CN102346132B - 基于外场调制的表面等离子体共振检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于外场调制的表面等离子体共振检测系统及方法，其中，所述检测方法包括：1)在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的样品溶液，在一定检测角度下完成外场扫描，确定两个调制外场；2)分别在两个调制外场的作用下完成对两种折射率或浓度已知溶液的强度检测，计算两个调制外场下的强度检测结果之差从而标定系统灵敏度；3)在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入待测样品溶液，分别在步骤1)所确定的两个调制外场下的作用下完成强度检测，再根据步骤2)所标定的系统灵敏度得到待测样品溶液的折射率或浓度。本发明能够提高灵敏度，抑制信号漂移，同时具有检测位置灵活的优点，并且可实现高通量检测。

Description

基于外场调制的表面等离子体共振检测方法

技术领域

本发明涉及传感器及传感技术领域，具体地说，本发明涉及一种基于外场调制的表面等离子体共振检测系统及检测方法。 

背景技术

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称为SPR)生化传感器是基于表面等离子体共振效应，通过检测表面折射率变化对生化物质做定性、定量分析的一类传感器。SPR生化传感器具有无标记、实时检测、高灵敏度、节约样品等优点，能够做浓度、亲和性、动力学、特异性分析，被广泛应用于蛋白质组学研究、癌症研究、新药研发、信号传递、分子识别、免疫调节、免疫测定、疫苗开发、瞬时结合、配体垂钓、结合特异性、酶反应等研究领域。 

表面等离子体波(Surface Plasmon Wave，简称为SPW)是沿金属(如金、银等)和介质界面间传播的表面电磁波，其场强在界面处达到最大并沿界面垂直方向指数衰减。根据Maxwell方程及相应边界条件，SPW的色散关系可以表述为： 

$k_{\mathrm{sp}}=\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}{\left(\frac{{\mathrm{\ϵ}}_m{\mathrm{\ϵ}}_d}{{\mathrm{\ϵ}}_m+{\mathrm{\ϵ}}_d}\right)}^{1/2}=\frac{\mathrm{\ω}}{c}{\left(\frac{{\mathrm{\ϵ}}_m{\mathrm{\ϵ}}_d}{{\mathrm{\ϵ}}_m+{\mathrm{\ϵ}}_d}\right)}^{1/2}$

其中k_sp为金属表面等离子波的传播常数，λ、ω、c分别为波长、角频率和光速，ε_m和ε_d分别为金属层和金属表面介质的介电常数。SPW在介质中的穿透深度小于300nm，结合上述色散关系得出结论：SPW的属性同紧邻金属表面的介质折射率密切相关。 

SPW通过光进行激发，实现光到SPW能量的转移，这就是SPR现象。SPR现象的出现需要激发光满足一定条件：激发光为p偏振光且光波波矢同SPW的传播常数相匹配。在此条件下，光耦合入SPW的能量最多，呈现在反射光谱上为一个吸收尖峰，我们称之为共振峰。金属表面介质的变化导致SPW传播常数的改变，从而影响激发光同SPW的耦合条件，体现在反射光 谱上为共振峰位置相对于表面介质折射率的线性变化。基于此基本原理，SPR现象可以用于表面折射率的检测。 

将单色平行光束的入射角度固定在SPR共振峰两侧线性区域的某一位置，对反射光强进行检测。当金属表面介质折射率变化时，共振峰位置随折射率变化线性移动，上述固定位置的检测光强也将发生线性变化。根据光强变化同折射率变化的线性关系，实现对表面折射率的检测，这就是SPR强度检测方法。SPR强度检测方法光路结构简单，易于实现大面积、微型化检测，所以目前被广泛应用于表面等离子体共振成像(Surface Plasmon ResonanceImaging，简称为SPRI)检测中。然而，SPR强度检测方法本身灵敏度有待提高，且易受到外界噪声(如散粒噪声、强度漂移等)的影响，分辨率较低。提高SPR强度检测方法的灵敏度和分辨率，对于SPRI技术的发展有重大意义。其中，灵敏度和分辨率是表征SPR传感器性能的两项重要指标，其定义分别为：单位折射率变化所引起的检测信号变化，能产生可检测信号的最小折射率变化。灵敏度越高，分辨率越小，意味着SPR传感器的检测能力越强。 

