CN102329864A

CN102329864A - 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102329864A
Application number: CN201110275661A
Authority: CN
Inventors: 盘宝进; 温和心; 谢永平
Original assignee: BEIJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU INSPECTION QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER
Current assignee: BEIJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU INSPECTION QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-01-25

Abstract

本发明涉及一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，试剂盒中的试剂包括前引物、后引物、TaqMan探针、荧光PCR预混液、ROX液、纯水和阳性标准液；前引物、后引物和TaqMan探针是根据小肠结肠炎耶尔森氏菌特异、保守基因核酸序列合成并能与之特异结合的20～21碱基的DNA片段。本发明还提供了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括了以下步骤：样品前处理；用试剂盒的试剂进行检测；分析检测结果。本试剂盒简便快捷、灵敏准确、适用于大量样本检测。

Description

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR检测分析技术领域，尤其涉及了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR试剂及方法。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌能致人和其它多种动物发生胃肠炎、关节炎、败血症及结节性红斑等病，是非常重要的人畜共患病病原。该细菌在我国的分布非常广泛，从人群、动物、外环境和食品都可以分离出病原菌。该病与人们日常生活关系密切，流行病学研究表明，小肠结肠炎耶尔森氏菌能在冷藏温度下生长繁殖，故冰箱是耶尔森氏菌小肠结肠炎重要的传染源，俗称“冰箱菌”。

传统的分离鉴定方法检验小肠结肠炎耶尔森氏菌，从中温增菌到确定细菌的血清型、生物型大约需要1周的时间，不仅费力而且需要时间长。近年在PCR基础上发展起来的荧光定量PCR不仅继承了传统PCR的优点，避免了其检测过程容易污染环境容易造成假阳性的缺点，具有检测过程简便快速，结果敏感特异等特点。PCR是聚合酶链式反应英文缩写，其英文全称为Polymerase Chain Reaction，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。如公开号CN101200760A（申请号200710115174.2）公开了耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。该专利公开的试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、BstDNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-CCGGTTTGATCGGTTTCGCCCACAAGATGGGTGTGCC-3、下游内引物5-GTGCGTTTCTGGCCGAGCTTGCAGACGTTTTGCCAGGATT-3、上游外引物5-CGCCGTGAAGGTAAAGTTCA-3、下游外引物5-CAGAGTTCAGGAACGACAGC-3和甜菜碱；检测方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、耶尔森氏菌的环介导等温扩增反应和显色检测。《农产品加工》2008(11).-37-37报道，瑞典和芬兰的研究人员建立了一种新型食品检测方式，可快速、精确地对食物携带的病菌进行探查，这将为食品安全的监督提供有效帮助。研究人员利用TaqMan探针实时定量PCR（聚合酶链反应）法对食物中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行探查，但是没有具体研究内容。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便快速、灵敏准确、适用于大量样本检测的小肠结肠炎耶尔森氏菌试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，试剂盒中的试剂包括前引物、后引物、TaqMan探针、荧光PCR预混液、ROX校正液、纯水和阳性标准液；所述前引物的核酸序列是5’-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3’，所述后引物的核酸序列是5’-ATCCCAATCACTACTGACTTC-3’，所述TaqMan探针的核酸序列是5’-CAAGCAAGCTTG TGATCCTCCG-3’；所述前引物、后引物和TaqMan探针的摩尔数比为1:1:1；

所述的前引物、后引物和TaqMan探针是根据小肠结肠炎耶尔森氏菌特异、保守基因核酸序列合成并能与之特异结合的20～21碱基的DNA片段，TaqMan探针5’端用荧光基团异硫腈酸荧光素标记，3’端用淬灭基团标记。

所述TaqMan探针的5’端标记物为6-羧基琥珀酰亚胺酯,3’端标记物为6-羧基四甲基若丹明。

所述荧光PCR预混液包括PCR 扩增缓冲液，DNA 聚合酶和镁离子，和dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 4种脱氧核苷混合物。此荧光PCR预混液可以在市场上购买得到。

