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CN102272601B - 采用鉴定剂分离和表征微生物的方法 - Google Patents

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CN102272601B CN200980153289.8A CN200980153289A CN102272601B CN 102272601 B CN102272601 B CN 102272601B CN 200980153289 A CN200980153289 A CN 200980153289A CN 102272601 B CN102272601 B CN 102272601B
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Abstract

本发明涉及用于分离、表征和/或鉴定测试样品中的微生物的方法。本发明的方法包括用于溶解可能存在于测试样品中的非微生物细胞的可选溶胞步骤，接着是一个后续的分离步骤。该方法可以用于从复杂样品诸如含血液的培养基中分离、表征和/或鉴定微生物。本发明进一步提供了一种或多种鉴定剂的应用和探询微生物样品和/或所述一种或多种鉴定剂以产生表征和/或鉴定微生物的测定结果，这种表征和/或鉴定是基于所产生的测定结果和/或在微生物样品中存在或不存在鉴定剂或鉴定剂的代谢形式。

Description

采用鉴定剂分离和表征微生物的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求享有于2008年10月31日提交的题为“Method and Systemfor Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample”的美国临时专利申请第61/110,187号的权益，将其结合于本文中作为参考。
技术领域
本发明涉及检测、分离和/或鉴定样品中微生物的方法和系统。而且，本发明涉及利用鉴定剂强化表征和/或鉴定微生物的方法。
背景技术
检测生物学流体中的病原微生物，应该在尽可能最短的时间内进行，尤其是在败血症的情况下，对于该病症尽管医生可利用的抗生素的范围广泛，但是其死亡率仍然保持较高。生物学活性剂（诸如微生物）在患者体液尤其是血液中的存在，一般采用血培养瓶进行检测。血流感染与高的发病率和死亡率有关，然而当前的诊断方法即培养之后进行生物化学鉴定和抗生素敏感性测试，可能要耗费几天时间来进行。通常，基于临床症状开始经验疗法，而只有当初始疗法失效时测试结果才会影响临床决策。在阳性血液培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内表征血液感染的能力，将会显著地加强所提供的诊断信息的临床相关性。已经提出了分子扩增方法来填补这方面的需要，但是对于这种方法仍然存在严重的挑战。阳性血液培养液自身代表具有用于各种快速、鉴定（ID）试验的潜能的天然扩增的微生物种群。
为了提供稳健的结果，传统的自动表型ID测试（诸如、PhoenixTM和系统）或手动表型测试（诸如API）要求微生物处于适当的生长阶段并且无干涉培养基和血液产物。这些系统利用在平板培养基上从阳性培养液中生长18～24小时的菌落。然而，为了获得更快的结果，一些实验室已经报道了采用这些系统及从阳性血培养瓶中分离的微生物。这些直接获自培养瓶的试验并不是对于所有的微生物（例如，革兰氏阳性球菌）都是适当的，未经测试厂商验证，并且一般要花费3～8小时才能提供结果。迫切需要更快且更广泛的特异性试验，以便在阳性培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内为医师提供临床上相关的结果。
光学光谱学方法诸如内荧光（IF）、红外光谱法（FTIR）或拉曼光谱法，以及质谱方法诸如MALDI-TOF，都具有实现非常快速地鉴定微生物的潜能，但是可能会遇到在液体微生物培养基中和临床样品诸如血液或其组合中存在的许多高度荧光和吸收性化合物的干扰。直接从阳性血液培养液中回收微生物的最常用的方法是两步差速离心和在血清分离器管中的离心。
已经描述了用于分离、表征和/或鉴定微生物的其它方法，包括：
美国专利第4,847,198号公开了一种利用UV激发拉曼光谱法鉴定微生物的方法。根据′198专利，通过紫外光谱范围内的单波长接触细菌悬浮液。部分所用的光能被吸收而部分光能被发射。发射的光能，共振增强拉曼散射，作为反向散射能量进行测定。对该能量进行处理以产生细菌的特征性光谱。
Vo-Dinh的美国专利第5,938,617号涉及一种系统，该系统通过用几个波长的光激发样品并同步采集发射强度来鉴定样品中生物病原体。系统包括用于将样品暴露于激发辐射并由此产生发射辐射的机制。生物病原体可能是病毒和细菌。
美国专利第6,177,266号公开了一种采用通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析细胞蛋白提取物或整个细胞产生的属、种和菌株的特异性生物标记对细菌进行化学分类学分类的方法。
在美国专利第7,070,739号中，显示了一种通过二维超离心直接从体液或均质化组织中提取、分离和纯化微生物（包括病毒）的方法。在第一步离心步骤中，将沉降速度高于待鉴定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超离心步骤中，采用专用锯齿离心管，于填充的流体中应用等密度分带以形成宽范围的密度梯度。根据该专利，分离技术能够用于通过利用核酸特异性染料的光散射或荧光检测分带的粒子，以及用于以非常小的体积回收分带的粒子，从而通过质谱分析病毒蛋白亚单位和完整的病毒粒子以及通过荧光流量细胞计数测定核酸的质量和由限制酶产生的片段的质量进行表征。
美国专利申请出版物第2007/0037135号公开了一种用于鉴定和定量悬浮于液体中的生物样品的系统。该系统包括具有至少一个激发光源的荧光激发模块；样品界面模块，其可选地耦合到荧光激发模块用于定位生物样品以接受来自至少一个激发光源的激发光；荧光发射模块，其可选地耦合到样品界面模块并包含至少一个用于检测生物样品的荧光激发-发射矩阵的检测仪；和计算机模块，其经过操作耦合到荧光发射模块。计算机模块对生物样品的荧光激发-发射矩阵进行多变量分析以鉴定和定量生物样品。然而，'135申请并未讨论从复杂生物学样品诸如血液中鉴定和定量微生物。
美国专利申请出版物第2007/0175278号描述了采用液体培养基培养所关注的样品，包括例如血液、尿液、粪便、脉管导管等，工业生产线，水系统，食物产品，化妆品，药物制剂和法医样品。随后，通过本领域内已知的方法，例如通过离心可以从液体培养基中收集微生物。然后可以将浓缩的微生物转移到载体物质中，可选地在干燥之后，用于获取振动光谱。该专利申请讨论了用于鉴定和分类微生物的各种方法，包括振动光谱法，诸如拉曼光谱法。
然而，这些方法在试图从复杂样品（诸如含血液的培养基）中分离和表征微生物时具有一些缺点。所得的微生物制剂经常包含污染性的红血细胞、血小板、脂质微粒、血浆酶和细胞碎片，这些都可以导致结果变差。这些方法也是非常劳动密集型的并且由于其步骤能够使潜在危险的病原体在空气中暴露于使用者从而是不安全的。仍需要从临床样品（例如，血液培养液）和其它无这些干扰物质并与快速鉴定技术相容的复杂样品中分离微生物的安全且可靠的方法。
发明内容
本发明提供用于分离、表征和/或鉴定样品中微生物的方法。方法实现了比现有技术更快速地表征和/或鉴定微生物，从而更快地诊断（例如，在患有或疑似患有败血症的受试者中）并鉴定受污染物质（例如，食品和药物）。在本发明的方法中所包括的步骤，从获得样品到表征和/或鉴定微生物，都可以在非常短的时间框架内实施以产生临床相关的可采取行动的信息，例如在不到约120分钟内。另外，可以使本发明的方法完全自动化，由此降低处理传染性物质和/或污染样品的风险。
在一个方面中，本发明涉及表征和/或鉴定微生物的方法，包括：
（a）获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；
（b）将测试样品铺层于容器中的密度缓冲垫层的上方；
（c）向所述测试样品和/或所述密度缓冲垫层中加入鉴定剂；
（d）将所述容器离心以使微生物与所述测试样品的其它组分分离并形成微生物颗粒；
（e）对所述颗粒和/或所述一种或多种鉴定剂进行探询以产生鉴定微生物的测定结果；和
（f）基于所产生的测定结果和/或在颗粒中存在或不存在所述鉴定剂或所述鉴定剂的代谢形式来表征和/或鉴定颗粒中的微生物。
在另一个方面中，本发明涉及分离和鉴定微生物的方法，包括：
（a）获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；
（b）可选地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品；
（c）使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离以形成微生物颗粒；
（d）探询该颗粒以产生鉴定微生物的测定结果；
（e）基于所产生的测定结果鉴定微生物；和
（f）回收至少部分的颗粒以产生回收的微生物；
（g）对所述回收的微生物实施一种或多种进一步的测试。
在一个实施方式中，分离通过将样品铺层在容器中的密度缓冲垫层上方并将容器离心以粒化微生物，同时样品培养基仍保持在密度缓冲垫层的顶部来实施。在另一个实施方式中，容器在底部和/或侧面上具有光学窗口以便使微生物颗粒能够进行光谱学上的探询。可以通过将颗粒的光谱与已知微生物的一种光谱或多种光谱进行比较来鉴定微生物。这种无需进一步处理而直接在颗粒中鉴定微生物的能力增强了微生物鉴定的安全性。
在一个实施方式中，光谱探询是基于微生物的固有特征（例如，内荧光）。在其它实施方式中，光谱探询部分基于从在本发明方法期间加入且与特异性微生物或微生物组相互作用的其它物质获得的信号。
在另一个实施方式中，该方法进一步包括回收微生物颗粒，再悬浮微生物并进行进一步的鉴定或表征测试（例如，耐药性、毒力因子、抗药型）的步骤。