因此，当前迫切需要一种能够提高检测灵敏度、抑制信号漂移造成的误差，同时系统结构简单，易于微型化、提高检测的通量的SPR检测系统及方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高检测灵敏度、抑制信号漂移的SPR检测系统及方法，同时本系统与方法适用于大通量检测，具有实施条件宽松的特点。 

为实现上述发明目的，本发明提供了一种基于外场调制的表面等离子体共振检测系统，包括： 

平行光输出装置； 

可调谐SPR生物芯片； 

光耦合器，用于将平行光耦合进入可调谐SPR生物芯片； 

样品池，该样品池置于所述可调谐SPR生物芯片之上； 

光探测器，用于检测可调谐SPR生物芯片反射或透射光光强； 

场发生器，用于生成作用于所述可调谐SPR生物芯片的外场；以及 

控制系统，用于在一定检测角度下完成外场扫描，确定两个调制外场，并分别在两个调制外场的作用下进行强度检测。在定量分析中，控制系统 采用两种已知样品进行系统灵敏度标定，并根据所述系统灵敏度对未知样品分析得出表面等离子体共振检测结果。 

其中，所述可调谐SPR生物芯片包括可调谐介质层，所述可调谐介质层采用电光材料、磁光材料、热光材料或者声光材料。 

其中，所述可调谐SPR生物芯片采用耦合等离子体波导共振(CoupledPlasmon-Waveguide Resonance，简称为CPWR)、波导耦合表面等离子体共振(Waveguide-Coupled SPR，简称为WCSPR)或者其他具有能够通过调制介质层物理性质(如折射率、厚度)对检测信号进行调谐的结构。 

本发明还提供了一种基于外场调制的表面等离子体共振检测方法，包括下列步骤：

1)在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的第一样品溶液，在一定检测角度下完成外场扫描，确定两个调制外场； 

2)分别在两个调制外场的作用下进行强度检测；更换折射率或浓度已知且不同于第一样品溶液的第二样品溶液，然后再次在所述两个调制外场的作用下进行强度检测，计算在所述两个调制外场的作用下的两次强度检测结果之差从而标定系统灵敏度； 

3)分别在步骤1)所确定的两个调制外场下的作用下完成待测样品的强度检测，再根据步骤2)所标定的系统灵敏度得到待测样品溶液的折射率或浓度。 

其中，所述步骤1)包括下列子步骤： 

11)在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的样品溶液，在一定检测角度下完成外场扫描，得出反射光随外场变化的表面等离子体共振曲线； 

12)在所述表面等离子体共振曲线中找出共振峰所对应的共振外场值，选择所述共振外场值两侧的两个外场值作为调制外场值。 

其中，所述步骤11)中，所述一定检测角度的获取包括下列子步骤： 

111)不施加外场时，得出反射光随检测角度变化的表面等离子体共振曲线； 

112)在共振峰所对应的检测角度区间内，确定一个检测角度作为完成所述外场扫描的一定检测角度。 

其中，所述步骤12)中，所述调制外场值位于所述表面等离子体共振曲线共振峰两侧的线性区域。 

其中，所述步骤2)包括下列子步骤： 

21)对可调谐SPR生物芯片上的样品池中折射率或浓度已知的第一样品溶液，分别在两个调制外场F1和F2作用下，测出对应的反射光光强I₁、I₂； 

22)在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的第二样品溶液，在两个调制外场F1和F2作用下，测出对应的反射光光强I′₁、I′₂； 

23)由I₁、I₂和I′₁、I′₂得到信号变化的总和ΔI，根据第一样品溶液、第二样品溶液的折射率差ΔN或者浓度差ΔC，得到检测灵敏度S＝ΔI/Δn或S＝ΔI/ΔC。其中，ΔI可以表述为ΔI＝|I₁-I′₁|+|I₂-I′₂|，也可以表述为ΔI＝|I₁-I₂|+|I′₁-I′₂|。 

其中，所述步骤3)包括下列子步骤： 

31)可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入待测样品溶液，分别在两个调制外场F1和F2作用下，测出对应的反射光光强I″₁、I″₂； 

