CN102279273A

CN102279273A - 一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒

Info

Publication number: CN102279273A
Application number: CN2011102023235A
Authority: CN
Inventors: 赵益明; 阮长耿; 季顺东; 杨剑锋
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明公开了一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒，包括：固相化包被抗体的酶标板，辣根过氧化物酶标记的检测抗体，标准品，瑞斯托霉素，重组GPIbαH1-V289片段-Fc融合蛋白，样品稀释缓冲液，显色液，终止液，其中，所述包被抗体为抗血小板膜糖蛋白Ibα的单克隆抗体SZ-151；所述检测抗体为兔抗人VWF多抗；所述标准品为混合标准血浆。采用该试剂盒检测检测vWF:RCof时具有良好的重复性、灵敏度，且测试结果和vWF:Ag、vWF:CBA具有良好的相关性。

Description

一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明属于酶联免疫分析 ( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 技术，具体涉及一种检测血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性的试剂盒，采用抗血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ibα单克隆抗体( monoclonal antibody，mAb) SZ-151作为包被抗体来捕捉结合真核表达重组人GPIbα氨基端His¹-Val²⁸⁹片段的-Fc融合蛋白（rfGPIbα H1-V289-Fc），再捕获血浆中的血管性血友病因子（VWF），然后应用酶标检测仪检测血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性。

背景技术

血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）是一种大分子量的具有粘附功能的多聚体糖蛋白，在初期止血过程中发挥着重要怍用。它既可与血小板受体糖蛋白（GP）Ib/IX/V、GPⅡb/Ⅲa结合，又能与胶原等细胞外基质(ECM)结合，从而介导血小板的粘附与聚集。而且vWF还能与凝血因子Ⅷ结合，保护因子Ⅷ免受APC灭活。vWF量的减少或质的异常均能导致血管性血友病(von Willebrand’s diseases, vWD)的发生。

血管性血友病(von willebrand’s disease，vWD) 是最常见的一种遗传性出血性疾病，国外文献报道vWD发病率为0.1%-1%，其发病机制为患者的vWF基因突变，导致血浆中vWF 数量减少或质量异常。vWD主要分为3型，其中1型与3型为量的减少，2型为质的异常。2型又可进一步分为四种亚型(A，B，M和N)。（1）2A型为vWF前体装配异常或对蛋白水解酶的敏感性增加导致缺乏vWF高、中分子多聚体缺乏；（2）2B型发病机制为vWF与血小板膜GPⅠb亲和性增加以致自发结合，导致血小板聚集、减少，vWF清除加速，特征为缺乏vWF高分子多聚体；（3）2M型是由于vWF基因A1区突变，导致对血小板膜GPⅠb亲和性降低，vWF多聚体分析正常；（4）N型特征为vWF基因D′区或D3区突变，导致与因子Ⅷ亲和力降低，血浆FⅧ失去保护而被降解。

在大部分国家，疑似vWD患者的筛查试验包括：出血时间(BT)，vWF抗原水平 (vWF:Ag) 和vWF瑞斯托霉素辅因子活性试验(vWF:RCof)等。要做出准确、恰当的治疗尚需结合其他分型试验如瑞斯托霉素诱导的血小板聚集（RIPA）、胶原结合试验(vWF:CB)、vWF多聚体凝胶电泳和基因分析等。现有实验室检查方法各有一定局限性，因此不能仅凭单项实验做出可靠的诊断，需组合应用一系列检测方法才能较好地对vWD进行筛查、诊断和分型。vWF:Ag试验可较好的反映vWF量的异常但无法体现出vWF质的缺陷，其结果有助于诊断所有3型和大部分1型患者，由于部分2型患者vWF:Ag水平可能正常，因此该实验仅能辅助诊断部分2型患者。对于2型患者，反映vWF功能的主要试验vWF:RCof 就变得尤为重要。

