CN102335432A - 一种基于聚磷酸酯的用于脑内递药的药物传递系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种新型的具有脑内递药特性的药物传递系统，该药物传递系统的载体材料为以聚磷酸酯为亲水链的两亲性共聚物，以期自组装形成纳米胶束，纳米胶束表面可与脑靶向配体进行共价连接。本药物传递系统能够传递小分子化学药物和诊断药物中的一种或几种穿过血脑屏障进入脑内，发挥预防、治疗和诊断作用。该药物传递系统能够增加药物透过血脑屏障的量增加脑内分布，提高治疗和诊断效果；减少外周药物分布，降低全身毒副作用；载体材料可生物降解，避免载体材料毒性；其粒径、表面电荷、配体修饰可控，便于载体材料的优化。

Description

一种基于聚磷酸酯的用于脑内递药的药物传递系统

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及药物传递系统，具体涉及一种将小分子化学药物、诊断试剂传递入脑的基于聚磷酸酯的新型药物传递系统。

技术背景

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是由脑毛细血管内皮细胞、基底膜和神经胶质细胞组成的生理屏障，其能阻止绝大部分药物进入脑内分布。因此，如果是通过常规非侵袭途径给药，为了使药物在脑内能够达到治疗浓度，就需要加大给药剂量，但是外周药物高浓度也会导致严重的副作用。而如果采用包括高渗休克、颈动脉注射和直接脑室注射给药的侵袭性给药途径，虽然效果较好，却易造成脑部感染和BBB损伤。因此，如何增加非侵袭性给药后药物在脑部的分布是脑内药物递释系统研究的关键。

目前，为解决这一问题采取的策略可分为两大类：1)对药物进行化学修饰，包括改变药物溶解性、与可透过BBB的分子偶联；2)设计可透过血脑屏障的功能化药物传递系统。前者对药物分子的分子量及理化性质有较高的要求，限制了分子量较大的药物的脑内转运，此外化学修饰易造成药物活性丧失。后者通过载体与BBB的非特异性吸附或配-受体间的特异性结合，利用BBB的内吞作用，将载体连同包载其中的药物一起转运入脑，其克服了对药物分子量及理化性质的限制、避免了对药物的化学修饰，具有广阔的应用前景。已有研究结果显示，对载药系统进行表面电荷改性，粒径控制、表面阳离子白蛋白修饰、转铁蛋白修饰、乳铁蛋白修饰或抗转铁蛋白受体抗体等修饰后，能够显著增加药物的脑内分布。另外也有文献报道，50nm以下的纳米颗粒的脑内富集也多于50nm以上相同表面特性的纳米颗粒。目前常用的载体材料包括聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)、聚异氰基丙烯酸(PIBC)、PEG-磷脂等，通常以聚乙二醇(PEG)为其亲水链，但由于PEG不能够生物降解，因此进入脑部后存在一定的安全隐患。另外，PEG仅有末端可进行功能化修饰，因此无法满足多功能化修饰的要求。

聚磷酸酯(PPE)是一类由磷酸酯键连接主链结构单元的可降解高分子，其具有良好的生物降解性和生物相容性。自20世纪80年代用于药物传输研究以来，开发出了许多具有新颖结构和功能的PPE衍生物，特别是美国Guilford公司开发的

微球已进入临床试验阶段。将PPE与聚己内酯、聚乳酸等疏水性聚合物共聚后可获得粒径可控、侧链可修饰、端基可功能化的多功能纳米药物传递系统，是一种很有应用前景的载体材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PPE的用于脑内药物传递的可透过血脑屏障的药物传递系统。具体涉及一种将小分子化学药物和诊断药物等传递入脑的基于PPE的新型药物传递系统。

根据本发明的目的，本发明提供了一种基于PPE的用于脑内递药的药物传递系统，其特征在于，该药物传递系统为包含药物和载体材料的纳米胶束。

所述的载体材料为两亲性聚合物，包含亲水链段和疏水链段；且所述的亲水链段为聚磷酸酯PPE，所述疏水链段为聚己内酯PCL、聚乳酸PLA或聚乳酸羟基乙酸PLGA；即，所述的载体材料为聚磷酸酯-聚己内酯共聚物(PPE-PCL)、聚磷酸酯-聚乳酸共聚物(PPE-PLA)和聚磷酸酯-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PPE-PLGA)中的一种或几种。

所述亲水链段的结构示意如下：

其中，

侧链R₁可为带正电荷、带负电荷或不带电荷的小分子基团，优选为乙基、2-氨基乙基或2-羧基乙基，所述药物传递系统的表面电荷可通过调节侧链控制，

端基R₂可为羟基、马来酰亚胺基、巯基、氨基、羧基、酰肼基、生物素或亲和素，

n为10-200。

进一步，所述端基R₂可任选地与如阳离子白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白或抗转铁蛋白受体抗体的脑靶向配体共价连接，并且，基于所述载体材料的总摩尔数，所述脑靶向配体的修饰率为0.1-10％。

