CN102354046A - 一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，由多路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理两大部分构成，采用关键部件--集成式电控液晶全息透镜阵列实现多路共焦调频，通过多路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经由采集信号处理部分中的光纤及光纤耦合器组，经功率放大电路，再通过数据采集卡进行模数转换，经过对信号的傅里叶变换频谱信息，滤波，解调过程还原每个荧光点处发出的荧光信号随时间的强度变化，从而实现多点并行高分辨探测。具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高的特点，并且实现了多点并行实时探测，具有便捷和实用的应用特点。

Description

一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法

技术领域

本发明涉及一种显微成像技术，特别涉及一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法。

背景技术

共焦显微成像采用点光源照明，并用探测器之前的与光源成共轭关系的孔径来滤去焦外信号——“共焦”也就源于此。共焦成像的概念，是日本的Marvin Minsky教授于1957年首次提出，他发明并建成了世界上第一个共焦扫描显微镜，共焦成像克服了传统荧光显微镜的空间和时间分辨率低、信噪比低、扫描速度慢等局限性。此后，各种共焦显微镜相继出现，如1970年的第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜，1990年的双光子激光扫描显微镜等。后又出现使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜、三维数字共焦拉曼显微镜以及光纤耦合多路复用共焦显微镜等新型共焦显微镜。这些显微镜在继承和发展共焦显微成像技术的同时，提高了共焦显微成像的性能，如横向和纵向分辨率，扫描探测速度等。继波分复用荧光共焦成像概念被提出以后，频分复用荧光共焦显微成像的概念也被美国宾州州立大学的YIN教授小组研究并提出，但是所提出的实验基本系统是基于绿光波段激发的双通道系统，与多通道并行探测尚有距离。

对于激光共焦扫描显微成像技术，虽然可以显著提高其纵向和横向分辨率，但是由于扫描系统的存在，大大降低了探测样品成像速度。虽然研究人员提出了各种各样的方案提高探测速度，例如采用微透镜阵列（DMD）系统，转盘系统等，也包括频分复用方法等实现多路并行探测的方案，可是现在的方案都具有各自局限性。例如降低了分辨率，或者增加了系统的体积，不利于集成等，因而阻止了系统的实际应用进程。但是，在生物探测领域，还是需要新方法和新技术实现集成式，快速地，并行地多点探测。

发明内容

本发明是针对现有传统的共焦显微镜的存在的问题，提出了一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，此多路频分复用荧光共焦显微成像系统具有高的空间分辨率和时间分辨率，并且能够实现多点荧光信号的并行的实时的高速探测。

本发明的技术方案为：一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，具体包括如下步骤：

1）搭建四通道多频调制激光光路：将准直半导体激光器发出的光束耦合进扩束镜，扩束镜出射的光束到达2×2式H-PDLC透镜阵列上进行分光和四个不同频率的斩波调制输出，并调节后端透镜阵列，使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列的焦平面位置F；

2）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路：将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面耦合进入二向色镜组中，经二向色镜组激发的激光将耦合垂直入射无限远油浸显微物镜，将生物样品摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品与显微物镜间的距离，使样品恰好处于显微物镜焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品上聚焦为四个光点，激发出荧光；

3）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品表面激发的荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜，成为平行光束，达到二向色镜组，荧光全部从二向色镜透射出去，将这束荧光入射分光棱镜BS进行第二次分光，得到特性相同的两部分，其中一部分由消色差透镜会聚，并将CCD摄像机放置于透镜的焦平面上，探测荧光光束信号，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像；同时使从分光棱镜BS的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列相当于共焦小孔的作用后，通过光纤输送到光电倍增管PMT中；

4）信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管PMT的输出端接电压放大电路，将PMT采集到的微弱信号进行电压放大，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机，通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。

所述H-PDLC透镜阵列是通过驱动电路驱动全息聚合物分散液晶（H-PDLC）光栅，来实现斩波，调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号，经过调制的激发光能从生物样品的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，四个斩波通道分别设定不同的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，任意两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。

所述步骤3）中荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列相当于共焦小孔的作用后，通过光纤输送到光电倍增管PMT中，得到的信号属于共焦扫描显微信号，该共焦显微镜的横向分辨率                                                和轴向分辨率