瑞斯托霉素是一种抗生素，可诱导vWF 和血小板GPIb/V/IX 复合物的结合。已证实与vWF的A1区结合的部位为血小板GPIbα氨基末端分子量42kD的片段(H1-V289)。国内目前主要应用血液凝集仪检测vWF：Rcof，该方法需使用血小板聚集仪，其主要将固定正常血小板，患者血浆及一定浓度瑞斯托霉素混合，测定血小板凝集情况。由于该方法使用固定的正常血小板，存在重复性较差、批内变异和批间变异都较大的固有缺点，且血小板聚集程度有时难以判定，因此常导致部分vWD患者的误诊。

2000年Vanhoorelbeke 等首次报道了应用抗GPIbα单克隆抗体2D4包被96孔聚苯乙烯酶标板，加入重组的GPIbα，在小剂量瑞斯托霉素存在下建立了血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定的酶联免疫分析（vWF:Rcof –ELISA）；国内2007年徐海燕等应用该进口抗体2D4也报道了该方法：vWF:Rcof-ELISA法建立，以抗GPIba的单克隆抗体2D4为包被抗体，捕获重组的GPIba氨基端片断(v GPlba)，该片段在瑞斯托霉素存在的情况下与vWF结合（参见：徐海燕. 血管性血友病分型组合实验的建立和临床应用. 《苏州大学》2007年硕士论文）。

但是，现有技术中至今未见商品化的vWF:Rcof –ELISA诊断试剂盒。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒，包括：固相化包被抗体的酶标板，辣根过氧化物酶标记的检测抗体，标准品，瑞斯托霉素，重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白(rfGPIbα H1-V289-Fc)，样品稀释缓冲液，显色液，终止液，其中，所述包被抗体为抗血小板膜糖蛋白Ibα的单克隆抗体SZ-151；所述检测抗体为兔抗人VWF多抗(RAH-vWF-HRP)；所述标准品为混合标准血浆；

所述单克隆抗体SZ-151由杂交瘤细胞SZ-151制备得到，所述杂交瘤细胞SZ-151的保藏信息为：保藏日期：2011年5月24日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC C201131；分类命名：杂交瘤细胞SZ-151。

上述技术方案中，所述重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白rfGPIbα H1-V289-Fc可参考文献：杨剑峰，抗血小板膜糖蛋白Ibα单克隆抗体的人源化及基于膜糖蛋白Ibα结构的活性小分子化合物研究，2010年苏州大学内科血液病学专业博士论文，P48。

上述技术方案中，所述检测抗体为兔抗人VWF多抗RAH-vWF-HRP可参见文献：Vanhoorelbeke K,et al, 2000, Thromb Haemost, 83:107-13。

上述技术方案中，所述固相化包被抗体的酶标板为单抗SZ-151固相化的酶标板，即表示抗血小板膜糖蛋白Ibα的单克隆抗体SZ-151已包被在酶标板上，所述酶标板选自但不限于可拆卸的96孔聚苯乙烯酶标板。所述设有固相化的抗人血小板膜糖蛋白(GP) Ibα的单克隆抗体SZ-151的96孔聚苯乙烯酶标板，即每一个孔内都包被上SZ-151 IgG，每一个孔内的SZ-151 IgG能够在体外分别特异性捕捉结合重组真核表达重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白(rfGPIbα H1-V289-Fc)抗原分子。

上述技术方案中，所述样品稀释缓冲液为含有质量分数0.2%的BSA的PBS缓冲液；所述显色液为TMB显色液；所述终止液为3M的硫酸溶液。

上述技术方案中，正常混合标准血浆的制备方法为：(1) 取外周静脉血，采用枸橼酸三钠抗凝，离心后取贫血小板血浆（PPP）；(2) 取两名以上正常人的血浆等量混合后分装，得到正常混合标准血浆，置－80℃备用。

优选的技术方案中，SZ-151包板浓度为10μg/mL，重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白rfGPIbα H1-V289-Fc浓度为 4μg/mL，瑞斯托霉素浓度为760μg/mL。

应用上述试剂盒检测血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性的方法，包括以下步骤：

(1) 取单抗SZ-151固相化的酶标板，每孔加入100 μl重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白(rfGPIbα H1-V289-Fc)， 4 ℃静置过夜；