所述的疏水链段为聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸，其聚合度为20-1000。所述药物传递系统的纳米胶束的粒径可通过改变疏水链段控制，其粒径范围为10-500nm。

所述药物为香豆素-6、紫杉醇或替尼泊苷。

本发明还提供了基于PPE的用于脑内递药的载体材料，其特征在于，该载体材料为两亲性聚合物，其包含亲水链段和疏水链段；且所述亲水链段为PPE，所述疏水链段为PCL、PLA或PLGA；

所述亲水链段的结构示意如下：

其中，

侧链R₁可为带正电荷、带负电荷或不带电荷的小分子基团，优选为乙基、2-氨基乙基或2-羧基乙基，所述药物传递系统的表面电荷可通过调节侧链控制，

端基R₂可为羟基、马来酰亚胺基、氨基、羧基、巯基、酰肼基、生物素或亲和素，

n为10-200。

所述端基R₂可与如阳离子白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白或抗转铁蛋白受体抗体的脑靶向配体共价连接，并且，基于所述载体材料的总摩尔数，所述脑靶向配体的修饰率为0.1-10％。

所述的疏水链段为聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸，其聚合度为20-1000。

此外，本发明还提供了上述的用于脑内递药的药物传递系统的制备方法，具体为：

1)载体材料的制备：

a)通过R₁’-OH与2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷反应得到单体

b)以疏水链段的末端羟基为引发基团，通过如下的单体(I)的开环聚合反应得到聚合物(II)，

其中，疏水链段为PCL、PLA或PLGA，R₁’为-CH₃CH₃、CH₂CH₂NH-Boc或CH₂CH₂COOC₄H₉，n为10-200；

c)聚合物(II)经HCl/THF脱保护得到

聚合物(III)，其中，疏水链段、R₁和n的定义如上所述；

d)聚合物(III)通过下列反应生成载体材料

其中，疏水链段、R₂和n的定义如上所述：

当R₂为氢时，聚合物(III)即为所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与2-氨基马来酰亚胺通过酰胺键偶联得到R₂为马来酰亚胺基的所述载体材料，继续与巯基化亲和素偶联得到R₂为亲和素的所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与叔丁氧基羰基酰肼(tert-Butoxycarbonyl hydrazide)反应脱保护后得到R₂为酰肼基的所述载体材料，或与生物素分子上的羧基偶联得到R₂为生物素的所述载体材料，或者

聚合物(III)经羰基二咪唑(CDI)和二乙胺反应得到R₂为氨基的所述载体材料，然后与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate)反应脱保护后得到R₂为巯基的所述载体材料。

2)纳米胶束的制备：将药物与载体材料共同溶解于有机溶剂中，按溶剂沉淀法或溶剂蒸发法制备纳米胶束。

3)非必须地，脑靶向配体的处理：当所述纳米胶束的表面端基R₂为马来酰亚胺基或巯基时，需对该脑靶向配体进行表面功能化修饰，优选通过羟胺将该脑靶向配体表面的游离氨基转化为巯基；

4)通过所述纳米胶束表面的端基R₂使脑靶向配体与该纳米胶束共价连接：反应在pH 6-9的缓冲溶液中，氮气保护下，进行12-24h。

所述共价连接是通过以下方法实现的：即所述纳米胶束表面的氨基(R₂)与脑靶向配体的羧基、所述纳米胶束表面的羧基(R₂)与脑靶向配体的氨基、所述纳米胶束表面的巯基(R₂)与脑靶向配体的巯基、所述纳米胶束表面的马来酰亚胺基(R₂)与脑靶向配体的巯基、所述纳米胶束表面的酰肼基(R₂)与脑靶向配体的羰基、所述纳米胶束表面的马来酰亚胺(R₂)与亲和素共价连接后与生物素化脑靶向配体进行连接。

下面更加具体地描述本发明。

通常，药物传递系统是指能够包载并输送药物的复合体，它可以是通过药剂学手段制备的包载药物的各种微粒、脂质体、纳米粒、胶束等复合体。本发明所涉及的药物传递系统特指由以PPE为亲水链段的两亲性聚合物制备的纳米胶束，其表面可非必需地共价连接脑靶向配体(例如，阳离子白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白、抗转铁蛋白受体抗体等分子)，侧链可进行阳离子、阴离子、pH敏感、温度敏感基团修饰。制成的纳米胶束是能够透过血脑屏障、具有脑内递药特性的药物传递系统。该纳米胶束可以透过BBB传递小分子化学药物和诊断药物等入脑，能够增加药物在脑内的蓄积，提高治疗和诊断效果，降低外周毒性。

与其他用于脑部给药的药物传递系统相比，本发明的纳米胶束的载体材料为具有亲水链段为聚磷酸酯的两亲性聚合物，该PPE能够被生物降解，因此安全性高，并且PPE链段的侧链和主链端基能够被不同的功能基团修饰，因此能够满足多功能修饰的要求。