分别表示为：

，

其中，

为所激发出的荧光的波长，

表示显微物镜的数值孔径,为所探测样品的有效折射率。

所述步骤4）中的解调具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。

本发明的有益效果在于：本发明多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高的特点，并且实现了多点并行实时探测。尤其在荧光共焦探测和生物方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，因此具有便捷和实用的应用特点。

附图说明

图1为本发明四路频分复用荧光共焦显微镜的光路示意图；

图2为本发明2×2 H-PDLC透镜阵列示意图；

图3为本发明H-PDLC透镜的基本结构示意图；

图4为本发明制作H-PDLC透镜的全息光路图；

图5为本发明四路调制荧光信号拍频图；

图6为本发明滤波后的四路荧光信号频谱图；

图7为本发明解调制后的四路荧光信号强度随时间变化图。

具体实施方式

基于频分复用技术的多路频分复用荧光共焦显微技术实现步骤如下：

A:搭建四通道多频调制激光光路：将激光器1、扩束镜2、H-PDLC透镜阵列3、显微物镜4按照如图1所示的光路搭建起来。在此过程中需注意光束应尽量从各器件的中心通过并与平台始终保持水平。首先将由30mw准直半导体激光器1发出的波长为405nm的光束耦合进扩束镜2（用何种波长激光器取决于生物样品中的荧光标签，在本实验中生物样本对蓝紫光的敏感度较高，能激发出波长范围在520nm-540nm的绿色荧光）。使扩束器2出射的光束达到2×2式H-PDLC透镜阵列3上进行分光和不同频率的斩波调制，并调节透镜阵列4，使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列4的焦平面位置F。H-PDLC透镜3的斩波器作用是通过驱动电路驱动全息聚合物分散液晶（H-PDLC）光栅，也就是利用液晶光栅在电压驱动下的开关效应来实现斩波。可以调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号。通常将连续强度的光信号调制为方波信号。本实验中，经过调制的激发光能从生物样品的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，四个斩波通道分别设定一定的载波频率值。每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，如上文所述即不得高于125KHz。同时，任意两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。

B:搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路：通过焦平面也在H-PDLC透镜阵列的焦平面F的透镜，将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面5耦合进入二向色镜组DM6中，经二向色镜组6激发的405nm的激光将耦合射入放大倍率为40倍、数值孔径为0.65的无限远油浸显微物镜7。耦合过程中需要注意将光束的传播方向与显微物镜7的中心轴方向调整得尽量一致，以确保激发光束垂直入射显微物镜7。将生物样品8摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品8与显微物镜7间的距离，使样品8恰好处于显微物镜7焦平面上。光束将在物镜的作用下在生物样品8上聚焦为四个光点，激发出荧光。此时，经H-PDLC透镜3聚焦在焦平面的405nm激光点光源和生物样本8就形成了一对共焦关系。

C:搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品8表面激发的520nm-540nm绿色荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜7，成为平行光束，达到二向色镜组DM6。荧光全部从二向色镜6透射出去。将这束荧光入射分光棱镜BS9进行第二次分光，得到强度等各性相同的两部分。其中一部分由消色差透镜10会聚，并将CCD摄像机11放置于透镜10的焦平面上，即放置于透镜焦距处，使荧光光束信号能被CCD摄像机11探测到，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像。同时使从分光棱镜BS9的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组12、13耦合进入光纤，光纤阵列14相当于共焦小孔的作用。通过光纤15输送到光电倍增管PMT16中的信号属于共焦扫描显微信号。该共焦显微镜的横向分辨率

