CN102327259A

CN102327259A - 具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂

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Publication number: CN102327259A
Application number: CN201110078790A
Authority: CN
Inventors: 姜国辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2012-01-25

Abstract

本发明涉及一种具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂，由如下重量比例的原料组成：甘氨酸：15-18份；精氨酸：12-15份；半胱氨酸：15-18份；谷氨酰胺：16-18份；S-腺苷甲硫氨酸：7-10份；α-硫辛酸：7-12份。本发明对各种原因导致的肝损害均具有良好的治疗和预防作用，有效率(显效率)为98.6％，治愈率为76.8％。

Description

具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂

技术领域

本发明是涉及一种对化学性肝损伤有显著保护功能的复合生物制剂。

背景技术

中国是肝病高发大国，每年因各种肝脏疾病所支出的医疗费用高达500亿元人民币。化学性肝损伤及各种原因造成的脂肪肝成为我国越来越高发的常见疾病，流行病学研究表明中国人脂肪肝发病率约为22～25％，其发病率随着人们生活水平的提高而逐渐上升。例如临床流行病学研究表明：山东省人口化学性肝损伤及各种原因造成的脂肪肝发病率约为33～35％，北京市人口化学性肝损伤及各种原因造成的脂肪肝发病率约为25％，上海市人口化学性肝损伤及各种原因造成的脂肪肝发病率约为20％，深圳市人口化学性肝损伤及各种原因造成的脂肪肝发病率约为17％。肝细胞变性中度或重度脂肪肝如果不及时治疗，十年内发展成肝纤维化及肝硬化的比例高达70％，约20％-30％的肝硬化病人最终将发展成肝癌病人。

利用化学合成药物保肝解毒尽管是一条潜在的途径，但由于须对该药物进行代谢转化，这将对本已受损脆弱的肝脏造成更大的负荷。从目前已经采用的化学药物(如硫普罗宁等)及其它保健品(如水飞蓟等)的临床疗效及辅助保护化学性肝损伤的功效看，普遍都不理想。从天然存在的生化产物中寻找保护肝脏预防酒精或其它化学物质中毒，促进其代谢、排泄的新型内源性生物大分子复合抗氧化剂成为预防及治疗脂肪肝及代谢紊乱综合征的最佳选择。国际学术界公认，阻止或预防活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)和活性氮自由基(RNS)攻击，阻断核转录因子NF-κB(Nuclear transcipton factor，NF-κB)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转移生长因子β(Transforming Growth Factor β，TGF-β)及白介素等细胞因子的诱发释放是预防及治疗脂肪肝及代谢紊乱综合征的关键，调整肝细胞氧化还原代谢，给予强效抗氧化剂清除ROS及毒性细胞因子成为国际学术界公认的未来治疗纠正化学性肝损伤及各种原因造成的脂肪肝及代谢紊乱综合征的主要研发方向。

到目前为止，国内外对不同原因引起的肝损伤尚无良好的治疗办法，一系列的检索结果表明，国内外包括西方主要发达国家美国、英国、德国、意大利、法国、日本、澳大利亚、加拿大等尚无注册的有关高效治疗肝损伤的技术、知识产权及通过FDA认可的药物。目前，国内外有一些使用氨基酸辅助治疗肝损伤或具有其他保健作用的报道，大多采用一种或几种氨基酸组成的配方，如：由赖氨酸、色氨酸、蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸等组成的瑞年牌营养食品片，主要声称保健功能为保持旺盛精力、改善睡眠、提高免疫力等，未提及对化学性肝损伤有疗效，而且每100份仅含氨基酸43.6g份。目前市面上销售的海王金樽片主要以牡蛎精粉、维生素C、L-半胱氨酸、牛黄酸、淀粉、蔗糖等为主要成分，功效成分为粗粉糖及牛黄酸，其中牛磺酸为每百份仅0.846份含量，经近年来市场检验，有一定的解酒功效，这种营养食品片主要对肝脏有一定的辅助保护作用，但是对化学性肝损伤治疗效果不明显；专利申请号为200610102355.7的中国专利申请中公开了以自然界所存在的所有20种氨基酸中任意几种氨基酸混合，再配合自然界存在的所有维生素中任意几种维生素混合、再加几种微量元素为配方的治疗脂肪肝、酒精肝、降血脂、降转氨酶的药物，其特征在于按重量比例：氨基酸30-60份，维生素10-30份，微量元素2-5份为配方，经过我们多年的试验研究发现，各种氨基酸以任意几种、任意比例配合后对肝病治疗没有实际效果，更达不到该申请所宣称的显效率为83％。

国内外对不同原因引起的肝损伤尚无良好的治疗办法，治愈率和有效率较低。例如，在2006年6月中旬在美国华盛顿召开的世界内分泌及糖尿病学术大会最新报道，目前，在美国，脂肪肝治疗6个月的有效率仅为43.6％(脂肪肝是糖尿病常见的并发症之一)，在这次世界内分泌及糖尿病学术大会上，明确把脂肪肝归类为代谢紊乱综合症之一。寻找预防与治疗脂肪肝及代谢紊乱综合征的有效药物是全世界生物医学科学家聚焦的热点研究领域之一。

发明内容

本发明的目的主要针对现有技术的缺点，提供一种通过对脂肪肝的分子病理学、预防及治疗化学性肝损伤、脂肪肝的分子生物学机制及潜在途径研究、对多种高效天然活性抗氧化有效成份进行药理学、毒理学、分子生物学研究实验的最佳配方。

本发明的技术方案为：一种具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂，由如下重量比例的原料组成：

本发明的有益效果为：本发明对天然抗氧化有效成分进行了药理学、毒理学、分子生物学的研究，几经筛选、优化与有效成分的组合，具有极其显著的保护肝脏、抗氧化、调节代谢、抑制炎症和逆转脂肪肝的病理过程等作用，尤其对酒精性脂肪肝治疗效果更为显著。本发明通过改变和多重调整肝细胞的代谢途径、多位点阻止活性氧化自由基(ROS)攻击，使细胞内抗氧化能力增加，明显升高细胞内抗氧化GSH含量，抑制肝脏星形细胞、巨噬细胞诱导α-肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎性因子释放，抑制炎症反应和细胞凋亡过程，抵抗体内外化学毒素导致的肝损伤，能够显著改善肝脏功能。本发明具有极强的抗氧化和抑制炎症作用，S-腺苷甲硫氨酸及抗氧化剂半胱氨酸对脂多糖(LPS)诱导TNF-α、白介素IL-6、IL-10有直接调节作用，有助于促进有害物(如酒精等化学物质)的排泄、稳定和调节肝细胞代谢，降低酒精损伤诱导的肝脏转氨酶(AST、ALT)升高，逆转和修复肝脏结构与功能。本发明对各种原因导致的肝损害均具有良好的治疗和预防作用，有效率(显效率)为98.6％，治愈率为76.8％。

附图说明

图1为甲硫氨酸代谢途径

图2为实验一、SAMe，L-半胱氨酸对LPS诱导的血清肿瘤转移因子(TNF-α)及转氨酶ALT的影响的对比图表

图3为实验二、SAMe、半胱氨酸与α-硫辛酸对鼠RAW细胞白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)的影响的对比图表

图4为实验三、SAMe与半胱氨酸对LPS刺激的RAW细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)释放的影响的对比图表

图5为谷氨酰胺、精氨酸对小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT，U/L)的影响图表

图6为在532nm吸收波测定TBARS在肝组织中的含量图表

图7为实验五、甘氨酸对脂多糖(LPS)诱导的大鼠体内转氨酶及肿瘤坏死因子TNF-α生成与释放的影响的对比图表

图8为本发明配方对线粒体GSH、TBARS、ALT的影响对比图表

图9为对大鼠血清ALT及TNF-α含量的影响对比图表

图10为本发明对脂肪肝患者代谢的影响图表

图11为本发明对脂肪肝患者肝功能的影响图表

图12为本发明对肾功能的影响图表

图13为本发明对中度脂肪肝代谢的影响图表

图14为本发明对中度脂肪肝患者肝功能的影响图表

图15为本发明对重度脂肪肝患者肝功能的影响图表

图16为本发明对重度脂肪肝患者特殊炎性因子的影响图表

图17为本发明对酒精性脂肪肝患者肝功能的影响图表

图18为本发明对非酒精性脂肪肝患者肝功能的影响图表

图19本发明对不同类型及不同程度脂肪肝的临床综合疗效图表

具体实施方式

具体实施例1：

一种具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂，由如下重量比例的原料组成：甘氨酸15份；精氨酸12份；半胱氨酸15份；谷氨酰胺16份；S-腺苷甲硫氨酸7份；α-硫辛酸7份。