具体而言，本发明所述的纳米胶束，其载体材料为两亲性嵌段共聚物，并具有以下特征：

所述载体材料的亲水链段为PPE，聚合度(n)范围为10-200，所述的PPE端基(R²)可为羟基、马来酰亚胺基、巯基、氨基、羧基、酰肼基、生物素或亲和素中的一种，侧链(R¹)可为乙基、2-氨基乙基、2-羧基乙基中一种，所述亲水链段的结构示意如下：

所述载体材料的疏水链段可为聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)和聚乳酸羟基乙酸(PLGA)中的任一种，聚合度范围为20-1000。

在本发明中，使用PPE-PCL、PPE-PLA和PPE-PLGA中的一种或几种作为载体材料，具体方法为：

a)通过R₁-OH与2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷反应得到单体

(参照Macromolecules 2006 39 473-475中方法进行)；

b)以疏水链段的末端羟基为引发基团，通过如下的单体(I)的开环聚合反应得到聚合物(II)，

其中，疏水链段为PCL、PLA或PLGA，R₁’为-CH₃CH₃、CH₂CH₂NH-Boc或CH₂CH₂COOC₄H₉，n为10-200；

c)聚合物(II)经HCl/THF脱保护得到

聚合物(III)，其中，疏水链段、R₁和n的定义如上所述；

d)聚合物(III)通过下列反应生成载体材料

其中，疏水链段、R₂和n的定义如上所述：

当R₂为氢时，聚合物(III)即为所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与2-氨基马来酰亚胺通过酰胺键偶联得到R₂为马来酰亚胺基的所述载体材料，继续与巯基化亲和素偶联得到R₂为亲和素的所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与叔丁氧基羰基酰肼(tert-Butoxycarbonyl hydrazide)反应得到R₂酰肼基的所述载体材料，或与生物素分子上的羧基偶联得到R₂为生物素的所述载体材料，或者

聚合物(III)通过与活化后的CDI和二乙胺反应得到R₂为氨基的所述载体材料，然后与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate)(Sigma)反应脱保护后得到R₂为巯基的所述载体材料。

按照下述常规制备方法的一种或几种来制备包载药物的纳米胶束。所述方法包括溶剂沉淀法或溶剂蒸发法等。纳米胶束包载的药物主要为疏水性药物。制备纳米胶束时，将疏水药物和所述载体材料(功能化的载体材料是脑部给药非必须的特征，小粒径能够在一定程度上增加药物脑内分布)一起溶解于有机溶剂中，将水相缓慢滴加入有机溶剂中，通过透析或者减压挥发除去有机溶剂即形成载药纳米胶束。制备时，载体材料和药物的质量比为10∶1-200∶1，载体材料在有机溶剂中的浓度为10-400mg/mL，所用有机溶剂可以是四氢呋喃、二氧六环、乙腈、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种溶剂的混合溶剂，水和有机溶剂的体积比为1∶1-50∶1。

所制备的纳米胶束可通过其表面的功能性官能团(R₂)与脑靶向配体(包括阳离子白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白、抗转铁蛋白受体抗体等分子)共价连接，形成经脑靶向配体修饰的纳米胶束。若所述纳米胶束的端基R₂为马来酰亚胺基或巯基，则需对脑靶向配体进行表面功能化修饰，主要方式是通过羟胺将脑靶向配体表面的游离氨基转化为巯基，以使其与马来酰亚胺基或巯基反应；若所述纳米胶束的端基R₂为氨基、羧基、酰肼基、生物素或亲和素，则无需对脑靶向配体进行预先处理，可在EDC/NHS催化下完成。所述功能性官能团与脑靶向配体的连接方式可以是：为PPE端基(R₂)的马来酰亚胺基团与所述脑靶向配体的巯基连接；为PPE端基(R₂)的巯基与所述脑靶向配体的马来酰亚胺基或巯基连接；为PPE端基(R₂)的氨基与所述脑靶向配体的羧基连接；为PPE端基(R₂)的羧基与所述脑靶向配体的氨基连接；为PPE端基(R₂)的酰肼基与所述脑靶向配体的羧基连接；为PPE端基(R₂)的生物素或亲和素分别与亲和素或生物素化的脑靶向配体连接(聚合物末端初始即为羟基，不需进一步修饰)。聚合物合成后初始末端为羟基，可通过与丁二酸酐或CDI/乙二胺反应变为羧基或氨基。将末端羧基或氨基进一步变为马来酰亚胺基、酰肼基、生物素或亲和素的方法可参照文献《bioconjugate technique》中的方法进行。相对于载体材料的总摩尔数，脑靶向配体的修饰率为0.1-10％。经脑靶向配体修饰后得到的纳米胶束的粒径范围为10-500nm。

包载于纳米胶束的药物可以是小分子化学药物和诊断药物中的一种或几种。其中小分子药物可以是抗癌药物、抗老年痴呆药物、抗帕金森病药物、抗脑部病毒及微生物感染药物、抗脑缺血药物，诊断药物可以是核医学诊断试剂、MRI诊断试剂、荧光诊断试剂、荧光量子点等。