在本文的附图中和下面阐述的描述中对本发明进行更详细的解释。
附图说明
图1显示了金黄色葡萄球菌（S.aureus）悬浮液的激发-发射矩阵。
图2显示了大肠杆菌（E.coli）悬浮液的激发-发射矩阵。
图3显示了直接从阳性血液培养物中分离出的微生物颗粒中测定的焦谷氨酰肽酶(PyrA)活性的条形图。
图4是显示离心后溶胞的含微生物的血液培养液的分离装置照片。照片中清晰可见的是溶胞的血液培养物、密度缓冲垫层和微生物颗粒。
图5显示了PNA FISH探针特异性结合各种念珠菌的条形图。
具体实施方式
本发明可以以不同的形式体现，并且不应该解释为仅限于本文中所阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式以便使本公开是全面和完整的，并将向本领域的技术人员充分表达本发明的范围。例如，可以将有关一个实施方式举例说明的特征结合至其它实施方式中，以及可以将有关具体实施方式举例说明的特征从该实施方式中删除。另外，依据本公开，在本文中提出的对实施方式的各种变通和添加对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的，所述的各种变通和添加没有偏离本发明。
除非另外规定，本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文中在本发明的说明书中所用的术语仅仅是为了达到描述具体实施方式的目的而不是用来限制本发明。
定义
如本文中所用的“一个（一种）”（“a”，“an”）或“该（the）”可以意指一个（一种）或多于一个（一种）。例如，“一个”细胞可以意指单个细胞或多个细胞。
而且，如本文中所用的“和/或”是指并包含一个或多个相关所列项的任何和所有的可能的组合，以及在另一种情况（“或”）下解释为不组合。
另外，如本文中所用的术语“约”，当是指可测量的值诸如本发明的化合物或物质的量、剂量、时间、温度等时，意味着包含指定量的±20%、+10%、±5%、±1%、±0.5%，或甚至±0.1%的变化。
如本文中所用的术语“微生物”意图包括通常是单细胞的生物体，其能够在实验室中进行繁殖和处理，包括但不限于革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌、寄生虫和柔膜细菌。本发明的革兰氏阴性细菌的非限制性的实例包括以下属的细菌：假单胞菌属（Pseudomonas）、埃希式杆菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、志贺氏杆菌属（Shigella）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷白氏杆菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）、变形杆菌属（Proteus）、弯曲菌属（Campylobacter）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、摩根氏菌属（Morganella）、弧菌属（Vibrio）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、不动杆菌属（Acinetobacter）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、青枯菌属（Ralstonia）、无色杆菌属（Achromobacter）、梭菌属（Fusobacterium）、普氏菌属（Prevotella）、布兰汉氏球菌属（Branhamella）、奈瑟菌属（Neisseria）、伯克氏菌属（Burkholderia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、哈夫尼菌属（Hafnia）、爱德华氏菌属（Edwardsiella）、气单胞菌属（Aeromonas）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）、布鲁氏菌属（Brucella）、巴斯德氏菌属（Pasteurella）、普罗维登斯菌属（Providencia）、和军团菌属（Legionella）。本发明的革兰氏阳性细菌的非限制性的实例包括以下属的细菌：肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、李斯特菌属（Listeria）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、丙酸菌属（Propionibacterium）、梭菌属（Clostridium）、拟杆菌属（Bacteroides）、加德纳菌属（Gardnerella）、库克菌属（Kocuria）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、微球菌属（Micrococcus）、分枝杆菌属（Mycobacteria）和棒状杆菌属（Corynebacteria）。本发明的酵母菌和霉菌的非限制性的实例包括以下属的那些：念珠菌属（Candida）、隐球菌属（Cryptococcus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、青霉菌属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）、红酵母属（Rhodotorula）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、酵母属（Saccharomyces）和毛孢子菌属（Trichosporon）。本发明的寄生虫的非限制性的实例包括以下属的那些：锥体虫属（Trypanosoma）、巴贝西虫属（Babesia）、利什曼原虫属（Leishmania）、疟原虫属（Plasmodium）、Wucheria、布鲁格氏丝虫属（Brugia）、盘尾丝虫属（Onchocerca）和纳氏虫属（Naegleria）。本发明的柔膜细菌的非限制性的实例包括以下属的那些：支原体属（Mycoplasma）和脲原体属（Ureaplasma）。
如本文中所用的术语“鉴定剂”意图包括结合微生物或作用于微生物以产生与已知微生物或微生物组相关的测定结果的任何化合物。术语“鉴定剂”还可以包括作用于微生物或其组分（例如，由所述微生物产生的酶）并能够产生与已知微生物或微生物组相关的测定结果的任何化合物。
在如本文中更详细地描述的一个实施方式中，可以对来自样品或生长培养基的微生物进行分离和探询以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文中所用的术语“分离（separate）”意图包括已经从其原始状态或从生长培养基或培养基中除去、浓缩或另外分开的任何的微生物样品。例如，根据本发明，可以使微生物与可能另外干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分分离开（例如，作为分离的样品（separated sample））。该术语可以包括夹在两个其它层之间的微生物层（例如，离心后在高密度缓冲垫层顶部收集的微生物），或在固体表面（例如，过滤膜）上收集的微生物层。该术语也可以包括已经部分地通过层（例如，密度缓冲垫层）的微生物的收集。同样，分离的微生物样品可以包括微生物和/或其组分的任何收集或层，这比原始样品更浓，或另外从原始样品中分离出来，并且其可以是从微生物的紧密堆积的稠密块到微生物的扩散层。在分离形式或样品中可以包含的微生物组分包括但不限于以任何组合形式存在的菌毛、鞭毛、伞毛和荚膜。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如，血液细胞和/或其它组织细胞）和/或其任何组分。
在如本文中更详细地描述的又一个实施方式中，可以对来自样品或生长培养基的微生物进行分离和探询以表征和/或鉴定样品中存在的微生物。如本文中所用的术语“离析的”意图包括已经从其原始状态或从其生长培养基或培养基中至少部分地纯化的任何微生物样品，以及其中所含的任何非微生物或非微生物组分。例如，根据本发明，微生物可以与可能另外干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分离析分开（例如，作为离析的样品（isolated sample））。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如，血液细胞和/或其它组织细胞）和/或其任何组分。
在如本文中更详细地描述的又一个实施方案中，可以对来自样品或生长培养基的微生物进行粒化和探询以表征和鉴定样品中存在的微生物。如本文中所用的术语“颗粒”意图包括已经被压缩或沉积成微生物团块的任何微生物样品。例如，通过离心或本领域内的其它已知方法可以将样品中的微生物在试管底部压缩或沉积成团块。该术语包括离心后在容器的底部和/或侧面上的微生物（和/或其组分）的收集。在颗粒中可以包含的微生物组分包括但不限于以任何组合形式存在的菌毛、鞭毛、伞毛和荚膜。根据本发明，微生物可以与可能另外干扰表征和/或鉴定的非微生物或非微生物组分粒化分开（例如作为基本上纯化的微生物颗粒）。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如，血液细胞和/或其它组织细胞）和/或其任何组分。
如本文中所用的术语“密度缓冲垫层”是指整个具有均匀密度的溶液。