具体实施例2：

一种具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂，由如下重量比例的原料组成：甘氨酸18份；精氨酸15份；半胱氨酸18份；谷氨酰胺18份；S-腺苷甲硫氨酸10份；α-硫辛酸12份。

具体实施例2：

一种具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂，由如下重量比例的原料组成：甘氨酸16份；精氨酸13份；半胱氨酸16份；谷氨酰胺17份；S-腺苷甲硫氨酸9份；α-硫辛酸10份。

谷胱甘肽(GSH)是一种三肽，作为机体主要的抗氧化攻击屏障，以极高浓度(m mol/L水平)存在于细胞内。约85％GSH存在于细胞质中，仅10～15％GSH存在于细胞的氧化场所线粒体内。由于线粒体本身没有γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶，线粒体内的GSH主动转运取之于细胞质中的GSH。众所周知，线粒体是产生活性氧自由基(ROS)的场所，并且对氧化攻击敏感，所以GSH是线粒体最主要的抵抗ROS攻击的屏障。

细胞因子的诱导释放是外源化合物肝损伤及酒精性肝损伤的重要特征之一。多年来的临床研究发现，脂肪变性肝炎、肝硬化及酒精性肝炎病人血清中TNF-α，白细胞介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)明显升高。在大量实验性肝损伤模型中，也发现TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β等在肝细胞损伤及坏死过程中发挥中心作用。在正常情况下，肝脏细胞能够抵抗TNF-α的细胞毒作用。然而当TNF-α大量产生释放或肝内抗氧化物质大量减少不足以抵抗TNF-α时，肝细胞即被大量杀伤。TGF-β在发挥杀伤肝细胞作用同时，尚可大量诱导合成胶原，加速肝纤维化过程。TNF-α大量产生与释放是酒精性肝炎病理发生发展过程的中心环节之一。因为酒精氧化代谢产生的ROS攻击不但大量激活肝脏星形细胞(Kupffer cell)释放核转录因子NF-κB，肿瘤坏死因子TNF-α，而且酒精的氧化代谢严重消耗了肝内抗氧化物质，改变了肝细胞正常的氧化还原平衡，使肝细胞对TNF-α造成的肝毒害更加敏感。

肝脏内肝细胞正常的甲硫氨酸(Methionine，)代谢途径是肝内维持抗氧化剂平衡的重要途径。甲硫氨酸是一种肝脏疾病辅助治疗用药，也是人体的一种必需氨基酸之一。甲硫氨酸代谢途径在正常人体生理代谢，特别是维持人体抗氧化平衡过程中发挥重要作用。甲硫氨酸通过甲硫氨酸腺苷转移酶(Methionine Adenosyltransferase，MAT)催化，可代谢成多种人体必需的重要氨基酸，作为前体合成人体必需的人体重要生理物质，如多胺、胆碱、谷胱甘肽、半胱氨酸等，其中谷胱甘肽、半胱氨酸是人体及肝脏细胞内最重要的抗氧化物质。甲硫氨酸代谢的另一重要作用是为体内各种重要的生化生理甲基化反应提供甲基(通过转甲基酶)。甲硫氨酸代谢途径见图1。

脂肪肝状况下，通常甲硫氨酸转移酶(MAT)活性下降，导致甲硫氨酸堆积，同时下游代谢产物大大减少。

从图1可以看出，通过甲硫氨酸代谢转化，人体可以获得许多重要生理物质，特别是谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，半胱氨酸(Cysteine)等，在保持细胞的正常氧化还原状态过程中发挥着极重要的功能，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAMe)，是转硫反应是必须中间产物，通过这一途径，甲硫氨酸才能转化为半胱氨酸，提供其他重要蛋白质合成原料及维持细胞内及细胞间正常氧化还原状态。S-腺半胱氨酸转甲基后，被代谢为S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)。SAH被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine Hydrolase，SAHH)代谢为同型半胱氨酸和腺苷。同型半胱氨酸一方面可被转化为半胱氨酸，另一方面又可被维生素B12依赖的甲硫氨酸合成酶(Methionine Synthase，MS)利用5-甲基四氢叶酸(CH₃THF)重新合成甲硫氨酸。产生的四氢叶酸(THF)又继而被甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate Reductase，MTHFR)重新还原生成甲基四氢叶酸(CH₃THF)，同型半胱氨酸也可被甜菜碱(Betaine)同型半胱氨酸转移酶(Bataine Homocysteine S-methyltransferase，BHMT)催化形成甲硫氨酸，同时释放出二甲基甘氨酸(Dimethyl-glycine，DMG)。

由此可见，体内甲硫氨酸代谢途径是一个精细的代谢循环途径。一旦这一途径的某一环节被阻断，就会产生系列的代谢紊乱，打破肝脏内原有的良好的氧化还原状态。

正常情况下，成年人每日可产生6～8克SAMe，大量研究表明，多数脂肪肝状态下存在甲硫氨酸代谢循环紊乱。例如，长期饮用酒精可导致甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)活性下降，导致甲硫氨酸过剩，而下游代谢产物大大减少，使机体无法获得维持正常功能所需的氨基酸及抗氧化物质。研究证实，人体缺乏SAMe可导致血中TNF-α水平大大升高，并可引起内毒素血症，TNF-α又可诱导一系列细胞因子释放及激活炎症过程。

1、S-腺苷甲硫氨酸、半胱氨酸(Cysteine)抗氧化与肝损伤保护

肝内S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)缺乏是脂肪肝形成与进展过程中极其重要的环节。正如前述甲硫氨酸代谢途径，SAMe是代谢途径的中心环节之一。因为SAMe是谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸等体内重要抗氧化物质的合成前体。GSH是一种三肽，作为机体主要的抗氧化攻击屏障，以极高浓度(mmol/L水平)存在于细胞内。约85％GSH存在于细胞质中，仅10～15％GSH存在于细胞内氧化场所线粒体内。由于线粒体本身没有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，线粒体内的GSH主要通过主动转运取之于细胞质中的GSH。

众所周知，线粒体是产生ROS的场所，并且对氧化攻击敏感，所以GSH是线粒体最主要的抵抗ROS攻击的屏障。SAMe及半胱氨酸是GSH的合成前体，补充SAMe及半胱氨酸能够纠正肝细胞内及线粒体内由于GSH浓度下降，ROS造成的攻击损伤。

细胞因子的诱导释放是外源化合物肝损伤及酒精肝损伤的重要特征之一。多年来的临床研究发现，脂肪变性肝炎、肝硬化及酒精性肝炎病人血清中TNF-α，白细胞介素1(IL-1)，白介素6(IL-6)，自介素8(IL-8)明显升高。在大量实验性肝损伤模型中，也发现TNF-α、 IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β等在肝细胞损伤及坏死过程中发挥中心作用。

在正常情况下，肝脏细胞能够抵抗TNF-α的细胞毒作用。然而当TNF-α大量产生释放或肝内抗氧化物质大量减少不足以抵抗TNF-α时，肝细胞即被大量杀伤。TGF-β在发挥杀伤肝细胞作用同时，尚可大量诱导合成胶原，加速肝纤维化过程。TNF-α大量产生与释放是酒精性肝炎病理发生发展过程的中心环节之一。因为酒精氧化代谢产生的ROS攻击不但大量激活Kupffer细胞释放TNF-α，而且酒精的氧化代谢严重消耗了肝内抗氧化物质，改变了肝细胞正常的氧化还原平衡，使肝细胞对TNF-α造成的肝毒害更加敏感。

