CN102321168B - 新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，将含有血小板生成素拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，将菌体超声破碎，尿素裂解，复性，调pH值，经Protein-AMabselectSuRe层析、SPSepharoseH.P层析和SephacrylS-200分子筛层析进行组合纯化，生产出符合中国药典规定的血小板生成素拟肽蛋白。本发明的有益效果是：复性率高，纯化工艺组合合理，操作程序简化，收率高，生产成本低，为血小板生成素拟肽大规模生产提供可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种血小板生成素拟肽的生产方法，特别涉及一种在大肠杆菌中表达的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法。
背景技术
慢性特发性血小板减少性紫癜（ITP）是一种自身性免疫性疾病，由致血小板减少的一种自身免疫反应引起，其特征是血小板数降低，其患者面临出血高风险，往往导致患者小血管出血，症状为淤青、鼻出血和牙龈出血，严重者可出现致命性胃肠道和脑内出血。目前治疗ITP的主要手段是使用免疫抑制类药物，如皮质类固醇、静注免疫球蛋白、抗D免疫球蛋白和Genentech公司产品利妥昔单抗，而对严重衰竭性病人的最后办法则是行脾切除术。其中大多数治疗药物未曾经历随机安慰剂对照临床试验的考察，虽对不同患者群均有效，但同时也会产生严重的毒副反应，其作用机制是阻止血小板破坏，而非促进血小板产生。
血小板生成素（TPO）为一种糖蛋白，主要产生于肝脏，在巨核细胞及血小板的产生中起着重要的调节作用。其与c-Mpl结合后可激活下游信号级联反应，从而导致巨核细胞的分化和增值，且伴随着血小板水平升高。第1代促血小板生成剂-糖基化全长重组人血小板生成素（rhTPO）和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长及发育因子（PEG-rHuMGDF）随之问世。其可促进健康受试者体内巨核细胞生成，并提高血小板数量，且在用于治疗癌症患者、免疫性血小板生成素减少性紫癜患者及接受非清髓性化疗的癌症患者的研究中均获得了成功。然而，第1代促血小板生成剂可能会导致受试者体内产生抗TPO抗体，因而具有诱发血小板减少症的风险，糖基化全长重组人血小板生成素（rhTPO）和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长及发育因子（PEG-rHuMGDF）的开发被迫停止。此后研究人员在多肽文库中寻找随机、无相关性的多肽，企图在不产生抗TPO抗体的情况下刺激依赖于TPO的细胞株，尝试将筛选得到的多肽连接于各种载体分子，以增加其半衰期。由此开发出以重组血小板拟肽为代表的第2代促血小板生成剂。此产品在健康受试者及ITP患者中的试验均获得了成功，且试验中亦未见受试者体内产生抗TPO抗体。
血小板生成素拟肽为一种新型重组蛋白，可特异性结合并激活血小板生成素（TPO）受体c-Mpl，从而显著提高血小板水平。血小板生成素拟肽含有两个相同的亚单位，每个亚单位分别由一个IgG1 Fc结构区和c-Mpl结合区共价结合构成，且与TPO无氨基酸序列同源性，故不会在用药者体内产生抗TPO抗体。其主要用于治疗脾切除及非脾切除的成人免疫性血小板减少症。但是，目前尚无适合大规模生产血小板生成素拟肽的生产工艺。
发明内容
为了血小板生成素拟肽大规模生产，本发明实施例提供了一种新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）超声破菌：每克菌体加入10ml预冷TE 缓冲液，所述缓冲液为50mM Tris-Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5，混匀后加入溶菌酶至菌体的浓度为1%，充分混匀，温度保持在2~8℃，作用1小时以上；超声破菌2min/次，共6次；然后在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；
（2）TE缓冲液洗涤：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5% tritron-100 TE缓冲液洗涤，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述缓冲液为50mM Tris-Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5；
（3）室温裂解：将步骤（2）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入包涵体裂解液中，搅匀，室温裂解1小时；所述包涵体裂解液为6M盐酸胍、50mM Tris-Hcl和8mM DTT中的一种或多种，所述包涵体裂解液的pH值为9.0；
（4）复性：将步骤（3）裂解后的混合溶液滴加至复性液中，稀释后的蛋白浓度为1~2mg/ml，在2~8℃的温度下搅拌48小时，再用pH9.0的10mM Tris-Hcl和1.5M尿素稀释1~5倍；
（5）调节PH和离心：用醋酸调节pH值至5.0，离心去除沉淀物，收集溶液；
（6）将溶液依次进行Protein-A Mabselect SuRe层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S-200分子筛层析。
其中，上述步骤（6）中的所述Protein-A Mabselect SuRe层析如下进行：先用pH值为8.5的含2M脲的50mM的Tris-Hcl，平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子3~5个柱体积，上样，再用pH值为8.5的含2M脲的50mM Tris-Hcl，充分平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2~3个柱体积，然后用pH值为7.2的含20mM PBS的缓冲液平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2~3个柱体积，最后用pH3.0的含50mM 醋酸-醋酸钠的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
上述步骤（6）中的所述SP Sepharose H.P层析如下进行：用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，充分平衡SP Sepharose H.P柱子，上样，再用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡柱子，然后用pH值为5.0的含210mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱杂质，最后用pH值为5.0的含300mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