本发明提供了用于分离、表征和/或鉴定样品中微生物的方法。而且，该方法可以特别用于从复杂样品诸如含血液的培养基中分离、表征和/或鉴定微生物。快速方法也实现了比现有技术更快地表征和/或鉴定微生物，从而更快速地诊断（例如，在患有或疑似患有败血症的受试者中）并表征/鉴定受污染物质（例如，食品和药物）。本发明的方法中所包含的步骤，从获得样品到表征和/或鉴定微生物，都可以在非常短的时间框架内实施以得到临床上相关的可采取行动的信息。在某些实施方式中，本发明的方法可以在不到约120分钟内，例如在不到约110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2或1分钟内进行实施。本发明的方法的极度快速性代表优于现有方法的改进。可以使用本发明方法来表征和/或鉴定本文中所述的任何微生物。在一个实施方式中，微生物是细菌。在另一个实施方式中，微生物是酵母菌。在另一个实施方式中，微生物是霉菌。在另外的实施方式中，微生物是寄生虫。在另一个实施方式中，微生物是柔膜细菌。另外，可以使本发明的方法完全自动化，从而降低了处理传染性物质和/或污染样品的风险。
在一个方面中，本发明涉及表征和/或鉴定微生物的方法，包括：
（a）获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；
（b）将测试样品铺层于容器中的密度缓冲垫层的上方；
（c）向所述样品和/或所述密度缓冲垫层中加入鉴定剂；
（d）将所述容器离心以使微生物与所述测试样品的其它组分分离并形成微生物颗粒；
（e）对所述颗粒和/或所述一种或多种鉴定剂进行探询以产生鉴定微生物的测定结果；和
（f）基于所产生的测定结果和/或在颗粒中存在或不存在所述鉴定剂或所述鉴定剂的代谢形式来表征和/或鉴定颗粒中的微生物。
在另一个方面中，本发明涉及分离和鉴定微生物的方法，包括：
（a）获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；
（b）可选地溶解所述样品中的细胞以产生溶胞样品；
（c）使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离以形成微生物颗粒；
（d）探询该颗粒以产生鉴定微生物的测定结果；
（e）基于所产生的测定结果鉴定微生物；和
（f）回收至少部分的颗粒以产生回收的微生物；
（g）对所述回收的微生物实施一种或多种进一步的测试。
在本发明的另一个实施方式中，方法包括在探询微生物之前从分离容器中回收分离步骤期间形成的微生物颗粒或其的一部分。例如，在形成颗粒之后，可以将流体从颗粒中吸出并将颗粒再悬浮于合适的培养基（例如，其中微生物能存活的培养基）中。可以将再悬浮的微生物从分离容器中移出。然后，可以例如在悬浮液中或在已将它们再粒化之后对微生物探询从而进行表征和/或鉴定。在其它实施方式中，可以在分离容器中对再悬浮的微生物进行探询，例如在悬浮液中或已将它们再粒化之后。在另外的实施方式中，从颗粒中回收的微生物可以直接用于进一步的探询（例如，拉曼光谱法，质谱法）而无需再悬浮。
样品
可以通过本发明的方法进行测试的样品（即，测试样品）包括其中微生物存在和/或生长或可能疑似存在和/或生长的临床和非临床样品，以及对微生物的存在进行常规或不定期检测的物质的样品。所利用的样品的量由于方法的通用性和/或灵敏度可能大大不同。样品制备可以通过本领域内技术人员已知的任何技术来实施，尽管本发明的一个优点在于可以利用系统对复杂的样品类型（诸如例如血液、体液、和/或其它不透明的物质）直接进行测试，而仅需极少的或无需大量的预处理。在一个实施方式中，样品取自培养物。在另一个实施方式中，样品取自微生物培养物（例如，血液培养物）。在另一个实施方式中，在样品中疑似或已知包含微生物。
可以检测的临床样品包括通常在临床或研究实验室中测试的任何类型的样品，包括但不限于血液、血清、血浆、血液部分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊髓液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓抽取液、骨匀浆、痰、抽吸物、拭子和拭子渣液（rinsates）、其它体液等。在另一个实施方式中，可以对临床样品进行培养并使用培养样品。
本发明发现了在研究以及兽用和医药应用中的用途。可以获取临床样品的合适受试者一般是哺乳动物受试者，但是可以是任何动物。如本文中所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔子、啮齿类动物（例如，大鼠或小鼠）等。人类受试者包括新生儿、婴幼儿、青少年、成年人和老年受试者。可以获取样品的受试者包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。
可以进行测试的非临床样品包括物质，所述物质包含但不限于食品、饮料、药物、化妆品、水（例如，饮用水、非饮用水、和废水）、海水压载物、空气、土壤、污水、植物材料（种子、叶子、茎、根、花、果实）、血液制品（例如血小板、血清、血浆、白血细胞部分等）、捐赠器官或组织样品、生物战样品等等。方法也尤其十分适合实时测试以监控工业环境中的污染水平、过程控制、质量控制等。在另一个实施方式中，可以对非临床样品进行培养，并使用培养样品。
在本发明的一个实施方式中，样品获自患有或疑似患有微生物感染的受试者（例如，患者）。在一个实施方式中，受试者患有或疑似患有败血症，例如，菌血症或真菌血症。样品可以是直接获自受试者的血液样品。样品可以来自由患者的血液样品生长的血液培养物，例如血液培养物。血液培养样品可以来自阳性血液培养物，例如，表明微生物存在的血液培养物。在某些实施方式中，样品在其转为阳性之后短时间内，例如约6h之内，例如约5、4、3、或2h内，或在约60min，例如约55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1min内取自阳性血液培养物。在一个实施方式中，样品取自其中微生物处于对数生长期的培养物。在另一个实施方式中，样品取自其中微生物处于静止期的培养物。
本发明提供了用于检测、表征和/或鉴定微生物的高灵敏度。这能够使检测、表征和/或鉴定无需首先必须经过下列步骤：通过使它们在固体或半固体培养基上生长来分离微生物，以及对生长的菌落采样。因此，在本发明一个实施方式中，样品不是来自在固体或半固体表面上生长的微生物（例如，细菌、酵母菌或霉菌）菌落。因此在本发明一个实施方式中，样品不是来自在固体或半固体表面上生长的微生物（例如，细菌、酵母菌或霉菌）菌落。
样品的体积应该足够大以产生实施本发明方法的分离/离析步骤后可以进行探询的微生物的分离样品或微生物颗粒。适当的体积将取决于样品的来源和样品中微生物的预期水平。例如，阳性血液培养物将含有比待检测污染的饮用水样品更高的每体积微生物水平，因此可能需要相对于饮用水样品体积更小的血液培养基。一般而言，样品大小可以是低于约50ml，例如，低于约40、30、20、15、10、5、4、3、或2ml。在某些实施方式中，样品大小可以是约1ml，例如约0.75、0.5或0.25ml。在某些实施方式中，其中分离以微量规模进行，则样品大小可以是低于约200μl，例如，低于约150、100、50、25、20、15、10或5μl。在一些实施方式中（例如，当期望样品含有少量微生物时），样品大小可以是约100ml或更大，例如，约250、500、750或1000ml或更大。
可选的溶胞步骤
在一些实施方式中，获得样品之后，本发明的方法中的下一个步骤是选择性地溶解样品中可能存在的不想要的细胞，例如血液细胞和/或组织细胞。细胞可以溶解以允许微生物与样品的其它组分分离。微生物与其它组分的分离防止在探询步骤期间产生干扰。如果期望非微生物细胞在样品中不存在或期望其不会干扰探询步骤，则可以不需要实施溶胞步骤。在一个实施方式中，待溶解的细胞是样品中存在的非微生物细胞且可能存在于样品中的微生物细胞不发生溶解。然而，在一些实施方式中，特定种类的微生物的选择性溶胞可能是所期望的并因此可以根据本文中描述的以及本领域内众所周知的方法进行实施。例如，可以选择性地溶解不想要的微生物种类，例如溶解酵母菌，而不溶解细菌或反之亦然。在另一个实施方式中，溶解所需的微生物以便分离微生物的特定亚细胞组分，例如，细胞膜或细胞器。在一个实施方式中，溶解所有的非微生物细胞。在其它实施方式中，溶解一部分的非微生物细胞，例如，溶解防止干扰探询步骤的足够多的细胞。细胞的溶解可以通过本领域内已知的有效地选择性溶解细胞而溶解或不溶解微生物的任何方法进行实施，包括但不限于加入溶胞溶液、超声处理、渗透压冲击、化学处理和/或其组合。
溶胞溶液是一种能够溶解细胞例如非微生物细胞（例如，通过溶解真核细胞膜）和/或微生物细胞的溶液。在一个实施方式中，溶胞溶液可以包含一种或多种清洁剂、一种或多种酶、或一种或多种清洁剂和一种或多种酶的组合，并且可以进一步包含其它物质。在一个实施方式中，清洁剂可以是非变性溶胞清洁剂，诸如X-100、X-100-R、X-114、NP-40、C-100、X-100、CA630、ArlasolveTM200、96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷和单十二烷基九乙二醇醚（C12E9，聚多卡醇（polidocenol））。可选地，可以包含变性溶胞清洁剂，诸如十二烷基硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐类、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14（amidosulfobetaine-14）和C7BzO。可选地，还可以包含增溶剂，诸如98、58、35、80、20、L64、P84、非-清洁性磺基甜菜碱（NDSB201）、两亲高分子（amphipols）（PMAL-C8）和甲基-β-环糊精。通常，非-变性清洁剂和增溶剂以超过其临界胶束浓度（CMC）的浓度使用，而变性清洁剂可以以低于其CMC的浓度加入。例如，非-变性溶胞清洁剂可以在约0.010%至约10%，例如约0.015%至约1.0%，例如约0.05%至约0.5%，例如约0.10%至约0.30%（用样品稀释后的最终浓度）的浓度使用。在另一个实施方式中，可以优选使用聚氧乙烯清洁剂。聚氧乙烯清洁剂可以包含C12-18/E9-10结构，其中C12-18表示12～18个碳原子的碳链长度和E9-10表示9～10个氧乙烯亲水性头基团。例如，聚氧乙烯清洁剂可以选自97、96V、C-100、X-100、单十二烷基九乙二醇醚（聚多卡醇），或其组合组成的组。