研究表明，抗TNF-α抗体疗法能够有效地阻止酒精及其他化学物质造成的肝损伤。临床研究发现，抗TNF-α抗体疗法可有效地改善关节炎、炎症性小肠疾病等也侧面证实了TNF-α在许多疾病中的作用。研究表明，SAMe及半胱氨酸均可通过调节肝损伤过程中细胞因子的产生与释放及增加肝脏内GSH发挥抗肝细胞损伤作用。半胱氨酸是含巯基氨基酸，一方面它是GSH合成前体，另一方面，作为抗氧化剂，它可直接清除体内自由基。

2、SAMe及半胱氨酸的抗氧化作用及对细胞因子的影响

ROS氧化攻击可直接刺激机体产生分泌内毒素，血中内毒素升高[如脂质过氧化物、脂多糖(LPS)]可诱导激活肝脏星形细胞(Kupffer cell)，使其分泌并释放大量α-肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素IL-6、IL-8、IL-10等。TNF-α可直接引起肝细胞脂肪变性，炎症及坏死。TNF-α还可促进体外周脂肪分解，使游离脂肪酸通过血液进入肝脏并蓄积。TNF-α也可减少肝脏细胞对低密度脂蛋白的清除。因此TNF-α在脂肪肝、肝硬化的发生、发展过程中起重要作用。

白介素10(IL-10)，最初被称为细胞因子合成抑制因子。它是一种机体内重要的炎症反应及免疫亢进反应抑制因子。不同细胞包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴B细胞、T细胞以及自然杀伤细胞等都可产生释放IL-10，IL-10有较强的抗纤维化作用，IL-10主要通过抑制胶原基因转录及增加胶原分解酶表达发挥其抗纤维化作用。临床研究表明，肝硬化病人白介素10(IL-10)生成量及血中浓度均明显降低，IL-10基因敲除小鼠对醋氨酚及酒精诱导的肝脏损害更敏感。白介素-6是一种多功能细胞因子，它既有促炎症作用又可发挥抗炎症作用，到目前为止，较多证据表明，IL-6具有抗炎症及抗细胞凋亡作用。白介素-6预处理大鼠能显著保护缺血再灌注引起的肝损伤。白介素-6还可保护内皮细胞功能及保护肝细胞损伤。另外白介素-6尚与肝脏再生功能密切相关。IL-6基因敲除小鼠显示肝再生功能障碍，因此IL-6处理可完成翻转这种肝再生障碍。

硫辛酸(alpha lipoic acid)是一种能消除加速老化与致病的自由基、属于B族维他命物质，硫辛酸是一种存在于线粒体的酵素，硫辛酸在体内经肠道吸收后进入细胞，兼具脂溶性与水溶性的特性，因此可以在全身通行无阻，到达任何一个细胞部位，提供人体全面效能，是唯一兼具脂溶性与水溶性的万能生物抗氧化剂。美国加州大学柏克莱分校的派克博士(Dr.Lester Packer)是世界顶尖的硫辛酸和抗氧化剂权威。他发现硫辛酸不像别的抗氧化剂在体内只有一项特定的任务，它具「自由体」的身份，能在其它抗氧化剂短缺时为之「代打」；也就是说，如果人体内缺乏维他命E或C，硫辛酸将暂时接手它们的工作。而且硫辛酸还能大大增强维他命C和E的作用，於是，如果将Alpha-Lipoic Acid和一些其它的抗氧化成份一起制成复方，可能就会提高这些抗氧化成份的效果，少数的研究报告显示硫辛酸用来预防甚至治疗某些疾病如：AIDS、糖尿病及其并发症、神经系统退化及肝机能失调等症状。但由於硫辛酸只少量存在於马铃薯、菠菜及肉类中，因此若要补充足够的硫辛酸来预防疾病，最好还是选择已萃取好的营养补充品市面上业者常常将硫辛酸与葡萄子，绿茶，维他命C等成份制成复方产品。硫辛酸是一种超强型的抗氧化剂，被称为“万能抗氧化剂”，更是自由基捕手，是机体细胞利用糖类等能源物质产生能量所需的一种限制性必需营养物质，广泛用于治疗和预防心脏病、糖尿病等多种疾病。一般认为它能保存和再生其它抗氧化剂，如维生素C和E等，并能平衡血糖浓度。有效增强体内免疫系统，免受于自由基的破坏。它对多种病症具有治疗功效：肝病、糖尿病、人类后天免疫不全带原者、艾滋病、牛皮藓、湿疹、烧伤、皮肤癌、多发性硬化症、帕金森氏症、神经科方面的疾病、风湿病、风湿性关节炎、红斑性狼疮、硬皮症、自体免疫方面的疾病、白内障、其它眼科疾病、心脏病、中风、动脉硬化、用于急性及慢性肝炎、肝硬变、肝性昏迷、脂肪肝等疾病。

为研究SAMe及抗氧化剂半胱氨酸对细胞因子的调节作用，我们观察了SAMe及半胱氨酸对脂多糖(LPS)诱导的TNF-α的影响及对白介素IL-6、IL-10的影响。

实验一、SAMe，L-半胱氨酸对LPS诱导的血清肿瘤转移因子(TNF-α)及转氨酶ALT的影响

正常雄性SD大鼠体重200-220g，分为三组，每组12只，正常对照组，SAMe给药组，及半胱氨酸给药组。正常对照组每天肌肉注射一次等体积生理盐水，SAMe组每天肌肉注射一次SAMe(50mg/kg体重)，半胱氨酸组每天肌肉注射一次半胱氨酸，剂量为60mg/kg体重。连续给药14天，14天后大鼠尾静脉注射脂多糖(LPS)2mg/kg体重，120分钟后，取血，分离血清，测定大鼠血清中TNF-α水平及丙氨酸转氨酶(ALT)水平。结果如下。

^※※与对照组比较，p＜0.001，^△△与对照组比较，p＜0.001

如图2，上述结果表明，外源性给予SAMe与半胱氨酸可显著抑制LPS诱导的TNF-α产生与释放。结果提示SAMe和半胱氨酸均对TNF-α导致的炎症及细胞损伤有良好的保护作用。

实验二、SAMe、半胱氨酸与α-硫辛酸对鼠RAW细胞白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)的影响

为观察SAMe与半胱氨酸对白细胞介素产生与释放的影响，我们研究了SAMe与半胱氨酸对鼠单核细胞RAW264.7细胞株IL-6与IL-10的影响，RAW264.7细胞株被广泛用于研究细胞因子产生与释放。

RAW cells以DMEM(含10％小牛血清，2mM谷氨酸胺，5U/ml青霉素，5μg/ml链霉素)培养，RAW264.7细胞初始培养密度为0.5×105细胞/ml，37℃培养过夜。24小时培养后，加入0，0.1，0.5，1.0mM SAMe(终浓度)或0，10，50mM α-硫辛酸，培养2小时，然后在各培养皿中加入100ng/ml，LPS(终浓度)，37℃培养16小时后，收集细胞培养液，3000rpm4℃离心10分钟去除细胞及悬浮物，用IL-10、IL-6、ELISA试剂盒测定培养液中IL-10、IL-6 浓度，IL-10、IL-6试剂盒测定灵敏度均为4.0pg/ml。结果如下。

与0mM SAMe对照组比较：^※※p＜0.001，^△p＜0.05，^△△p＜0.001

与0mM α-硫辛酸对照组比较：^※※p＜0.001

如图3，实验结果表明，SAMe在0.1mM浓度即可显著促进RAW细胞释放白介素-6及白介素-10，在1.0mM浓度时，可刺激RAW细胞产生释放近二倍浓度的白介素-6及白介素-10。然而，α-硫辛酸对RAW细胞释放白介素-10无明显影响，在高浓度时(50mM)，α-硫辛酸可明显降低对LPS刺激的白介素-6的生成与释放。