和轴向分辨率分别表示为：

其中，

为所激发出的荧光的波长，

表示显微物镜的数值孔径, 

为所探测样品的有效折射率，样品中70%是水，可以设定值为1.3。假定激发出的荧光波长为530nm，显微物镜的数值孔径

为0.65，则横向分辨率

为0.5μm，轴向分辨率

为2μm左右。时间分辨率受数据采集卡的采样频率和所选用的斩波频率的限制。

D:基于聚合物分散液晶全息透镜阵列斩光调制的制作和特性：作为共焦斩波调制的关键部件，2×2式H-PDLC透镜阵列3，其结构如示意图2所示，能同时实现分光，聚焦，调频功能。31为电极，32为固定基板，此处采用透镜聚焦的目的就是使光源与放置样品的无限远显微物镜的焦平面满足共轭关系，实现共焦，这样就可以滤去焦外杂散信号，以提高系统整体探测能力。同时通过电源控制系统能分别给光束调制不同的斩波频率，实现频率调制功能。实验室中采用聚合物分散液晶的透镜制作。其基本结构如图3所示，由两片带有氧化锡铟34的导电玻璃33相互垂直制作液晶盒，将液晶，预聚物，光引发剂，协同引导剂，交联剂等混合材料注入液晶盒中。然后再放置在全息制作光路中曝光，其制作光路如图4所示。采用双路相干激光，其中一束采用透镜聚焦扩束后满足相干条件，将透镜全息信息记录进入H-PDLC材料。

H-PDLC透镜的焦距是由信息记录波长和再现波长两个共同确定的，焦距的理论计算公式为：

其中

是波长变化因子，

为记录波长，

为再现波长，

是乳胶或液晶盒厚度的变化因子，取

=1，

和

分别是物光束和参考光束出射点到曝光面的距离， 也就是图4中的物镜Lens的焦点到曝光面的距离

，而由于参考光束没有聚焦，则可以看成是从无限远处到曝光面的距离，所以取无穷大。则焦距的计算公式简化为:

  也就是 

实验时采用488nm的激光为写入光，在多路共焦系统中，读出激光波长为405nm。405nm读出激光下，H-PDLC焦距在60mm左右。

E:信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT16将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出。将光电倍增管PMT16的输出端接电压放大电路17。放大电路如图5所示。电压放大电路由LH05-10A05交流/直流转换器和OP07低偏移电压动态放大器组成，其作用在于将PMT采集到的微弱信号进行电压放大。随后，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机18。通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离。按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。

经PMT接收的荧光信号，经功率放大器将信号放大，再经过模数转换器将信号类型转换后经数据卡，最后输送到电脑，通过采集卡的电脑控制端完成数据采集。数据采集到后，通过Matlab编程对信号进行选频、滤波和还原等操作，最后得到荧光强度随时间变化曲线。

频分复用多路荧光共焦显微成像系统由多路频分复用荧光共焦显微镜和采集信号处理系统构成。

多路频分复用荧光共焦显微镜是结合了频分复用技术的共焦显微镜。其特点是不仅具有较高的横向分辨率、纵向分辨率以及信噪比，还有较高的时间分辨率，能对处于物体不同位置进行多点同步并行处理成像。

作为本专利申请的实施范例，构建了简单的2X2阵列的四路频分复用荧光共焦显微成像系统。系统的主要构成包括：激发光源采用的是出射405nm蓝紫色光束的30mw准直半导体激光器（上海梦激光科技有限公司产品），聚合物分散液晶透镜阵列2X2的斩光调频器件，该H-PDLC的透镜阵列采用全息聚合物分散液晶透镜，无限远显微物镜（放大倍率为40X，数值孔径为0.65）、能分离405nm蓝紫光和520-540nm绿光的紫波段二向色镜组（上海长方光学仪器有限公司提供）、CR186型高速光电倍增管（简称PMT，响应时间4μs，光谱响应范围是300nm～650nm，峰值波长为420nm，阳极增益为1.88×106，北京滨松光子提供）和高分辨率彩色CCD摄像机（最高分辨率1280×1024像素，大恒图像提供的DH-M1300UC）。