上述步骤（6）中的所述Sephacryl S-200分子筛层析如下进行：用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡Sephacryl S-200分子筛柱子3-5个柱体积，上样，上样量为柱床体积的1~5%，用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，收集目的蛋白峰。
上述Sephacryl S-200分子筛层析中，所述上样量优选为柱床体积的3%。
上述步骤（2）为：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5% tritron-100 TE缓冲液洗涤，在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述缓冲液为50mM Tris-Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5。
上述步骤（4）中，所述稀释后的蛋白浓度为1.5mg/ml，和/或用pH9.0的 10mM Tris-Hcl和1.5M尿素稀释3倍。
上述步骤（4）中，所述复性液包括1~3M尿素、50mM Tris-Hcl、1~10mM 还原性谷胱甘肽和1mM氧化性谷胱甘肽中的一种或多种，所述复性液的pH值为8.0~9.0。
上述步骤（4）中，所述复性液包括2M尿素、50mM Tris-Hcl、2mM 还原性谷胱甘肽和1mM氧化性谷胱甘肽的一种或多种，复性液的pH值优选为8.5。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：复性工艺采用稀释的复性方法，其复性率在30%-40%之间；同时建立了一种新型血小板生成素拟肽分离纯化方法，整个层析过程采用Protein-A Mabselect SuRe 层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S-200分子筛层析，三种不同分离机制的层析组合，具有很好的纯化效果，可以去除绝大部分的杂蛋白、热源、核酸片段和二聚体等杂质，纯化出的原液收率在20~30％之间，相当于每升发酵液可获得血小板生成素拟肽纯品为300mg左右，比活在1.0×106IU/mg以上，各项指标均符合药典中的相关规定，且易于产业化放大，此外，整个工艺组合合理，不需要其他处理过程，操作简单，工艺稳定。
附图说明
图1 血小板生成素拟肽原液高效液相纯度检测分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，将含有血小板生成素拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，取出后对菌体进行洗涤：融化，加入预冷的TE缓冲液，搅匀，在4℃的温度下以 4000转/分钟的转速离心20分钟，弃上清留沉淀，除出发酵培养基中残留的培养基成分；然后进行以下步骤：
（1）超声破菌：每克菌体加入10ml预冷TE 缓冲液，缓冲液为50mM Tris-Hcl和5mM EDTA，缓冲液的pH值为8.5，混匀后加入溶菌酶至菌体的浓度为1%，充分混匀，温度保持在2~8℃，作用1小时以上；超声破菌2min/次，共6次；然后在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀。通过溶菌酶和超声破碎仪，提取血小板生成素拟肽包涵体。
（2）TE缓冲液洗涤：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5% tritron-100 TE缓冲液洗涤，在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；其中，缓冲液为50mM Tris-Hcl和5mM EDTA，缓冲液的pH值为8.5；TE缓冲液洗涤可以除去蛋白酶，防止在后续的纯化中蛋白质的不稳定，还可以去除核酸和脂类物质以及可溶性的细胞蛋白和其他组分。
（3）室温裂解：将步骤（2）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入包涵体裂解液中，搅匀，室温裂解1小时；其中，包涵体裂解液为6M盐酸胍、50mM Tris-Hcl和8mM DTT，包涵体裂解液的pH值为9.0；通过包涵体裂解液将错配的无活性的包涵体溶解，为重新复性做准备。
（4）复性：将步骤（3）裂解后的混合溶液滴加至复性液中，稀释后的蛋白浓度为1.5mg/ml，在2~8℃的温度下搅拌48小时，再用pH9.0的10mM Tris-Hcl和1.5M尿素稀释3倍；其中，复性液包括2M尿素、50mM Tris-Hcl、2mM 还原性谷胱甘肽和1mM氧化性谷胱甘肽，复性液的pH值为8.5；将溶解的无活性的血小板生成素拟肽包涵体重新复性成有活性的血小板生成素拟肽。
（5）调节pH和离心：用醋酸调节pH至5.0，离心去除沉淀物，收集溶液；血小板生成素拟肽在pH=5.0时稳定，其他杂蛋白不稳定而产生沉淀，通过离心，去除沉淀的杂蛋白，达到纯化的目的。
（6）将溶液依次进行Protein-A Mabselect SuRe 层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S-200分子筛层析。
步骤（6）中的Protein-A Mabselect SuRe 层析如下进行：先用pH值为8.5的含2M脲的50mM的Tris-Hcl，平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子3~5个柱体积，上样，再用pH值为8.5的含2M脲的50mM Tris-Hcl，充分平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2~3个柱体积，然后用pH值为7.2的含20mM PBS的缓冲液平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2~3个柱体积，最后用pH3.0的含50mM醋酸-醋酸钠的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
步骤（6）中的SP Sepharose H.P层析如下进行：用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，充分平衡SP Sepharose H.P柱子，上样，再用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡柱子，然后用pH值为5.0的含210mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱杂质，最后用pH值为5.0的含300mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