实验三、SAMe与半胱氨酸对LPS刺激的RAW细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)释放的影响

上述结果表明，SAMe与半胱氨酸对LPS刺激产生释放白介素的影响不同，我们进一步观察比较了SAMe与半胱氨酸对LPS刺激的TNF-α释放的影响。RAW培养与上述一致。24小时过夜培养后，分别加入0，0.1，0.5，1.0mM SAMe或0，10，50mM半胱氨酸于培养液中，培养2小时后，加入100ng/mL(终浓度)LPS 37℃培养16小时，然后收集培养液，以TNF- αEILSA试剂盒测定TNF-α在培养液中的浓度。TNF-α试剂盒检测灵敏度为13.5pg/mL，试验结果如下。

与0mM SAMe对照组比较：^※p＜0.05，^※※p＜0.001

与0mM半胱氨酸对照组比较：^※※p＜0.001

如图4，结果表明，SAMe与NAC均可显著抑制LPS刺激引起的TNF-α释放。在体外，0.5mM SAMe抑制TNF-α释放的作用与半胱氨酸10mM相当。

谷氨酰胺、精氨酸的保肝抗氧化损伤作用及其配伍协同作用

精氨酸是人体生理生化过程中的一种重要半必需氨基酸，精氨酸在组织器官代谢过程中发挥重要生理生化功能，它是蛋白质合成及一些具有重要功能生物大分子的合成前体物，这些重要功能生物大分子包括：一氧化氮(NO)、鸟氨酸、多胺、精胺、脯氨酸、谷氨酰胺、肌酸、二甲基精氨酸、尿素等。在生长发育期，精氨酸是良好生长发育的必氨需基酸。在成年期，精氨酸是一种必不可少的调节性必需氨基酸。在某些疾病状态下，例如创伤、烧伤、小肠切除术、脓毒血症、肾衰竭及肿瘤等，可导致机体利用精氨酸大大增加，当超出机体自身产生量时，导致精氨酸缺乏，当机体营养物摄入不足时，就会加重这些疾病。研究表明，精氨酸外源摄取增加能够改善氮平衡，提高淋巴细胞功能，并且能够刺激精氨酸在肝脏中的转运。另外，服用精氨酸能够改善心血管、肺、免疫及消化功能，而且对早期癌变具有良好的预防作用。临床研究证明，精氨酸能够有效的改善高血压、高脂血症症状，并能够显著降低糖尿病患者脂质过氧化水平。

近来研究表明，精氨酸对非酒精脂肪肝、缺血再灌注急性肝损伤及脂肪肝微血管循环有明显保护或改善作用。NO是众所周知的血管扩张因子，广泛研究证实，在肝脏疾病，特别是脂肪肝与肝硬化过程中，NO对调节肝内血管动力学及肝微循环有极其重要作用。Oshita等研究证实，NO作用血管扩张因子，能够显著改善酒精诱导的肝血管收缩，改善肝内血流循环。Kakumitsu等发现，给予L-精氨酸能够选择性增加肝硬化肝脏的门脉血流，并明显改善肝内血流动力学及肝微循环。

最近有文献报道，大鼠喂饲L-精氨酸(1.25g/kg体重)四周，能明显减轻氮自由基，(NOS)损伤，并且能够预防或减轻乙烯乙二醇(EG)诱导的肾结石形成与肾细胞损伤，其主要作用机制为纠正氮自由基及氯自由基(ROS)对肾细胞功能的损伤^[82]。L-精氨酸的上述作用，为临床应用外源性L-精氨酸预防及治疗脂肪肝及预防肾结石及心血管疾病奠定了良好的基础。

谷氨酰胺(GLN)是一种机体内重要的非必需氨基酸，谷氨酰胺在氨基酸通过α-酮戊二酸及谷氨酸途径转氨基代谢过程中发挥中心作用。近来研究表明，GLN具有免疫调节及细胞调节作用。研究显示谷氨酰胺作用谷胱甘肽合成前体及嘌呤及嘧啶合成前体，对细胞功能具有多方面调节作用，例如GLN能够调节精氨酸及NO代谢，能调节细胞体积及刺激细胞因子形成，调节免疫细胞功能，例如：刺激干扰素生成、抑制细胞凋亡、增加白细胞介素生成、刺激细胞RNA合成等。作为GSH合成前体，GLN与半胱氨酸、甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸一起合成GSH，谷氨酰胺与半胱氨酸在肾脏、肝脏、小肠氧化还原代谢中作用尤其重要。

研究表明，在糖尿病、尿毒症、肝硬化、溃疡性结肠炎、化疗病人等机体谷氨酰胺含量均显著降低，非胰岛素依赖患者自由基产生明显升高并加重糖尿病患者各种并发症。静注GSH能显著提高非胰岛素依赖糖尿病患者的GSH∶GSSG比率，增加糖摄取利用。研究早已证实，GSH水平的降低明显减弱了非胰岛素依赖糖尿病患者的胰岛素敏感性，影响了β-细胞对血糖的反应。在尿毒症病人治疗过程中，外源性增加GSH能够使促红细胞生成素使用量降低37％。另外，GLN是小肠内皮细胞的主要代谢燃料，能够显著保护小肠缺血再灌注损伤，外源增加GLN能明显促进烧伤病人康复或减少感染发生率，并对外科手术及骨髓转植手术后恢复有良好促进作用。研究发现，GLN对不同化学物质造成的肝损伤均有一定的保护作用，其保护作用的主要机制为抗氧化作用及增加GSH含量。

综合实验四、谷氨酰胺及精氨酸及其联合使用对化学性肝损伤的协同保护作用

为探讨谷氨酰胺及精氨酸对脂肪肝的保护治疗作用，我们研究了谷氨酰胺及精氨酸及其联合使用对酒精诱导的肝损伤的保护作用。

正常雄性小鼠体重(18-22g)，分为5组，每组动物10只，分为对照组、酒精喂饲组、谷氨酰胺+酒精喂饲组、精氨酸+酒精喂饲组及谷氨酰胺+精氨酸+酒精喂饲组，小鼠每12小时喂饲6g/kg体重酒精，共给予4次，正常对照组每12小时给予等体积等热量麦芽糖糊精溶液。谷氨酰胺+酒精组在喂饲酒精前(6g/kg)腹腔注射100mg/kg体重谷氨酰胺；精氨酸+酒精组喂饲酒精前(6g/kg)，腹腔注射100mg/kg精氨酸；谷氨酰胺+精氨酸+酒精喂饲组，在酒精喂饲前，腹腔注射100mg/kg谷氨酰胺+100mg/kg体重精氨酸。在最后一次酒精及药物给予6h后，取血并分离血清备用。处死小鼠，迅速取小鼠肝脏匀浆化，600x g 4℃离心，移取上清液，7000x g 4℃离心10分钟，得线粒体(沉淀)，HMS缓冲液冲洗10分钟后，再进行离心(7000x g)，弃上清液，重新悬浮线粒体待测。

血清丙氨酸转氨酶(ALT)以诊断试剂盒测定，结果如下。

^※※与对照组比较：p＜0.001，^△△与对照组比较：p＜0.001

##与酒精+谷氨酰胺组比较：p＜0.001，++与酒精+精氨酸组比较：p＜0.001。

谷氨酰胺、精氨酸对小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT，U/L)的影响

如图5，结果表明，酒精喂饲后，血清ALT水平明显升高。分别给予100mg/kg谷氨酰胺及100mg/kg精氨酸能显著降低酒精引起的ALT升高，谷氨酰胺与精氨酸联合应用比单独使用能更明显降低酒精引起的ALT升高。按上述(SAMe部分)方法，测定了谷氨酰胺、精氨酸对肝脏线粒体GSH含量的影响，并以硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含量为指标，观察了谷氨酰胺及精氨酸对酒精引起的肝脏脂质过氧化的影响。线粒体GSH以GSH测定试剂盒方法测定。TBARS按文献方法在532nm吸收波测定TBARS在肝组织中的含量。结果如下。

^※※与对照组比较：p＜0.001，^△与酒精组比较：p＜0.05，^△△p＜0.001，

⁺⁺与酒精+精氨酸组比较：p＜0.001，^##与酒精+谷氨酰胺组比较：p＜0.001.