32)根据I″₁、I″₂相对于I₁、I₂或I′₁、I′₂的变化ΔI′，由步骤23)所标定的灵敏度S得到待测样品溶液的折射率或浓度信息。 

其中，所述外场可以是电、磁、声或热场。 

与现有技术相比，本发明的技术效果包括： 

1、灵敏度提高。在双外场的调制下，可调谐SPR生物芯片的可调谐介质层获得两种不同的光学参数。相当于在相同的外界条件下，两个不同结构参数的SPR生物传感器同时对同一表面进行检测。上述两个等效的SPR生物传感器获得的检测信号变化方向相反，总检测信号的相对变化获得增大，即对应的检测灵敏度获得提高。 

2、检测位置灵活。由于采用外场调制并且对于检测角度的选择具有很大的灵活性，这样就消除了对机械结构的依赖，提高易操作性且容易实现器件的集成，利于微型化。

3、漂移自补偿，减小外界条件改变造成的影响。本发明提出的检测方法获得的检测值是两个检测信号的差值，具有自动消除信号漂移的能力，减小外界噪声影响(如温度、压力)，获得信号质量的提高。 

4、可实现高通量检测。本发明采用的检测系统光路简单，容易实现对二维表面的检测，能够被应用于高通量的阵列检测中。 

附图说明

图1是双外场调制检测方法的原理示意图； 

图2是基于电光调制的WCSPR检测系统； 

图3是WCSPR角度扫描曲线； 

图4是将检测角度确定在位于WCSPR反射曲线共振峰处的52.7度得到的电压扫描曲线及选择的两个调制电压-44V和15V； 

图5是在52.7度的检测角度下，施加-44V和15V的调制电压分别得到信号的相对变化及总信号的相对变化； 

图6是在52.7度的检测角度下，施加-44V和15V的调制电压分别得到信号及总信号； 

图7是将检测角度确定在位于WCSPR反射曲线共振峰左侧的52.67度得到的电压扫描曲线及选择的两个调制电压-54V和2V； 

图8是在52.67度的检测角度下，施加-54V和2V的调制电压分别得到信号的相对变化及总信号的相对变化； 

图9是在52.67度的检测角度下，施加-54V和2V的调制电压分别得到信号及总信号； 

图10是将检测角度确定在位于WCSPR反射曲线共振峰右侧的52.74度得到的电压扫描曲线及选择的两个调制电压-30V和32V； 

图11是在52.74度的检测角度下，施加-30V和32V的调制电压分别得到信号的相对变化及总信号的相对变化； 

图12是在52.74度的检测角度下，施加-30V和32V的调制电压分别得到信号及总信号。 

具体实施方式

下面，结合附图和具体实施例对本发明做进一步地说明。 

参考图2，根据本发明的一个实施例，提供了一种使用电场作为外场调制的表面等离子体共振检测系统，该检测系统包括单色光源1、光学组件2、高折射率棱镜3、电场可调谐WCSPR生物芯片5、电压源8、光探测器4、控制系统9、样品池6及微流控系统7。 

其中，单色光源1和光学组件2组成平行光输出装置，用于提供单色、线性偏振(TM模式)、准直的光束。所述光学组件2包括不限顺序的透镜组、滤波片和偏振片等。 

高折射率棱镜3用于使所述平行光输出装置提供的光束耦合进入电场可调谐WCSPR生物芯片5。本发明中，也可使用其它种类的棱镜、光栅或其他能够将所述光束耦合进入可调谐SPR生物芯片的光耦合器来替代所述高折射率棱镜3。 

参考图2，本实施例中，电场可调谐WCSPR生物芯片5从上至下依次由生物检测层、上层金属、电调制层、下层金属以及基底组成。电压源8用于调谐电场可调谐WCSPR生物芯片5中的电调制层的物理性质(如折射率、厚度)。本实例对电调制层的折射率进行调谐，即采用电光调制层。 

样品池6是将检测物质局限于电场可调谐WCSPR生物芯片5检测表面的装置，其数量、形状及尺寸由检测需要决定。 

光探测器4用于对来自电场可调谐WCSPR生物芯片5的检测层的反射或透射光强进行检测。光探测器4可以是CCD、光电二极管，或者其他对光强敏感的传感器。 

控制系统9是确定检测角度、完成外场扫描、确定调制外场、记录检测信号、完成数据分析处理的软硬件系统，包括但不限于转台控制器、场发生器控制器、数据采集器、中央控制器以及控制及分析软件。 