此外，还包括光纤和光纤耦合器组、光电倍增管（PMT）和电压放大电路以及数据采集卡等，分别完成荧光信号共焦、信号采集、信号放大和模数、数模转换等功能。

所构建的2X2 通道共焦显微成像系统结构如附图1所示，激光光束首先通过扩束镜后经H-PDLC透镜阵列被分成四个部分，调节透镜的衍射角使得各光束的一级布拉格衍射光聚焦到同一个焦平面上，同时用驱动电压通过H-PDLC透镜阵列对每束光进行不同频率的调制，然后经过共焦透镜系统变成平行光束，平行光束通过二向色镜组DM（经过二向色镜组DM,405nm的蓝紫波段的激发光和绿色的荧光信号都具有单方向的传输特性）。405nm的四束激发光分别聚焦到生物样品的四个不同位置，并产生了波长为520nm-540nm的荧光；这四束荧光随后通过显微物镜聚光，通过二向色镜组滤去除绿荧光外的杂光，再进入分光棱镜BS,分为强度均等相同的两部分。其中一部分通过消色差成像物镜，成像于CCD摄像机。而另一部分荧光经聚焦透镜聚焦后，经棱镜将每通道的荧光信号分开，再通过光纤耦合器组耦合到光纤后输入光电倍增管PMT。

对于荧光共焦显微镜光路中的H-PDLC透镜阵列的斩波器的实现，要通过全息实现H-PDLC透镜电控调频阵列，其四路的调制信号频率必需满足一定的要求。首先，为满足奈奎斯特抽样定理，数据采集卡的采样频率必需大于等于调制频率的两倍，实验系统中数据采集卡采样频率为250KHz，即应小于等于125KHz。其次，为防止各路光信号的频率出现重叠的现象致使各路信号相互串扰，两个相邻信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高荧光信号变化频率的两倍。

在信号收集处理部分，实验系统中，电压放大电路由LH05-10A05交流/直流转换器和OP07低偏移电压动态放大器组成，其作用在于将PMT采集到的微弱数据进行电压放大。随后，采用USB2816型数据采集卡（采样频率为250KHz，北京阿尔泰公司提供）将放大电路的输出信号由USB接口送入计算机。再通过Matlab软件，将调制荧光信号进行滤波和解调后获取原始荧光信号，得到每个荧光点荧光强度随时间变化信息。

为了证实实验系统，首先对采用四种调制频率的系统进行了模拟调制解调。四路调制信号的频率分别为500Hz，2000Hz，2413Hz和2778Hz。图5是被调制的四路拍频荧光信号图。图6是滤波后的信号频谱图；图7是经过解调后的四路荧光信号随时间变化图。在过程中，加入了少量随机干扰信号。

Claims (4)

1.一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）搭建四通道多频调制激光光路：将准直半导体激光器（1）发出的光束耦合进扩束镜（2），扩束镜（2）出射的光束到达2×2式H-PDLC透镜阵列（3）上进行分光和四个不同频率的斩波调制输出，并调节后端透镜阵列（4），使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列（4）的焦平面位置F；

2）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路：将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面（5）耦合进入二向色镜组（6）中，经二向色镜组（6）激发的激光将耦合垂直入射无限远油浸显微物镜（7），将生物样品（8）摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品（8）与显微物镜（7）间的距离，使样品（8）恰好处于显微物镜（7）焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品（8）上聚焦为四个光点，激发出荧光；

3）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品（8）表面激发的荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜（7），成为平行光束，达到二向色镜组（6），荧光全部从二向色镜（6）透射出去，将这束荧光入射分光棱镜BS（9）进行第二次分光，得到特性相同的两部分，其中一部分由消色差透镜（10）会聚，并将CCD摄像机（11）放置于透镜（10）的焦平面上，探测荧光光束信号，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像；同时使从分光棱镜BS（9）的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列（14）相当于共焦小孔的作用后，通过光纤（15）输送到光电倍增管PMT（16）中；

4）信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT（16）将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管PMT（16）的输出端接电压放大电路（17），将PMT（16）采集到的微弱信号进行电压放大，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机（18），通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。

2.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述H-PDLC透镜阵列（3）是通过驱动电路驱动全息聚合物分散液晶（H-PDLC）光栅，来实现斩波，调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号，经过调制的激发光能从生物样品的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，四个斩波通道分别设定不同的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，任意两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。

3.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述步骤3）中荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列（14）相当于共焦小孔的作用后，通过光纤（15）输送到光电倍增管PMT（16）中，得到的信号属于共焦扫描显微信号，该共焦显微镜的横向分辨率                                                

和轴向分辨率分别表示为：

   

，

其中，

为所激发出的荧光的波长，

表示显微物镜的数值孔径,

为所探测样品的有效折射率。

4.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述步骤4）中的解调具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。

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