如图6，结果表明，酒精喂饲后，小鼠肝脏内GSH水平明显降低，肝内脂质过氧化产物大大提高，分别给予谷氨酰胺及精氨酸均能够部分升高肝线粒体内GSH含量，降低肝内脂质过氧化产物生成量。谷氨酰胺与精氨酸联合使用几乎可以使肝线粒体内GSH升到正常范围，并且比单用谷氨酰胺或精氨酸更加显著地减少了酒精氧化产生的肝内脂质过氧化物含量。

3、甘氨酸与肝氧化损伤保护与治疗

甘氨酸是一种人体非必需氨基酸，参与人体多种重要的生理生化调节。例如甘氨酸参与糖代谢、蛋白质合成、嘌呤合成、胆汁酸结合反应等。甘氨酸能够通过抑制钙离子内流，稳定巨噬细胞及肝星形细胞(Kupffer细胞)抑制TNF-α释放。甘氨酸能够良好地预防及减轻肝缺血再灌注损伤、酒精性肝损伤、脂肪肝、化学药物性肝损伤。另外，有报道指出，甘氨酸能够预防肝癌发生并对某些黑色素瘤有良好的治疗作用。另有研究表明，甘氨酸能够通过抗组织缺氧，阻止耗竭ATP而有效地保护肾脏近曲小管及肝细胞，甘氨酸还可以通过促进肝内微循环减轻肝再灌注损伤。

脂肪肝的主要病理特征是肝细胞脂肪变性及坏死，其中肝内星形细胞(Kupffer细胞)产生释放的细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF-α)起主要作用，体内氧化还原状态失去平衡，产生过量自由基时，(包括ROS、NOS等)，血中内毒素水平(例如LPS)明显升高，激活肝内Kupffer细胞释放TNF-α。近来研究表明，甘氨酸保护肝细胞，阻止Kupffer细胞释放TNF-α的机制是，甘氨酸可激活开放Kupffer细胞膜内甘氨酸介导的氯离子通道(Glycine-gated Chloride Channel)，增加氯离子内流(升高2～3倍)，使细胞膜极性升高，稳定了Kupffer细胞膜，使Ca++离子通道无法打开，从而阻断了钙离子内流引发的TNF-α合成与分泌(内毒素主要通过刺激Kupffer细胞膜，激活钙离子内流释放TNF-α)。

实验五、甘氨酸对脂多糖(LPS)诱导的大鼠体内转氨酶及肿瘤坏死因子TNF-α生成与释放的影响

为研究甘氨酸对TNF-α分泌释放的影响，我们观察了甘氨酸对脂多糖(LPS)诱导的大鼠体内TNF-α生成与释放的影响。

正常雄性大鼠，体重200～220g，设3组，每组动物10只，分为正常对照组、60mg/kg体重甘氨酸组、120mg/kg体重甘氨酸组。正常组大鼠每日腹腔注射等体积生理盐水1次，甘氨酸大鼠每日腹腔注射不同计量甘氨酸1次，连续给药14天，14天后大鼠尾静脉注射脂多糖(LPS)2mg/kg体重，120分钟后，取血，分离血清，测定大鼠血中丙氨酸转氨酶(ALT)及TNF-α含量。结果如下。

^※※与对照组比较：p＜0.001，^##与60mg/kg甘氨酸组比较：p＜0.001

如图7，上述结果表明，甘氨酸可非常显著地降低LPS诱导的TNF-α生成与释放。120mg/kg甘氨酸给药组TNF-α释放抑制作用更加明显。甘氨酸亦对LPS诱导的强烈的转氨酶升高有较强的保护作用。

4、高效天然抗氧化综合配方的确立及其对肝损伤的保护治疗的联合协同作用

根据以上大量实验研究结果及国际上在该领域研究取得的进展，我们确立了经过多次优化配伍实验筛选、全方位、多途径保肝抗氧化配方。该配方根据化学性肝损伤及脂肪肝发生发展的分子病理学原理，或多重阻断氧化攻击或多重提供活性抗氧化生物前体，或促进有害物的快速排泄。我们以动物实验观察了抗氧化综合配方对肝损伤的联合协同保护作用及其机理。

综合实验六、高效天然抗氧化综合配方对肝损伤的保护治疗联合协同作用及机理研究

正常雄性小鼠体重18～22g，分为3组，每只动物12只，分为正常对照组、酒精喂饲组、综合配方组+酒精喂饲组。酒精组小鼠每日喂饲酒精1次，6g/kg体重，综合配方组+酒精喂饲组，在喂饲酒精前1小时，喂饲0.15mL综合配方(甘氨酸60mg/kg、L-精氨酸50mg/kg、谷氨酰胺60mg/kg、L-半胱氨酸70mg/kg、S-腺苷甲硫氨酸35mg/kg、α-硫辛酸35mg/kg)。然后喂饲酒精6g/kg，正常组给予等体积(0.15mL)生理盐水，连续给予酒精或药物+酒精2周。取血，分离血清备用。上述方法制备线粒体及肝组织匀浆测定线粒体内GSH含量及肝组织匀浆脂质过氧化物(TBARS)。结果如下：

^※※与正常对照组比较：p＜0.001，^△△与酒精组比较：p＜0.001，^△p＜0.05

如图8，上述结果表明，综合配方有非常显著的抗氧化保护肝脏作用。酒精喂饲2周后，小鼠肝线粒体GSH含量极度降低，脂质过氧化物生成量(TBARS)大幅升高(10倍)，ALT也显著升高，酒精+综合配方组2周后线粒体GSH与正常对照组含量相仿，TBARS生成量略高于正常对照，ALT也仅略有升高。

我们还进一步观察了综合配方对脂多糖(LPS)诱导的大鼠体内TNF-α生成与释放的影响。正常雄性SD大鼠，体重200～220g，分为2组，对照组及综合配方组，每组动物12只，对照组大鼠每日腹腔注射等体积生理盐水1次(0.2mL)，综合配方组每日注射0.2mL配方药物，组方成分剂量与上述实验相同(半胱氨酸、L-精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸)，共连续给药14天。14天后大鼠尾静脉注射脂多糖(LPS)2mg/kg体重，120分钟后取血，分离血清，测定大鼠血清ALT及TNF-α含量变化。结果如下：

^※※与对照组比较：P＜0.001

如图9，综合配方对LPS诱导的大鼠TNF-α有极显著抑制作用，LPS能显著升高对照组大鼠ALT，而综合配方组ALT仅略有升高。结果提示：综合配方对内毒素诱导的肝损伤有极强的联合协同保护作用。

上述对化学性肝损伤及脂肪肝的预防及治疗的分子生物学机制的研究结果及对多种高效天然活性抗氧化有效成份进行药理学、毒理学、分子生物学实验研究结果表明，我们研究设计的从多重肝细胞代谢途径、多位点阻止或预防活性氧自由基(ROS)攻击，阻断α-肿瘤坏死因子(TNF-α)诱发与释放，预防化学性肝中毒保护肝脏的天然抗氧化多分子综合配方具有非常显著的改善肝细胞抗氧化能力，能够稳定细胞膜、显著抑制或阻断α-肿瘤坏死因子(TNF-α)释放，抵抗体内、外化学毒素导致的肝损伤，综合配方对肝损伤有极强的联合协同保护作用。

本发明临床疗效与安全性系统观察与研究结果数据

(A)脂肪肝的诊断标准：

1、脂肪肝的超声诊断标准：(1)肝区近场弥漫性点状高回声。回声强度高于脾脏和肾脏，少数表现为灶性高回声；(2)远场回声衰减，光点稀疏；(3)肝内管道结构显示不清；(4)肝脏轻度或中度肿大，肝前缘变钝。仅具备(1)项者作为疑似诊断；具备第(1)项加其余1项以上者可确诊为脂肪肝。