微流控系统7用于实现样品池中样品更换，生物芯片表面清洗、重生的流体控制器，包括流体泵、选通阀和微流管道。 

本实施例中，光源发出的光束经过光学系统整形、滤波、偏振处理，产生单色、平行、p型偏振的光通过高折射率棱镜耦合入电光调制的WCSPR生物芯片。光探测器接受来自生物芯片的反射光，通过光强的变化对生物芯片表面的信息进行检测。以WCSPR生物芯片的上下层金属为电极，电压源向电光调制层施加电场。电光调制层采用线性电光材料，其折射率变化与外加电场的关系为：

$\mathrm{\Δn}=-\frac{1}{2}{n}^3{\mathrm{\γ}}_{33}\frac{V}{d}$

其中d为电光调制层的厚度，V为施加于电光调制层的电压，γ₃₃为电光调制层的电光系数，n为电光调制层的原始折射率。从上式中可以看出，电光调制层的折射率变化与外加电场具有线性关系，以此基本原理，通过外加电场对电光调制层的折射率进行调制。微流控系统通过微流泵、选通阀等装置，对样品池中注入溶液或者进行样品的更换、清洗等。上述所有的光源、光探测器、微流控系统、电压源等都通过控制系统进行协调，包括光强的大 小，反射光采集的频率，光源、光探测器的位置，样品溶液的流速、流通时间，外加电场的大小、频率，获得数据的处理等，从而获得生物芯片表面信息，完成生物分子相互作用的检测。 

值得说明的是，本实施例中的电场可调谐WCSPR生物芯片5也可用其它可调谐SPR生物芯片替代。可调谐SPR生物芯片是外场调谐和生物检测的载体。本发明中，可以采用耦合等离子体波导共振(CoupledPlasmon-Waveguide Resonance，简称为CPWR)、波导耦合表面等离子体共振(Waveguide-Coupled SPR，简称为WCSPR)或者其他具有能够通过调制介质层物理性质(如折射率、厚度)对检测信号进行调谐的结构。可调谐SPR生物芯片一般包括可调谐介质层、检测金属层和检测层。另外，可调谐SPR生物芯片5的可调谐介质层可以通过电、磁、热、声，或者其他可以使物理性质(如折射率、厚度)发生变化的外场进行调节。具体地，所述可调谐介质层可以采用电光材料、磁光材料、热光材料、声光材料，或者其他可以在外场的作用下物理性质(如折射率、厚度)发生变化的材料制作。所述金属层可采用的材料包括纯金属、合金、金属化合物，或者其他能够作为SPW载体的材料。其中，所述的纯金属包括金、银、铬、铜和铝。所述检测层是被检测物质、修饰物质、标签物质或者上述的组合。 

类似地，本实施例中的电压源8也可用其它场发生器替代。场发生器是各种电场、磁场、温度、声波可控装置，所述可调谐SPR生物芯片的可调谐介质层的物理性质由场发生器进行调谐。 

根据本发明的另一个实施例，还提供了一种基于双外场调制的表面等离子体共振检测方法。为便于理解，下面分三个部分进行介绍。这三个部分分别是用双外场调制进行SPR检测的原理、双外场调制的SPR检测方法以及双电压调制的SPR检测方法的性能。 

一、用双外场调制进行SPR检测的原理 

众所周知，基于角度或者波长检测的SPR生物传感器，当检测表面发生变化时，SPR反射率曲线的位置会发生线性偏移。基于此，将检测角度、波长固定在SPR反射率曲线的线性区域，当检测表面发生变化时，探测到的反射光强发生也会线性变化。另外，在外场的作用下，外场可调谐的SPR生物芯片的结构参数会发生改变，相应的SPR反射率曲线的位置发生变化，从而实现SPR反射率曲线位置的外场可调。基于此原理，在两个外场的作用下可 以将SPR反射率曲线分别调节至共振峰两侧的线性区域。选择两个合适的外场以一定频率周期性地交替作用于可调谐SPR生物芯片，可以得到两组随检测表面变化而线性变化的反射光强信号。这两组信号都是对检测表面和外界条件变化的反映，并且，这两组信号中，对于检测表面变化得到的信号变化方向相反，而外界条件变化得到的信号变化方向相同。将上述两组信号的差模作为一组总的输出信号(简称总信号)，则由于检测表面变化得到的总信号增强，外界条件变化引起的信号漂移减弱。 

