CN102276726A - 肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，利用分子生物学技术，表达多种不同组合的单个或多个肝细胞生长因子受体活性基团与人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白质。肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白质可高效、特异地与生长因子结合，阻止生长因子与肿瘤细胞的结合，抑制肿瘤细胞的生长和转移，靶向定点治疗肿瘤；由于肝细胞生长因子受体活性基团的多样性，因此通过单个或多个受体活性基团的组合，可得到具有不同亲和力和药物代谢动力学的融合蛋白质。

Description

肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白

技术领域

本发明涉及融合蛋白，具体涉及编码包含肝细胞生长因子受体（cMet）活性基团和Fc片段的融合蛋白及其编码DNA。

背景技术

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），又称扩散因子（scatter factor,SF），是由一条α重链（相对分子量为69kDa）和一条β轻链（相对分子量为34kDa）组成的异二聚体。HGF是一种刺激肝细胞增生的有丝分裂原，对肝切除或化学损伤后的肝细胞再生起重要作用。HGF能刺激多种类型细胞分化、增殖、再生、运动及形态的改变，是一种多功能的细胞因子。

HGF的受体即肝细胞生长因子受体(cMet)，是1984年Cooper等从NIH3T3细胞中克隆出的一种原癌基因（Proto-Oncogen）,突变可成为一个致癌基因，引发癌症； cMet是由相对分子质量为50kDa的α亚单位和相对分子质量为145kDa的β亚单位通过二硫键连接而形成的一个相对分子质量为190kDa的异二聚体，其中β亚单位C-末端具有酪氨酸激酶功能和若干调节其受体活性的自身磷酸化功能；当cMet与HGF结合后，可快速转移到细胞核，通过钙离子通道传递信息，激活细胞功能，促进细胞组织增长，重生和正常组织结构的重组；并能参与癌症细胞侵润性生长，导致肿瘤细胞侵入周围组织内生长，穿透脏器，组织层，最终扩展到全身。

肝细胞生长因子（HGF）及其受体酪氨酸激酶肝细胞生长因子受体(cMet)已成为肿瘤生长和血管生成的关键因素，肝细胞生长因子（HGF）的表达和在肿瘤细胞的分泌会激活cMet，诱导肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭，减少人体对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞抑制；肝细胞生长因子受体(cMet)会激活肿瘤血管内皮细胞，诱导细胞外基质降解、小血管形成及体内血管新生；在动物实验肿瘤模型中，cMet和肝细胞生长因子可导致动物的肿瘤细胞生长和血管新生。肝细胞生长因子（HGF）和肝细胞生长因子受体(cMet)在肿瘤中的表达经常与肿瘤的分级程度、肿瘤血管密度密切相联，但是其预后差。

肺癌在西方国家是排第一位引起人类死亡的肿瘤，80%新诊断的肺癌是非小细胞型（NSCLC）。多数非小细胞型肺癌病人发现时为癌症后期或转移性肿瘤，无法手术切除；其五年成活率很低，化疗是对非小细胞型肺癌后期和转移型的主要的治疗方法。临床对2714个肺癌病人的研究发现，在开始的12个月内，化疗只对9%的病人有明显的效果。因此，化疗对多数肺癌病人无明显的改善。研究发现肝细胞生长因子受体(cMet)大量表达在非小细胞型肺癌细胞中，对其的药物可能可用于非小细胞型肺癌的治疗。

近年来，通过对肿瘤分子生物学和肿瘤发病机理的进一步研究和了解，从而发现了多个潜在的肿瘤分子靶点目标,其可用于新颖的肿瘤靶向定点（Targeted)治疗。这些治疗可抑制肿瘤发展过程的信息传递通道，这些通道只在肿瘤细胞中可激活，但正常细胞将不会被激活。利用肿瘤特定靶点目标（Targeted）治疗法治疗肿瘤比常规的细胞毒类药物的治疗对正常细胞的毒性小，更易被人体接受。表皮生长因子（EGF）受体抑制剂，表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体，酪氨酸激酶抑制剂和抗血管增生类制剂最近在肿瘤治疗中显示明显的优势，利用肿瘤细胞特定的单克隆抗体（如EGFR）进行肿瘤的靶向治疗，取得了较好的效果。

