CN102300585A

CN102300585A - 包含血红蛋白受体的脑膜炎球菌疫苗

Info

Publication number: CN102300585A
Application number: CN2009801560205A
Authority: CN
Inventors: B·阿科; M·斯卡塞利; R·拉普奥利
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-12-28
Also published as: CA2747340A1; NZ593674A; AU2009329193A1; US20100189737A1; JP2012512240A; WO2010070453A3; WO2010070453A8; WO2010070453A2; EP2367568A2; MX2011006648A; BRPI0923006A2

Abstract

脑膜炎球菌血红蛋白受体，HmbR与一种或多种其它抗原联合用作疫苗抗原，例如与脑膜炎球菌外膜囊泡，另一纯化的脑膜炎球菌抗原(例如，fHBP、287、NadA、NspA、NhhA、App、Omp85、LOS)，偶联的脑膜炎球菌荚膜糖等联合。

Description

包含血红蛋白受体的脑膜炎球菌疫苗

本专利申请要求2008年12月17日提交的美国临时专利申请61/203,087的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及脑膜炎球菌疫苗的领域。

背景技术

目前正在研究针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(″Men-B″)的各种疫苗。一些疫苗基于外膜囊泡(OMV)，例如诺华疫苗(Novartis Vaccines)的MENZB^TM产品、芬雷研究院(Finlay Institute)的VA-MENGOC-BC^TM产品、挪威公共卫生研究院(Norwegian Institute of PublicHealth)的MENBVAC^TM产品。其它疫苗基于重组蛋白，例如参考文献1中诺华疫苗报道的“血清群B脑膜炎球菌通用疫苗”。

发明内容

本发明考虑使用脑膜炎球菌血红蛋白受体，HmbR作为疫苗抗原。然而，与参考文献2不同，HmbR不是作为唯一抗原包含在疫苗中。其与一种或多种其它脑膜炎球菌抗原联合包含以便提供更宽和更好的免疫应答。

本发明提供包含脑膜炎球菌HmbR抗原和脑膜炎球菌外膜囊泡的免疫原性组合物。

本发明还提供(i)超表达HmbR的脑膜炎球菌细菌，和(ii)从此类细菌制备的外膜囊泡，和(iii)从此类细菌产生囊泡的方法。

本发明还提供包含hmbR基因的脑膜炎球菌，该基因的表达非相可变(phase variable)。本发明还提供组成型表达HmbR的脑膜炎球菌。本发明还提供包含在诱导型启动子控制下的hmbR基因的脑膜炎球菌。本发明还提供(i)从此类细菌制备的外膜囊泡，和(ii)从此类细菌产生囊泡的方法。

本发明还提供包含脑膜炎球菌HmbR抗原和一种或多种以下脑膜炎球菌抗原的免疫原性组合物：fHBP；287；NadA；NspA；NhhA；App；Omp85和/或LOS。

本发明还提供(i)表达脑膜炎球菌HmbR的非脑膜炎球菌细菌，和(ii)从此类非脑膜炎球菌细菌制备的外膜囊泡，和(iii)从此类细菌产生囊泡的方法。

本发明提供包含脑膜炎球菌HmbR抗原和偶联的脑膜炎球菌荚膜糖的免疫原性组合物。

本发明还提供包含下式所示氨基酸序列的杂交多肽：

-A-[-X-L-]_n-B-

式中X是包含脑膜炎球菌抗原序列的氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数，条件是至少一个X部分是HmbR抗原。优选的非HmbR X部分是：fHBP；287；NadA；NspA；NhhA；App和/或Omp85。这些杂交多肽可形成免疫原性组合物的一部分。

本发明还提供包含以下的混合物的免疫原性组合物：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的多肽；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的多肽；(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的多肽；和(iv)HmbR抗原。参考文献1和3公开了(i)和(ii)和(iii)的混合物。

本发明还提供包含氨基酸序列SEQ ID NO：20的多肽，条件是所述多肽长度短于500个氨基酸，例如＜400aa、＜300aa、＜200aa。

本发明还提供包含氨基酸序列SEQ ID NO：21的多肽，条件是所述多肽长度短于750个氨基酸，例如＜750aa、＜700aa。

本发明还提供包含氨基酸序列SEQ ID NO：22的多肽，条件是所述多肽不包括(i)位于所述多肽中SEQ ID NO：22上游和(ii)与SEQ ID NO：19的氨基酸1-23相同的序列。

HmbR

本发明组合物包含脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB1668(本文的SEQ ID NO：7)。参考文献2报道了不同菌株的HmbR序列(本文的SEQ ID NO：8)。本文的实施例报道了从菌株NZ05/33克隆SEQ ID NO：19。SEQ ID NO：7和8的长度相差1个氨基酸，二者具有94.2％相同性。SEQ IDNO：19比SEQ ID NO：7短1个氨基酸，CLUSTALW检测到它们具有99％相同性(一处插入，7处不同)。本发明可利用任何此类HmbR多肽。

本发明可利用包含全长HmbR序列的多肽，但常利用包含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些实施方式中，本发明所用的HmbR序列可包含与SEQID NO：7具有至少i％序列相同性的氨基酸序列，其中i的数值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，本发明所用的HmbR序列可包含SEQ ID NO：7的至少j个毗连氨基酸的片段，其中j的数值为7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方式中，本发明所用的HmbR序列可包含以下氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO：7具有至少i％序列相同性和/或(ii)包含SEQ ID NO：7的至少j个毗连氨基酸的片段。

j个氨基酸的优选片段包含SEQ ID NO：7的表位。此类表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括含有参与HmbR结合血红蛋白的氨基酸的那些表位，因为结合这些表位的抗体可阻断细菌结合宿主血红蛋白的能力。参考文献4研究了HmbR的拓扑学特征及其关键的功能残基。保留跨膜序列的片段是有用的，因为它们可展示在细菌表面，例如囊泡中。HmbR的长片段的例子对应于SEQ ID NO：21和22。然而，如果利用可溶性HmbR，可利用省去跨膜序列的序列，但通常保留胞外部分的表位。

本发明的最有用的HmbR抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：7构成的脑膜炎球菌多肽。本发明优选利用的HmbR抗原在给予对象后能引发杀菌性抗-脑膜炎球菌抗体。

与参考文献5不同，本发明的HmbR抗原通常不与荚膜糖抗原偶联。

外膜囊泡和合适的产囊泡脑膜炎球菌菌株

本发明的一个实施方式提供包含(a)脑膜炎球菌HmbR抗原和(b)脑膜炎球菌外膜囊泡的免疫原性组合物。可以分别制备这两种组分(a)和(b)，然后混合得到免疫原性组合物[21]。本发明的另一实施方式提供从超表达脑膜炎球菌HmbR抗原的脑膜炎球菌细菌制备的外膜囊泡。还提供此类超表达菌株[21]。从这些菌株制备的囊泡优选包含HmbR抗原，其应采取囊泡中的免疫可接近形式，即，抗-HmbR抗体应能结合囊泡中存在的HmbR。

这些外膜囊泡包括由脑膜炎球菌外膜的破坏或发泡形成包含外膜蛋白组分的囊泡而获得的任何脂蛋白体囊泡。因此该术语包括OMV(有时称为“小泡”)、微囊泡(MV[6])和“天然OMV”(“NOMV”[7]))。

MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长期间自发形成，并释放到培养基中。MV可通过以下方法获得：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌(Neisseria)，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从细胞耗尽的培养基中收集MV(例如，通过过滤、差速离心或MV聚集，通过高速离心以沉淀MV)。一般可以根据培养基中产生的MV的量来选择用于生产MV的菌株，例如，参考文献8和9描述了具有高MV产量的奈瑟球菌。

从细菌人工制备OMV，可以利用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方式(例如参见参考文献10)进行制备。形成OMV的技术包括：用胆酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[11和12]处理奈瑟球菌)在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[13]处理细菌。其它技术基本可以在没有去污剂存在下[10]利用如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、弗氏压碎器、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[10]。因此一种方法可以使用含有约0.5％或更低如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或0浓度的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。

参考文献14描述了制备OMV的有用方法，包括超滤粗制OMV，而非高速离心。该过程可以包括在超滤后进行超离心的步骤。

本发明所用的囊泡可以从任何脑膜炎球菌菌株制备。所述囊泡通常来自血清群B菌株，但是也可能从除B以外的血清群制备(例如，参考文献13公开了血清群A的方法)，如A、C、W135或Y。所述菌株可以属于任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3，3，7；L10等)。脑膜炎球菌可以来自任何合适的谱系，包括超侵袭性和超毒力谱系，例如以下7种超毒力谱系中的任一种：亚群I；亚群III；亚群IV-1；ET-5复合体；ET-37复合体；A4簇；谱系3。通过多基因座酶电泳(MLEE)对这些谱系进行测定，但是也可以采用多基因座序列分型(MLST)对脑膜炎球菌分类[参考文献15]，例如通过MLST将ET-37复合体分类为ST-11复合体，ET-5复合体是ST-32(ET-5)，谱系3是ST-41/44，等等。可从具有以下亚型中一种的谱系制备囊泡：P1.2；P1.2，5；P1.4；P1.5；P1.5，2；P1.5，c；P1.5c，10；P1.7，16；P1.7，16b；P1.7h，4；P1.9；P1.15；P1.9，15；P1.12，13；P1.13；P1.14；P1.21，16；P1.22，14。

可从野生型脑膜炎球菌菌株或突变型脑膜炎球菌菌株(包括经工程改造超表达脑膜炎球菌HmbR抗原的菌株)制备本发明所用的囊泡。例如，参考文献16公开了从含有修饰的fur基因的脑膜炎奈瑟球菌获得囊泡。参考文献25教导了应通过同时敲除porA和cps上调nspA的表达。参考文献25-27公开了用于OMV产生的脑膜炎奈瑟球菌的其它敲除突变体。参考文献17公开了其中fHBP上调的囊泡。参考文献18公开了从经修饰表达6种不同PorA亚型的菌株构建囊泡。还可利用通过敲除参与LPS生物合成的酶获得的内毒素水平低的突变型奈瑟球菌[19、20]。这些或其它突变体均可用于本发明。

因此，在一些实施方式中，本发明所用的菌株表达一种以上PorA亚型。之前构建了6-价和9-价PorA菌株。该菌株可表达2、3、4、5、6、7、8或9种PorA亚型：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1和/或P1.18-1，3，6。在其它实施方式中，可下调菌株的PorA表达，例如，PorA的量相对于野生型水平(例如相对于参考文献29公开的H44/76菌株)减少了至少20％(例如，≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％等)，或甚至被敲除。

在一些实施方式中，菌株可以超表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可以超表达NspA、蛋白287[21]、fHBP[17]、TbpA和/或TbpB[22]、Cu、Zn-超氧化物歧化酶[22]等。如上所述，在一些实施方式中，脑膜炎球菌超表达(相对于相应的野生型菌株)HmbR抗原。因此，可将HmbR的编码基因置于导致表达超过野生型菌株的启动子的启动子控制下，或者可给菌株提供非天然HmbR编码序列，例如通过整合入染色体或质粒内。

对于囊泡生产，优选对脑膜炎球菌进行遗传工程改造以确保具有不会发生相变异的hmbR基因。参考文献23公开了减少或消除脑膜炎球菌中基因表达相变异的方法。例如，可将hmbR基因置于组成型或诱导型启动子的控制下，或通过去除或取代负责其相变异的DNA基序。

在一些实施方式中，菌株可以包括一个或多个敲除和/或参考文献24-27公开的超表达突变。要下调和/或敲除的优选基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[24]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[25]；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[26]；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC[27]。

在一些实施方式中，使用突变型菌株时，其可具有一个或多个或全部的以下特征：(i)LgtB和/或GalE下调或敲除，以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)TbpA上调；(iii)NhhA上调；(iv)Omp85上调；(v)LbpA上调；(vi)NspA上调；(vii)PorA敲除；(viii)FrpB下调或敲除；(ix)Opa下调或敲除；(x)Opc下调或敲除；(xii)cps基因复合体缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以为半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。

根据用于制备囊泡的脑膜炎球菌菌株，其可以包含或不包含菌株的天然HmbR抗原[28]。本发明可用含有HmbR或不含HmbR的囊泡，但如果所述囊泡是从超表达HmbR的菌株制得，其目的是为确保该囊泡含有HmbR。

如果LOS存在于囊泡中，可以对囊泡进行处理，以连接其LOS与蛋白质组分(“内泡”偶联[27])。

本发明可利用不同菌株的囊泡的混合物。例如，参考文献29公开了包含多价脑膜炎球菌囊泡组合物的疫苗，其包含衍生自在使用国度流行的血清亚型的脑膜炎球菌菌株的第一囊泡和衍生自无需具有在使用国度流行的血清亚型的菌株的第二囊泡。参考文献30公开了不同囊泡的有用组合。一些实施方式可利用L2和L3免疫型中各自菌株的囊泡组合。

用于工程改造HmbR-超表达菌株的三种有用的背景菌株是MC58、NZ05/33和GB013。MC58具有PorA血清亚型1.7，16；NZ05/33具有血清亚型1.7-2，4；GB013具有血清亚型1.22，9，

fHBP(H因子结合蛋白)

本发明组合物可包含fHBP抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

现已对fHBP作了详细表征。其还称为蛋白质′741′[参考文献40的SEQID 2535和2536]、‘NMB1870’、‘GNA1870’[参考文献31-33]、‘P2086’、‘LP2086’或‘ORF2086’[34-36]。它天然是一种脂蛋白，在所有脑膜炎球菌血清群中均有表达。通过NMR测定了fHbp的C-末端免疫显性结构域(‘fHbpC’)的结构[37]。蛋白质的该部分形成8-链β-筒(eight-strandedβ-barrel)，其链通过长度各异的环连接。该筒之前是短α-螺旋和柔韧的N-末端尾。

fHBP抗原有三种不同变体[38]，发现针对给定家族产生的血清在同一家族内具有杀菌性，但对表达其它两个家族之一的菌株无活性，即，具有家族内交叉保护作用，但没有家族间交叉保护作用。本发明可利用一种fHBP变体，但有用地包含来自两或三种变体的fHBP。因此，可利用两种或三种不同fHBP的组合，其选自：(a)第一蛋白，包含与SEQ ID NO：1有至少a％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；(b)第二蛋白，包含与SEQ ID NO：2有至少b％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；和/或(c)第三蛋白，包含与SEQ ID NO：3有至少c％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列。

a的值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。b的值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。c的值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。a、b和c的值彼此无关。

x的值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y的值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z的值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z的值彼此无关。