具体地，对于电压调制的SPR检测方式，在固定的检测角度和波长下，对电压可调谐芯片施加一定范围线性变化的电压，可以得到电压调制SPR反射率曲线。图1显示了基于双电压调制的SPR检测基本原理，其中(a)为对两种样品(样品1和样品2)进行检测得到的两条电压调制SPR反射率曲线，(b)为调制电压V1对应的对两种样品进行检测的角度SPR反射率曲线，(c)为调制电压V2对应的对两种样品进行检测的角度SPR反射率曲线。由图1(a)中看出，两个检测电压(V1，V2)分别选择在电压调制SPR反射率曲线左右两侧的两个线性区域当中，分别检测这两个电压下对应的反射光强变化。当样品1换为样品2后，电压调制SPR反射率曲线向左移动，两个检测电压对应的反射光强发生方向相反的变化。在对样品1进行检测时，检测电压V1和V2分别对应的反射光强为I₁、I₂；对样品2进行检测时，对应的反射光强分别为I′₁、I′₂。这样，总的光强变化ΔI＝|I₁-I′₁|+|I₂-I′₂|＞|I₁-I′₁|或|I₂-I′₂|。随着检测时间的延长，外界条件(如温度、湿度等)发生改变，反射光强将产生漂移ΔI_t(在检测限之上，ΔI_t＜|I₁-I′₁|或|I₂-I′₂|)。这时， 

I′_1t＝I′₁+ΔI_t

I′_2t＝I′₂+ΔI_t

那么 

ΔI′＝|I₁-I′_1t|+|I₂-I′_2t| 

＝|(I₁-I′₁)-ΔI_t|+|(I₂-I′₂)-ΔI_t| 

其中 

(I₁-I′₁)、(I₂-I′₂)符号相反 

那么可以得到结论 

ΔI′＝|I₁-I′₁|+|I₂-I′₂|＝ΔI 

即，采用双电压调制的SPR检测方式能够抑制外界条件改变引起的信号漂移。 

上述数据处理方式是对不同电压调制周期的同一电压下的反射信号进行处理，即ΔI₁＝|I₁-I′₁|、ΔI₂＝|I₂-I′₂|，从而得到总检测信号。本发明中的检测方法也适用于对同一电压调制周期内的反射信号进行处理，即： 

ΔI＝|I₁-I₂|+|I′₁-I′₂| 

其中，施加电场V1后再施加V2的这段时间为一个电压调制周期，其中I₁和I₂由一个电压周期得到，I′₁和I′₂由另一个电压周期得到。 

可以看出，此数据处理方法也同样具备放大检测信号，抑制信号漂移的特点。 

图1(b)、(c)从SPR角度检测曲线显示双电压调制SPR检测方法的基本原理。对电压可调谐SPR生物芯片分别施加检测电压V1、V2，则处于两种状态下的芯片对应的SPR反射率曲线位置不同。其中，对于检测电压V1对应的SPR反射率曲线，固定的检测角度a0(即测量得到图1(a)时所处的角度)处于右侧的线性检测区域，如图1(b)所示；对于检测电压V2对应的SPR反射率曲线，固定的检测角度a0处于左侧的线性检测区域，如图1(c)所示。将样品1换为样品2，若电压调制SPR反射率曲线向左移动，那么角度SPR反射率曲线向右移动。因此，由图1(b)、(c)可以看出，检测信号的变化趋势与图1(a)的相同，而事实上对应的值的大小也是相同的。 

二、双外场调制的SPR检测方法 

下面，以基于电光调制的WCSPR生物芯片检测系统为例，对本实施例的双外场调制的SPR检测方法进行描述。所述双外场调制的SPR检测方法包括下列步骤： 

1、基于双电压调制的SPR检测系统灵敏度标定。包括下列子步骤： 

1)在样品池中通入折射率或浓度已知的样品溶液1，并保持溶液静止或者流速均匀。 

2)调节激发光束对电光WCSPR生物芯片表面的入射角度，使其在共振峰值附近，并固定该位置。 

3)对电光WCSPR生物芯片施加线性变化的电压，并记录来自生物芯片检测表面的光强及相对应的电场大小，得到光强-电场曲线。 

4)选择两个合适的电压值V1、V2，使其分别在光强-电场曲线两侧的线性区域。 

5)周期性对电光WCSPR生物芯片施加电压V1、V2，并记录来自敏感 表面的分别对应电压V1、V2的光强I₁、I₂(即对样品溶液1进行强度检测)。 

6)在样品池中通入折射率或浓度已知的样品溶液2，并保持溶液静止或者流速均匀。周期性对电光WCSPR生物芯片施加电压V1、V2，并记录来自敏感表面的分别对应电压V1、V2的光强I′₁、I′₂(即对样品溶液2进行强度检测)。 