对HGF的抑制使得肿瘤生长和肿瘤血管的生成受到抑制。目前已经开发出了许多HGF调节剂（包括抗体）来治疗涉及HGF活性的多种紊乱，如某些HGF响应的癌症。

中国专利文献CN101460521A(申请号200780020154.5，申请日2007.6.1)公开了肝细胞生长因子（HGF）的结合蛋白质，该结合蛋白质包含结构CDRL1-CDRL2-CDRL3D的免疫球蛋白轻链可变区及3个互补性决定区的免疫球蛋白重链可变区；所述结合蛋白质抑制HGF与其同源受体结合，由此中和了HGF的活性；当施用至哺乳动物时，所述的结合蛋白质能够抑制或减少哺乳动物中肿瘤的生长。

当然，我们还需要其他类型的抑制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效、特异地与肝细胞生长因子（HGF）结合的肝细胞生长因子受体（cMet）的融合蛋白。

实现本发明目的的技术方案是一种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，由来自肝细胞生长因子受体的直接作为功能基团的活性基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，或者由来自肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，其中肝细胞生长因子受体的功能基团在氮端，人免疫球蛋白Fc片段在碳端；所述肝细胞生长因子受体的活性基团包括Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团；所述活性基团经组合后的功能基团包括复数个相同的活性基团组合而成的功能基团以及其中2～3种活性基团单个或复数个任意组合而成的功能基团；

所述肝细胞生长因子受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所述，肝细胞生长因子受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所述；

肝细胞生长因子受体的Sema蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1-1546核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的Sema蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中1-516氨基酸序列所述；

肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1547-1686核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中517-772氨基酸序列所述；

肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1687-2796核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中773-932氨基酸序列所述。

上述肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团为由Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团，或者为MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为2～3组Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团。

上述人免疫球蛋白为hIgG1，其Fc片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所述，其Fc片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所述。

上述功能基团由Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。

上述功能基团由Sema蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.3所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。

上述功能基团由两组Sema蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.5所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所述。

上述功能基团由MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.7所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所述。

上所述功能基团为IPT蛋白活性基团时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.9所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所述。

上述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白与肝细胞生长因子结合。

上述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的肝细胞生长因子受体的融合蛋白具有与肝细胞生长因子结合的能力；所述融合蛋白质可高效、特异地与肝细胞生长因子结合，从而阻止肝细胞生长因子与肿瘤细胞的受体结合。（2）由于肝细胞生长因子受体活性基团的多样性，因此通过单个或多个受体活性基团的组合，而得到具有不同亲和力和药物代谢动力学的融合蛋白。（3）由于本发明的肝细胞生长因子受体的融合蛋白的组成是来源于人体本身的蛋白质，因此使用时可减少自身免疫反应。

附图说明

图1为肝细胞生长因子受体的结构模式图，其中：N-氨基端，SEMA-Sema蛋白活性基团（斯玛域），MRS-MRS蛋白活性基团（原癌基因），IPT-IPT蛋白活性基团（免疫球蛋白类地区plexins和转录因子），TM-跨膜蛋白域，KD-激酶域，CT-羧基端尾部，C-羧基端。

图2为本发明的融合蛋白的结构示意图，其中：（a）是实施例1的SMI-Fc融合蛋白的结构示意图；（b）是实施例2的SM-Fc融合蛋白的结构示意图；（c）是实施例3的SM²-Fc融合蛋白的结构示意图；（d）是实施例4的MI-Fc融合蛋白的结构示意图；（e）是实施例5的IPT-Fc融合蛋白的结构示意图。

图3为实施例7肝细胞生长因子与本发明融合蛋白结合的反应过程示意图。

图4为实施例7分子表达的肝细胞生长因子受体融合蛋白的活性检测结果。

具体实施方式

本发明设计并构建了一种由肝细胞生长因子受体（cMet）的功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白，肝细胞生长因子受体（cMet）的功能基团为肝细胞生长因子受体的活性基团或者为由各活性基团经任意组合后得到的功能基团。

肝细胞生长因子受体（cMet）的结构模式图如图1所示，cMet的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所述，肝细胞生长因子受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所述。

所述肝细胞生长因子受体（cMet）的活性基团包括Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团。

cMet的Sema蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1-1546核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的Sema蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中1-516氨基酸序列所述。

cMet的MRS蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1547-1686核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中517-772氨基酸序列所述。

cMet的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1687-2796核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中773-932氨基酸序列所述。

融合蛋白中的Fc来自人免疫球蛋白IgG1，也可以是亚型IgG2、IgG3、IgG4，或者人免疫球蛋白IgE、IgM和IgA。人类免疫球蛋白Fc片断可改善cMet活性基团融合蛋白在体內的降解速度，延长融合蛋白质在体内的存活时间（PK T1/2，半衰期）和改进免疫原性。