(2) 以洗液洗板6次（TBS(0.02 mol/L Tris-HCL, pH7.4)-0．1%Tween-20洗涤6次），取正常混合标准血浆，用样品稀释缓冲液按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200 共7个倍比稀释，稀释后的以50μL/孔加入ELISA板；将枸橼酸三钠抗凝的待测血浆用样品稀释缓冲液按照1∶50稀释，稀释后的以50μL/孔加入ELISA板；同时按照50μL/孔的用量加入终浓度760μg/mL的瑞斯托霉素；同时设立空白对照孔，所述空白对照孔为 0.01mol/L pH7.4 TBS-1mL/L Tween-20；37℃温育 2小时；

(3) 以洗液洗板6次，每孔再加入100μl辣根过氧化物酶标记兔抗人 vWF多抗（RAH-vWF-HRP），37℃温育 1小时；

(4) 以洗液洗板9次，每孔加入100μl显色液，显色 10 分钟；

(5) 按照50μl / 孔的用量加入终止液以终止反应，在酶标仪上450 nm处测定各孔光吸收（OD 450 nm）值；

(6) 计算和结果判定：以正常混合血浆的7个倍比稀释度的对数为横坐标，相应OD450 nm值为纵坐标，作标准曲线和直线回归方程后计算含量；以正常混合标准血浆的vWF：Rcof定为100 U/dL，根据标准曲线和直线回归方程，根据待测血浆测定的OD值计算出待检测孔内vWF：Rcof，再乘上50（待测样本的稀释倍数），即为待测血浆内的vWF：Rcof。

进一步的技术方案中，采用现有技术测得待测血浆的vWF：Ag以及vWF:CBA，结合上述待测血浆的vWF：Rcof比值判定血管性血友病的分型，具体方法为：（vWF：RCof）/（vWF：Ag）比值常用于区分1型和2型vWD，1型患者该比值一般大于0.6，2型患者该比值一般小于0.6；vWD，3型患者，其vWF：Ag，vWF：Rcof和vWF:CBA均小于5 U/dL。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

(1) 本发明中包被抗GPIbα单抗SZ-151由本发明人研制，具有自主知识产权，使得本试剂盒国产化，降低了试剂成本，与国外的抗GPIbα单抗2D4包板所测结果进行对比，结果显示两种方法检测vWF:RCof 较为相符（r=0.96）。该方法具有较好的重复性（批内和批间差异分别为8%和12%），且灵敏度更高（其DL为0.01 U/dL）。

(2) 该方法检测结果与vWF:Ag（r = 0.91）和vWF:CBA（r = 0.85）具有良好的相关性。

(3) 该方法血浆用量少，只需5μl。对于vWF抗原水平极低的患者，由于该方法灵敏度更高，因此可为其提供更准确的诊断和分型依据。

(4) 我们用未经过纯化的表达rfGPIbα的CHO培养上清液代替纯化的rfGPIbα蛋白进行vWF:RCof-ELISA试验，同样具有较好的结果，这提示今后或可直接使用未纯化的CHO培养上清液，简化试验步骤并避免rfGPIbα蛋白在纯化过程中的损失，节省成本。

附图说明

杂交瘤细胞SZ-151的保藏信息为：保藏日期：2011年5月24日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC C201131；分类命名：杂交瘤细胞SZ-151；

图1为实施例六中不同瑞斯托霉素浓度的测试效果；

图2为实施例六中两种试剂盒的测试灵敏度对比图；

图3为实施例六中两种试剂盒的测试结果相关性图；

图4为实施例七中vWF:RiCof 与vWF:Ag相关性图；

图5为实施例七中vWF:RiCof 与vWF:CBA 相关性图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：制备杂交瘤细胞株SZ-151。

使用正常人混合血小板作为免疫原，常规三次免疫接种8周龄雌性Balb/c小鼠（每次间隔4周），用酶联免疫吸附法（ELISA）检测被免疫动物血清中单克隆抗体的存在和浓度。免疫完成后，选择产生足够高浓度（血清内抗体效价为1：20000以上）抗血清的小鼠，分离动物脾脏并制备脾细胞悬液。