所述荧光PCR预混液含4 种dNTP 的摩尔数配比为dATP:dCTP:dGTP:dTTP=l:l:l:l。

所述试剂盒的荧光PCR 扩增的目标模板为小肠结肠炎耶尔森细菌DNA。

所述试剂盒的PCR反应程序是95℃ 30秒酶活化后，95℃ 5～10秒变性，60℃ 30～60秒退火、延伸、荧光信号采集，35～40个循环。

所述纯水为三蒸水或去离子水，所述阳性标准液的菌体浓度为10⁷cfu/ml，所述ROX校正液的主要成分是罗丹明，罗丹明是可用作生物荧光染色剂的一种由三苯甲烷衍生的染料，其别名有：玫瑰红123和2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester。

所述试剂盒的待测样品为食品、环境样品或排泄物。

本发明所述试剂盒中前引物、后引物、TaqMan探针为干粉状态，使用前加入100微升（μL）纯水，其它试剂均为工作液可直接使用，试剂盒储存条件是-20℃，有效期一年，运输条件是4℃～8℃，时间不超过72小时。

本发明的检测原理：根据小肠结肠炎耶尔森氏菌特有的、稳定的一个基因片段，合成能与之特异结合的前、后引物和标记有荧光-淬灭基团的DNA探针，当样品中有目标基因存在时，前后引物与之结合后，在DNA聚合酶的作用下对目标基因进行复制，同时荧光探针也与目标基因结合，在DNA聚合酶外切功能的作用下，探针被酶解，结合在探针两端上的荧光和淬灭基团被释放开来，荧光素脱离淬灭基团而发光，随着基因复制几何级数的增加，释放的荧光也几何级数地累积，通过监测反应液中荧光变化的来判断反应液中是否有目标基因，或基因含量多少。规定一定的荧光强度为阈值，当反应产生的荧光强度达到该阈值时所用循环数为Ct值，该值与样品目标基因含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出小肠结肠炎耶尔森氏菌的浓度。

荧光PCR 是现代化实验室常用的检测技术，是在普通PCR基础上增加一组敏感的光电检测元件，直接检测反应管内信号，无须普通PCR电泳步骤，节省时间和试剂，对环境无污染。本发明所述试剂盒进行检测方法如下：

1. 从-20℃冷冻环境中取出所需试剂，置室温（20～25℃）中直至完全融化，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2. 细菌DNA提取纯化：用酚-氯仿裂解细菌，分离核酸，用酒精洗涤纯化核酸，最后用超纯水溶解核酸即可用于荧光PCR检测。

3. 配液：根据阳性标准液和样品总量n吸取荧光PCR预混液10（n+1）μL，前引物、后引物、TaqMan探针、ROX液各0.4（n+1）μL,纯水6.4（n+1）μL，将以上液体在离心管中充分混匀，再分装入荧光PCR反应管中，18μL/管（因为液体分装误差所以多配1份）。

4. 编号：将阴阳性标准和样本对应管按序编号，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5. 加样：加阴阳性标准/样本 2μl/孔到各自的反应管中，盖紧盖子或板膜封板，将管壁的液体甩下。

6. 上机：开启荧光PCR仪，按下弹出样品仓，将加好反应液的反应管插入卡槽，关上仓门。

7. 参数设置：TaqMan探针模式，发光基团FAM，淬灭基团TAMRA，反应体积20μL。

反应程序设置：95℃ 30秒酶活化后，95℃ 5～10秒变性，60℃ 30～60秒退火、延伸、荧光信号采集，35～40个循环。

8. 检测：启动反应程序后，仪器进入反应-检测状态，并实时显示检测结果。

9. 结果判定

结果判定有两种方法，阴阳性判定可用第（1）种方法，定量判定用第2种方法。注意样本Ct值与其小肠结肠炎耶尔森氏菌浓度成反比。

（1）阴阳性判定

扩增曲线呈“S”形，且Ct值≤38判定为阳性，无Ct值判为阴性， Ct值>38判为可疑，可疑样品进行第二次检测，扩增曲线呈“S”形且Ct值≤40判为阳性，无Ct值判为阴性。

（2）定量分析

以标准品的Ct值为纵坐标，以标准品的浓度对数为横坐标，绘制标准曲线图，见图1。将样本的Ct值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中小肠结肠炎耶尔森氏菌实际浓度。