本发明的融合蛋白是由不同长度的cMet功能基团的cDNA序列和人免疫球蛋白IgGFc的 cDNA序列通过PCR扩增，并将其相互连接后，分别克隆到载体中，构建成表达受体- IgG融合蛋白，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或其他载体。

本发明融合蛋白的N -端蛋白序列含有不同长度的cMet功能基团，而C -端蛋白序列含有IgG-Fc片段。

本发明描述的cMet功能基团与人免疫球蛋白Fc的融合蛋白及其编码的DNA可以通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如《分子克隆》第三版（Joseph Sambrook，科学出版社）及类似的实验手册所记载。

（实施例1、SMI-Fc融合蛋白的基因序列及其制备）

本实施例所构建的SMI-Fc融合蛋白的结构见图2（a）。SMI-Fc融合蛋白由Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hIgG1-Fc融合而成。

SMI-Fc融合蛋白基因是由上述Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团、IPT蛋白活性基团和hIgG1-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增而得。

进行PCR扩增时，PCR引物cMet1F和cMet2RL以及cMet核酸模板 （核苷酸序列见SEQ ID NO.14），PCR引物cMet2FL和hIgGFcRev1以及人免疫球蛋白重链核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID NO.11)先分别进行第一次PCR扩增而获得两个PCR产物；然后PCR引物cMet1F和hIgGFcRev1以第一次扩增获得的两个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使两个PCR产物相互连接成一个PCR产物，扩增产物克隆在pcDNA3.1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet1F的核苷酸序列为5′-caccatgaaggcccccgctgt，PCR引物cMet2RL的核苷酸序列为5′-ggaagaggaagactgacggtgtgaaattctgatctgggtgaa，PCR引物cMet2FL的核苷酸序列为5’-ttcaaccagatcagaatttcacaccgtcagtcttcctcttccc，PCR引物hIgGFcRev1的核苷酸序列为5’-cgaattcatttacccggggacagggagaggct。

上述各聚合酶链式反应在96孔PCR板上进行，反应总体积为50μL。在反应孔中加入25μL含Taq酶、dNTP、Taq酶缓冲液及氯化镁等的 PCR反应混合液（Promega，USA），2μL 的浓度为10μM的对应模板DNA, 0.5μL的浓度为50μM的对应正向和反向引物；然后加无菌去离子水至50μL。聚合酶链反应条件：94 ℃下2分钟一次，94℃下 1分钟、55℃下1分30秒、70℃下3分钟，循环30次，最后延伸72℃下10分钟；反应板保存在4℃下直至结果分析。

PCR反应产物运行凝胶，检查PCR产物的大小和浓度；将正确的PCR产物用刀切下产物斑纯化，以用于后继的PCR反应或分子克隆。

将纯化后的PCR产物克隆在pcDNA3.1D/V5-His-TOPO表达载体质粒上（Invitrogen公司，加利福尼亚州）：将3μL PCR产物与1μL盐溶液，加无菌水至终体积为5μL，加入1μL pcDNA3.1D/V5-His载体混合物，轻轻混匀，在室温下孵育30分钟；将2μL克隆连接后的载体质粒与50μL化学处理后的TOP10大肠杆菌混合，轻轻混匀，在冰上孵化30分钟，在42℃条件下热休克细胞30秒后立即将试管放在冰上；加入250μL的室温S.O.C.培养液，在37℃颤抖孵育1小时；接种事先预热的50-200μL细菌混合液，具有选择性抗菌素的细菌培养板在37℃培养过夜。

对单个克隆的细菌用PCR检测是否含有正确的DNA产物，并进行核苷酸序列分析；对含有正确的核苷酸序列的细菌克隆增殖、扩增，克隆纯化后的表达载体质粒受体- IgG融合蛋白质DNA将用于感染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），通过抗菌素的筛选，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清液是否有表达的蛋白质基因产物，寻找可持续稳定，高浓度表达cMet融合蛋白的单个细胞株用于蛋白质的表达和生产。

SMI-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.1。SMI-Fc融合蛋白核酸由3429个核苷酸组成，其中前1-2796个核苷酸来源于cMet的Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团，2797-3429是人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。