按照已知的杂交瘤技术（Kohler and Milstein，Nature 215：495-497，1975；Kohler et al，Immunology Today，4：72-76，1983）将所得到的小鼠脾细胞与适当的骨髓瘤（SP2/0）相融合，应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤，制备得到可持续传代并分泌抗血管性血友病因子A3区单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

上述杂交瘤细胞系已于2011年5月24日将产生并分泌本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株保存在中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC C201131。

实施例二：纯化单抗SZ-151。

按照常规技术制备单抗SZ-151腹水，在PH8.0，0.1M的 PBS缓冲液中透析，8000rpm离心，取腹水上清约1ml过柱（亲和层析柱Protein G-Sepharose 4B）使各IgG与蛋白G充分结合，用0.1M pH2.8甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，收集各单抗IgG峰。收集IgG用PEG（分子量约20000）浓缩，在0.01MPBS中透析4小时，用280nm测蛋白含量，SZ-151-IgG冻低温冰箱备用。

实施例三：SZ-151 IgG固相化包被酶标板。

将抗GPIbα 单克隆抗体SZ-151-IgG用包被缓冲液（0.1M, pH9.6碳酸缓冲液）稀释，以10 μg/mL加入96孔聚苯乙烯酶标板孔中，100μl/孔，4℃湿盒过夜；次日，用PBS-0.05% Tween洗涤3次后，用封闭液（2% BSA-PBS） 250μl/孔封闭，4℃湿盒过夜；次日，同上洗涤3次后备用或－20℃冻存。

实施例四：重组GPIbα H1-V289-Fc 片段-Fc融合蛋白（rfGPIbα H1-V289-Fc）的真核表达、纯化。

将稳定表达重组人GPIbα氨基端His¹-Val²⁸⁹片段的-Fc融合蛋白（rfGPIbα H1-V289-Fc）的CHO细胞用含10%胎牛血清的IMDM培养液37℃培养，细胞生长旺盛后弃去上清，加入SFM培养基继续培养五天，收获上清，将高表达rGPIbα H1-V289的培养上清液用Protein A –Sepharose 4B亲和层析柱纯化。

实施例五：正常混合标准血浆的制备。

取外周静脉血2ml，枸橼酸三钠（1:9）抗凝，3000 rpm/min，离心10 min，取贫血小板血浆（PPP）。本研究取40名正常献血员的血浆等量混合后分装，置－80℃备用，为正常混合标准血浆。

待测血浆分离方法同上。

实施例六：

一种vWF:Rcof –ELISA试剂盒，包括以下组分：

(1) 单抗SZ-151固相化的酶标板，抗血小板膜糖蛋白Ibα的单克隆抗体SZ-151已包被在可拆卸的96孔聚苯乙烯酶标板上；

(2) 重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白（rfGPIbα H1-V289-Fc）纯品一瓶，10 ml, 4μg / ml；

(3) 混合的标准血浆4瓶，50 μl/瓶；

(4) 瑞斯托霉素一瓶，5 ml，1.5～2mg / ml；

(5) 辣根过氧化物酶标记的兔抗人VWF多抗（RAH-vWF-HRP），10ml；

(6) 样品稀释缓冲液（0.2% BSA-PBS）一瓶，10 ml；

(7) TMB显色液一瓶，10 ml；

(8) 终止液一瓶（3M H₂SO₄），5 ml。

（一）、确定上述试剂盒的最佳瑞斯托霉素浓度：正常混合标准血浆分别作1/32 ～1/512稀释后，分别以终浓度为1 mg/ml，760μg/ml，500μg/ml和250μg/ml 瑞斯托霉素37℃温育 2小时后，测定vWF:RCof；所述测定vWF:RCof的方法包括以下步骤：

(1) 取单抗SZ-151固相化的酶标板，每孔加入100μl重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白，4 ℃湿盒过夜；