如果本发明利用一种fHBP变体，组合物可包含含有以下氨基酸序列的多肽：(a)包含与SEQ ID NO：1有至少a％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；或(b)包含与SEQ ID NO：2有至少b％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；或(c)包含与SEQ ID NO：3有至少c％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列。

如果本发明利用两种或三种变体的fHBP，组合物可包含两种或三种不同fHBP的组合，其选自：(a)第一多肽，包含与SEQ ID NO：1有至少a％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含与SEQ ID NO：2有至少b％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；和/或(c)第三多肽，包含与SEQ ID NO：3有至少c％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列。第一、第二和第三多肽具有不同的氨基酸序列。

如果本发明利用两种变体的fHBP，组合物可同时包含：(a)第一多肽，包含与SEQ ID NO：1有至少a％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ IDNO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；和(b)第二多肽，包含与SEQ ID NO：2有至少b％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：2的至少y个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。

如果本发明利用两种变体的fHBP，组合物可同时包含：(a)第一多肽，包含与SEQ ID NO：1有至少a％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ IDNO：1的至少x个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含与SEQ ID NO：3有至少c％序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO：3的至少z个毗连氨基酸的片段构成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。

在一些实施方式中，fHBP蛋白质可脂质化，例如在N-末端半胱氨酸处。在其它实施方式中，它们未脂质化。

287

本发明的组合物可包含287抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

287抗原包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB2132(GenBank登录号GI：7227388；本文的SEQ ID NO：9)。其后公开了许多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式可见于参考文献39的图5和15，参考文献40的实施例13和图21(其中的SEQID 3179到3184)。还报道了287抗原的各种免疫原性片段。

本发明所用的优选287抗原包含下述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：9有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：9的至少’n’个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：9的表位。

本发明的最有用287抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：9构成的脑膜炎球菌多肽。本发明所用的优选287抗原在给予对象后可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

NadA(奈瑟球菌粘附素A)

本发明的组合物可包含NadA抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

NadA抗原包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB1994(GenBank登录号GI：7227256；本文的SEQ ID NO：10)。其后公开了许多菌株的NadA抗原序列，奈瑟球菌粘附素的蛋白质活性也有充分记录。还报道了NadA的各种免疫原性片段。

本发明所用的优选NadA抗原包含下述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：10有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：10的至少’n’个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：10的表位。

本发明的最有用NadA抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：10构成的脑膜炎球菌多肽。本发明所用的优选NadA抗原在给予对象后可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO：6是一种此类片段。

NspA(奈瑟球菌表面蛋白A)

本发明的组合物可包含NspA抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

NspA抗原包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB0663(GenBank登录号GI：7225888；本文的SEQ ID NO：11)。之前从参考文献41和42已知该抗原。其后公开了许多菌株的NspA抗原序列。还报道了NspA的各种免疫原性片段。

本发明所用的优选NspA抗原包含下述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：11有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：11的至少’n’个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：11的表位。

本发明最有用的NspA抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：11构成的脑膜炎球菌多肽。本发明所用的优选NspA抗原在给予对象后可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

NhhA(奈瑟球菌hia同源物)

本发明的组合物可包含NhhA抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

NhhA抗原包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB0992(GenBank登录号GI：7226232；本文的SEQ ID NO：12)。此后公开了许多菌株的NhhA抗原的序列，例如参考文献39和43，还报道了NhhA的各种免疫原性片段。其也称为Hsf。

本发明所用的优选NhhA抗原包含下述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：12有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：12的至少’n’个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：12的表位。

本发明的最有用NhhA抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：12构成的脑膜炎球菌多肽。本发明所用的优选NhhA抗原在给予对象后可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

App(粘附素和穿透蛋白(penetration protein))

本发明的组合物可包含App抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

App抗原包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB1985(GenBank登录号GI：7227246；本文的SEQ ID NO：13)。此后公开了许多菌株的App抗原的序列。其也称为“ORF1”和“Hap”。还报道了App的各种免疫原性片段。

本发明所用的优选App抗原包含下述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：13有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：13的至少’n’个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：13的表位。

本发明的最有用App抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：13构成的脑膜炎球菌多肽。本发明所用的优选App抗原在给予对象后可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

Omp85(85kDa外膜蛋白)

本发明的组合物可包含Omp85抗原，其可以是从纯化HmbR抗原分离的纯化多肽或是与HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作为杂交多肽的一部分)。

Omp85抗原包含在脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因组序列中[109]，作为基因NMB0182(GenBank登录号GI：7225401；本文的SEQ ID NO：14)。此后公开了许多菌株的Omp85抗原的序列。Omp85的其它信息可见参考文献44和45。还报道了Omp85的各种免疫原性片段。

本发明所用的优选Omp85抗原包含下述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：14有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：14的至少’n’个毗连氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含SEQ ID NO：14的表位。

本发明的最有用Omp85抗原可引发抗体，给予对象后，其能结合氨基酸序列SEQ ID NO：14构成的脑膜炎球菌多肽。本发明所用的优选Omp85在给予对象后抗原可引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

杂交多肽

在一些实施方式中，本发明提供包含式-A-[-X-L-]_n-B-所示氨基酸序列的杂交多肽，式中：X是包含脑膜炎球菌抗原序列的氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数(n通常是2或3)。

至少一个X部分是HmbR抗原，如上文所定义。理想地，至少一个其它X部分选自：fHBP；287；NadA；NspA；NhhA；App；和/或Omp85。

将至少两个(例如，2、3、4、5或更多)抗原表达成一条多肽链(“杂交”多肽)主要有两个优点：第一，本身不稳定或表达差的多肽可通过加入克服该问题的合适杂交伴侣来协助；第二，商业生产简化成只需采用一次表达和纯化即可产生可用作抗原的两种多肽。

如果-X-部分具有其野生形式的前导肽序列，杂交蛋白质中可包含或省去它。在一些实施方式中，除了位于杂交蛋白质的N-末端的-X-部分的前导肽，所述前导肽缺失，即，X₁的前导肽保留，而X₂...X_n的前导肽省去。这相当于删除所有前导肽，利用X₁的前导肽作为部分-A-。

对于[-X-L-]的各种情况的n，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，当n＝2时，该杂交体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如，20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即，包含Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)和组氨酸标签(即，His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。其它合适的接头氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。一种有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：15)或GSGSGGGG(SEQID NO：16)，其中Gly-Ser二肽从BamHI限制性位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)₄四肽是典型的聚-甘氨酸接头。其它合适的接头，特别是用作最终L_n的是Leu-Glu二肽。

-A-是任选的N-末端氨基酸序列。其通常较短(例如，40个或更少的氨基酸，即，40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。其它合适的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。如果X₁缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，优选-A-为提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，含1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，例如Met-Ala-Ser或单个Met残基。

-B-是任选的C-末端氨基酸序列。其通常较短(例如，40个或更少的氨基酸，即，39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，包含组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高，例如SEQ ID NO：17)，或增强蛋白质稳定性的序列。其它合适的C-末端氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。