载有药物的本发明的药物传递系统可以分散在药剂学上可以接受的各种缓冲溶液中，通过静脉注射的方式给药，所述缓冲溶液包括生理盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、5％葡萄糖等。静脉给药后，药物在脑内的达峰时间在0.5-4h之间，在脑内达到峰浓度时，药物在每克脑组织内的量占给药剂量/g脑组织的0.1-5％。

本发明中的药物传递系统与常规药物传递系统和给药方式相比，具有以下优点：(1)增加药物透过血脑屏障的量，进而增加药物在脑内的分布，从而提高治疗和诊断效果；(2)减少外周的药物分布，降低全身毒副作用；(3)药物传递系统可生物降解，降低载体毒性；(4)粒径、表面电荷、配体修饰可控，便于载体优化。

附图说明

图1：37℃下，脑毛细血管内皮细胞摄取载药纳米胶束(香豆素-6纳米胶束，Coumarin-6Micelles，CMs)及对照药物溶液(香豆素-6溶液，Coumarin-6Solution，CS)(50ng/ml香豆素)的数量-时间曲线。

图2：不同浓度胶束对脑毛细血管内皮细胞活性和屏障能力的影响。

图3：尾静脉给予正常ICR小鼠载药纳米胶束(CMs)或对照药物溶液(CS)(0.4mg/kg香豆素)后，脑内香豆素量随时间的变化曲线。

图4：转铁蛋白修饰紫杉醇纳米胶束(PTX-M)和对照紫杉醇溶液(PTX-S)在尾静脉给予ICR小鼠10mg紫杉醇/kg体重药物1h后，药物在动物主要脏器中的分布。

具体实施方式

本发明通过以下描述和实施例进行说明，以下描述是为了更好的理解本发明，但并不限制本发明的权利要求范围。

实施例

实施例1：由于嵌段共聚物疏水链段仅发挥包载疏水药物的作用，而不影响最终形成的纳米胶束的表面特性，因此本实施例及以下实施例以PPE-PCL为代表，对基于聚磷酸酯的两亲性嵌段共聚物的脑靶向性能进行考察。

为了证明以PPE-PCL制备得到的胶束能够增加药物向脑内分布，制备了包载荧光染料香豆素-6(购自美国Acros)的纳米胶束，并考察了其毒性和脑靶向能力。

1)制备载有荧光染料香豆素-6的药物纳米胶束

以PCL-OH为大分子引发剂，在无水THF中引发2-乙氧基-1，3，2-二氧磷杂环戊烷开环聚合，经乙醚沉淀纯化得到R₁为乙基、R₂为氢的聚合物PCL-PPE-OH。将40mg PCL-PPE-OH和0.2mg香豆素-6溶解于200μl四氢呋喃(分析纯，国药集团)中，向其中滴加入1mL去离子水，搅拌30min。随后减压搅拌1h，除去其中的四氢呋喃。通过动态光散射(NICOMP，美国)测定载药纳米胶束的平均粒径为31.3±10.7nm。

2)原代大鼠脑毛细血管内皮细胞(BMECs)摄取包载香豆素-6的纳米胶束或对照溶液的定量实验

将BMECs以50,000个细胞/孔的密度接种于24孔培养板，待7天后细胞汇合为单细胞层时进行细胞摄取实验。吸去培养液，用480μL Hank’s液预孵30min，将在步骤1)中制备的包载香豆素-6的纳米胶束水溶液或对照溶液(4％吐温80增溶的香豆素-6溶液)以25-200ng/mL的不同浓度加入培养板，每孔加20μL，用于定量检测不同时间不同浓度下细胞对药物的摄取。培养结束后，用冷Hank’s溶液吸去表面药物，用RIPA裂解液溶解细胞，取20μl样品用BCA试剂盒(Pierce公司)测定总蛋白量，取100μl样品用400μl乙腈破坏，涡旋5min，15,000rpm离心10min，吸取上清20μl采用荧光读板器(Novostar公司)进行荧光强度测定。结果显示在图1中。图1为37℃下，脑毛细血管内皮细胞摄取载药纳米胶束(香豆素-6纳米胶束，Coumarin-6Micelles，CMs)及对照药物溶液(香豆素-6溶液，Coumarin-6 Solution，CS)(50ng/ml香豆素)的数量-时间曲线。从图1可以看出：细胞对载药胶束的摄取是一个时间和浓度依赖的过程，在较低浓度下，载药胶束进入BMECs的速度明显快于对照溶液，其进入细胞的量也明显高于对照溶液。

3)纳米胶束的细胞毒性考察

将BMECs以50,000细胞/孔的密度接种于24孔培养板或Transwell中，待7天后细胞汇合为单细胞层时进行细胞毒性实验。向孔中加入0.1-2mg/mL的在步骤1)中制备的胶束溶液20μL，孵育24h后，用MTT法测定活细胞产生的甲臜在二甲亚砜中570nm处的吸光度，考察纳米胶束对细胞存活能力的影响。另外，当BMECs在Transwell(Millipore公司)中长成单细胞层，并且电阻达到300Ωcm²以上时，加入2mg/mL在步骤1)中制备的纳米胶束溶液20μL，孵育24h后吸去胶束溶液，继续孵育48h，期间测定电阻变化。结果如图2所示：在胶束溶液的浓度达到2mg/mL时，仍对BMECs存活没有影响(图2A)，同时不影响其屏障功能(图2B)。