(2) 次日，以TBS(0.02 mol/L Tris-HCL, pH7.4)-0.1%Tween-20洗涤6次，正常混合标准血浆分别作1/32 ～1/512稀释后，按50μL/孔的量加入酶标板；同时加入瑞斯托霉素50 μl/孔，终浓度分别为1 mg/ml，760μg/ml，500μg/ml和250μg/ml；空白对照孔为 0.01mol/L pH7.4 TBS-1mL/L Tween-20，37℃温育 2小时；

(3) 同上洗涤 6次；每孔再加入100μl辣根过氧化物酶标记兔抗人 vWF多抗，37℃温育 1小时；

(4) 同上洗涤 9次，每孔加入100 μl显色液TMB，显色 10 分钟了；

(5) 以50 μl / 孔的用量加入终止液以终止反应，在酶标仪上450 nm处测定各孔光吸收（OD 450 nm）值；

(6) 计算和结果判定：以正常混合血浆的7个倍比稀释度的对数为横坐标，相应OD450 nm值为纵坐标，作标准曲线和直线回归方程后计算含量。结果显示瑞斯托霉素浓度为1 mg/ml和 760μg/ml时测定的稀释血浆的vWF:RCof明显高于500μg/ml和250μg/ml的vWF:RCof。我们选择瑞斯托霉素760μg/ml为试验浓度（图1）。

（二）、测定上述vWF:Rcof –ELISA试剂盒的灵敏度：分别用抗GP I bα单抗SZ-151和国外进口的单抗2D4包板，正常混合血浆作1：50～1：12800 九个倍比稀释度，同样采用上述方法检测vWF：RCof，并以混合血浆的vWF：Rcof定为100 U/dL。

结果显示SZ-151包板的灵敏度为0.03 U/dL（图2），高于2D4包板（0.05 U/dL）。

（三）、测定上述vWF:Rcof –ELISA试剂盒的重复性：

(1) 批内重复性：同一份标本在相同条件下重复测定10次，观察批内重复性。(2) 批间重复性：同一正常献血员标本在不同时间、相同条件下进行重复试验10次，观察批间重复性。

结果表明：SZ-151包板测定血浆vWF:RiCof的批内差异和批间差异分别为7.8%和9.4%，而同等条件下，2D4包板的批内差异和批间差异分别为9.6%和12.8%。

（四）、测定上述vWF:Rcof –ELISA技术（SZ-151包板）与2D4包板方法的相关性：

结果如图4所示，表明上述vWF:Rcof –ELISA技术（SZ-151包板）与2D4包板方法具有良好的相关性，其结果经直线回归分析得r=0.96（图3），可见所述单抗SZ-151完全可以替代2D4包板用于检测vWF:RiCof。

（五）、用未经过纯化的表达rfGPIbα的CHO培养上清液代替纯化的rfGPIbα蛋白进行vWF:RCof-ELISA试验，同样具有较好的结果，这提示今后或可直接使用未纯化的CHO培养上清液，简化试验步骤并避免rfGPIbα蛋白在纯化过程中的损失，节省成本。

实施例七：临床标本采集和正常人及vWD 患者的血浆VWF:RCof 与vWF:CBA 、vWF:Ag 的测定和比较。

所述vWF:Ag测定方法为（奚晓东，等，1988，中华医学检验杂志，12：272-275）：

包板：将抗人vWF单克隆抗体SZ-29溶于包被缓冲液，以2μg/mL包被于96孔ELISA板，100μl/孔，4℃湿盒过夜；次日，用PBS-0.05%Tween洗涤3次后，用封闭液200μl/孔封闭，4℃湿盒过夜；次日同上洗涤3次后备用或－20℃冻存。