LOS

脑膜炎球菌HmbR抗原可与纯化的脑膜炎球菌脂寡糖(LOS)联用。LOS可以其本身使用，或偶联于载体。偶联时，偶联可经LOS中的脂质A部分或通过任何合适的部分，例如KDO残基。如果LOS的脂质A部分不存在，则需要这种替代连接。

本发明所用的LOS可来自任何免疫型，例如L2、L3、L7等。

优选利用修饰形式，而非天然的LOS。可通过化学方法实现这些修饰，但敲除Men-B中负责某些生物合成添加的酶更方便。例如，可修饰LOS以去除至少天然乳糖-N新四糖单位的末端Gal，这种修饰可通过敲除一个或多个相关酶得以实现。可敲除负责在天然LOS中加入两个末端单糖(唾液酸和半乳糖)的酶，从而恰好消除末端Sia或消除Sia-Gal二糖。例如，敲除lgtB基因去除了Sia-Gal。敲除galE基因还提供有用的修饰LOS。可敲除脂质A脂肪转移酶基因[46]。

可从LOS中去除至少一个一级O-连接脂肪酸[47]。还可利用每个LOS分子的二级酰基链数量减少的LOS[48]。LOS可没有α链。

LOS可包含GlcNAc-Hep₂磷酸乙醇胺-KDO₂-脂质A[49]。

脑膜炎球菌荚膜糖

脑膜炎球菌HmbR抗原可与一种或多种脑膜炎球菌荚膜糖联用，所述荚膜糖通常偶联于载体蛋白。

针对血清群C的偶联单价疫苗已被批准用于人，其包括MENJUGATE^TM、MENINGITEC^TM和NEISVAC-C^TM。已知血清群A+C的偶联物的混合物[50，51]，已报道了血清群A+C+W135+Y的偶联物的混合物[52-55]，2005年作为MENACTRA^TM产品得到批准。

本发明组合物可包含脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的1、2、3或4种的荚膜糖的一种或多种偶联物，例如A+C，A+W135，A+Y，C+W135，C+Y，W135+Y，A+C+W135，A+C+Y，A+W135+Y，A+C+W135+Y，等等。理想的是包含血清群A、C、W135和Y所有四种的糖的组分。

血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，其中C3和C4位有部分O-乙酰基化。C-3位的乙酰化可以是70-95％。用于纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但在该C-3位保留OAc是有用的。在一些实施方式中，血清群A糖中至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％或更多)的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰基化。乙酰基可被封闭基团取代以避免水解[56]，这种改性的糖仍然是本发明涵义内的血清群A糖。

血清群C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，或“NeuNAc”)的均聚物。糖结构书写为→9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8位具有O-乙酰基团，但约15％的临床分离物缺乏这些O-乙酰基[57，58]。OAc基团的存在与否产生独特表位，抗体与糖结合的特异性可影响其对O-乙酰化(OAc+)和脱-O-乙酰化(OAc-)菌株的杀菌活性[59-61]。本发明所用的血清群C糖可以从OAc+或OAc-菌株获得。许可的MenC偶联物疫苗同时包含OAc-(NEISVAC-C^TM)和OAc+(MENJUGATE^TM和MENINGITEC^TM)糖。在一些实施方式中，用于制备血清群C偶联物的菌株是例如血清型16，血清亚型P1.7a，1等的OAc+菌株，。因此，可使用C:16:P1.7a，1OAc+菌株。也可使用血清亚型P1.1的OAc+菌株，例如C11菌株。

血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。与血清群C糖一样，其具有可变的O-乙酰化，但位于唾液酸7和9位[62]。结构书写为：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。

血清群Y糖类似于血清群W135糖，只是二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。与血清群W135一样，其在唾液酸7和9位具有可变的O-乙酰化[62]。血清群Y的结构书写为：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。

本发明所用的糖可以如上所述O-乙酰化(例如，与在天然荚膜糖中所见相同的O乙酰化模式)，或者可以在糖环的一个或多个位置部分或完全脱-O-乙酰化，或者可相对于天然荚膜糖超-O-乙酰化。

偶联物中的糖部分可包含由脑膜炎球菌制备的全长糖，和/或可包含全长糖的片段，即所述糖可短于细菌中所见的天然荚膜糖。因此，糖可以解聚，解聚发生在糖纯化期间或者之后、但在偶联之前。解聚降低糖的链长度。一种解聚方法包括使用过氧化氢[52]。将过氧化氢加入糖中(例如，使H₂O₂终浓度为1％)，然后温育混合物(例如在约55℃)直到实现所需的链长降低。另一种解聚方法包括酸水解[53]。其它解聚方法是本领域已知的。用于制备本发明所用偶联物的糖可以通过这些解聚方法中的任一种获得。可利用解聚提供对于免疫原性最佳的链长和/或为达到糖的物理可操作性而降低链长。在一些实施方式中，糖具有以下平均聚合度(Dp)范围：A＝10-20；C＝12-22；W135＝15-25；Y＝15-25。在分子量而非Dp方面，对于所有血清群的有用范围是：＜100kDa；5kDa-75kDa；7kDa-50kDa；8kDa-35kDa；12kDa-25kDa；15kDa-22kDa。

在一些实施方式中，脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y各自的糖的平均分子量可超过50kDa，例如≥75kDa，≥100kDa，≥110kDa，≥120kDa，≥130kDa，等等[63]，甚至最高达1500kDa，具体通过MALLS测定。例如：MenA糖可以处于50-500kDa，如60-80kDa范围；MenC糖可以处于100-210kDa范围；MenW135糖可以处于60-190kDa，如120-140kDa范围；和/或MenY糖可以处于60-190kDa，如150-160kDa范围。

组合物中每种血清群的脑膜炎球菌糖的质量通常在1微克(μg)到20μg之间，例如每种血清群2-10μg，或约4μg或约5μg或约10μg。如果包括来自多于一种血清群的偶联物，它们可以基本上相等的质量存在，例如各血清群糖的质量在彼此的+10％内。作为相等比例的替代形式，可利用双倍质量的血清群A的糖。因此，疫苗可包含10μg MenA糖以及各5μg的MenC、W135和Y糖。

优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉毒素或破伤风毒素，或其类毒素或突变体。这些载体通常用于偶联物疫苗。特别优选CRM₁₉₇白喉毒素突变体[64]。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[65]、合成肽[66，67]、热激蛋白[68，69]、百日咳蛋白[70，71]、细胞因子[72]、淋巴因子[72]、激素[72]、生长因子[72]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[73]如N19[74]、流感嗜血杆菌(Hameophilusinfluenzae)的D蛋白[75-77]、肺炎球菌溶血素[78]或其无毒衍生物[79]、肺炎球菌表面蛋白PspA[80]、铁摄取蛋白[81]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[82]、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[83]，等等。一种载体蛋白可携带多种不同血清群的糖[84]，但不优选这种配置。如果组合物包含多于一种脑膜炎球菌血清群的偶联物，则各种偶联物可利用不同载体蛋白(例如，一种血清群偶联于CRM197，另一种偶联于破伤风类毒素)或者它们可利用相同的载体蛋白(例如，两种血清群的糖分别偶联于CRM197，然后混合)。