4)包载香豆素-6的纳米胶束及对照溶液在小鼠脑内和外周组织的分布

小鼠尾静脉注射0.4mg香豆素-6/kg的在步骤1)中制备的包载香豆素纳米胶束或对照溶液(4％吐温80增溶的香豆素-6溶液)。一部分小鼠，在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8h被断颈处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑、血组织样品，用RIPA裂解组织后，用4倍体积的乙腈(国药集团)萃取香豆素-6并沉淀蛋白，15,000rpm离心30min，取20μl上清液测定香豆素-6的浓度。另外的小鼠，在给药1h后，经腹腔注射水合氯醛(国药集团)麻醉，心室灌流生理盐水20min，用4％多聚甲醛(国药集团)灌注固定后，迅速取出脑组织，并将其置于15％和30％蔗糖溶液中脱水24h，包埋后冷冻切片，厚度为20μm/片，PBS漂洗后用1μg/mL DAPI染色10min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜下观察香豆素-6在脑组织的分布和荧光强度。图3为尾静脉给予正常ICR小鼠载药纳米胶束(CMs)或对照药物溶液(CS)(0.4mg/kg香豆素)后，脑内香豆素量随时间的变化曲线。结果：如图3所示，给药1h后，使用包载香豆素的纳米胶束时，每克脑组织内香豆素的量为注射剂量/g脑组织的3.74％(3.74％ID/g)，与对照溶液相比，载药纳米胶束能够显著增加香豆素-6在脑组织的分布；冷冻切片后观察香豆素在脑组织中分布，结果，香豆素在脑内的分布主要位于海马和纹状体区域，纳米胶束组的荧光强度明显强于对照溶液组。

实施例2：为了证明基于聚磷酸酯的脑靶向配体修饰的官能化纳米胶束能够促进药物的脑内分布，制备了该胶束并将其用于脑内给药。因各靶向配体与胶束的连接方式对脑内靶向效果无影响，不同的配体增加脑内药物分布的本质没有明显差异，因此本实施例以马来酰亚胺基团与转铁蛋白的连接为例，考察了基于聚磷酸酯的脑靶向配体修饰的官能化纳米胶束的脑内递药性能。

1)转铁蛋白的巯基化

将转铁蛋白(Sigma)溶解于pH7.4的HEPES缓冲液中得到1mg/mL的溶液，按每毫克蛋白加入100μl 0.1M的羟胺(Sigma)的比例，将转铁蛋白巯基化2h，然后进行超滤纯化。用Ellman’s试剂(Sigma)测定转铁蛋白的巯基化程度，平均为2-3mol巯基/mol蛋白。

2)马来酰亚胺基官能化的PCL-PPE(PCL-PPE-Mal)的制备

将实施例1中合成的PCL-PPE-OH(溶解于无水二氯甲烷(国药集团)中，加入1.2倍摩尔量的丁二酸酐(国药集团)、1.5倍摩尔量的二甲氨基吡啶(国药集团)和1.5倍摩尔量的三乙胺，室温密闭反应24h。反应后浓缩，沉淀于冷乙醚(国药集团)得端基R₂为羧基的PCL-PPE。将所得端基为羧基的PCL-PPE溶解于二甲基甲酰胺(国药集团)中，加入1.2倍摩尔量的二环己基碳二亚胺(国药集团)、2倍摩尔量的2-氨基马来酰亚胺(Sigma)和2倍摩尔量的三乙胺，密闭反应过夜，经过滤、浓缩后，沉淀于冷乙醚得到PCL-PPE-Mal(R₁为乙基，R₂为马来酰亚胺基团)。

3)包载紫杉醇的官能化纳米胶束的制备

将30mg未官能化的PCL-PPE-OH(实施例1中制备)和10mgPCL-PPE-Mal(步骤2中制备)和2mg紫杉醇(上海三维)溶解于200μl四氢呋喃中，向其中滴加入1mL去离子水，搅拌30min。随后减压搅拌1h，除去其中的四氢呋喃，制得包载药物的官能化纳米胶束。

4)脑靶向配体修饰的官能化纳米胶束的制备

将在步骤1)中制备的巯基化的转铁蛋白和在步骤3)中制备的纳米胶束以1∶1(巯基摩尔数∶马来酰亚胺基摩尔数)的比例反应6h，得到被巯基化转铁蛋白修饰的官能化纳米胶束。通过动态光散射测定该纳米胶束的平均粒径为56.2±35.1nm。

5)抗胶质瘤作用

将人脑胶质瘤细胞以3,000个细胞/孔的密度接种入96孔板中，24h后加入终浓度为0.01-10,000nM的在步骤4)中制备的胶束溶液，继续孵育72h，用SRB法测定其对胶质瘤细胞毒性。结果：包载紫杉醇的纳米胶束对胶质瘤细胞的IC₅₀为9.4±0.8nM。