检测：正常混合血浆以1：20、1：50、1：100、1：200、1：500、1：1000六个稀释度作为标准曲线，100μL/孔，待测血浆作1：50稀释亦可按实际需要提高或降低稀释度，均以0.2% BSA-PBS为稀释液，空白对照孔加入0.2 %BSA-PBS溶液，37℃温育2 h；同上洗涤3次后加入HRP标记的抗人vWF单抗-34, 100μL/孔，37℃温育 2 h；同上洗涤 6次后以TMB显色，3M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上测定450 nm处各孔OD值。以正常混合血浆的6个稀释度的对数为横坐标，相应OD值为纵坐标，作直线回归方程后计算含量，以混合血浆的vWF：Ag定为100 U/dL。

所述vWF:CBA测定方法为（徐海燕，等，中华血液学杂志，2007，28:637-639）：

包板：将牛皮肤Ⅲ型胶原（Sigma公司）用包被缓冲液稀释，以20μg/mL包被于96孔ELISA板，100μl/孔，4℃湿盒过夜；次日，用PBS-0.05%Tween洗涤3次后，用封闭液200μl/孔封闭，4℃湿盒过夜；次日同上洗涤3次后备用或－20℃冻存。

检测：正常混合血浆以1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280、1：2560六个倍比稀释度作为标准曲线，100μL/孔，待测血浆作1：200稀释或根据实际需要确定稀释度，均以2% BSA-PBS为稀释液，空白对照孔加入2%BSA-PBS溶液，37℃温育 2 h；同上洗涤3次后加入HRP标记兔抗人vWF多抗，37℃温育1h；同上洗涤6次后以TMB显色，3M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上测定450 nm处各孔OD值。以正常混合血浆的6个稀释度的对数为横坐标，相应OD值为纵坐标，作直线回归方程后计算含量，以混合血浆的vWF：CBA定为100 U/dL。

36例按国家规定体检合格的健康志愿者（正常组）。vWD患者25例（vWD组），符合2008年美国国家心肺和血液研究所（NHLBI）颁布的血管性血友病诊断与治疗指南。

分别测定36例正常人和25例vWD患者的血浆中VWF:RCof 与vWF:CBA 、vWF:Ag的含量，并分别计算VWF:RCof/vWF:Ag和vWF:RCof /vWF:CBA的比值（见表.1.）。本研究中36名正常人血浆vWF:RCof > 50U/dL（仅两名例外），与vWF:Ag、vWF:CBA 检测结果一致，vWF:RCof / vWF:Ag和vWF:CBA/vWF:Ag比值接近1（均值分别为0.92和1.06）。1型vWD患者vWF:RCof <50U/dL（仅1名例外，为57 U/dL），由于1型vWD 主要是vWF量的减少而非质的缺失，vWF:Ag 和vWF:CBA、vWF:RCof检测结果较为相当，vWF:RCof / vWF:Ag和vWF:CBA/vWF:Ag比值均>0.7。2型vWD患者vWF:RCof与vWF:Ag 相比明显更低，vWF:RCof/vWF:Ag比值均<0.6。3型vWD患者其vWF:RCof、vWF:CBA和vWF:Ag 均极低（<5U/dL）。

表 1 36名健康志愿者和25名vWD患者的血浆vWF:RCof 、vWF:Ag及vWF:CB（U/dL）的均值（范围）和比值

经直线回归分析得vWF:RiCof 与vWF:Ag （r= 0.91），vWF:RiCof 与vWF:CBA （r=0.85 ）（参见图4、5），vWF:Ag 与vWF:CBA （r=0.80 ）。

Claims

1.一种血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒，包括：固相化包被抗体的酶标板，辣根过氧化物酶标记的检测抗体，标准品，瑞斯托霉素，重组GPIbαH1-V289 片段-Fc融合蛋白，样品稀释缓冲液，显色液，终止液，其特征在于，所述包被抗体为抗血小板膜糖蛋白Ibα的单克隆抗体SZ-151；所述检测抗体为兔抗人VWF多抗；所述标准品为混合标准血浆；

2.根据权利要求1所述血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子酶联免疫试剂盒，其特征在于，正常混合标准血浆的制备方法为：(1) 取外周静脉血，采用枸橼酸三钠抗凝，离心后取贫血小板血浆；(2) 取两名以上正常人的血浆等量混合后分装，得到正常混合标准血浆。