可以用在溶胞溶液中的酶包括但不限于，消化核酸和其它膜污染物质的酶（例如，蛋白酶XXIII、脱氧核糖核酸酶、神经氨糖酸苷酶、多糖酶、和）。可以使用的其它添加剂包括但不限于还原剂诸如2-巯基乙醇（2-Me）或二硫苏糖醇（DTT）和稳定剂诸如镁、丙酮酸盐和保湿剂。溶胞溶液可以在适合溶解所需细胞的任何pH下进行缓冲，而这将取决于多种因素，包括但不限于，样品的类型、待溶解的细胞和所用的清洁剂。在一些实施方式中，pH可以处于约2至约13，例如约6至约13，例如约8至约13，例如约10至约13的范围中。合适的pH缓冲剂包括能够保持pH处于所需范围中的任何缓冲剂，例如，约0.05M至约1.0M的CAPS。
在一个实施方式中，将样品和溶胞溶液混合然后孵育足以发生细胞膜的溶胞和溶解的一段时间，例如，约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或60秒，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20分钟或更长的时间，例如，约1秒至约20分钟，约1秒至约5分钟，或约1秒至约2分钟。孵育时间将取决于溶胞溶液的强度，例如清洁剂和/或酶的浓度。一般而言，越弱溶胞缓冲剂越需要更长的时间和更大的样品稀释度来完全溶解非微生物细胞。溶胞溶液的强度可以基于样品中已知存在或疑似存在的微生物进行选择。对于更易于溶胞的微生物，可以使用弱的溶胞溶液。溶胞可以在约2℃至约45℃，例如约15℃至约40℃，例如约30℃至约40℃的温度下发生。在一个实施方式中，可以将溶胞溶液载入到注射器中，然后可以将样品吸入到注射器中从而使混合和孵育在注射器内发生。在一个实施方式中，可以将溶胞溶液载入到注射器中，然后将样品吸入到注射器中从而使混合和孵育在注射器内发生。
在一些实施方式中，溶胞条件（例如，溶解或孵育时间），以及分离和/或探询步骤，能够足以杀死样品中一些或所有的微生物。本发明的方法是高度通用的并且不要求所有微生物对于要发生的分离和鉴定都是活着的。在某些实施方式中，一些或所有的微生物可以是死亡的，死亡可以发生在本发明方法的步骤实施之前、期间和/或之后。
分离步骤
本发明的方法中的下一步骤（例如，如果进行溶胞步骤，则是在样品已经被溶胞之后的步骤）是分离步骤。可以实施分离步骤以使微生物与样品的其它组分（例如，非微生物或其组分）分离，并将微生物浓缩成为实现鉴定和表征目的可以进行探询的颗粒。分离不必是完全的，即，不要求达到100%的分离。需要的是微生物与样品的其它组分的分离足以允许对微生物进行探询且基本上不会受到其它组分干扰。例如，分离能够产生至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%纯度的或更高纯度的微生物颗粒。
在一个实施方式中，分离通过离心步骤实施，其中将样品（例如，溶胞样品）置于分离容器中的密度缓冲垫层的顶部并且将容器在允许微生物被分离的条件下离心（例如，微生物可以在容器的底部和/或侧面上形成颗粒）。根据该实施方式，样品的其它组分（例如，在样品培养基中可能存在的非微生物或其组分）保留在密度缓冲垫层的顶部或在密度缓冲垫层的顶层部分内。一般而言，任何已知的容器都可以用于分离步骤。在一个实施方式中，分离容器是在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms”的序列号为12/589,969中的有关美国专利申请中公开的分离装置，将该专利申请结合于本文中作为参考。该分离步骤从样品中的物质，诸如培养基、细胞碎片、和/或其它可能干扰微生物的探询（例如，通过内荧光）的组分中分离出微生物。在一个实施方式中，密度缓冲垫层还用于分离活的微生物和死亡微生物（其不通过密度缓冲垫层）。在另一个实施方式中，密度缓冲垫层不含有密度梯度，无论是在离心之前还是在离心之后。换句话说，对分离容器离心的时间和/或加速度的量不足以使组成密度缓冲垫层的物质形成密度梯度。
选择缓冲垫层的密度以便使样品中的微生物通过缓冲垫层而样品的其它组分（例如，血液培养液、细胞碎片）仍保留在垫层的顶部或没有完全通过密度缓冲垫层。也可以选择密度缓冲垫层用来分离活的微生物（其通过缓冲垫层）和死亡微生物（其不通过缓冲垫层）。合适的密度将取决于密度缓冲垫层中所用的物质以及待分离的样品。在一个实施方式中，缓冲垫层的密度在约1.025至约1.120g/ml，例如约1.030至约1.070g/ml，约1.040至约1.060g/mL的范围中或在约1.025至约1.120g/ml之间的任何范围中。在另一个实施方式中，缓冲垫层的密度为约1.025、1.030、1.035、1.040、1.045、1.050、1.055、1.060、1.065、1.070、1.075、1.080、1.085、1.090、1.095、1.100、1.105、1.110、1.115或1.120g/ml。
用于密度缓冲垫层的物质可以是具有用于本发明方法的适当的密度范围的任何物质。在一个实施方式中，物质是胶体二氧化硅。胶体二氧化硅可以是未涂覆的（例如，（W.R.Grace，CT））或者是例如用硅烷（例如，（Nidacon Int′l，瑞典）或（Irvine Scientific，Santa Ana，CA））或聚乙烯吡咯烷酮（例如，PercollTM，PercollTM Plus（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO））涂覆的。在一个实施方式中，选择了对光谱探询产生最小干扰作用的胶体二氧化硅，例如，具有最低内荧光的物质。胶体二氧化硅可以在任何合适的介质中稀释以形成合适的密度，例如，平衡盐溶液、生理盐水和/或0.25M的蔗糖。合适的密度可以采用浓度为约15%至约80%v/v，例如约20%至约65%v/v的胶体二氧化硅获得。密度缓冲垫层的另一种合适的物质是碘化造影剂，例如碘海醇（OmnipaqueTM NycoPrepTM，或）和碘克沙醇（VisipaqueTM或OptiPrepTM）。对于血液培养样品，合适的密度可以采用浓度为约10%至约25%w/v，例如约14%至约18%w/v的碘海醇或碘克沙醇获得。对于血液培养样品，蔗糖可以以约10%至约30%w/v例如约15%至约20%w/v的浓度用作密度缓冲垫层。可以用于制备密度缓冲垫层的其它合适的物质包括低粘度高密度的油，诸如显微镜浸镜油（例如，Type DF；Cargille Labs，New York）；矿物油（例如，5，Draketex50，；Penreco Co.，Pennsylvania）；硅油（聚二甲基硅氧烷）；氟硅油；硅凝胶；甲泛影酸盐-（LymphoPrepTM），例如，对于血液培养样品在约75%至约100%浓度下；泛影酸盐-葡聚糖（PolymorphoPrep），例如，对于血液培养样品在约25%至约50%浓度下；羧甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素；聚环氧乙烷（高分子量）；F127；F68；化合物的混合物；聚丙烯酸；交联的聚乙烯醇；交联的聚乙烯吡咯烷；PEG甲醚甲基丙烯酸酯；果胶；琼脂糖；黄原胶；胶凝糖；；山梨醇；（例如，对于血液培养样品浓度为约10%至约15%的400）；甘油；葡聚糖（例如，对于血液培养样品在约10%至约15%的浓度下）；糖原；氯化铯（例如，对于血液培养样品在约15%至约25%的浓度下）；全氟碳流体（例如，全氟正辛烷）；氢氟碳流体（例如，Vertrel XF）；和本领域内众所周知的类似物质等等。在一个实施方式中，密度缓冲垫层选自以任意组合形式存在的一种或多种胶体二氧化硅、碘克沙醇、碘海醇、氯化铯、甲泛影酸盐-、泛影酸盐-葡聚糖、蔗糖、400、和/或葡聚糖。密度缓冲垫层也可以由物质的组合构成，例如胶体二氧化硅和油的组合。上述化合物的某些组合对于本发明的分离和读数步骤是有益的。例如，具有不同UV-淬灭性质的化合物的组合，如氯化铯和碘海醇。
密度缓冲垫层的体积/高度应该足以实现微生物与其它样品组分的分离。体积将取决于分离容器的大小和形状。一般而言，可以使用约0.1至约5ml的体积，例如约0.2至约1ml，例如约0.2ml至约0.5ml。如果以微量规模进行分离，则密度缓冲垫层的体积可以是约1μl至约100μl，例如约5μl至约50μl。在密度缓冲垫层的顶部放置或铺层的样品的体积应该足以提供可产生适合探询的颗粒的足够的微生物。一般而言，可以使用适合装入到容器中的任何体积。例如，可以使用约0.1ml至约5ml的体积，例如约0.2ml至约1ml，例如约0.2ml至约0.5ml。如果以微量规模进行分离，则样品的体积可以是约1μl至约100μl，例如约5μl至约50μl。对于样品在容器中的可利用空间将取决于容器的尺寸和形状。在一些实施方式中，在将样品放置或铺层在顶部之前可以将中间层（液体或固体）放置在密度缓冲垫层的顶部以防止密度缓冲垫层和样品之间的任何混合。在一个实施方式中，中间层可以是聚乙烯珠。在另一个实施方式中，可以在密度缓冲垫层和样品之间放置小气泡以防止混合。在另外的实施方式中，可以将密度缓冲垫层铺层在高密度物质（例如，全氟碳流体）的顶部从而使微生物在分离期间通过密度缓冲垫层并在密度缓冲垫层和高密度物质之间的界面处收集。
在本发明的一个实施方式中，分离容器在甩平式转头中进行离心从而使微生物直接在容器底部上形成颗粒。在足够的加速度下将容器离心足够长的时间从而使微生物与其它样品组分分离（例如形成的颗粒）。离心加速度可以是约1,000x g至约20,000x g，例如约2,500x g至约15,000x g，例如约7,500x g至约12,500x g，等。离心时间可以是约30s至约30min，例如约1min至约15min，例如，约1min至约5min。离心可以在约2℃至约45℃，例如约15℃至约40℃，例如约20℃至约30℃的温度下进行实施。在一个实施方式中，分离容器包含封套，并在离心之前将封套应用于容器以形成气密式密封。封套的存在降低了处理具有或可能具有传染性和/或危险性的微生物的风险，以及污染样品的风险。本发明方法的一个优点是能够采用密封容器（例如，气密式密封容器）内的微生物实施方法的任意一个或多个步骤（例如，溶胞、分离、探询、和/或鉴定）。本发明方法，涉及自动化系统的应用，避免与处理高毒性微生物相关的健康和安全性风险，诸如从样品中回收微生物用于直接测试发生的。在一个实施方式中，对容器离心的时间和/或力不足以在密度缓冲垫层内形成密度梯度。本发明不涉及样品的超离心，例如，在超过约100,000x g的力下离心。而且，本发明也不涉及等密度（平衡）沉降或分带。