可使用糖∶蛋白质比例(w/w)在1∶5(即蛋白质过量)和5∶1(即糖过量)之间的偶联物，例如比例在1∶2到5∶1之间，比例在1∶1.25到1∶2.5之间。如参考文献85所述，混合物中不同的脑膜炎球菌血清群偶联物可具有不同的糖∶蛋白质比例，例如一种的比例在1∶2到1∶5之间，而另一种的比例在5∶1到1∶1.99之间。

载体分子可直接或经接头共价偶联于葡聚糖。已知各种接头，例如，可通过将游离-NH₂基团(例如通过胺化引入糖)偶联于己二酸(采用，例如二酰亚胺活化)得到的己二酸接头，然后将蛋白质偶联于得到的糖-己二酸中间体[86，87]。另一优选的连接类型是羰基接头，其可通过将修饰的葡聚糖的游离羟基与CDI反应得到[88，89]，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接键。其它接头包括β-丙酰胺基[90]、硝基苯基-乙基胺[91]、卤代酰基卤化物[92]、糖苷键[93]、6-氨基己酸[94]、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)[95]、己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide)ADH[96]、C₄-C₁₂部分[97]等。也可采用碳二亚胺缩合反应[98]。

如参考文献99所述，混合物可包含一种糖/蛋白直接连接的偶联物和另一种通过接头连接的偶联物。当使用来自不同脑膜炎球菌血清群的糖偶联物时这种设置尤其适用，例如MenA和MenC糖可通过接头偶联，而MenW135和MenY糖则直接偶联于载体蛋白。

如果组合物包含MenA、C、W和/或Y偶联物中的一种或多种，在一些实施方式中，优选还包含Hib偶联物(B型流感嗜血杆菌荚膜糖)。如果组合物包含来自多于一种的脑膜炎球菌血清群的糖，则每种血清群有平均糖质量。如果使用基本相等质量的各血清群，则平均质量与各单独质量相同；如果使用不相等的质量，则平均质量不同，例如，对于10∶5∶5∶5μg的MenACWY混合物，平均质量为每血清群6.25μg。如果还包含Hib糖，则在一些实施方式中，其质量与每血清群的脑膜炎球菌糖的平均质量基本相同。在一些实施方式中，Hib糖的质量大于每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量(例如，至少1.5倍)。在一些实施方式中，Hib糖的质量小于每血清群的脑膜炎球菌糖平均质量(例如，至少1.5倍)[100]。

用于展示HmbR的非脑膜炎球菌细菌

在本发明的一些实施方式中，脑膜炎球菌HmbR抗原由非脑膜炎球菌细菌，例如大肠杆菌细菌呈递。

因此，本发明提供表达脑膜炎球菌HmbR的非脑膜炎球菌细菌。该细菌通常是革兰氏阴性细菌。理想的是大肠杆菌(Escherichia coli)细菌。所述细菌可组成型表达异源HmbR抗原，或者hmbR基因可以处于诱导型启动子的控制下。

该菌株可具有缺陷型Tol-Pal系统，从而其在正常生长期间自发释放囊泡，藉此避免对洗涤剂提取的任何需求，等等。大肠杆菌的此类Tol-Pal突变体公开于，例如参考文献101和102，例如不表达功能性TolR蛋白质的菌株，如含有tolR敲除。

本发明还提供从此类非脑膜炎球菌细菌制备的外膜囊泡以及从此类非脑膜炎球菌细菌产生囊泡的方法。

药物组合物

可采用本发明制备给予患者的药物组合物。这些药物组合物通常包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的充分讨论见参考文献103。

可常规确定有效剂量体积，但该组合物的典型人用剂量是约0.5ml的体积，例如以便肌内注射。通过肌内注射将0.5ml体积的RIVM OMV疫苗给予大腿或上臂[104]。通过肌内注射将0.5m1的MeNZB^TM给予大腿前外侧或手臂的三角肌区域。其它递送途径可采用类似剂量，例如雾化的鼻内OMV疫苗的体积是每次喷雾约100μl或约130μl，给予四次喷雾获得的总剂量是约0.5ml。

本发明组合物的pH通常是6-8，更优选6.5-7.5(例如，约7)。RIVM OMV疫苗的pH是7.4[105]，本发明组合物优选pH＜7.5。利用10mM Tris/HCl缓冲液维持RIVM OMV疫苗的pH，可利用缓冲液，例如Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液或组氨酸缓冲液维持本发明组合物的稳定pH。因此，本发明组合物通常包含缓冲液。

组合物可以无菌和/或无热原。本发明组合物对于人可以是等渗的。

给予患者的本发明组合物是免疫原性的，更优选疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即，防止感染)或治疗性的(即，治疗感染)，但通常是预防性的。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学有效量的抗原以及需要的任何其它组分。“免疫学有效量”表示将该用量以单剂量或作为一系列剂量的一部分给予个体对于治疗或预防是有效的。该用量根据待治疗个体的健康和身体条件、年龄、分类学组别(例如，非人灵长类、灵长类等)、该个体的免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗的配方、治疗医师对医学状况的评估和其它相关因素而有所不同。预计该用量落在通过常规试验可确定的较宽范围中。通常以每剂量的蛋白质含量表示本发明组合物的抗原含量。OMV鼻内疫苗的剂量通常是每毫升约0.9毫克蛋白质。

本发明组合物可包含免疫学佐剂。因此，例如，它们可包含铝盐佐剂或水包油乳液(例如，水包角鲨烯乳液)。合适的铝盐包括氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)(例如，参见参考文献106的第8和9章)，或它们的混合物。盐可采取任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)，优选抗原吸附于盐。给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于5mg/ml，例如，≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值是0.85mg/剂。氢氧化铝佐剂尤其适用于脑膜炎球菌疫苗。

脑膜炎球菌影响身体的各个部分，因此本发明组合物可以制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为溶液或悬浮液形式的注射剂。可利用细喷雾制备用于肺部给药的组合物，例如通过吸入器。可制备组合物用于鼻、耳或眼部给药，例如作为喷雾剂或滴剂。通常是肌内给药的注射剂。

本发明组合物可包含抗菌剂，特别是包装成多剂量形式之时。疫苗中通常有抗菌剂，例如硫柳汞和2-苯氧基乙醇，但优选利用无汞防腐剂或完全不含防腐剂。

本发明组合物可包含去污剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。去污剂通常是低水平的，例如＜0.01％。

本发明组合物可包含制备OMV的残留去污剂(例如，脱氧胆酸盐)。每μgMen-B蛋白的残留去污剂含量优选低于0.4μg(更优选低于0.2μg)。

如果本发明组合物包含LOS，每μg蛋白的LOS含量优选低于0.12μg(更优选低于0.05μg)。

本发明组合物可包含钠盐(例如，氯化钠)以获得张力。典型的浓度是10±2mg/ml NaCl，例如约9mg/ml。

治疗方法

本发明还提供在哺乳动物中产生免疫应答的方法，包括将本发明的组合物给予该哺乳动物。免疫应答优选是保护性的，优选包括抗体。该方法可在已针对脑膜炎奈瑟球菌作过初免的患者中产生加强应答。