2、脂肪肝程度判定标准：(范建高、曾民德，主编，脂肪肝，上海医科大学出版社，2000，115-188)

(1)轻度：光点细密，近场回声增强，远场回声轻度衰减，血管，血管结构清晰。

(2)中度：光点细密，前场回声增强，远场回声明显衰减，血管结构不清。

(3)重度：光点细密，前场回声显著增强，远场回声显著衰减，血管结构不能辨认。

3、非酒精性脂肪肝诊断标准

非酒精性脂肪肝是一种以无过量饮酒史，肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征.疾病随病程的进展表现不一，包括单纯脂肪肝、脂肪性肝炎(除上述单纯脂肪肝影像学表现外，可出现肝实质密度和信号改变，脾增厚或肿大，胆囊壁增厚或胆囊形态改变等)、脂肪性肝纤维和肝硬化。

凡具备下列1-5项和第6项或第7项任一项者即可诊断为非酒精性脂肪肝。

1.有易患因素，如肥胖、2型糖尿病、高脂血症和女性等；

2.无饮酒史或饮酒折合酒精量每周小于40克；

3.除外病毒性肝炎、药物性肝炎、Wilson病、全胃肠外营养和自身免疫性肝炎；

4.原发病临床表现外，可出现乏力、肝区痛等症状，可伴有肝脾肿大；

5.清转氨酶可升高，并以ALT为主，可伴有γ-GT、铁蛋白和尿酸等增高；

6.有超声诊断依据。

单纯性脂肪肝诊断标准：(1)肝功能检查基本正常；(2)超声学表现符合轻、中度、重度脂肪肝。

非酒精性脂肪肝肝炎诊断标准：(1)血清ALT和(或)γ-GT高于正常值上限的1.5倍，持续时间大于4周(2)超声学诊断依据。

4、酒精性脂肪肝诊断标准

酒精性脂肪肝诊断标准：男性酒精摄入量经常性每日超过40g，女性酒精摄入量经常性每日超过20-30g。或者近期有一次性或多次超大量饮酒史(可直接导致急性酒精中毒并严重损害肝脏，肾脏等人体重要器官)。可出现乏力、肝区痛等症状，可伴有肝脾肿大；通常伴随血清转氨酶升高，并以AST、ALT为主，可伴有γ-GT、铁蛋白和尿酸等增高；有影像学诊断依据。

(B)材料与方法：

1、研究对象与分组

本项目从青岛市内分泌糖尿病医院住院、门诊就诊患者和健康查体人群中，选择经彩色多谱勒诊断脂肪肝患者862例(男558例，女304例)平均年龄52±19岁(40-71岁)参照《中华医学会肝脏病学分会酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝诊断标准》将862例脂肪肝患者分为2组：(1)酒精性脂肪肝组(290例)，(2)非酒精性脂肪肝组(572例)。

2、观察项目

对所有脂肪肝受试者(治疗组和对照组)均经专门培训的医学专业技术人员负责进行调查，询问并记录、年龄、性别、职业、饮酒、糖尿病、高血压病以及药物治疗史等。全部完成以下体格检查与实验室和彩色多谱勒检查。

(1)临床体格检查

用台式秤测量被检者的身高(厘米，cm)、空腹体重(千克，kg)，测量时被检者应脱鞋、脱帽、着单衣、单裤测量。用软尺测量腰围及臀围(厘米，cm)。腰围的测量以肋缘与髂嵴上缘间的最小周径为准，而臀围的测量以前经耻骨联合、两侧经股骨大转子，后经臀部最突出部位为标准，计算体重指数(BMI)＝体重(Kg)/身高(m)²，腰臀比(WH)＝腰围(cm)/臀围(cm)。血压(BP)的测量方法采用全国高血压抽样调查统一标准，一律使用汞拄式血压计。被检者在测量前需静坐休息5分钟，然后取坐位，测量右上肢血压。收缩压(SBP)以听到第1期心音为准，而舒张压(DBP)以第5期消失音为准。间隔2分钟，连续测量两次，取其平均值。测量前体重计、血压计均经过校正。以上操作均为专人专机进行。

(2)实验室检查

治疗前全部研究对象均隔夜禁食12小时，次日日清晨空腹抽血，采用全自动生化仪器、测空腹血糖(FBG)、胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，γ-谷氨酰转肽酶(GTT)、谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)，尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)等。采用美国强生全自动干化学仪测定肿瘤坏死因子(TNF-α)、C-反应蛋白(CRP)。

(3)肝脏彩色多普勒检查

肝脏彩超使用美国PHILIPS M2540A型彩色多普勒超声仪，频率10MHz，固定专人操作。受试者隔夜禁食12小时，当日清晨，取平卧位，横断扫查与纵断扫查相结合，清楚显示肝脏结构。

所有研究对象均于当日开始服用本发明配方(以上述高效综合配方使用相关药用辅料制成片剂，片剂工艺在下部分详述)，0.6g/片，4片/次，3次/天，连续用药8-10周。服药后4-5、和8-10周分别复查上述指标和实验室检查，观察并纪录患者对药物反应等。

3、疗效评价标准

观察指标及疗效评价标准：治疗前后分别抽取空腹静脉血，测量空腹血糖(FBG)、胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，γ-谷氨酰转肽酶(GTT)、谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)，尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、C-反应蛋白(CRP)，测量血压，行肝脏彩色多普勒检查，治疗前后均由同一位医师进行，对比观察肝脏声像图变化。

治愈：症状、体征基本消失，肝功能各项指标恢复正常，超肝声像图恢复正常。

显效：症状、体征明显改善，肝功能恢复正常或下降50％以上，超声肝脏像图明显改善(下降1个等级)，血脂、尿酸(UA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等各项指标至少有1项以上恢复正常或下降50％以上，

有效：治愈及显效者均判定为有效；

无效：症状、体征无明显改善，肝功能、血脂各项指标下降20％以下，B超肝声像图无明显变化。

(三)结果分析与统计学处理

统计学分析采用spss11.5软件包进行，组间差异采用t检验，多个样本均数比较用方差分析；另外，按脂肪肝轻重程度分类方法将肪肝患者分为：轻度脂肪肝组(220例)、中度脂肪肝组(386例)、重度脂肪肝组(256例)，以便进一步分析总结各类脂肪肝的典型的病理生理特征，评估美中清素治疗不同原因脂肪肝及不同轻重程度脂肪肝的临床效果。

(四)结果

我们观察了862例患有不同原因导致的脂肪肝患者，应用高效天然抗氧化多分子复合配方对脂肪肝、血糖、血脂、总胆固醇、尿酸、肝功能、肾功能等临床指标的影响，以便比较高效天然抗氧化多分子复合配方美中清素对不同类型、不同程度脂肪肝的临床疗效。

1、使用本发明治疗前后各项指标比较

脂肪肝患者临床一般资料影响(表1A)

项目	治疗前	治疗后	P值
				例数(男/女)	862(558/304)	862(558/304)
年龄	52.10±12.19	52.10±12.19
				身高(m)	1.68±0.87	1.68±0.87
体重(Kg)	78.38±14.09	78.05±13.28	0.56
				体重指数(BMI)	27.75±3.51	27.65±3.27	0.87
腰围(cm)	94.86±7.73	94.51±6.88	0.70
				臀围(cm)	101.28±5.57	100.95±5.38	0.94
腰/臀	0.94±0.06	0.94±0.05	0.825
				收缩压(mmHg)	130.31±15.56	129.60±14.86	0.410
舒张压(mmHg)	83.73±7.60	83.15±7.42	0.447
				体脂含量(％)	34.52±3.83	32.45±3.47	0.56

治疗后，体重、BMI、腰围、臀围较治疗前有所下降，但统计学差异不显著，而体脂含量明显下降。

对脂肪肝患者代谢的影响(表1B)

项目	治疗前	治疗后	P值
				FBG(mmol/L)	6.35±2.02	6.24±1.71	0.583
TC(mmol/L)	5.77±1.41	5.36±1.54	0.066
				TG(mmol/L)	2.62±2.27	1.37±0.61	0.000*
LDL(mmol/L)	3.45±1.63	3.51±1.48	0.38
				HDL(mmol/L)	1.13±0.48	1.22±0.46	0.365