分离容器可以是任何具有足以容纳密度缓冲垫层和样品的容积的容器。如本文中所指出的，在本发明的实践中可以使用在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/orIdentification of Microorganisms”序列号为12/589,969的有关美国专利申请中公开的分离装置，将该专利申请结合于本文中作为参考。在一个实施方式中，容器刚好放入或能够被刚好放入到离心机转子中。容器的容积可以是约0.1ml至约25ml，例如约1ml至约10ml，例如约2ml至约8ml。如果分离以微量规模进行，容器的容积可以是约2μl至约100μl，例如，约5μl至约50μl。在一个实施方式中，容器在其上层部具有宽的内径以容纳样品和大部分的密度缓冲垫层，而在收集微生物颗粒的下层部分具有较窄的内径。窄部分具有的内径可以是约0.04至约0.12英寸，例如约0.06至约0.10英寸，例如约0.08英寸。宽部分具有的内径可以是约0.32至约0.40英寸，例如约0.34至约0.38英寸，例如约0.36英寸。对于微量分离，内径可以甚至更小。例如，窄部分的内径可以是约0.001至约0.04英寸，例如，约0.002至约0.01英寸。锥形内径部分可以连接上下层部分。锥形部分具有的角度可以是约20至约70度，例如约30至约60度。在一个实施方式中，下层窄部分低于容器的总高度的一半，例如，低于容器的总高度的约40%、30%、20%或10%。容器可以具有连接的封套装置或可以通过螺纹接受封套装置（例如，封盖）从而使容器在离心期间可以是密封式封闭的。在某些实施方式中，容器经过设计以便使微生物样品或颗粒可以在分离之后很容易地回收、或另外获得或从容器中移出，不论是以手动还是自动的方式（从而使技术人员不会暴露于容器的内容物）。例如，容器可以包含含有颗粒并能够与容器其余部分分开的可卸下部分或脱离部分。在另一个实施方式中，容器包含用于分离之后接近颗粒的工具，诸如一个或多个用于插入注射器或其它采样装置或用于吸出颗粒的孔道或可穿透的表面。在一个实施方式中，容器可以是管，例如离心管。在另一个实施方式中，容器可以是小片或卡片。在一个实施方式中，容器是独立容器，即分离单个样品的装置。在其它实施方式中，容器是包含两个或更多个分离容器从而能够同时分离多个样品的装置的部分。在一个实施方式中，装置包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、36、42、48、60、72、84、96或更多个分离容器。
容器可以包含光学窗口，通过该光学窗口探询能够进行。光学窗口可以是在容器的底部、顶部和/或侧面。窗口可以由任何对光（例如，至少部分的近红外光（NIR；700nm-1400nm）、紫外光（UV；190nm-400nm）和/或可见光（VIS；400nm-700nm）光谱）透明的材料构成。合适的材料的实例包括但不限于，丙烯酸树脂、甲基丙烯酸酯、石英、熔融硅石、蓝宝石和/或环状烯烃共聚物（COC）。窗口还可以由具有可与微生物光谱区别开的振动结构的任何材料组成。可以使用其它区分技术诸如共焦拉曼光谱法采集微生物的振动光谱同时剔除窗口材料的光谱；这种技术为本领域内技术人员众所周知的。另外一种技术是空间偏转拉曼光谱法，其中激发光纤沿着窗口从发射（瑞利和拉曼光谱）置换。这种技术作为区分窗口材料和在窗口下方待测定的数量之间的方法对于本领域技术人员也是已知的。在一个实施方式中，整个容器都由光学窗口材料制成。在另一实施方式中，容器可以由两个或更多个独立部件，诸如用于光学窗口的光学UV-VIS-NIR透明或拉曼透明组件和构成容器其余部分的另一种材料（例如，低成本标准模铸塑料）制成（例如，模塑）。在一个实施方式中，光学窗口足够薄而容许光谱探询，这将取决于窗口的材质。在另一个实施方式中，光学窗口尽可能薄而降低光谱探询的干涉。例如窗口能够具有低于约0.20英寸，例如，低于约0.15，0.10，或0.05英寸的厚度。
在另一个实施方式中，通过过滤步骤实施分离，在所述的过滤步骤中，将样品（例如溶胞样品）放置于装有具有阻留微生物的孔径的选择性过滤器或过滤装置。所阻留的微生物可以通过使合适的缓冲液缓缓地通过过滤器来进行洗涤。然后洗涤的微生物可以直接在过滤器上进行探询和/或通过直接在过滤器表面上采样或通过用合适的水性缓冲溶液反冲洗过滤器回收进行探询。
探询步骤
一旦已将微生物分离、离析和/或粒化，可以对分离的样品、离析的样品或颗粒进行探询以鉴定和/或表征样品或颗粒中的微生物。在一个实施方式中，探询以非侵入方式进行，即，对颗粒进行探询同时其保留在分离容器中。在另一个实施方式中，分离容器在整个探询期间保持密封。以非侵入方式鉴定微生物的能力，可选地加上在整个分离和鉴定/表征过程期间保持容器密封并使一些或所有的步骤自动化，从而避免不断处理受污染的和/或感染性的样品并大大地提高了整个工艺的安全性。另外，通过直接探询而不进一步处理样品或颗粒（例如，再悬浮、平板培养和菌落生长）进行表征和/或鉴定微生物的能力，大大地提高了能够进行鉴定/表征的速度。在一个实施方式中，在探询之前将样品或颗粒从分离容器中回收和/或再悬浮和可选地移出。在另一个实施方式中，在原位探询之后将样品或颗粒回收和/或再悬浮，然后实施进一步的探询。例如，能够应用于分离的微生物而不是微生物颗粒的技术诸如胶乳凝集测试或自动表型鉴定测试能够在回收的和/或再悬浮的微生物上实施。
在一些实施方式中，可以对分离的样品或颗粒进行光谱探询。在一个实施方式中，光学光谱学方法能够用于分析微生物的一种或多种固有性质，例如，在不存在其它物质，诸如染色剂、染料、结合剂等的情况下微生物内存在的性质。在其它实施方式中，光学光谱方法可以用于分析微生物的一种或多种非固有性质，例如，只有在其它物质的辅助下才能检测到的性质。探询可以采用，例如，荧光光谱法、漫反射光谱法、红外光谱法、太赫兹光谱法、吸收和透射光谱法、拉曼光谱法（包括表面增强拉曼光谱法（SERS）、空间偏转拉曼光谱法（SORS）、透射拉曼光谱法和/或共振拉曼光谱法）进行实施。为了增强拉曼（SERS）和荧光信号，微生物可以在离心之前用金和/或银纳米粒子涂层，和/或内部光学表面可以用特定尺寸和形状的金属胶体预先涂层（参考文献:对于荧光，Lakowicz，Anal.Biochem.337:171（2005）；对于SERS，Efrima等，J.Phys.Chem.B.（Letter）102:5947（1998））。适用于采用拉曼光谱法对微生物样品和/或颗粒进行探询的更多细节公开在于2009年10月30日提交的标题为“Methods for Separation，Characterization and/or Identification ofMicroorganisms using Raman Spectroscopy”，序列号为12/589,976的共同受让的美国专利申请中，将该专利申请结合于本文中作为参考。在另一个实施方式中，纳米粒子在离心之前存在于密度缓冲垫层中并且当微生物通过密度缓冲垫层时与微生物缔合。在其它实施方式中，采用质谱技术，诸如MALDI-TOF质谱法、解吸电喷雾离子化（DESI）质谱法、GC质谱法、LC质谱法、电喷雾离子化（ESI）质谱法和选择性离子流量管（SIFT）光谱法，对颗粒中的微生物进行探询。在一个实施方式中，对分离的样品或颗粒进行光谱探询同时其仍保留在分离容器中。可以通过容器上的光学窗口对容器进行探询。光学窗口可以在容器的底部和/或任何一个侧面或多个侧面和/或顶部上。在一个实施方式中，分离容器在适合探询的位置上放入或能够被放入到分光光度计的支架中。光谱探询可以通过本领域内的技术人员已知的用于有效地检测和/鉴定微生物的一种或多种固有或非固有性质的任何技术进行实施。例如，正面荧光（其中激发光和发射光进入和离开相同的光学表面，并且如果样品是一般光学厚时，则激发光穿透到样品中的距离非常短（参见，例如，Eisinger,J.，和J.Flores，“Front-face fluorometry of liquid samples,”Anal.Biochem.94:15（1983））可以用于鉴定颗粒中的微生物。其它形式的测定，诸如落射荧光、反射比、吸收度和/或散射测定，也可以应用于本发明中。在另一个实施方式中，如本文中所述的，可以将分离的样品或颗粒移出用于探询（例如，可以将分离的样品或颗粒移出并制备用于通过质谱进行探询，如本领域内众所周知的）。在又一个实施方式中，可以采用一种以上的方式对分离的样品或颗粒进行探询。例如，可以采用荧光光谱法和拉曼光谱法对分离的样品或颗粒进行探询。根据该实施方式，可以连续地或同时地实施这些探询步骤。
样品照明源，或激发源，可以选自本领域内技术人员已知的许多合适的光源。可以使用产生可用数据的电磁波谱的任何部分。能够在紫外、可见和/或近红外光谱中发射的光源，以及电磁波谱的其它部分，都可以利用并且对于本领域内的技术人员都是已知的。例如，光源可以是连续光谱灯诸如用于产生紫外光的氘灯或氙弧灯，和/或用于产生可见/近红外激发的卤钨灯。这些光源提供了宽的发射范围并且具体激发波长的光谱带宽可以采用光干涉滤光片、棱镜和/或光学光栅来降低，如在本领域众所周知的。
另外，多个窄带光源，诸如发光二极管和/或激光，可以在空间和/或时间上进行多路复用以提供多波长激发源。例如，发光二极管从240nm至超过900nm是可利用的并且该源具有20～40nm（半极大处全宽度）的光谱带宽。激光在从紫外至近红外的离散波长中是可利用的并可以采用本领域技术人员众所周知的多路复用方法进行应用。
任何光源的光谱选择性可以通过采用光谱区分装置诸如扫描单色器来改进。可以利用其它区分方法，如本领域技术人员已知的，诸如声光可调滤波器、液晶可调滤波器、光学干涉滤光片阵列、棱镜光谱仪等，及其任意组合。在选择光谱鉴别器时需要考虑可调性的范围以及选择性的水平。通过举例说明的方式，例如，鉴别器可能利用300-800nm的波长范围而选择性为10nm。这些参数一般决定达到可调谐性范围以及选择性必需的最佳技术。