哺乳动物优选人。如果疫苗是作预防性应用，则人优选儿童(例如，学步儿童或婴儿)或青少年；如果疫苗是作治疗性应用，则人优选成年人。打算用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。

本发明还提供用作药物的本发明组合物。所述药物优选用于在哺乳动物中产生免疫应答(即，其是免疫原性组合物)，更优选是疫苗。

本发明还提供本发明组合物在制备在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的应用。本发明还提供以下物质在制备在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的应用：(i)脑膜炎球菌HmbR抗原；和(ii)脑膜炎球菌外膜囊泡。本发明还提供以下物质在制备在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的应用：(i)脑膜炎球菌HmbR抗原；和(ii)以下脑膜炎球菌抗原中的一种或多种：fHBP；287；NadA；NspA；NhhA；App；Omp85；LOS。本发明还提供以下物质在制备在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的应用：(i)脑膜炎球菌HmbR抗原；和(ii)脑膜炎球菌荚膜糖的偶联糖。

这些应用和方法优选用于预防和/或治疗脑膜炎奈瑟球菌所致疾病，例如细菌性(或者，更具体地说脑膜炎球菌性)脑膜炎或败血症。

一种检测治疗性治疗功效的方法包括给予本发明组合物后监测奈瑟菌感染。一种检测预防性治疗功效的方法包括给予组合物后监测针对抗原的免疫应答。本发明组合物的免疫原性可用以下方法测定：将其给予测试对象(例如12-16月大的儿童或动物模型[107])，然后检测包括血清杀菌抗体(SBA)以及ELISA效价在内的标准参数(GMT)。这些免疫应答通常应在组合物给药约4周后测定，并与该组合物给药前测定的值相比较。优选SBA提高至少4倍或8倍。如果给予多于一次剂量的组合物，可以进行多于一次的给药后测定。

本发明组合物通常在给予对象后能诱导血清杀菌抗体应答。这些应答不难在小鼠中检测，并且是疫苗功效的标准指标。血清杀菌活性(SBA)衡量补体介导的细菌杀死作用，可利用人或幼兔补体检测。WHO标准要求疫苗在超过90％的受试者中诱导SBA升高至少4-倍。给予第三剂量后4-6周，MeNZB^TM引发SBA升高4倍。

优选组合物可以在人对象患者体内产生的抗体效价优于可接受百分比对象的血清保护力标准。抗原及相关抗体效价(高于其认为宿主对该抗原发生血清转化)是众所周知的，并且这些效价由例如WHO等组织公布。优选大于80％的具有统计学意义的对象样品发生血清转化，更优选大于90％，还优选大于93％，最优选96-100％。

本发明组合物通常直接给予患者。直接递送可通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或注射至组织间隙)，或通过任何其它合适途径实现。本发明可用于引发全身性和/或粘膜免疫力。优选肌内给药至大腿或上臂。注射可以通过针头(例如皮下针头)，但还可采用无针头注射。典型的肌内剂量是0.5ml。

剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。可以在初次剂量方案之后实施加强剂量方案。可常规确定初免剂量之间(例如4-16周之间)以及初免和加强之间的适当间隔时间。采用3-或4-剂量初免方案测试基于OMV的RIVM疫苗，在第0、2和8或0、1、2和8月接种。以6周间隔给予3剂量的MeNZB^TM。

可利用本发明组合物诱导针对多于一种的脑膜炎球菌超毒力谱系的杀菌抗体应答。具体地说，它们可优选诱导针对以下三种超毒力谱系中2或3种的杀菌应答：(i)簇A4；(ii)ET5复合体；和(iii)谱系3。它们还可诱导针对超毒力谱系亚群I、亚群III、亚群IV-1或ET-37复合体中一种或多种以及针对其它谱系，例如超侵袭性谱系的杀菌抗体应答。这并不一定表示该组合物可诱导针对这些超毒力谱系内各脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体；而是，例如对于任何给定的由特定超毒力谱系中的4种或更多脑膜炎球菌菌株构成的组而言，该组合物诱导的抗体针对该组的至少50％(例如60％、70％、80％、90％或更高)具有杀菌活性。优选的菌株组包括从以下至少4个国家分离的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清优选具有至少1024的杀菌效价(例如2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，例如，所述血清在稀释为1/1024时能够杀死特定菌株至少50％的测试菌。

有用组合物可诱导针对以下血清群B脑膜炎球菌菌株的杀菌应答：(i)来自簇A4，菌株961-5945(B:2b:P1.21，16)和/或菌株G2136(B:-)；(ii)来自ET-5复合体，菌株MC58(B:15:P1.7，16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7，16)；(iii)来自谱系3的，菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)。更优选组合物可诱导对菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌应答。

菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌MLST参照菌株[参考文献108中是638和1002]。菌株MC58可广泛获得(例如，ATCC BAA-335)，在参考文献109中对此菌株进行了测序。菌株44/76已被广泛应用和鉴定(例如，参考文献110)，其是奈瑟菌MLST对照菌株之一[参考文献108中是237；参考文献15中表2第32行]。菌株394/98最初于1998年在新西兰分离得到，采用该菌株已发表了几篇研究(例如，参考文献111和112)。菌株BZ198是另一种MLST对照菌株[参考文献108中是409；参考文献15中表2第41行]。

其它抗原性组分

除了含有脑膜炎奈瑟球菌的抗原，组合物可包含其它病原体的抗原。例如，所述组合物可包含以下其它抗原中的一种或多种：

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原，例如糖(通常是偶联的)；

-乙型肝炎病毒的抗原，例如表面抗原HBsAg；

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3联用；

-白喉抗原，如白喉类毒素；

-破伤风抗原，例如破伤风类毒素；

-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B(Hib)的糖抗原，通常是偶联的；

-灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。

白喉抗原包含在组合物中时，其还优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。类似地，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。

如果包含Hib糖(通常是偶联物)，该糖部分可以是多糖(例如，从细菌纯化的全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但也可能通过，例如水解将纯化的糖断裂以制备寡糖(例如，分子量约1-约5kDa)。组合物中Hib偶联物的浓度通常处于0.5μg-50μg，例如1-20μg、10-15μg、12-16μg等等。在一些实施方式中，该含量可以是约15g，或约12.5μg。低于5μg的含量可能是合适的[113]，例如处于1-5μg、2-4μg或约2.5μg。如上所述，在包含Hib糖和脑膜炎球菌糖的组合中，可根据后者的剂量(具体地说，对于具有多种脑膜炎球菌血清群的情况而言，为它们的平均质量)选择前者的剂量。Hib偶联物的其它特征如上文脑膜炎球菌偶联物所述，包括载体蛋白(例如，CRM197或破伤风类毒素)、连接键、比例等的选择。