SMI-Fc融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。SMI-Fc融合蛋白含有1142个氨基酸，其中前1-932氨基酸来源于cMet的Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团，933-1142是人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列（含210氨基酸）。

 

（实施例2、SM-Fc融合蛋白的基因序列及其制备）

本实施例所构建的SM-Fc融合蛋白的结构见图2（b）。SM-Fc融合蛋白由cMet的Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hIgG1-Fc融合而成。

SM-Fc融合蛋白基因是由上述Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和hIgG1-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增而得。

进行PCR扩增时，PCR引物cMet1F和cMet3RL以及cMet核酸模板 （核苷酸序列见SEQ ID NO.14），PCR引物cMet3FL和hIgGFcRev1以及人免疫球蛋白重链核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID NO.11) 先分别进行第一次PCR扩增而获得两个PCR产物；然后PCR引物cMet1F和hIgGFcRev1以第一次扩增获得的两个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使两个PCR产物相互连接成一个PCR产物，扩增产物克隆在pcDNA3.1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet3RL的核苷酸序列为5’-ggaagaggaagactgacggcagacagatctgttgagtcc，PCR引物cMet3FL的核苷酸序列为5’-ggactcaacagatctgtctgccgtcagtcttcctcttcc。PCR扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。

SM-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。SM-Fc融合蛋白核酸共有2319个核苷酸，其中前1-1686核苷酸序列来源于cMet的Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团，1687-2319是人免疫球蛋白IgGFc的核苷酸序列。

SM-Fc融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.4。SM-Fc融合蛋白含有772个氨基酸，前1-562个氨基酸序列来源于cMet的Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团，563-772是人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列（含210氨基酸）。

 

（实施例3、SM²-Fc融合蛋白的制备）

本实施例所构建的SM²-Fc融合蛋白的结构见图2（c）。SM²-Fc融合蛋白由cMet的两组Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hIgG1-Fc融合而成。

SM²-Fc融合蛋白基因是由上述Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和hIgG1-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增而得。

进行PCR扩增时，PCR引物cMet1F和cMet4RL以及cMet核酸模板 （核苷酸序列见SEQ ID NO.14），PCR引物cMet4FL和cMet3RL以及cMet核酸模板 （核苷酸序列见SEQ ID NO.14），PCR引物cMet3FL和hIgGFcRev1以及人免疫球蛋白重链核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID NO.11) 先分别进行第一次PCR扩增而获得三个PCR产物； 然后PCR引物cMet1F和hIgGFcRev1核酸小片段以第一次扩增获得的三个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使三个PCR产物相互连接成一个PCR产物，扩增产物克隆在pcDNA3.1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet4RL的核苷酸序列为5’-tgctagtgcctctttacactccagacagatctgttgagtcc，PCR引物cMet4FL的核苷酸序列为5’-ggactcaacagatctgtctggagtgtaaagaggcactagca。PCR扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。

SM²-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.5。SM²-Fc融合蛋白核酸共有3933个核苷酸，其中1-1686核苷酸序列来源于cMet的Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团，1687-3300核苷酸序列与前1-1686核苷酸相同，3301-3933是人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。

SM²-Fc融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.6。SM²-Fc融合蛋白含有1310个氨基酸，1-562氨基酸序列来源于cMet的Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团，563-1100氨基酸序列与前1-562氨基酸序列相同，1101-1310是人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列。

 

（实施例4、MI-Fc融合蛋白的制备）

本实施例所构建的MI-Fc融合蛋白的结构见图2（d）。MI-Fc融合蛋白由cMet的MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hIgG1-Fc融合而成。

MI-Fc融合蛋白基因是由上述MRS蛋白活性基团、IPT蛋白活性基团和hIgG1-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增而得。

进行PCR扩增时，PCR引物cMet1F和cMet5RL以及cMet核苷酸模板 （SEQ ID NO.14），PCR引物cMet5FL和cMet2RL以及cMet核苷酸模板 （SEQ ID NO.14），PCR引物cMet2FL和hIgGFcRev1及人免疫球蛋白重链核酸模板(SEQ ID NO.11) 先分别进行第一次PCR扩增而获得三个PCR产物； 然后PCR引物cMet1F和hIgGFcRev1以第一次扩增获得的三个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使三个PCR产物相互连接成为一个PCR产物，扩增的PCR产物克隆在pcDNA3.1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet5RL的核苷酸序列为5’-tgcagcccaagccattcccattgctcctctgcac，PCR引物cMet5FL的核苷酸序列为5’-gtgcagaggagcaatgggaatggcttgggctgca。PCR扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。