与现有技术相比，本发明的优点：

1.检测过程简便快捷，整个过程仅需2小时，传统的细菌培养法则要4天。

2.闭管反应和检测，不污染环境，反应过程能实时监测结果，避免了普通PCR试剂盒操作繁琐，容易污染环境造成假阳性结果。

3.灵敏度高，检测灵敏度是普通PCR试剂盒的100倍。

附图说明

图1为小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测标准曲线图，横坐标表示细菌标准品浓度对数，纵坐标表示细菌标准品Ct值。

图2为小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒特异性试验图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1：

本发明的小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，试剂盒中的试剂包括核酸序列为5’-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3’的前引物、核酸序列为5’-ATCCCAATCACTACTGACTTC-3’的后引物、核酸序列为5’-CAAGCAAGCTTGTGATCCTCCG-3’ 的TaqMan探针、PCR 扩增缓冲液，含DNA 聚合酶、镁离子及dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 4种脱氧核苷的混合液体、去离子水和菌体浓度为10⁷cfu/ml的阳性标准液。而TaqMan探针的5’端标记物为6-羧基琥珀酰亚胺酯,3’端标记物为6-羧基四甲基若丹明；其中前引物、后引物和TaqMan探针的摩尔数比为 1:1:1；4种dNTP的摩尔数配比为dATP:dCTP:dGTP:dTTP=l:l:l:l。这便是本发明的用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒。

实施例2：粪便样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的定量检测

1.细菌DNA提取

（1）加入样品4倍量的磷酸盐缓冲液（PBS）与粪便样品充分混匀，100℃水浴15分钟，8000rpm（每分钟转数），离心5min，取500μL上清夜，加50μL 10%十二烷基硫酸钠（SDS），20μL蛋白酶K，50℃水浴1h，15min摇一次。

（2）加入等量苯酚，摇匀，10000rpm，离心5min。

（3）取上清液，加入苯酚、氯仿各300μL，摇匀，10000rpm，离心5min。

（4）取上清液（不能吸入杂物），加等量氯仿混匀，10000rpm，离心5min。

（5）取上清液（不能吸入杂物），加入1000μL冷冻的无水乙醇，再加1/10体积，3mol/L的NaAc，置-20℃沉淀30min。

（6）10000rpm，离心15min，沉淀DNA，轻弃上清，用75%酒精500μL冲洗两次，37℃烘干，之后加入30μL双蒸水溶解用于加样检测。

2.用试剂盒检测

从-20℃冷冻环境中取出所需试剂，置室温（20～25℃）中直至完全融化，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。

配液：根据阴阳性标准和样品总量n吸取荧光PCR预混液10（n+1）μL，前引物、后引物、TaqMan探针、ROX液各0.4（n+1）μL,纯水6.4（n+1）μL，将以上液体在离心管中充分混匀，再分装入荧光PCR反应管中，18μL/管（因为液体分装误差所以可以多配1份）。

编号：将阴阳性标准和样本对应微孔按序编号，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

加样：加阴阳性标准/样本 2μl/孔到各自的反应管中，盖紧盖子或板膜封板，将管壁的液体甩下。

上机：开启荧光PCR仪，按下弹出样品仓，将加好反应液的反应管插入卡槽，关上仓门。

设置参数：TaqMan探针模式，发光基团FAM，淬灭基团TARAMA，反应体积20μL。

反应程序：95℃ 30秒酶活化后，95℃ 5秒变性，60℃ 30秒退火、延伸、检测，35个循环。

检测：启动反应程序后，仪器进入反应-检测状态，并实时显示检测结果。

3. 检测结果分析

以标准品的Ct值为纵坐标，以标准品的浓度对数为横坐标，绘制标准曲线图（图1），将样本的Ct值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中小肠结肠炎耶尔森氏菌实际浓度。

实施例3：食品样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的定量检测

1.细菌DNA提取

（1）加入样品4倍量的磷酸盐缓冲液（PBS）与食品样品研磨匀浆，100℃水浴15分钟，8000rpm（每分钟转数），离心5min，取500μL上清夜，加50μL 10%十二烷基硫酸钠（SDS），20μL蛋白酶K，50℃水浴1h，15min摇一次。

（2）加入等量苯酚，摇匀，10000rpm，离心5min。

2.用试剂盒检测

配液：根据阴阳性标准和样品总量n吸取荧光PCR预混液10（n+1）μL，前引物、后引物、TaqMan探针、ROX校正液各0.4（n+1）μL,纯水6.4（n+1）μL，将以上液体在离心管中充分混匀，再分装入荧光PCR反应管中，18μL/管（因为液体分装误差所以可以多配1份）。