通常，光源导致样品的激发，接着在预定时间点或连续地测定样品荧光的发射。类似地，可以测定来自激发源与样品的相互作用的反射光以提供检测和/或表征的相关资料。
样品的发射可以通过任何合适的光谱区分装置进行测定，最优选采用光谱仪。光谱仪可以是检测特定发射波长的扫描单色器，由此从单色器产生的输出通过光电倍增管进行检测，和/或分光光度计可以被设置为成像光谱仪，由此输出通过成像检测器阵列诸如电荷耦合器件（CCD）检测器阵列检测。在一个实施方式中，鉴别器允许通过光电检测装置（诸如，光电倍增管、雪崩光电二极管、CCD检测器阵列和/或电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）检测器阵列）观察荧光和/或散射信号。
使用光谱技术来获得测定结果，该测定结果优选作为激发-发射矩阵（EEM）测定结果提供的。如本文中所用的EEM定义为作为激发和发射波长的函数的荧光物质的发光光谱发射强度，并包括全谱或其子集，其中子集可以包含单对或多对激发/发射对。另外，采用固定激发波长的EEM的横截面可以用于显示具体激发波长的发射光谱，而采用固定发射波长的EEM的横截面可以用于显示样品的激发光谱。在一个实施方式中，在多个特定激发-发射波长对下，例如，至少在2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个特定激发-发射波长对下测定多重EEM。
根据本发明的一个具体实施方式，已经发现，正面荧光光谱法在测定高度散射和高度淬灭样品的荧光和/或反射性质方面提供了优势。在一个实施方式中，正面方法可能尤其适用。例如，正面荧光可能尤其适用于高度吸收性样品，因为激发和发射束不需要经过大多数样品，因此可能较少地受其中可能含有的干扰组分（例如，血液细胞和微生物培养基）的影响。容器的光学表面可以以提供本领域技术人员已知的可接受的结果的角度进行照射，（例如，Eisinger，J.，和J.Flores，“Front-face fluorometry of liquid samples,”Anal.Biochem.94:15-21（1983））。在一个实施方式中，系统经过设计以便使光学系统除了在最少一个固定角度下测定发射的荧光之外，还在最少一个固定角度下测定漫反射光。
根据本发明，对于已知微生物进行了对照测量，由此实现采用本领域技术人员已知的各种数学方法使所测量的试验数据与所关注的微生物的表征相关。例如，使用本领域技术人员已知的软件系统可以将样品的数据与基线或对照测量结果进行对比。更具体而言，这些数据可以通过许多多元分析方法，诸如例如一般判别分析法（General Discriminant Analysis）（GDA）、偏最小二乘判别分析法（Partial Least Squares Discriminant Analysis）（PLSDA）、偏最小二乘回归（Partial Least Squares regression）、主成分分析（Principal Component Analysis）（PCA）、平行因素分析（Parallel Factor Analysis）（PARAFAC）、神经网络分析（Neural Network Analysis）（NNA）和/或支持向量机（Support Vector Machine）（SVM）进行分析。这些方法可以用于将所关注的未知微生物基于已存在的命名分类到相关组，和/或基于在如以前所述的设计用于监控、检测和/或表征生物体的系统中的生物体的代谢、病原性和/或毒力分类到天然存在组。
在另一个实施方式中，采用质谱技术可以对颗粒中的微生物进行探询。根据该实施方式，在探询之前可以将样品或颗粒回收和/或再悬浮和可选地从分离容器中移出。在另一个实施方式中，在原位探询之后将样品或颗粒回收和或再悬浮，然后实施进一步的光谱探询。例如，可以对回收的和/或再悬浮的微生物实施能够应用于分离的微生物但不能应用于微生物颗粒的技术，诸如胶乳凝集测试或自动表型鉴定测试。在样品进行再悬浮之后，从悬浮液中移出部分样品，并将其置于用于引入到质谱仪的板子上。高度吸收性物质沉积在样品（例如，基质）的顶部；这种物质关于用于离子化样品的激光频率具有非常高的光吸收系数（例如，对于氮激光器，其发射波长为337nm，因此这种吸收性物质将会在337nm的波长下具有大的吸收系数）。将样品和吸收性物质干燥后，将板子插入到质谱仪中。在对样品抽空降压（即，从样品中移除大气气体从而使其处于10-5至10-7torr的环境中）所需的时间之后，将样品引入到质谱仪的电离室。将样品与系统对准。当达到最佳对准时，氮激光器产生脉冲。基质吸收的激光能量导致其由于沉积的高能量从板子表面上剥蚀下来。作为一个副作用，部分微生物细胞也将在此过程中被汽化和离子化。通过板子和质谱仪飞行管的入口之间产生静电场（即，系统的这部分是质/荷鉴别器）使这些离子加速到已知的动能。所有单电荷离子，无论质量如何，将在飞行管入口处具有相同的动能，但是它们将会具有与其质量成反比的速率。由此，离子沿飞行管移向检测器，而较轻的离子将在较重的离子之前到达（飞行管是质/荷鉴别器）。每当离子撞击检测器时检测器产生电荷。将检测器的输出数字化并且输出在一个轴上显示质/荷比以及在另一个轴上显示撞击次数。
根据该实施方式，通过质谱法可以对分离的微生物样品进行探询以采集所述微生物的质谱并通过将所测定的质谱与对照质谱图和/或已知微生物的细胞组分的已知或预测质量比较来表征和/或鉴定该微生物。用于探询微生物样品和/或颗粒的更多细节公开在于2009年10月30日提交的标题为“Methods forSeparation,Characterization and/or Identification of Microorganisms using MassSpectrometry”，序列号为12/589,976的共同受让的美国专利申请中，将其结合于本文中作为参考。
在又一个实施方式中，可以使用根据检测系统的非-光谱测量结果诸如检测时间和生长速率来辅助表征和/或鉴定离析的样品或颗粒中的微生物。另外，取自分离装置下部区域的照片图像的测量结果可以提供关于鉴别分离物的有价值的信息，诸如颗粒大小、形状、颜色和密度。
在本发明的一些实施方式中，离析的样品或颗粒中的微生物的表征和/或鉴定不需要涉及精确物种的鉴定。表征涵盖了生物微粒的广泛分类或分级以及单一物种的实际鉴定。离析的样品或颗粒中的微生物的分类可以包含对微生物的表型和/或形态学特征的测定。例如，生物微粒的表征可以基于可观察的差异，诸如组成、形状、大小、聚簇和/或代谢实现。在一些实施方式中，所关注的生物微粒的分类可能不需要给定的生物微粒的特征的先验知识而只需要与经验测量结果一致的相关性，从而使这种方法比基于特异性结合事件或代谢反应的方法更加通用和更易适应。如本文中所用的“鉴定”意指确定以前未知的微生物所属的科、属、种和/或菌株。例如，将以前未知的微生物鉴定到科、属、种和/或菌株水平。
在一些情况下，表征包含提供足够用于采取行动的有用信息的分类模型。如本文中所用的优选的分类模型包含分组到以下一组或多组：（1）革兰氏组；（2）临床革兰氏组；（3）治疗组；和（4）功能组；和（5）天然内荧光组。
（1）革兰氏组：在革兰氏组分类中，基于其革兰氏染色反应和总尺寸，可以将微生物归类成三大分类类别之一，所述组选自以下一组或多组：（a）采用革兰氏染色法染成深蓝色的革兰氏阳性微生物；（b）采用革兰氏染色法染成红色的革兰氏阴性微生物；和（c）采用革兰氏染色法染成蓝黑色但是通过形态学特征和尺寸与细菌进行区分的非常大的圆形细胞的酵母细胞。
（2）临床革兰氏组：可以将革兰氏组进一步分成几组代表有区别的形态学特征的子类。这些子类包括由有经验的实验室技师报道的所有相关临床信息，并由此提供比阳性或阴性革兰氏反应更高水平的鉴定。这种具体的分类是非常有用的，因为其通过采用自动化系统提供相当的临床相关信息消除了关于依赖革兰氏染色质量和/或技师读取涂片的技能水平的问题。更具体而言，基于这种分类模型的微生物子类可以选自以下一种或多种：（a）球菌，其是小而圆的细胞；（b）双球菌，其是结合在一起的两个小而圆的细胞；（c）棒状菌，其是矩形形状；和（d）杆菌，其具有杆状形状。这些能够通过其它形态学信息确证的子类的实例包括：（i）革兰氏阳性球菌；（ii）链状革兰氏阳性球菌；（iii）簇状革兰氏阳性球菌（即，“葡萄样”簇）；（iv）革兰氏阳性双球菌；（v）革兰氏阳性杆菌；（vi）具有内芽孢的革兰氏阳性杆菌；（vii）革兰氏阴性杆菌；（viii）革兰氏阴性球杆菌；（ix）革兰氏阴性双球菌；（x）酵母菌；和（xi）丝状真菌。
（3）治疗组：治疗组包括多种微生物物种，所述的微生物物种当从具体试样类型中分离出来时，用同类抗生素或抗生素的混合物进行处理（例如，如在“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy2008”中所述的）。在许多情况下，对于能够从初始的经验疗法改变至更靶向的疗法的临床医师，不需要鉴定到种水平，因为一个以上的物种可以采用相同的抗生素选择处理。这种分类水平正确地将这些“相同处理”的微生物归类到单个治疗类别。这种表征水平的实例包括区分高度耐药的肠杆菌（Enterobacteriacae）（EB）种与敏感EB种（肠杆菌属某些种（Enterobacter spp.）与大肠杆菌（E.coli））、或耐氟康唑的念珠菌种（光滑念珠菌（C.glabrata）和克柔念珠菌（C.kruzei））与敏感念珠菌种（白色念珠菌（C.albicans）和近平滑念珠菌（C.parapsilosis））等等的能力。
（4）功能组：根据本发明，基于代谢、毒力和/或表型特性的混合，也可以将微生物归类到几个组中。非发酵性生物体可以明确地与发酵性生物体区分开。而且，产生溶血素的微生物物种可以与非溶血性物种分别进行分组。在一些情况下，这些组表示比属水平（例如，大肠杆菌类，革兰氏阴性非发酵性杆菌）更宽泛的类别，一些在属水平（例如，肠球菌属（Enterococcus），念珠菌属（Candida）），和一些具有更近于种水平的区分（例如，凝固酶阴性葡萄球菌，α-溶血性链球菌，β-溶血性链球菌，凝固酶阳性葡萄球菌，即金黄色葡萄球菌（S.aureus））。