6)体内分布研究

ICR小鼠尾静脉注射在步骤4)中制备的包载紫杉醇的纳米胶束(PTX-M)(10mg紫杉醇/kg)，对照溶液为用聚氧乙烯蓖麻油∶乙醇∶水＝1∶1∶10(v/v)的混合物增溶的紫杉醇溶液(PTX-S)。在给药1h后将小鼠断颈处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑组织样品，用5倍质量的甲醇悬浮，用探头超声仪(上海之信)，200瓦超声处理2min，充分萃取组织中的紫杉醇。用HPLC(Agilent 1100)测定组织中药物的浓度，并换算成％ID/g。图4为转铁蛋白修饰紫杉醇纳米胶束(PTX-M)和对照紫杉醇溶液(PTX-S)在尾静脉给予ICR小鼠10mg紫杉醇/kg体重药物1h后，药物在动物主要脏器中的分布。结果如图4所示：步骤4)中制备得到的纳米胶束(PTX-M)与对照溶液(PTX-S)能够显著增加紫杉醇的脑内分布，可提升至对照溶液的6倍(0.38±0.09％ID/g vs 0.06±0.03％ID/g)，而在其他组织中，两者的分布无显著性差异。

实施例3：由于替尼泊苷的溶解性和紫杉醇有较大差异，因此其根据本发明的纳米胶束的制备方法也略有不同。为了说明包载替尼泊苷的脑靶向纳米胶束的制备方法，本实施例以抗转铁蛋白受体抗体作为脑靶向配体修饰PCL-PPE-Mal为例，说明其制备方法，疏水链段和亲水链段侧链的种类不影响其制备方法。

1)抗转铁蛋白受体抗体的巯基化

将抗转铁蛋白受体抗体(武汉博士德)溶解于pH7.4的HEPES缓冲液中得到1mg/mL的溶液，按每毫克蛋白加入100μl 0.1M的羟胺的比例，将抗转铁蛋白受体抗体巯基化2h，然后进行超滤纯化。用Ellman’s试剂测定乳铁蛋白的巯基化程度，平均为2-3mol巯基/mol蛋白。

2)包载替尼泊苷的官能化纳米胶束的制备

将30mg未官能化的PPE-PCL、10mg Mal-PPE-PCL和1mg替尼泊苷(上海百灵威)溶解于200μl二甲基甲酰胺中，向其中滴加入1mL去离子水，搅拌30min。随后将溶液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋(上海绿鸟科技)中，用4L去离子水透析12h，除去其中的二甲基甲酰胺，制得包载替尼泊苷的官能化纳米胶束。

3)脑靶向配体修饰的官能化纳米胶束的制备

将在步骤1)中制备的巯基化抗转铁蛋白受体抗体和在步骤2)中制备的纳米胶束以1∶1(巯基摩尔数∶马来酰亚胺基摩尔数)的比例反应6h，得到被巯基化抗转铁蛋白受体抗体修饰的纳米胶束。通过动态光散射测定该纳米胶束的平均粒径为56.2±35.1nm。

实施例4：为了证明亲水链PPE相对于目前广泛应用的亲水链聚乙烯醇(PEG)具有可调控其侧链电荷的优势，本实施例制备了因具有不同侧链而具有不同表面电荷的包载紫杉醇的纳米胶束并测试了其脑内分布。由于不同的脑靶向配体和包载药物对纳米胶束的表面电荷不会产生显著影响，因此本实施例仅以转铁蛋白修饰的包载紫杉醇的纳米胶束为例，测试不同侧链对纳米胶束的脑靶向性能的影响，即分别具有正、负和近中性的表面电荷的纳米胶束的脑靶向性能。

1)转铁蛋白的巯基化

将转铁蛋白(Sigma)溶解于pH7.4的HEPES缓冲液中得到1mg/mL的溶液，按每毫克蛋白加入100μl 0.1M的羟胺(Sigma)的比例，将转铁蛋白巯基化2h，然后进行超滤纯化。用Ellman’s试剂(Sigma)测定转铁蛋白的巯基化程度，平均为2-3mol巯基/mol蛋白。

2)具有不同表面电荷的纳米胶束的制备

将30mg在实施例1中制备的未官能化的PCL-PPE-OH(侧链(R₁)分别为乙基、2-氨基乙基或2-羧基乙基，其合成方法参考Biomaterials 2008年29卷4348-4355的方法，亲水链单体侧链分别为乙基、Boc保护2-氨基乙基或2-羧基乙基叔丁基酯(三种侧链试剂均购自Sigma))，合成完毕后经HCl/THF处理脱去保护暴露氨基或羧基。将上述材料和10mg PCL-PPE-Mal分别溶解于200μl四氢呋喃中，各加入2mg紫杉醇搅拌均匀，向其中滴加入1mL去离子水，搅拌30min。随后将溶液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋中，用4L去离子水透析12h，除去其中的四氢呋喃，制得具有不同侧链的纳米胶束。