MI-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.7。MI-Fc融合蛋白核酸共有1956个核苷酸，1-72核苷酸序列为cMet前导序列（见SEQ ID NO.13），73-1323核苷酸序列为cMet的MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团的核苷酸序列，1324-1956是人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。

MI-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.8。MI-Fc融合蛋白含有651个氨基酸，1-24氨基酸序列为cMet前导序列蛋白质，25-441氨基酸序列为 cMet的MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团的氨基酸序列，442-651氨基酸序列为人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列。

 

（实施例5、IPT-Fc融合蛋白的制备）

本实施例所构建的IPT-Fc融合蛋白的结构见图2（e）。IPT-Fc融合蛋白由cMet的直接作为功能基团的IPT蛋白活性基团和人免疫球蛋白hIgG1-Fc融合而成。

IPT-Fc融合蛋白基因是由上述IPT蛋白活性基团和hIgG1-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增而得。

进行PCR扩增时, PCR引物cMet1F和cMet6RL以及cMet核苷酸模板 （SEQ ID NO.14），PCR引物cMet6FL和cMet2RL以及cMet核苷酸模板 （SEQ ID NO.14），PCR引物cMet2FL和hIgGFcRev1以及人免疫球蛋白重链核酸模板(SEQ ID NO.11) 先分别进行第一次PCR扩增而获得三个PCR产物； 然后PCR引物cMet1F和hIgGFcRev1以第一次扩增获得的三个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使三个PCR产物相互连接成为一个PCR产物，扩增的PCR产物克隆在pcDNA3.1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet6RL的核苷酸序列为5’-aaccttgtagattgcaggcccattgctcctctgcac，PCR引物cMet6FL的核苷酸序列为5’-gtgcagaggagcaatgggcctgcaatctacaaggtt。PCR扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。

IPT-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.9。IPT-Fc融合蛋白核酸共有1815个核苷酸组成，1-72核酸序列为cMet前导序列（见SEQ ID NO.13），73-1182核酸序列为cMet的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列，1183-1815为人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。

IPT-Fc融合蛋白的氨基序列见SEQ ID NO.10。IPT-Fc融合蛋白含有604个氨基酸，1-24氨基酸序列为cMet前导序列蛋白质，25-394为 cMet的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列，395-604氨基酸序列为人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列。

（实施例6、肝细胞生长因子受体活性基团融合蛋白的纯化）

肝细胞生长因子受体活性基团融合蛋白的纯化过程如下：

融合蛋白稳定细胞株用无血清的细胞培养液在37℃，5% CO₂培养箱培养，经过15-25天的培养，培养液在4℃ 下、10000r/m离心30分钟；收集上清液，用0.2微米过滤器过滤。过滤液用蛋白A层析柱进行纯化，层析柱用10倍柱容量的PBS清洗，然后用pH值3.5，25mM的醋酸缓冲液洗脱融合蛋白，用收集器收集洗脱液，并用1.5M Tris缓冲液调整pH值至pH 7.0，浓缩后，用PBS在4℃透析过夜。

纯化的蛋白质可用紫外280nm测试蛋白质含量，用受体融合蛋白与肝细胞生长因子结合试验检测融合蛋白的生物结合活性。纯化蛋白质样品，采用SDS-PAGE电泳和微流控芯片自动化电泳系统分析其纯度和分子量。

 

（实施例7、cMet活性基团的融合蛋白与肝细胞生长因子的结合）

见图3，检测时，将融合蛋白（以cMethFc融合蛋白表示各种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白）与肝细胞生长因子结合后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白Fc抗体，然后加入碱性磷酸酶底物pNPP，cMet活性基团的融合蛋白与肝细胞生长因子的结合越强，则碱性磷酸酶底物pNPP与标记碱性磷酸酶的显色反应越强，反应后所得溶液的颜色越深，以吸光度值定量地表示颜色深浅。