步骤（6）中的Sephacryl S-200分子筛层析如下进行：用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡Sephacryl S-200分子筛柱子3-5个柱体积，上样，上样量为柱床体积的3%，用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，收集目的蛋白峰。
根据中国药典有关规定对三批血小板生成素拟肽原液进行了相关检测，具体项目如下：
生物学活性测定：用Mo7e细胞增值法/MTT法，用重组人血小板生成素拟肽参考品校准。
蛋白含量:采用Lowry法，使用国家药品食品检定院提供的人血白蛋白为标准品。
高效液相色谱纯度:采用HPLC-C8反相柱（Waters（USA）），10%~80％含0.1%TFA乙腈梯度，流速为1ml/min，检测为280nm。所得原液的纯度应不小于95%，检测结果如图1所示。
分子量测定:采用还原型SDS-PAGE电泳法，加样量应不低于1.0μg，分子量应为59KD±5.9KD。
菌体蛋白质残留量：采用ELISA酶标法，宿主菌蛋白残留量不得超过总蛋白的0.05%。
?肽图测定：采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法，应与血小板生成素拟肽对照品一致。
?N-末端氨基酸序列：用氨基酸序列分析仪测定，应为M D K T H T C P P C P A P E L。
三批血小板生成素拟肽成品检测结果如表1所示，由表1的各项检测结果可知，各项指标均符合药典中的相关规定。此外，纯化出的原液收率在20～30％之间，相当于每升发酵液可获得血小板生成素拟肽纯品为300mg左右，血小板生成素拟肽最高规格为0.5mg，每升发酵液可得成品600支左右，完全可以满足生产的需要，为血小板生成素拟肽大规模生产提供可能。
表1血小板生成素拟肽成品检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）超声破菌：将含有血小板生成素拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，每克菌体加入10ml预冷的TE缓冲液，所述TE缓冲液为含有5mM EDTA的50mM Tris-HCl，pH值为8.5，混匀后加入溶菌酶至溶菌酶的浓度为1%（重量/体积），充分混匀，温度保持在2～8℃，作用1小时以上；超声破菌2min/次，共6次；然后在2～8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；所述血小板生成素拟肽含有两个相同的亚单位，每个亚单位由一个IgG1Fc结构区和c-Mpl结合区共价结合构成；
（2）TE缓冲液洗涤：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5%Tritron X-100的TE缓冲液洗涤，在2～8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述TE缓冲液为含有5mM EDTA的50mM Tris-HCl，pH值为8.5；
（3）室温裂解：将步骤（2）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入包涵体裂解液中，搅匀，室温裂解1小时；所述包涵体裂解液的组成为6M盐酸胍、50mM Tris-HCl和8mM DTT，所述包涵体裂解液的pH值为9.0；
（4）复性：将步骤（3）裂解后的混合溶液滴加至复性液中，稀释后的蛋白浓度为1～2mg/ml，在2～8℃的温度下搅拌48小时，再用pH9.0的10mM Tris-HCl和1.5M尿素稀释1～5倍；所述复性液的组成为1～3M尿素、50mM Tris-HCl、1～10mM还原型谷胱甘肽和1mM氧化型谷胱甘肽，所述复性液的pH值为8.0～9.0；
（5）调节PH和离心：用醋酸调节pH值至5.0，离心去除沉淀物，收集溶液；
（6）将溶液依次进行Protein-A Mabselect SuRe层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S-200分子筛层析。
2.根据权利要求1所述的血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（6）中的所述Protein-A Mabselect SuRe层析如下进行：先用pH值为8.5的含2M脲的50mM的Tris-HCl，平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子3～5个柱体积，上样，再用pH值为8.5的含2M脲的50mM Tris-HCl，充分平衡Protein-AMabselect SuRe柱子2～3个柱体积，然后用pH值为7.2的含20mM PBS的缓冲液平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2～3个柱体积，最后用pH3.0的含50mM醋酸-醋酸钠的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
3.根据权利要求1所述的血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（6）中的所述SP Sepharose H.P层析如下进行：用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，充分平衡SP Sepharose H.P柱子，上样，再用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡柱子，然后用pH值为5.0的含210mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱杂质，最后用pH值为5.0的含300mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
4.根据权利要求1所述的血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（6）中的所述Sephacryl S-200分子筛层析如下进行：用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡Sephacryl S-200分子筛柱子3-5个柱体积，上样，上样量为柱床体积的1～5%，用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，收集目的蛋白峰。
5.根据权利要求4所述的血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，在所述Sephacryl S-200分子筛层析中，所述上样量为柱床体积的3%。
6.根据权利要求1所述的血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（4）中复性液包括2M尿素、50mM Tris-HCl、2mM还原性谷胱甘肽和1mM氧化性谷胱甘肽，所述复性液的pH值为8.5。
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