对脂肪肝患者肝功能的影响(表1C)

项目	治疗前	治疗后	P值
				GGT(U/L)	54.66±21.40	34.40±9.81	0.000*
ALT(U/L)	54.53±24.05	33.19±10.33	0.000*
				AST(U/L)	51.08±27.72	26.15±9.32	0.000*

[0154]

对肾功能的影响(表1D)

项目	治疗前	治疗后	P值
				BUN(mmol/L)	5.19±1.51	5.17±1.25	0.620
Cr(umol/L)	74.80±13.88	75.45±17.10	0.352
				UA(umol/L)	364.2±86.18	358.1±62.62	0.368

对脂肪肝患者特殊炎症细胞因子的影响(表1E)

项目	治疗前	治疗后	P值
				TNF(pg/ml)	17.82±6.84	9.58±3.17	0.000*
CRP(mg/L)	3.12±0.91	2.42±0.68	0.000*

上述统计学结果表明，治疗组应用本发明前后相比，体脂含量、TG、GGT、ALT、AST均明显下降，肿瘤坏死因子、CRP水平大幅度降低，治疗前后有显著统计学差异。

2、本发明对不同程度脂肪肝患者的影响与疗效分析

根据彩超声脂肪肝程度判定标准，本组轻度脂肪肝患者220例(男/女131/89)；中度386例(男/女221/165)；重度256(男/女206/50)。统计分析本发明复合配方对不同程度脂肪肝的影响与疗效分析。

(1)对轻度脂肪肝的影响

轻度脂肪肝治疗前后一般资料的变化(表2A)

项目

治疗前

治疗后

P值

[0166]

例数(男/女)	220(131/89)	220(131/89)
				年龄	51.90±12.83	51.90±12.83
身高(m)	1.65±0.10	1.65±0.10
				体重(Kg)	73.01±13.22	73.06±12.78	0.834
体重指数(BMI)	26.65±3.58	26.67±3.44	0.747
				腰围(cm)	89.90±7.83	90.19±7.03	0.432
臀围(cm)	100.50±4.66	100.30±4.52	0.522
				腰臀比	0.89±0.06	0.90±0.05	0.138
收缩压(mmHg)	129.75±11.75	130.00±14.33	0.895
				舒张压(mmHg)	83.00±7.33	82.00±8.34	0.560
体脂含量(％)	34.80±4.51	34.11±3.46	0.67

对轻度脂肪肝患者代谢的影响(表2B)

项目	治疗前	治疗后	P值
				FBG(mmol/L)	5.99±1.56	6.16±1.18	0.543
TC(mmol/L)	6.30±1.52	5.95±1.62	0.362
				TG(mmol/L)	2.20±1.36	1.52±0.74	0.023
LDL(mmol/L)	4.17±1.52	4.03±1.52	0.710
				HDL(mmol/L)	1.13±0.45	1.23±0.49	0.226

对轻度脂肪肝患者治疗后肝功能的变化(表2C)

项目	治疗前	治疗后	P值
				GGT(U/L)	41.25±12.37	36.95±11.17	0.026
ALT(U/L)	33.30±11.59	30.65±7.45	0.206
				AST(U/L)	36.75±12.11	29.45±8.03	0.001

对轻度脂肪肝患者治疗前后肾功能变化(表2D)

项目	治疗前	治疗后	P值
				BUN(mmol/L)	5.35±1.91	5.31±1.60	0.753
Cr(umol/L)	73.22±13.96	83.03±24.40	0.155
				UA(umol/L)	366.12±78.93	359.49±55.04	0.641

对轻度脂肪肝患者特殊细胞因子的影响(表2E)

项目	治疗前	治疗后	P值
				TNF(pg/ml)	13.89±5.86	8.85±3.30	0.000

上述统计学结果表明，轻度脂肪肝组使用本发明前后，TG、GGT、AST、体脂含量均明显好转或降低，肿瘤坏死因子水平明显降低，治疗前后比较有显著统计学差异。

(2)本发明对中度脂肪肝的影响

对中度脂肪肝一般临床资料的影响(表3A)

项目	治疗前	治疗后	P值
				例数(男/女)	386(221/165)	386(221/165)
年龄	52.10±14.24	52.10±14.24
				身高(m)	1.69±0.08	1.69±0.08
体重(Kg)	79.85±13.83	79.57±13.18	0.279
				体重指数(BMI)	27.92±3.88	27.80±3.64	0.314
腰围(cm)	96.81±5.78	96.63±5.35	0.485
				臀围(cm)	101.22±5.90	101.07±5.65	0.351
腰臀比	0.96±0.04	0.96±0.04	0.884
				收缩压(mmHg)	131.10±16.77	130.00±14.92	0.480
舒张压(mmHg)	83.52±7.37	84.52±7.05	0.401
				体脂含量(％)	34.29±3.52	32.76±3.65	0.067

对中度脂肪肝代谢的影响(表3B)

项目	治疗前	治疗后	P值
				FBG(mmol/L)	6.77±2.22	6.14±1.44	0.066
TC(mmol/L)	5.46±1.00	5.04±1.34	0.325
				TG(mmol/L)	3.03±3.44	1.27±0.59	0.028
LDL(mmol/L)	2.89±1.82	3.14±1.34	0.639
				HDL(mmol/L)	1.19±0.50	1.32±0.47	0.124

对中度脂肪肝患者肝功能的影响(表3C)

项目	治疗前	治疗后	P值
				GGT(U/L)	52.86±19.86	33.62±8.47	0.000*
ALT(U/L)	55.59±14.36	33.95±12.30	0.000*
				AST(U/L)	48.05±17.80	24.86±11.06	0.000*

[0184]

对中度脂肪肝肾功能的影响(表3D)

项目	治疗前	治疗后	P值
				BUN(mmol/L)	4.90±1.13	5.07±1.06	0.374
Cr(umol/L)	77.65±13.49	73.97±10.30	0.166
				UA(umol/L)	351.50±91.98	358.38±65.71	0.674

对中度脂肪肝特殊炎症细胞因子的影响(表3E)

项目	治疗前	治疗后	P值
				TNF(pg/ml)	18.03±5.95	9.80±3.44	0.000*

上述统计学结果表明，中度脂肪肝组应用本发明前后，体脂含量、TG、GGT、ALT、AST均明显好转或降低，肿瘤坏死因子水平明显降低，降低幅度将近1倍，治疗前后比较有显著统计学差异。

(3)对重度脂肪肝患者的影响

对重度脂肪肝患者一般临床资料的影响(表4A)

项目	治疗前	治疗后	P值
				例数(男/女)	256(206/50)	256(206/50)
年龄	52.29±9.70	52.29±9.70
				身高(m)	1.69±0.09	1.69±0.09
体重(Kg)	82.03±14.25	81.29±13.07	0.62
				体重指数(BMI)	28.64±2.89	28.41±2.55	0.79
腰围(cm)	97.64±7.35	96.49±6.42	0.2
				臀围(cm)	102.07±6.16	101.47±6.01	0.196
腰臀比	0.96±0.06	0.95±0.05	0.326
				收缩压(mmHg)	130.05±18.03	128.81±15.96	0.242
舒张压(mmHg)	84.62±8.34	82.80±6.99	0.102
				体脂含量(％)	34.40±3.60	33.50±3.34	0.12

对重度脂肪肝患者代谢的影响(表4B)

项目	治疗前	治疗后	P值
				FBG(mmol/L)	6.29±2.23	6.42±2.32	0.752

[0195]

TC(mmol/L)	5.56±1.56	5.11±1.55	0.223
				TG(mmol/L)	2.61±1.35	1.32±0.47	0.000
LDL(mmol/L)	3.31±1.32	3.39±1.51	0.842
				HDL(mmol/L)	1.07±0.49	1.12±0.41	0.594

对重度脂肪肝患者肝功能的影响(表4C)