如果包含肺炎链球菌抗原，其可以是多肽或糖。偶联荚膜糖尤其可用于对肺炎球菌进行免疫。糖可以是具有从细菌纯化糖期间产生的大小的多糖，或者其可以是通过将这种多糖断裂获得的寡糖。例如，在7-价PREVNAR^TM产品中，糖中的6种呈现为完整的多糖，而一种(18C血清型)呈现为寡糖。组合物可包含以下肺炎球菌血清型中一种或多种的荚膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。组合物可包含多种血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种血清型。本领域已知7-价、9-价、10-价、11-价和13-价偶联物组合，以及23-价未偶联组合。例如，10-价组合可包含血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖。11-价组合还可包含血清型3的糖。可将12-价组合加入10-价混合物：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；r22F和15B；可将13-价组合加入11-价混合物：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F，等等。肺炎球菌偶联物的其它特征如上文脑膜炎球菌偶联物所述，包括载体蛋白(例如，CRM197或破伤风类毒素)、连接键、比例等的选择。如果组合物包含多于一种的偶联物，各偶联物可利用相同或不同的载体蛋白。参考文献114描述了在多价肺炎球菌偶联物疫苗中利用不同载体蛋白时的潜在优势。

概要

除非另有说明，实施本发明可采用本领域已知的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。文献中完整描述了此类技术。参见，例如参考文献115-121，等等。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由......构成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X构成，或可以包括其它物质，例如X+Y。

关于数值x的术语“约”是任选的，表示，例如x±10％。

如果本发明涉及“表位”，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位，但通常是B-细胞表位。可凭经验鉴定此类表位(例如，采用PEPSCAN[122、123]或类似的方法)，或者可预测它们(例如，采用Jameson-Wolf抗原性指数[124]、基质方法[125]、MAPITOPE[126]、TEPITOPE[127、128]、神经网络[129]、OptiMer&EpiMer[130、131]、ADEPT[132]、Tsites[133]、亲水性[134]、抗原性指数[135]或参考文献136-140公开的方法，等等)。表位是抗体的抗原结合位点或T-细胞受体识别并结合的抗原诸部分，它们还称为“抗原决定簇”。

如果本发明利用“纯化的”抗原，该抗原从其天然产生的环境中分离。例如，除了存在任何其它纯化抗原外，该抗原基本上不含其它脑膜炎球菌组分。一般通过分别纯化各抗原，然后重新混合它们来制备纯化抗原的混合物，即便两种抗原天然混合在一起。

述及两条氨基酸序列之间的序列相同性百分比表示比对时，两条序列比较中相同的氨基酸百分比。可利用本领域已知的软件程序测定该比对和同源性或序列相同性百分比，例如参考文献141的7.7.18章描述的那些。通过Smith-Waterman同源性检索算法，利用仿射空位检索(affine gap search)测定优选的比对，其中空位罚分12，空位延伸罚分2，BLOSUM矩阵62。参考文献142公开了Smith-Waterman同源性检索算法。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上”不含Y的组合物可以完全不含Y。需要时，“基本上”这个词可以从本发明的定义中省略。

附图简述

图1显示在有(正方形)或没有(菱形)去铁胺存在下，MC58(图1A)或M1239(图1B)培养物的生长曲线(OD相对以分钟表示的培养时间)。

图2显示利用抗-HmbR血清的蛋白质印迹。四条泳道从左至右是：MC58、去铁胺^-；MC58、去铁胺⁺；M1239、去铁胺^-；M1239、去铁胺⁺。箭头显示HmbR。

图3同图2，但血清是抗-Tbp2血清。箭头显示Tbp2。

图4显示MC58的FACS分析。从左至右的三列是不同标记的抗体：免疫前；抗-HmbR-2；抗-Tbp2。两行是没有(上)或有(下)去铁胺存在下的细菌生长情况。图5与图4相同，除了菌株是M1239。

图6是显示以下情况中HmbR表达的蛋白质印迹：(1和8)野生型MC58；(2)内源性hmbR基因敲除的MC58；(3-7)含IPTG-诱导型启动子控制的外源性hmbR基因的敲除菌株，IPTG为0、0.001、0.01、0.1或1mM；(9)用去铁胺培养的野生型MC58；和(10)野生型NZ菌株。

图7是显示GB013菌株中HmbR表达的蛋白质印迹：wt＝野生型GB013；k/o＝GB013ΔhmbR；c＝GB013ΔhmbR-chmbR。分析各菌株的0.5或1μg蛋白。

图8是各种菌株的外膜材料的蛋白质印迹。泳道1-3含有不同稀释度的重组HmbR-2。泳道5是含有异源脑膜炎球菌hmbR基因的大肠杆菌BL21菌株。泳道12是补体致活的GB013菌株。其它泳道是对照。

图9是大肠杆菌BL21菌株自身诱导生长后所得组分的蛋白质印迹。泳道2-6是ΔtolR菌株；泳道8-12是DE3^*菌株。泳道4、6、9和10显示HmbR的强条带。

图10显示大肠杆菌ΔtolR菌株中HmbR表达的FACS分析。表达HmbR的菌株的峰在右侧。

图11是各种菌株的囊泡的蛋白质印迹。泳道1-3含有不同稀释度的重组HmbR-2。泳道5、7和9是表达HmbR的大肠杆菌ΔtolR菌株，稀释度降低。泳道11和12是不含TolR修饰的BL21菌株。

本发明实施方式

许多脑膜炎球菌分离物不包含hmbR基因。此外，在hmbR⁺菌株中，基因表达经历相变异[143]，这是DNA水平可逆改变导致相开启和关闭之间的基因表达改变。相变异是许多病原体中控制表面暴露毒力因子表达的共有机制。

在一组III谱系菌株中，12种菌株中有10种检测到hmbR基因。在所有10种菌株中，该基因是MC58菌株保守性的。

hmbR基因克隆自菌株NZ05/33。包括前导肽在内的编码序列是2373bp加上终止(序列)(SEQ ID NO：18)，编码791个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：19)。制备该序列的几种衍生物以供表达：(i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸24-170的‘HmbR-塞(plug)’(即，SEQ ID NO：20)，融合于C-末端聚组氨酸标签；(ii)具有SEQ ID NO：19的氨基酸171-191的‘HmbR-下(down)’(即，SEQ ID NO：21)，融合于C-末端聚组氨酸标签；(iii)具有SEQ ID NO：19的氨基酸24-791的‘HmbR-2’(即，SEQ ID NO：22)，省去前导肽，融合于C-末端聚组氨酸标签；和(iv)具有SEQ ID NO：19的氨基酸1-791的‘HmbR-3’，融合于C-末端聚组氨酸标签。

将编码这些多肽的载体转化入大肠杆菌BL21细胞以供表达。纯化表达的多肽，用于免疫小鼠。HmbR-塞具有可溶性，分子量为16kDa。HmbR-下(68kDa)不可溶，但可利用8M脲溶解以供免疫。HmbR-2(85kDa)不可溶，但可利用2M脲溶解以供免疫。联用这3种纯化的多肽和完全弗氏佐剂(FCA)免疫小鼠，通过SBA测试免疫血清。还如此测试了HmbR-塞和HmbR-下的混合物。

HmbR多肽无一能在小鼠中诱导杀菌抗体(所有SBA滴度效价＜16)。此外，血清不能检测同源菌株NZ05/33中HmbR的表面暴露(FACS试验)。但是在蛋白质提取物中，血清能检测hmbR⁺菌株(除了M01-240149)中的蛋白质。

尽管缺乏SBA活性，仍进行了进一步的实验。用在25μM去铁胺存在下培养的细菌检验抗-HmbR抗血清，从而限制细菌对铁的利用。培养了两种菌株：hmbR⁺菌株(MC58)和hmbR^-菌株(M1239)。有去铁胺存在下菌株生长情况差很多(图1A和1B)。