7)由I₁、I₂和I′₁、I′₂得到信号变化的总和ΔI，样品溶液1、样品溶液2的折射率或者浓度差Δn、ΔC，得到检测灵敏度S＝ΔI/Δn或S＝ΔI/ΔC，即单位折射率或浓度变化引起的检测信号改变。 

2、基于双电压调制的SPR生物检测，包括下列子步骤： 

1)在样品池中通入待测样品溶液3，并保持溶液静止或者流速均匀。周期性对电光WCSPR生物芯片施加电压V1、V2，并记录来自敏感表面的分别对应电压V1、V2的光强I″₁、I″₂。 

2)根据I″₁、I″₂相对于I₁、I₂或I′₁、I′₂的变化ΔI′，由上述标定的灵敏度S即可得到待测样品溶液3的折射率或浓度信息。 

3、对于定性分析，只要变换溶液得到的信号或者参照信号发生变化，就可以利用结果进行判定。 

三、双电压调制的SPR检测方法的性能 

对于双电压调制的SPR检测方法的性能，本实例从三个检测角度进行展示，意在说明本检测方法具有较大检测自由度，并且实现检测灵敏度性能的提高。本实例中，采用的基于电光调制的WCSPR生物芯片检测系统的参数如下：激发光波长980nm；棱镜折射率为1.7053；上下层金属采用金，相应折射率为0.185145+6.1504i，厚度都为30nm；电光调制层的原始折射率为1.60388，电光系数为100pm/V，厚度为2200nm；采用检测溶液为折射率1.333的二次去离子水，0.1X-1.0X磷酸盐缓冲液，浓度间隔为0.1X，并且折射率随浓度线性变化，相对于二次去离子水，浓度每增大1.0X，折射率增大0.00154。图3是无外加电压，样品池中为二次去离子水时，电光调制WCSPR生物芯片检测系统的反射率曲线图，其SPR共振峰的位置是52.7度。本实例选取共振峰及其左右两侧的两个检测角度(52.67度和52.74度)，完成对本发明检测方法及性能的展示。 

将检测角度固定在SPR共振峰(52.7度)处，图4显示了调制电压在-100V 到100V之间的SPR反射率曲线。由于随检测折射率增大，电压SPR反射率曲线向左移动，为了实现较大的动态范围，所选择的两个调制电压应使曲线左侧的光强尽量大而右侧的尽量小。在本检测角度下，选择的两个调制电压分别为-44V和15V，其具体位置都在图4中被标明。对二次去离子水及浓度间隔为0.1X的0.1-1.0X磷酸盐缓冲液分别进行检测，得到的数据可以采用两种方式进行处理：相对光强变化，绝对光强变化，分别如图5、6所示。检测灵敏度通过计算线段斜率得到，不同处理方法不会对计算结果造成影响。调制电压-44V、15V分别对应的检测灵敏度为12055RU/RIU、24624RU/RIU，而总信号灵敏度为36679RU/RIU。可以看出，基于双电压调制SPR检测方法能够提高检测灵敏度。 

将检测角度固定在SPR共振峰左侧(52.67度)处，图7显示了调制电压在-100V到100V之间的SPR反射率曲线。在本检测角度下，选择的两个调制电压分别为-54V和2V，其具体位置都在图7中被标明。对二次去离子水及浓度间隔为0.1X的0.1-1.0X磷酸盐缓冲液分别进行检测，得到的数据可以采用两种方式进行处理：相对光强变化，绝对光强变化，分别如图8、9所示。调制电压-54V、2V分别对应的检测灵敏度为11739RU/RIU、24045RU/RIU，而总信号灵敏度为35784RU/RIU。可以看出，基于双电压调制SPR检测方法能够提高检测灵敏度。 