具体操作步骤如下：在96孔酶标板中加入碳酸盐缓冲液稀释（pH值9.6）的5μg/mL的肝细胞生长因子，100μL/孔，酶标板放在4℃过夜；然后每孔加入300μL1％BSA-TBST，室温下放置2小时后分别加入实施例1、2、4、5制备的融合蛋白上清液，100微升/孔，室温反应1小时，用TBST洗4次以洗去未结合的蛋白质，接着每孔加入100μL 1％BSA-TBST（1:2500）稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白Fc抗体，室温反应1小时，用TBST洗板4次，洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶底物pNPP后，反应30分钟，终止反应，用酶标仪检测在405 nm处的吸光度值；阴性对照例中是无受体核苷酸的表达载体质粒细胞上清液。检验结果见图4，与没有融合蛋白上清液（阴性对照，Mock）的对照例相比，试验例的吸光度值均高于对照例，因此结果表明本发明的融合蛋白可有效地与肝细胞生长因子结合。由于肝细胞生长因子（HGF）的表达和在肿瘤细胞的分泌会激活cMet，诱导肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭，减少人体对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞抑制，而cMet活性基团的融合蛋白可高效、特异地与生长因子结合，因此阻止了生长因子与肿瘤细胞的结合，从而可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。

以上各实施例是对本发明的具体实施方式的说明，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

                                                              序列表

 

<110>  常州新泉生物医药科技有限公司

<120>  肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白

<160>  15   

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  3429

<212>  DNA

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  1

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag    120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat    180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag    240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac    300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta    360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc    420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc    480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg    540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc    600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag    660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag    720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac    780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg    840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc    900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg    960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac   1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct   1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa   1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg   1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt   1260

accacagctt tgcagcgtgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca   1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt   1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc   1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc   1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc   1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg   1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc   1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg   1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa   1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat   1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt   1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca   1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat   2040

tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa   2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt   2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa   2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata   2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat   2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt   2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt   2460

ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg   2520

tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt   2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag   2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg   2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt   2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaccgt cagtcttcct cttcccccca   2820

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac   2880

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat   2940

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc   3000

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac   3060

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa   3120

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg   3180

acctgcctgg tcaaaggctt ttatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg   3240

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc   3300

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc   3360

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg   3420

ggtaaatga                                                           3429

 

<210>  2

<211>  1142

<212>  PRT

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  2

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1               5                   10                  15     

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

            20                  25                  30         

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

        35                  40                  45             

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

    50                  55                  60                 

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65                  70                  75                  80 

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

                85                  90                  95     

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

            100                 105                 110        

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

        115                 120                 125            

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

    130                 135                 140                

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145                 150                 155                 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

                165                 170                 175    

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

            180                 185                 190        

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

        195                 200                 205            

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

    210                 215                 220                

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225                 230                 235                 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

                245                 250                 255    

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

            260                 265                 270        

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

        275                 280                 285            

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

    290                 295                 300                

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305                 310                 315                 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

                325                 330                 335    

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

            340                 345                 350        

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

        355                 360                 365            

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

    370                 375                 380                

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385                 390                 395                 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

                405                 410                 415    

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

            420                 425                 430        

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

        435                 440                 445            

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

    450                 455                 460                

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465                 470                 475                 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

                485                 490                 495    

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

            500                 505                 510        

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

        515                 520                 525            

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

    530                 535                 540                 

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545                 550                 555                 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

                565                 570                 575    

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

            580                 585                 590        

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

        595                 600                 605             

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

    610                 615                 620                

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625                 630                 635                 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

                645                 650                 655    

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

            660                 665                 670        

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

        675                 680                 685            

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

    690                 695                 700                

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705                 710                 715                 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

                725                 730                 735    

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

            740                 745                 750        

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

        755                 760                 765            

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

    770                 775                 780                

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785                 790                 795                 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

                805                 810                 815    

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

            820                 825                 830        

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

        835                 840                 845            

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

    850                 855                 860                

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865                 870                 875                 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

                885                 890                 895    

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

            900                 905                 910        

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

        915                 920                 925            

Gln Asn Phe Thr Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

    930                 935                 940                

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

945                 950                 955                 960

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

                965                 970                 975    

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

            980                 985                 990        

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val  Leu Thr Val Leu His  Gln Asp Trp