3)脑靶向配体修饰的纳米胶束的制备

将在步骤1)中制备的巯基化的转铁蛋白和在步骤2)中制备的纳米胶束以1∶1(巯基摩尔数∶马来酰亚胺基摩尔数)的比例反应6h，得到被巯基化转铁蛋白修饰的纳米胶束。通过动态光散射粒径测定仪测定该纳米胶束的平均粒径为56.2±35.1nm。测定侧链分别为乙基、2-氨基乙基、2-羧基乙基的纳米胶束的平均粒径分别为27.3±9.3nm、25.4±8.9nm和29.5±11.3nm，电势分别为-1.34±0.28mV、15.82±2.87mV和-13.73±3.82mV。

4)静脉注射后三种纳米胶束在小鼠脑内的分布

将三种纳米胶束按照10mg紫杉醇/kg的剂量，尾静脉给予正常ICR小鼠，给药1h后将小鼠断颈处死，取脑组织，组织处理方法同实施例2，测定组织中的药物含量以％ID/g脑组织计算。结果：三种纳米胶束在脑内药物浓度存在显著的差异，脑内药物分布最高的是带正电荷的纳米胶束(侧链为2-氨基乙基)为0.91±0.10％ID/g，其次是带负电荷的纳米胶束(侧链为2-羧基乙基)为0.59±0.08ID/g，而分布最少的是基本不带电荷的纳米胶束(侧链为乙基)为0.44±0.05％ID/g。

实施例5：为了证明本发明的纳米胶束能够通过控制疏水链段长度而控制纳米胶束的粒径，并进而影响纳米胶束在脑内的分布，本实施例测试了不同长度的PCL形成的不同粒径纳米胶束在脑内的分布。由于聚合物的端基修饰或侧链电荷一旦确定，疏水链长度对纳米胶束粒径的影响规律没有本质区别，因此本实施例具有不带电荷侧链的转铁蛋白修饰的纳米胶束为例进行测试。

1)转铁蛋白的巯基化

将转铁蛋白(Sigma)溶解于pH7.4的HEPES缓冲液中得到1mg/mL的溶液，按每毫克蛋白加入100μl 0.1M的羟胺(Sigma)的比例，将转铁蛋白巯基化2h，然后进行超滤纯化。用Ellman’s试剂(Sigma)测定转铁蛋白的巯基化程度，平均为2-3mol巯基/mol蛋白。

2)不同粒径的纳米胶束的制备

将30mg在实施例1中制备的未官能化的PPE-PCL(PPE聚合度均为41，PCL聚合度分别为32、78、231，不同PPE-PCL的合成参考Biomacromolecules2008年第9卷388-395进行)和10mg相应PCL长度的Mal-PPE-PCL分别溶解于200μl四氢呋喃中，各加入2mg紫杉醇搅拌均匀，向其中滴加入1mL去离子水，搅拌30min。随后将溶液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋中，用4L去离子水透析12h，除去其中的四氢呋喃。

3)转铁蛋白功能化纳米胶束制备

将步骤1)制备的巯基化转铁蛋白和步骤2)中制备的纳米胶束混合，以1∶1(巯基摩尔数∶马来酰亚胺基摩尔数)的比例反应6h，得到被巯基化转铁蛋白修饰的纳米胶束。用动态光散射法测定PCL聚合度分别为32、78、231的纳米胶束，其粒径分别为26.5±5.8nm、49.2±16.5nm和127.9±37.3nm，电势分别为-2.63±0.37mV、-1.89±0.38mV和-2.44±0.53mV。

4)静脉注射后三种纳米胶束在小鼠脑内的分布

将三种纳米胶束按照10mg紫杉醇/kg的剂量，尾静脉给予正常ICR小鼠，在给药1h后将小鼠断颈处死，取脑组织，按实施例2中组织处理方法处理，测定组织中的药物含量，以％ID/g脑组织表示。结果：三种纳米胶束在脑内药物浓度存在差异，随着粒径的增加，药物在脑内的分布逐渐降低，粒径最小的纳米胶束脑内分布为0.52±0.08％ID/g，中间大小的纳米胶束脑内分布为0.39±0.08％ID/g，最大的纳米胶束脑内分布为0.12±0.03％ID/g。

Claims (12)

1.一种基于聚磷酸酯的用于脑内递药的药物传递系统，其特征在于，该药物传递系统为包含药物和载体材料的纳米胶束；所述载体材料为两亲性聚合物，其包含亲水链段和疏水链段；且所述亲水链段为聚磷酸酯，所述疏水链段为聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸；

所述亲水链段的结构示意如下：

其中，

侧链R₁为乙基、2-氨基乙基或2-羧基乙基，

端基R₂为氢、马来酰亚胺基、巯基、氨基、羧基、酰肼基、生物素或亲和素，

n为10-200。

2.根据权利要求1所述的药物传递系统，其中，所述端基R₂任选地与脑靶向配体共价连接；所述脑靶向配体为阳离子白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白或抗转铁蛋白受体抗体。

