剂或填充剂4~8份。

2.根据权利要求1所述的保健食品，其特征在于，所述保健食品的制备方法如下：将谷胱甘肽、海参或海鱼蛋白肽制备物、右旋硫辛酸、叶酸、原花青素、L-瓜氨酸与赋形剂或填充剂按上述重量比例混匀，以常规药物加工工艺压成片剂或制成粉状冲剂，干燥，包装得成品。

3.一种功能肽强化的保健食品，其特征在于，各成分的重量配比为：谷胱甘肽制备物2~5份，大豆蛋白肽制备物2~5份，右旋硫辛酸0.04~0.1份，叶酸1~3×10^-5份，原花青素0.2~0.5份，食品级L-瓜氨酸2~5份；赋形剂或填充剂4~8份。

4.根据权利要求1所述的保健食品，其特征在于，所述保健食品的制备方法如下：将上述谷胱甘肽制备物、大豆蛋白肽制备物、右旋硫辛酸、叶酸、原花青素、L-瓜氨酸与赋形剂或填充剂按上述重量比例混匀，以常规药物加工工艺压成片剂或制成粉状冲剂，干燥，包装得成品。

5.根据权利要求1或3所述的保健食品，其特征在于：所述的谷胱甘肽制备物是从谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母的细胞中提取获得的，该提取物的制备方法如下：将所述酿酒酵母接种于YPD培养基或含蛋白胨和氨基酸的培养基，于30℃振荡或搅拌培养48～70小时，收集酵母细胞，用乙醇或同类有机溶剂抽提，离心取上清，去溶剂，得到谷胱甘肽制备物。

6.根据权利要求5所述的保健食品，其特征在于：所述的谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母是保藏号为CGMCC No.5153的谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母BY-GSW（Saccharomyces cerevisiae BY-GSW）。

7.根据权利要求6所述的保健食品，其特征在于：所述的谷胱甘肽高产菌株酿酒酵母BY-GSW中含有序列如SEQ ID NO.1所示的负责谷胱甘肽合成的双功能基因GSW，该基因编码一个同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶功能和γ-谷胱甘肽合成酶功能的双功能合成酶。

8.根据权利要求1所述的保健食品，其特征在于：所述的海参或海鱼蛋白肽制备物是通过以下方法制备的：将干净的鲜海参或鲜海鱼组织经匀浆后，98^oC保温10分钟，冷却至65^oC，调pH约7.0，加入木瓜蛋白酶，保温搅拌约3小时，然后冷却至50^oC，调整pH至8.5，加入氨基肽酶保温3小时，酶解反应液加热至沸，保持10分钟，喷雾干燥，得到海参或海鱼蛋白肽制备物。

9.根据权利要求3所述的保健食品，其特征在于：所述的酶解大豆蛋白肽制备物是通过以下制备方法制备的：大豆蛋白粉悬浮或溶解于无菌水中（约1:10），加热至95 ^oC保持10 分钟，冷却至65^oC，调pH约7.0，加入木瓜蛋白酶，保温搅拌约3小时，然后冷却至50^oC，调整pH至8.5，加入氨基肽酶保温3小时，酶解反应液加热至沸，保持10分钟，喷雾干燥，得到酶解大豆蛋白肽制备物。