（5）天然内荧光（“IF”）组：也可以将微生物归类为基于它们的自然趋势的类别中以按照其先天的和/或固有的荧光特征一起分组。这些组中的一些可能是治疗和功能组类型共有的。这些分组可以包括个体物种，诸如具有特征性IF信号的粪肠球菌（E.faecalis）、化脓链球菌（S.pyogenes）或铜绿假单胞菌（P.aeruginosa），和/或可以包含小的具有相对保守的IF信号的生物体组，诸如肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）-产酸克雷伯菌（K.oxytoca）组或产气肠杆菌（E.aerogenes）-阴沟肠杆菌（E.cloacae）组。
除了测量微生物的固有性质（诸如内荧光）用于鉴定目的外，本发明的方法可以进一步包含使用其它鉴定剂来辅助分离和/或鉴定方法。与特异性微生物结合的物质，如亲和配体，可以用于分离微生物，鉴定微生物的分类或物种（例如，通过与独特的表面蛋白或受体结合）和/或鉴别微生物的特征（例如，抗生素耐药性）。所用的鉴定剂包括但不限于单克隆和多克隆抗体及其片段（例如，用于金黄色葡萄球菌鉴定的抗-Eap）、核酸探针、抗生素（例如，青霉素、万古霉素、多粘菌素B）、适体、肽模拟物、噬菌体衍生的结合蛋白、凝集素、宿主先天免疫生物标记物（急性期蛋白、LPS结合蛋白、CD14、甘露糖结合凝集素、Toll样受体），宿主防御肽（例如，防御素、cathelicidins、proteogrins、爪蟾抗菌肽）、细菌素（bacterocins）（例如，羊毛硫抗生素（诸如乳酸链球菌肽、mersacidin、表皮素、鸡葡萄球菌素（gallidermin）和plantaricin C），和II类肽）、细菌噬菌体和选择性用于核酸、脂质、碳水化合物、多糖、荚膜/黏液或蛋白质的染料、或其任意组合。如果该物质自身没有给出可检测信号，则可以对物质进行标记，诸如通过将该物质与标记物（例如，可见的或荧光的）结合以提供可检测信号。标记物包括但不限于，荧光化合物、发光化合物、发磷光化合物、放射性化合物、拉曼活性化合物和/或比色化合物。可以在本发明方法的任何步骤中，例如当获得样品时、溶胞期间、和/或分离期间将作用剂加入微生物中。在一些实施方式中，在颗粒的探询期间可以测定该作用剂在颗粒中的存在。其它可用的鉴定剂包括微生物酶的底物、螯合剂、光增敏剂、淬灭剂、还原剂、氧化剂、缓冲剂、酸、碱、溶剂、固定剂、清洁剂、表面活性剂、消毒剂（例如，醇、漂白剂、过氧化氢）和有毒化合物（例如，叠氮化钠、氰化钾）和代谢抑制剂如环己酰胺等。类似地，许多用于测定微生物细胞活力、代谢和/或膜电位的荧光化合物在本发明中可以用作鉴定剂。如本领域技术人员所易于理解的，具体微生物对影响其物理状态或代谢的任何化合物诸如抗生素的敏感性，可以通过将化合物加入样品、溶胞缓冲液、密度缓冲垫层或其任何混合物中进行快速确定。
在本发明的一个方面中，方法可以进一步包含回收微生物颗粒和实施另外测试的步骤。在一个实施方式中，可以通过从样品培养基和密度缓冲垫层中吸出来回收颗粒。在另一个实施方式中，可以通过将注射器插入容器并将颗粒吸出来回收颗粒，同时样品培养基和密度缓冲垫层仍保持完整。然后可以将回收的颗粒再悬浮于合适介质例如盐水中。一旦再悬浮，可以对微生物进行任何进一步所需的测试，如本领域内的技术人员公知的以及如以上所述的。具体而言，用再悬浮的微生物可以实施需要清洁微生物样品的任何测试。在一些实施方式中，可以进行另外的鉴定测试。鉴定测试的实例包括2、扩增和非扩增核酸测试（NAT）、显色和乳胶凝集分析、免疫分析（例如，采用标记的抗体和/或其它配体）、质谱法（例如，MALDI-TOF质谱法）和/或其它光学技术诸如红外光谱法（FTIR）或拉曼光谱法。也可以进行其它表征测试，诸如抗生素和/或其它药物的耐药性。其它表征可以是在本方法的初始分离和鉴定步骤期间开始的测试的一部分。例如，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的检测可以通过在分离微生物之前将标记的青霉素（例如，荧光标记的或拉曼标记的）加入样品中开始。一旦已将颗粒回收并且再悬浮，可以测定结合的青霉素水平。
在本发明的一个方面，可以使一些或所有的方法步骤自动化。使方法步骤自动化允许更有效地检测大量的样品并降低了在处理可能包含有害和/或传染性的微生物的样品中的人为误差的风险。然而，更重要的是，自动化能够在白天或夜晚的任何时间递送关键性的结果而无延误。一些研究已表明，更快速地鉴定导致败血症的生物与改善患者护理，缩短住院时间和降低整个成本相关。
在本发明的一个方面中，可以使一些或所有的方法步骤自动化。使本方法的步骤自动化不仅允许更快地测试更多的样品，而且这也降低了处理可能包含有害和/或传染性的微生物的样品中的人为误差的风险。
在本发明的某些实施方式中，方法还可以用于检测测试样品中微生物的存在。在这些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
（a）获得测试样品；
（b）可选地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品；和
（c）使微生物与所述样品的其它组分分离以形成微生物颗粒；其中颗粒的存在表明在样品中存在微生物。在一个实施方式中，采用裸眼检测颗粒。在其它实施方式中，通过探询，例如在光谱学上检测颗粒。
在一些实施方式中，检测方法能够用于监控被微生物污染的样品，例如食品、药物、饮用水等。在一个实施方式中，所述方法可以以重复模式实施用于定期监控污染，例如，每月一次，每周一次，每天一次，每小时一次或任何其它时间模式。在另一个实施方式中，可以根据需要对样品进行检测，例如，当怀疑受到污染时。在另外的实施方式中，检测方法可以用于在临床样品例如血液培养物中寻找微生物的存在。例如，在某些时间点可以将样品从血液培养基中移出并对样品实施检测方法以测定血液培养物是否是阳性的。在一个实施方式中，可以在培养物接种后的设定时间点取样，例如，接种后24h取样，以测定血液培养基是否是阳性的。在另一个实施方式中，可以定期例如，每12、6、4或2h或每60、50、40、30、20、15、10或5min从血液培养物中取样，以在可检测为阳性的短时间内鉴定阳性血液培养物。在检测方法的某些实施方式中，检测步骤可以可选地在如本文中描述的鉴定方法之后进行。
在本发明的一个方面，可以使一些或所有的方法步骤自动化。使方法步骤自动化允许检测更有效地检测大量的样品并降低了在处理可能包含有害和/或传染性的微生物的样品中的人为误差的风险。然而，更重要的是，自动化能够在白天或夜晚的任何时间递送关键性的结果而无延误。一些研究已表明，更快速地鉴定导致败血症的生物与改善患者护理，缩短住院时间和降低整个成本相关。
在以下实施例中进一步详细说明本发明，所述实施例通过举例说明的方式提供而不是预期以任何方式限制本发明。利用本领域内众所周知的标准技术或下面具体描述的技术。
实施例
实施例1.快速微生物分离和鉴定方法
胶体二氧化硅悬浮液（0.2～0.5mL；密度为1.040～1.050gm/mL）加入到几个尖底微量离心管中。将溶胞的阳性SA血液培养液样品（0.5～1.0mL）覆盖在胶体二氧化硅悬浮液上。另外，采用针或套管可以将胶体二氧化硅溶液加入到溶胞血液培养液下面。对来自含以下微生物的培养物的阳性培养液进行测试：
大肠杆菌（E.coli），ATCC25922
粪肠球菌（E.Faecalis），ATCC29212
金黄色葡萄球菌（S.aureus），ATCC12600
铜绿假单胞菌（P.aeruginosa），ATCC10145
将管封盖，然后在微量离心机中在室温（20～25℃）下以约10,000g旋转2min。将上清液吸出，然后将纯化的微生物颗粒再悬浮在0.45%w/v NaCl中以至660nm的光学密度为0.40。
将每一种悬浮液的一部分转移至丙烯酸比色皿中并在荧光分光光度计（3（HORIBA Jobin Yvon Inc.，New Jersey））中扫描以测定微生物的内荧光。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的激发-发射矩阵在图1和2中给出。
将第二部分载入到2ID/AST卡（bioMerieux Inc.，Missouri）上。将“直接的”2结果与来自由阳性培养液继代培养的过夜生长的菌落（传统方法）的悬浮液进行比较。对于直接获自血液培养法和标准法所有4个物种都给出了优异的鉴定置信度水平，证明基于密度的分离方法提供基本上不含有血液和/或来源于培养液的粒子和蛋白质的微生物。
实施例2.在溶胞缓冲液中的EDTA作为鉴定剂
许多溶胞缓冲液，尤其是用于分子方法的那些，含有螯合剂诸如EDTA以辅助溶解步骤。我们采用革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物面板评价了向TXl00-CAPS溶胞缓冲基础液中加入EDTA的影响。表1显示了EDTA对铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌（A.baumanii）的快速抑制效应，但是对于两种其它的革兰氏阴性杆菌洋葱假单胞菌（B.cepacia）和肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae），或革兰氏阳性金黄色葡萄球菌没有快速抑制作用。注意到，尽管EDTA对铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌两种都有抑制作用，但是这两个菌种之间主要内荧光团的变化非常不同。铜绿假单胞菌是仅有的在EDTA处理之后NADH和色氨酸荧光都显著下降的测试生物。
这些实验代表了一个良好的实例，其中如何能够将某些添加剂或鉴定剂加入到溶胞缓冲液中以快速改变特定微生物的基础微生物内荧光曲线并提供强化鉴定和进一步表征该分离物的机会。正如本领域技术人员易于理解的那样，特定的微生物对影响其物理状态或代谢的任何化合物的敏感性可以通过将该化合物加入样品、溶胞缓冲液、密度缓冲垫层或其任何混合物中来快速地确定。类似地，改变溶胞条件或选择性溶胞缓冲液的组成（例如，缓冲液pH、清洁剂类型和其浓度）都可以产生微生物内荧光的特征性变化。