3.根据权利要求2所述的药物传递系统，其中，基于所述载体材料的总摩尔数，所述脑靶向配体的修饰率为0.1-10％。

4.根据权利要求2所述的药物传递系统，其中，所述纳米胶束的粒径范围为10-500nm。

5.根据权利要求1或2所述的药物传递系统，其中，所述药物为香豆素-6、紫杉醇或替尼泊苷。

6.根据权利要求1或2所述的药物传递系统，其中，所述疏水链段的聚合度为20-1000。

7.一种制备权利要求1所述的药物传递系统的方法，该方法包括：

1)载体材料的制备：

a)通过R₁’-OH与2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷反应得到单体

其中，R₁’为-CH₃CH₃、-CH₂CH₂NH-Boc或-CH₂CH₂COOC₄H₉；

b)以疏水链段的末端羟基为引发基团，通过如下的单体(I)的开环聚合反应得到聚合物(II)，

其中，所述疏水链段为聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸，n为10-200；

c)聚合物(II)经脱保护得到

聚合物(III)，其中R₁的定义如权利要求1所述；

d)聚合物(III)通过下列反应生成所述载体材料

其中，R₂的定义如权利要求1所述：

当R₂为氢时，聚合物(III)即为所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与2-氨基马来酰亚胺通过酰胺键偶联得到R₂为马来酰亚胺基的所述载体材料，继续与巯基化亲和素偶联得到R₂为亲和素的所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与叔丁氧基羰基酰肼反应脱保护后得到R₂为酰肼基的所述载体材料，或与生物素分子上的羧基偶联得到R₂为生物素的所述载体材料，或者

聚合物(III)经羰基二咪唑活化后和二乙胺反应得到R₂为氨基的所述载体材料，然后与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯反应，脱保护后得到R₂为巯基的所述载体材料；

2)纳米胶束的制备：将药物与所述载体材料共同溶解于有机溶剂中，将水缓慢滴加入该有机溶剂中，按溶剂沉淀法或溶剂蒸发法制备纳米胶束。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、乙腈、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种或其混合物；所述载体材料与药物的质量比为10∶1-200∶1，所述载体材料在有机溶剂中的浓度为10-400mg/mL，所述水与有机溶剂的体积比为1∶1-50∶1。

9.一种制备权利要求2所述的药物传递系统的方法，该方法包括：

1)载体材料的制备：同权利要求7的步骤1)；

2)纳米胶束的制备：同权利要求7的步骤2)；

3)非必须地，脑靶向配体的处理：当所述纳米胶束的表面端基R₂为马来酰亚胺基或巯基时，需对该脑靶向配体进行表面功能化修饰，通过羟胺将该脑靶向配体表面的游离氨基转化为巯基；

4)通过所述纳米胶束表面的端基R₂使脑靶向配体与该纳米胶束共价连接：反应在pH 6-9的缓冲溶液中，氮气保护下，进行12-24h。

10.一种基于聚磷酸酯的用于脑内递药的载体材料，其特征在于，该载体材料为两亲性聚合物，其包含亲水链段和疏水链段；且所述亲水链段为聚磷酸酯，所述疏水链段为聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸；

所述亲水链段的结构示意如下：

其中，

侧链R₁为乙基、2-氨基乙基或2-羧基乙基，

端基R₂为氢、马来酰亚胺基、巯基、氨基、羧基、酰肼基、生物素或亲和素，

n为10-200。

11.根据权利要求10所述的载体材料，其中，所述疏水链段的聚合度为20-1000。

12.一种制备权利要求10或11所述的载体材料的方法，该方法包括：

a)通过R₁’-OH与2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷反应得到单体

其中，R₁’为-CH₃CH₃、CH₂CH₂NH-Boc或CH₂CH₂COOC₄H₉；

b)以所述疏水链段的末端羟基为引发基团，通过如下的单体(I)的开环聚合反应得到聚合物(II)，

其中，n的定义如权利要求10所述；

c)聚合物(II)经脱保护得到

聚合物(III)，其中，R₁的定义如权利要求10所述；

d)聚合物(III)通过下列反应生成所述载体材料

其中，R₂的定义如权利要求10所述，

当R₂为氢时，聚合物(III)即为所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与2-氨基马来酰亚胺通过酰胺键偶联得到R₂为马来酰亚胺基的所述载体材料，继续与巯基化亲和素偶联将得到R₂为亲和素的所述载体材料，或者

聚合物(III)通过在无水二氯甲烷中引发丁二酸酐开环得到R₂为羧基的所述载体材料，然后与叔丁氧基羰基酰肼反应脱保护后得到R₂为酰肼基的所述载体材料，或与生物素分子的羧基偶联得到R₂为生物素的所述载体材料，或者

聚合物(III)通过与活化后的羰基二咪唑和二乙胺反应得到R₂为氨基的所述载体材料，然后与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯反应脱保护后得到R₂为巯基的所述载体材料。

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