将检测角度固定在SPR共振峰右侧(52.74度)处，图10显示了调制电压在-100V到100V之间的SPR反射率曲线。在本检测角度下，选择的两个调制电压分别为-30V和32V，其具体位置都在图10中被标明。对二次去离子水及浓度间隔为0.1X的0.1-1.0X磷酸盐缓冲液分别进行检测，得到的数据可以采用两种方式进行处理：相对光强变化，绝对光强变化，分别如图11、12所示。调制电压-30V和32V分别对应的检测灵敏度为12553RU/RIU、25177RU/RIU，而总信号灵敏度为37730RU/RIU。可以看出，基于双电压调制SPR检测方法能够提高检测灵敏度。

综上，三个检测位置得到的检测结果都保持良好的线性度，表明本发明的检测方法在检测位置的选择上具有较大的自由度。 

本实例采用电压调制方法，采用WCSPR芯片结构。但是本发明中强调的外场并不限于电场，可调谐介质层可以通过电、磁、热、声，或者其他可以使物理性质(如折射率、厚度)发生变化的外场进行调节。芯片结构也不限于WCSPR结构，可以是CPWR或者其他具有可调谐介质层的多层结构。 

上述的实施例仅用来说明本发明，它不应该理解为是对本发明的保护范围进行任何限制。而且，本领域的技术人员可以明白，在不脱离本实施例精神和原理下，对本实施例所进行的各种等效变化、变型以及在文中没有描述的各种改进均在本专利的保护范围之内。 

Claims (3)

1.一种基于外场调制的表面等离子体共振检测方法，包括下列步骤： 

1）在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的第一样品溶液，在一定检测角度下完成外场扫描，确定两个调制外场； 

2）分别在两个调制外场的作用下进行强度检测，更换折射率或浓度已知的第二样品溶液再次进行强度检测，计算在两个调制外场的作用下的两次强度检测结果之差从而标定系统灵敏度； 

3）在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入待测样品溶液，分别在步骤1）所确定的两个调制外场下的作用下完成待测样品的强度检测，再根据步骤2）所标定的系统灵敏度得到待测样品溶液的折射率或浓度； 

其中，所述步骤1）包括下列子步骤： 

11）在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的样品溶液，在一定检测角度下完成外场扫描，得出反射光随外场变化的表面等离子体共振曲线；所述一定检测角度的获取包括下列子步骤：111）在不加外场时，得出反射光随检测角度变化的表面等离子体共振曲线；112）在共振峰所对应的检测角度区间内，确定一个检测角度作为完成所述外场扫描的一定检测角度； 

12）在所述表面等离子体共振曲线中找出共振峰所对应的共振外场值，选择所述共振外场值两侧的两个外场值作为调制外场值；所述调制外场值位于所述表面等离子体共振曲线共振峰两侧的线性区域； 

所述步骤2）包括下列子步骤： 

21）对可调谐SPR生物芯片上的样品池中折射率或浓度已知的第一样品溶液，分别在两个调制外场F1和F2作用下，测出对应的反射光光强I₁、I₂； 

22）在可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入折射率或浓度已知的第二样品溶液，在两个调制外场F1和F2作用下，测出对应的反射光光强I₁′、I₂′； 

23）由I₁、I₂和I₁′、I₂′得到信号变化的总和ΔI，根据第一样品溶液、第二样品溶液的折射率差Δn或者浓度差ΔC，得到检测灵敏度S=ΔI/Δn或S=ΔI/ΔC，其中ΔI=|I₁-I₁′|+|I₂-I₂′|，或者ΔI=|I₁-I₂|+|I₁′-I₂′|。 

2.根据权利要求1所述的表面等离子体共振检测方法，其特征在于， 所述步骤3）包括下列子步骤： 

31）可调谐SPR生物芯片上的样品池中通入待测样品溶液，分别在两个调制外场F1和F2作用下，测出对应的反射光光强I₁″、I₂″； 

32）根据I₁″、I₂″相对于I₁、I₂或I₁′、I₂′的变化ΔI′，由步骤23）所标定的灵敏度S得到待测样品溶液的折射率或浓度信息。 

3.根据权利要求1所述的表面等离子体共振检测方法，其特征在于，所述外场是电场、磁场、声场或热场。 

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