表1：溶胞缓冲液中的EDTA作为铜绿假单胞菌的鉴定剂
实施例3.快速原位微生物酶分析
肠杆菌科（Enterobacteraciae）的一些紧密相关的成员可以通过存在或不存在被称为焦谷氨酰肽酶的酶进行区分。例如，产气肠杆菌（E.aerogenes）是阳性的而阴沟肠杆菌（E.cloacae）是阴性的；弗氏柠檬酸杆菌（C.freundii）是阳性的而大肠杆菌是阴性的。
为了对微生物焦谷氨酰肽酶(Pyr A)进行测试，对阳性血液培养液进行如下处理：
1.将2.0mL阳性培养液样品与1.0mL选择性溶胞缓冲液（0.45%w/v97+0.3M CAPS，pH11.7）混合，然后在37℃水浴上放置1min。
2.将1.0mL溶胞产物样品覆盖在容纳于定制光学分离管中包含的用300ug/mL L-焦谷氨酸-7AMC补充的0.5mL密度缓冲垫层（24%w/v氯化铯+10mM Hepes pH7.4+0.005%Pluronic F-108)上。在密度缓冲垫层的表面上存在聚丙烯球以有助于装载而不会干扰两个水相。
3.光学分离管用螺旋盖密封并以10,000rpm（配备A-8-11甩开转子的5417R微量离心机（Eppendorf，New York））离心2min；参见，例如，图4，这显示了离心后的溶胞的含微生物的血液培养液的分离设备。
4.然后将密封管转移到定制适配器中，该定制适配器将该管底部直接耦合至连接到荧光分光光度计（3（HORIBA Jobin Yvon Inc.，NewJersey））的300微米光纤光学探针。
5.在36℃下离心之后即刻（在图3中由0～5min表示的）或5min之后（图3中5～10min）对AMC（Ex380nm_Em460nm）在Ex/Em最大处读取沉降的微生物颗粒。
对于相同分离物组，通过这种5～10min分析测定的Pyr A活性与2GN Card Pyr A(bioMerieux Inc.，Missouri)的结果是完全一致的。在几分钟内测定被大量代谢活性细胞转换的光学分离管的限定区域内的这种荧光酶底物。正如本领域技术人员易于理解的，以相似的方法可以测定其它微生物酶活性。
实施例4.用于区分念珠菌属的快速原位FISH分析
采用酵母型菌落和白色念珠菌（C.albicans）/光滑念珠菌（C.glabrata）试剂盒(，Massachusetts)按如下所示使溶液荧光原位杂交（FISH）分析适应于本发明的方法：
1.采用一次性的1μL环，从含以下菌株的Sabaraud-Dextraos琼脂平板上收集布满酵母菌生长物的环：
a.白色念珠菌，StL#304776
b.光滑念珠菌，StL#304749
c.热带念珠菌（C.tropicalis），StL#304421
2.在1.5mL微量离心管中，将酵母生长物直接悬浮在固定剂和来自白色念珠菌/光滑念珠菌试剂盒(，Cat.No.KT006)的杂交剂的50μL1:1混合物中。
3.短暂地涡旋管以混合酵母菌细胞和试剂。
4.将管置于55℃的水浴中30min进行杂交
5.向每一个管中加入0.5mL预热至55℃的冲洗缓冲液。
6.立即将每个微型离心管的内容物转移至预先填充30%v/v的胶体二氧化硅在0.15M NaCl中的储备液(；密度=1.045gm/mL)的光学分离管中。
7.以10,000rpm在包含A-8-11甩开转子的5417R微量离心机中旋转分离管2min。
8.从离心机中移出管。将每个管转移至3分光光度计的定制30度正面适配器中。
9.采用扫描程序（包括Ex500_Em530(白色念珠菌探针)、Ex560_Em590(光滑念珠菌探针)、细胞色氨酸、NADH和黄素区）读取每一管子底部的酵母菌颗粒的荧光。
10.将所有数据输入到Excel程序进行分析。
在以上所述的分析条件下，标记的RNA探针以较高的量结合它们的特异性酵母菌种（图5）。正如本领域技术人员易于理解的，采用本发明中建立的原位分离和读取原理可以测定其它微生物特异性RNA或DNA分子。

Claims (25)

1.一种表征和/或鉴定微生物的方法，包括：
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；
(b)将测试样品铺层于容器中的均匀密度缓冲垫层的上方；
(c)向所述测试样品和/或所述密度缓冲垫层中加入鉴定剂；
(d)将所述容器离心以使微生物与测试样品的其它组分分离，所述微生物穿过所述密度缓冲垫层，以在所述容器底部形成微生物颗粒；
(e)通过光学光谱法对所述颗粒和所述一种或多种鉴定剂进行探询以产生表征和/或鉴定微生物的测定结果，其中，所述光学光谱法包括内荧光，并且其中，进行所述探询的同时所述颗粒仍保留在所述容器中；和
(f)基于所产生的测定结果和/或在颗粒中存在或不存在所述鉴定剂或所述鉴定剂的代谢形式来表征和/或鉴定颗粒中的微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定剂选自由亲合性配体、抗体或其片段、酶底物、核酸探针、抗生素、适体、肽模拟物、噬菌体衍生的结合蛋白、凝集素、宿主先天性免疫蛋白、宿主防御肽、细菌素、细菌噬菌体、选择性染料、螯合剂、光增敏剂、淬灭剂、还原剂、氧化剂、酸、碱、醇、固定剂、清洁剂、表面活性剂、消毒剂、有毒化合物、代谢抑制剂、氧化代谢探针、膜电位蛋白、或其任意组合组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定剂是螯合剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定剂是酶底物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定剂是焦谷氨酰肽酶的酶底物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定剂是荧光标记的核酸探针的混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)-(e)在密闭容器中实施并且其中所述探询步骤(e)是非侵入式的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述探询步骤(e)进一步包括从所述容器中去除所述颗粒，然后通过质谱法对所述颗粒进行探询。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学光谱法进一步包括拉曼光谱法。
11.根据权利要求1所述的方法，其中基于一种或多种表型特征和/或形态学特征对所述微生物进行表征。
12.根据权利要求1所述的方法，其中将所述微生物表征到一种或多种分类模型中，所述分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组和功能组组成的组。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将所述微生物鉴定至属水平、种水平和/或菌株水平。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述分离步骤(d)之前的选择性溶胞步骤。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述密度缓冲垫层包含胶体二氧化硅、碘化造影剂、蔗糖、显微镜浸镜油、矿物油、硅油、氟硅油、硅凝胶、甲泛影酸盐-泛影酸盐-葡聚糖、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚丙烯酸、交联的聚乙烯醇、交联的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、果胶、琼脂糖、黄原胶、胶凝糖、山梨醇、甘油、葡聚糖、糖原、氯化铯、全氟碳流体、和/或氢氟碳流体中的一种或多种。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样品是已知包含微生物的培养样品。
17.一种分离和鉴定微生物的方法，包括：
(a)获得已知包含或可能包含微生物的测试样品；
(b)使用包含一种或多种清洁剂的溶胞溶液选择性地溶解所述测试样品中的细胞以产生溶胞样品；
(c)使微生物与所述溶胞样品的其它组分分离以形成微生物颗粒；
(d)通过光学光谱法对颗粒进行探询以产生鉴定微生物的测定结果，其中，所述光学光谱法包括内荧光，并且其中，进行所述探询的同时所述颗粒仍保留在容器中；
(e)基于所产生的测定结果鉴定微生物；和
(f)回收至少一部分颗粒以产生回收的微生物；
(g)对所述回收的微生物实施一种或多种进一步的测试。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述测试步骤(g)进一步包括通过质谱法进行探询。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述溶胞溶液还包含一种或多种蛋白酶和一种或多种核酸酶的混合物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述溶胞溶液包含一种或多种缓冲剂。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述回收的微生物再悬浮于合适的缓冲液中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述进一步的测试是鉴定测试。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述进一步的测试是表征测试。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述进一步的测试是耐药性、毒力因子、和/或抗药型的测试。
25.根据权利要求17所述的方法，其中所述测试样品是已知包含微生物的培养样品。
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