采用蛋白质印迹和FACS分析评估表达。为作比较，Tbp2用作阳性对照，因为之前报道该蛋白质表达在低铁条件下诱导。

蛋白质印迹分析显示在低铁条件下MC58中的HmbR表达升高，但M1239在任何条件下均未观察到(图2)。相比之下，在低铁条件下，两种菌株均表达Tbp2(图3)。FACS分析确认在低铁条件下，MC58中免疫可接近HmbR表达升高(图4)，但M1239中不是(图5)。

与以上报道的SBA结果相反，当用在低铁条件下生长的菌株检验血清时，观察到杀菌效价升高。用没有(OD 0.25的细菌)或有(OD 0.16的细菌)去铁胺存在下培养的MC58检验抗-HmbR血清，与阳性对照杀菌抗血清相比，效价如下所示：

	去铁胺-	去铁胺+
			抗-HmbR	＜16	256
阳性对照	8192	≥8192

进一步的实验确认用不同HmbR衍生物(或它们的组合)产生的血清对在无去铁胺培养基中培养的菌株MC58没有杀菌活性，但对在有25μM去铁胺存在下培养的MC58显示出一定的杀菌活性。利用HmbR-2产生的血清观察到去铁胺培养细菌的背景以上效价。

这些实验是对抗-HmbR抗体对脑膜炎球菌有杀菌活性的首次报道。因此，与以前的报道相反，抗-HmbR抗体可能确实在保护免遭脑膜炎球菌感染和疾病中发挥作用，具体是在HmbR在细菌表面表达的生长期间。因此，HmbR可用于脑膜炎球菌疫苗，特别是如果与一种或多种其它脑膜炎球菌抗原联用的话。在工程改造细菌中去除其相变异性提供便于制备HmbR⁺囊泡的菌株。

除了利用去铁胺，尝试了提高HmbR表达的其它方法。在人血红蛋白存在下的生长可提高HmbR表达[143]，不表达Fur阻遏蛋白的fur突变体还可表达最大量的HmbR。检测这两种条件下的HmbR表达水平，并进行SBA。

在4μM人血红蛋白存在下的生长未将HmbR表达水平提高到超过利用去铁胺时所见水平。因此，利用抗-HmbR血清的SBA效价较低。

fur突变体显示良好水平的HmbR表达，但该菌株不能用于SBA，因为其被补体杀死而不用血清。

利用铁螯合剂的两个连续培养步骤也未提高MC58的SBA效价。用NZ菌株观察到小幅升高，但该升高可能(至少部分)是因为试验中的洗涤步骤；该步骤有时可削弱细菌。

总之，这些结果支持高水平HmbR表达和细菌杀死作用之间有相关性。

在进一步的实验中，工程改造MC58菌株去除其内源性hmbR基因。敲除的基因由IPTG-诱导型启动子控制的外源性hmbR基因补充。图5显示该工程改造的菌株可表达远高于野生型菌株的水平的HmbR，例如，泳道6和7。还采用FACS，利用HmbR-2、HmbR-下和HmbR-塞产生的血清研究表面表达。FACS实验确认野生型菌株的表面表达极低，敲除菌株无表面表达，无IPTG培养的敲除菌株无表面表达，但在IPTG诱导后具有良好表达。用0.1和1mMIPTG诱导观察到类似的高水平。

对这些菌株进行的SBA实验显示HmbR的高表达和表面暴露使得菌株对补体更敏感。高IPTG水平下，单用补体(家兔或人)杀死细菌，但IPTG对野生型菌株无作用。实验显示HmbR超表达菌株结合单独的补体，该结合作用不依赖于所用的抗血清。

还利用菌株GB013作为背景获得敲除和超表达菌株，从而得到敲除菌株(GB013ΔhmbR)和补体致活菌株(GB013ΔhmbR-chmbR)。互补基因来自NZ菌株。这些GB013菌株显示与MC58菌株类似的表达、FACS和SBA的结果。

总之，数据表明有家兔/人补体存在下细菌可耐受的HmbR表达存在临界阈值。

从GB013菌株制备OMV。图7显示利用抗-HmbR-2多克隆血清的三种菌株的OMV蛋白质印迹。OMV制品中的蛋白质浓度是0.272mg/ml(wt)、0.504mg/ml(ΔhmbR)和0.457mg/ml(补体致活的)。图7显示HmbR相比于野生型背景菌株的超表达。

在进一步的工作中，工程改造大肠杆菌菌株以表达NZ菌株的脑膜炎球菌HmbR。用pET21b hmbR转化BL21菌株(BL21DE3^*)。蛋白质印迹确认该菌株表达HmbR(例如，图8的泳道5)。还用pET21b hmbR转化大肠杆菌的ΔtolR菌株[101，102]以提供在生长期间释放含HmbR囊泡的菌株(例如，图9的泳道4和6)。FACS确认两种菌株均表达HmbR，例如，参见图10的ΔtolR菌株可。确认从ΔtolR菌株制备的囊泡含有HmbR(例如，图11的泳道5)。

将脑膜炎球菌GB013菌株和大肠杆菌菌株的OMV用作免疫。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可进行改进而仍保持在本发明的范围和构思内。

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Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含(i)脑膜炎球菌HmbR抗原和(ii)脑膜炎球菌外膜囊泡。

2.一种工程改造的脑膜炎球菌细菌，该细菌超表达脑膜炎球菌HmbR抗原。

3.一种工程改造的脑膜炎球菌细菌，该细菌包含hmbR基因，其表达不是相可变的。

4.一种工程改造的脑膜炎球菌细菌，该细菌组成型表达HmbR。

5.一种工程改造的脑膜炎球菌细菌，该细菌包含诱导型启动子控制下的hmbR基因。

6.从如权利要求2、3、4或5所述的细菌制备的外膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含脑膜炎球菌HmbR抗原。

7.一种制备脑膜炎球菌膜囊泡的方法，包括使如权利要求2、3、4或5所述的脑膜炎球菌破裂以提供囊泡的步骤。

8.一种免疫原性组合物，其包含(i)脑膜炎球菌HmbR抗原和(ii)选自下组的一种或多种脑膜炎球菌抗原：fHBP；287；NadA；NspA；NhhA；App；Omp85；和LOS。

9.一种免疫原性组合物，其包含(i)脑膜炎球菌HmbR抗原和(ii)一种或多种血清群A、C、W135或Y的偶联的脑膜炎球菌荚膜糖。

10.一种杂交多肽，其包含下式所示氨基酸序列：

NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH

其中：X是包含脑膜炎球菌抗原序列的氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数，条件是至少一个X部分是HmbR抗原。

11.如权利要求6所述的杂交多肽，其特征在于，X部分选自下组：fHBP；287；NadA；NspA；NhhA；App和Omp85。

12.一种免疫原性组合物，其包含以下的混合物：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的多肽；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的多肽；(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的多肽；和(iv)HmbR抗原。

13.如以上权利要求中任一项所述的组合物、细菌、囊泡、方法或多肽，其特征在于，所述HmbR包含与SEQ ID NO：7有至少80％序列相同性的和/或包含SEQ ID NO：7的表位的氨基酸序列。