项目	治疗前	治疗后	P值
				GGT(U/L)	69.24±21.24	32.76±9.67	0.000*
ALT(U/L)	73.71±24.33	34.86±10.57	0.000*
				AST(U/L)	67.76±37.14	24.29±8.08	0.000*

对重度脂肪肝肾功能的影响(表4D)

项目	治疗前	治疗后	P值
				BUN(mmol/L)	5.33±1.44	5.15±1.10	0.390
Cr(umol/L)	73.46±14.41	69.70±11.19	0.267
				UA(umol/L)	375.1±89.30	356.7±69.00	0.134

对重度脂肪肝患者特殊炎性因子的影响(表4E)

项目	治疗前	治疗后	P值
				TNF(pg/ml)	21.35±6.79	10.08±2.76	0.000*
CRP(mg/L)	7.12±1.91	3.42±0.68	0.000*

上述统计学结果表明，重度脂肪肝组应用本发明前后，腰围、体脂含量、TG、GGT、ALT、AST均明显改善或降低，肿瘤坏死因子水平明显降低，治疗前后比较有显著统计学差异。

3、本发明对酒精性脂肪肝的影响与疗效分析

对酒精性脂肪肝患者一般临床资料的影响(表5A)

项目

治疗前

治疗后

P值

[0208]

例数(男/女)	290(251/39)	290(251/39)
				年龄	50.34±9.04	50.34±9.04
身高(m)	1.71±0.67	1.71±0.67
				体重(Kg)	81.84±12.87	81.33±11.97	0.68
体重指数(BMI)	27.71±3.18	27.55±2.94	0.98
				腰围(cm)	96.28±7.69	95.92±6.60	0.283
臀围(cm)	100.788±5.08	100.70±4.89	0.498
				腰臀比	0.96±0.06	0.95±0.05	0.375
收缩压(mmHg)	127.52±13.22	126.55±12.89	0.527
				舒张压(mmHg)	84.48±8.06	83.45±8.67	0.424
体脂含量(％)	35.80±3.35	33.53±2.92	0.062

对酒精性脂肪肝患者代谢的影响(表5B)

项目	治疗前	治疗后	P值
				FBG(mmol/L)	6.36±2.08	6.53±1.85	0.606
TC(mmol/L)	5.48±1.45	4.97±1.53	0.095
				TG(mmol/L)	2.49±1.54	1.67±0.69	0.001
LDL(mmol/L)	3.28±1.53	3.12±1.43	0.648
				HDL(mmol/L)	1.07±0.42	1.17±0.48	0.224

对酒精性脂肪肝患者肝功能的影响(表5C)

项目	治疗前	治疗后	P值
				GGT(U/L)	60.59±24.57	35.38±8.29	0.000
ALT(U/L)	59.24±27.44	34.31±11.70	0.000
				AST(U/L)	61.48±31.40	27.62±8.02	0.000

对酒精性脂肪肝患者肾功能的影响(表5D)

项目	治疗前	治疗后	P值
				BUN(mmol/L)	5.25±1.33	5.05±0.98	0.160
Cr(umol/L)	74.68±12.30	76.20±20.97	0.753
				UA(umol/L)	397.98±82.46	378.64±58.37	0.141

对酒精性脂肪肝患者特殊炎性因子的影响(表5E)

项目	治疗前	治疗后	P值
				TNF(pg/ml)	20.44±5.43	10.02±3.15	0.000

上述统计学结果表明，酒精性脂肪肝组应用本发明前后，体脂含量、TG、GGT、ALT、AST均明显好转或显著降低，肿瘤坏死因子水平明显降低，治疗前后比较有显著统计学差异。

4、本发明对非酒精性脂肪肝的影响与疗效分析

对非酒精性脂肪肝患者一般临床资料的影响(表6A)

项目	治疗前	治疗后	P值
				例数(男/女)	572(268/304)	572(268/304)
年龄	53.64±14.37	53.64±14.37
				身高(m)	1.64±0.09	1.64±0.09
体重(Kg)	75.34±14.58	75.17±13.88	0.431
				体重指数(BMI)	27.79±3.83	27.73±3.58	0.470
腰围(cm)	93.62±7.67	94.26±6.98	0.130
				臀围(cm)	101.71±6.01	101.18±5.84	0.125
腰臀比	0.92±0.06	0.92±0.05	0.739
				收缩压(mmHg)	132.76±17.18	132.27±16.11	0.607
舒张压(mmHg)	83.06±7.24	83.88±6.25	0.841
				体脂含量(％)	33.39±3.92	32.50±3.68	0.162

对非酒精性脂肪肝患者代谢的影响(表6B)

项目	治疗前	治疗后	P值
				FBG(mmol/L)	6.35±2.00	5.99±1.55	0.142
TC(mmol/L)	6.01±1.35	5.70±1.48	0.334
				TG(mmol/L)	2.73±2.78	1.28±0.52	0.004*
LDL(mmol/L)	3.59±1.73	3.85±1.47	0.495
				HDL(mmol/L)	1.17±0.52	1.26±0.44	0.154

对非酒精性脂肪肝患者肝功能的影响(表6C)

项目	治疗前	治疗后	P值
				GGT(U/L)	49.45±16.89	33.54±11.04	0.000*
ALT(U/L)	50.38±20.15	32.21±9.03	0.000*
				AST(U/L)	41.94±20.44	24.85±10.28	0.000*

[0226]

对非酒精性脂肪肝患者肾功能的影响(表6D)

项目	治疗前	治疗后	P值
				BUN(mmol/L)	5.14±1.67	5.28±1.46	0.310
Cr(umol/L)	74.91±15.33	74.78±13.09	0.962
				UA(umol/L)	334.5±79.17	340.1±61.48	0.582

非酒精性脂肪肝应用本发明治疗前后特殊因子比较(表6E)

项目	治疗前	治疗后	P值
				TNF(pg/ml)	15.52±7.19	9.20±3.19	0.000*

使用本发明前后，平均体脂含量、TC、TG、GGT、ALT、AST、TNF均有显著性差异。平均体脂含量下降1.07％，TG下降1.25mmol/L，GGT下降20.26mmol/L，ALT下降21.33mmol/L，AST下降24.94mmol/l，TNF-α下降8.24pg/mL治疗前后比较差异非常显著。

5、本发明治疗脂肪肝临床疗效综合评价

1、治疗组应用本发明前后，体脂含量、总胆固醇TC、甘油三酯TG、γ-谷氨酰转肽酶(GTT)、谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子TNF均有显著性差异。其中体脂含量下降1.07％，TG下降1.25mmol/L，GGT下降20.26mmol/L，ALT下降21.33mmol/L，AST下降24.94mmol/l，TNF-α下降8.24pg/mL。

2、将治疗组按照脂肪肝轻中重度分类后行统计学分析，结果显示，轻度脂肪肝组应用本发明前后各项指标均明显改善或大幅度降低，TG、GGT、AST、TNF差异有统计学意义。中度脂肪肝组用本发明前后，体脂含量、TG、GGT、ALT、AST、TNF明显改善或降低，治疗前后比较有显著统计学差异。重度脂肪肝组用本发明前后，腰围、体脂含量、TG、GGT、ALT、AST、TNF有显著统计学差异。其中轻、中、重度脂肪肝患者TNF-α下降值分别为11.27pg/mL、8.23pg/mL、5.04pg/mL。

3、将治疗组按照酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝分组后进行统计学分析，无论是酒精性和非酒精性脂肪肝，治疗前后，体脂含量、TG、GGT、ALT、AST、TNF差异有统计学意义。酒精性脂肪肝组各项指标均较非酒精性脂肪肝组下降显著。其中，非酒精性脂肪肝组TNF-α下降6.32pg/mL，酒精性脂肪肝组下降10.42pg/ml。

本发明对不同类型及不同程度脂肪肝的临床综合疗效与评价如下：

Figure 209820DEST_PATH_GSB00000647204900251

Claims

1.一种具有显著化学性肝损伤保护功能的复合生物制剂，其特征在于：由如下重量比例的原料组成：