反应程序：95℃ 30秒酶活化后，95℃ 7秒变性，60℃ 45秒退火、延伸、检测，38个循环。

3. 检测结果分析

实施例4：环境样品（如土壤、冰箱污垢）中小肠结肠炎耶尔森氏菌的定量检测

1.细菌DNA提取

（1）加入样品4倍量磷酸盐缓冲液（PBS）与环境样品充分研磨匀浆，100℃水浴15分钟，8000rpm（每分钟转数），离心5min，取500μL上清夜，加50μL 10%十二烷基硫酸钠（SDS），20μL蛋白酶K，50℃水浴1h，15min摇一次。

（2）加入等量苯酚，摇匀，10000rpm，离心5min。

2.用试剂盒检测

配液：根据阴阳性标准和样品总量n吸取荧光PCR预混液10（n+1）μL，前引物、后引物、TaqMan探针、ROX校正液各0.4（n+1）μL,纯水6.4（n+1）μL，将以上液体在离心管中充分混匀，再分装入荧光PCR反应管中，18μL/管（因为液体分装误差所以多配1份）。

反应程序：95℃ 30秒酶活化后，95℃ 10秒变性，60℃ 60秒退火、延伸、检测，40个循环。

3. 检测结果分析

实施例5：试剂盒的特异性试验：

特异性是指引物、探针对待测物的识别能力，强调引物、探针与待测物间结合反应的专一性和对结构相近或相关物质的区分能力。特异性取决于待测物与其他物质的交叉反应。

按本试剂盒的检测方法分别对小肠结肠炎耶尔森氏菌，大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，琏球菌（均购自中国医学细菌保藏管理中心）纯培养物提取DNA后进行荧光PCR检测，结果见表1和附图2。

表1 试剂盒的特异性

细菌	小肠结肠炎耶尔森氏菌	大肠杆菌	沙门氏菌	志贺氏菌	琏球菌
						荧光PCR检测	+	-	-	-	-

试剂盒只对小肠结肠炎耶尔森氏菌反应，与常见肠道菌大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、琏球菌无交叉反应，表明本试剂盒具有高度特异性。

实施例6：试剂盒的灵敏度试验

将经过计数的菌液稀释成10⁸～10⁰cfu/ml 8个系列浓度，用实施例1中DNA提取方法提取DNA用于荧光PCR检测，用出现阳性反应的细菌最低浓度为试剂盒的灵敏度。结果见表2。

表2 试剂盒的敏感度

菌浓度cfu/ml

10⁷

10⁶

10⁵

10⁴

10³

10²

10¹

10⁰

Ct值

＋

-

测试表明，试剂盒最低能检测出浓度1cfu/ml的小肠结肠炎耶尔森氏菌。

Claims

1.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：试剂盒中的试剂包括前引物、后引物、TaqMan探针、荧光PCR预混液、ROX校正液、纯水和阳性标准液；所述前引物的核酸序列是5’-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3’，所述后引物的核酸序列是5’-ATCCCAATCACTACTGACTTC-3’，所述TaqMan探针的核酸序列是5’-CAAGCAAGCTTGTGATCCTCCG-3’；所述前引物、后引物和TaqMan探针的摩尔数比为1:1:1；

2.根据权利要求1所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述TaqMan探针的5’端标记物为6-羧基琥珀酰亚胺酯，3’端标记物为6-羧基四甲基若丹明。

3.根据权利要求1 所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光PCR预混液包括PCR 扩增缓冲液，DNA 聚合酶和镁离子，和dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 4种脱氧核苷混合物。

4.根据权利要求1所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光PCR预混液含4 种dNTP 的摩尔数配比为dATP:dCTP:dGTP:dTTP=l:l:l:l。

5.根据权利要求1所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的荧光PCR 扩增的目标模板为小肠结肠炎耶尔森细菌DNA。

6.根据权利要求1所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应程序是95℃ 30秒酶活化后，95℃ 5～10秒变性，60℃ 30～60秒退火、延伸、荧光信号采集，35～40个循环。

7.根据权利要求1 所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述纯水为三蒸水或去离子水，所述阳性标准液的菌体浓度为10⁷cfu/ml。