        995                 1000                 1005            

Leu Asn  Gly Lys Glu Tyr Lys  Cys Lys Val Ser Asn  Lys Ala Leu

    1010                 1015                 1020            

Pro Ala  Pro Ile Glu Lys Thr  Ile Ser Lys Ala Lys  Gly Gln Pro

    1025                 1030                 1035            

Arg Glu  Pro Gln Val Tyr Thr  Leu Pro Pro Ser Arg  Asp Glu Leu

    1040                 1045                 1050            

Thr Lys  Asn Gln Val Ser Leu  Thr Cys Leu Val Lys  Gly Phe Tyr

    1055                 1060                 1065            

Pro Ser  Asp Ile Ala Val Glu  Trp Glu Ser Asn Gly  Gln Pro Glu

    1070                 1075                 1080            

Asn Asn  Tyr Lys Thr Thr Pro  Pro Val Leu Asp Ser  Asp Gly Ser

    1085                 1090                 1095            

Phe Phe  Leu Tyr Ser Lys Leu  Thr Val Asp Lys Ser  Arg Trp Gln

    1100                 1105                 1110            

Gln Gly  Asn Val Phe Ser Cys  Ser Val Met His Glu  Ala Leu His

    1115                 1120                 1125            

Asn His  Tyr Thr Gln Lys Ser  Leu Ser Leu Ser Pro  Gly Lys

    1130                 1135                 1140        

<210>  3

<211>  2319

<212>  DNA

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  3

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag    120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat    180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag    240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac    300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta    360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc    420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc    480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg    540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc    600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag    660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag    720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac    780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg    840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc    900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg    960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac   1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct   1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa   1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg   1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt   1260

accacagctt tgcagcgtgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca   1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt   1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc   1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc   1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc   1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg   1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc   1680

tgtctgccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg   1740

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc   1800

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag   1860

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat   1920

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc   1980

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg   2040

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc   2100

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct   2160

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc   2220

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac   2280

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga                          2319

 

<210>  4

<211>  772

<212>  PRT

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  4

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1               5                   10                  15     

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

            20                  25                  30         

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

        35                  40                  45             

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

    50                  55                  60                  

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65                  70                  75                  80 

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

                85                  90                  95     

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

            100                 105                 110        

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

        115                 120                 125             

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

    130                 135                 140                

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145                 150                 155                 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

                165                 170                 175    

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

            180                 185                 190        

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

        195                 200                 205            

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

    210                 215                 220                

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225                 230                 235                 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

                245                 250                 255    

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

            260                 265                 270        

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

        275                 280                 285            

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

    290                 295                 300                

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305                 310                 315                 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

                325                 330                 335    

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

            340                 345                 350        

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

        355                 360                 365            

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

    370                 375                 380                

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385                 390                 395                 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

                405                 410                 415    

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

            420                 425                 430        

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

        435                 440                 445            

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

    450                 455                 460                

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465                 470                 475                 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

                485                 490                 495    

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

            500                 505                 510        

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

        515                 520                 525            

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

    530                 535                 540                

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545                 550                 555                 560

Cys Leu Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

                565                 570                 575    

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

            580                 585                 590        

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

        595                 600                 605            

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

    610                 615                 620                

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

625                 630                 635                 640

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

                645                 650                 655    

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

            660                 665                 670        

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

        675                 680                 685            

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

    690                 695                 700                

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

705                 710                 715                 720

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

                725                 730                 735    

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

            740                 745                 750        

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

        755                 760                 765            

Ser Pro Gly Lys

    770        

 

<210>  5

<211>  3933

<212>  DNA

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

 

<400>  5

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag    120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat    180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag    240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac    300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta    360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc    420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc    480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg    540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc    600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag    660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag    720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac    780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg    840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc    900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg    960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac   1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct   1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa   1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg   1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt   1260

accacagctt tgcagcgtgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca   1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt   1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc   1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc   1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc   1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg   1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc   1680

tgtctggagt gtaaagaggc actagcaaag tccgagatga atgtgaatat gaagtatcag   1740

cttcccaact tcaccgcgga aacacccatc cagaatgtca ttctacatga gcatcacatt   1800

ttccttggtg ccactaacta catttatgtt ttaaatgagg aagaccttca gaaggttgct   1860

gagtacaaga ctgggcctgt gctggaacac ccagattgtt tcccatgtca ggactgcagc   1920

agcaaagcca atttatcagg aggtgtttgg aaagataaca tcaacatggc tctagttgtc   1980

gacacctact atgatgatca actcattagc tgtggcagcg tcaacagagg gacctgccag   2040

cgacatgtct ttccccacaa tcatactgct gacatacagt cggaggttca ctgcatattc   2100

tccccacaga tagaagagcc cagccagtgt cctgactgtg tggtgagcgc cctgggagcc   2160

aaagtccttt catctgtaaa ggaccggttc atcaacttct ttgtaggcaa taccataaat   2220

tcttcttatt tcccagatca tccattgcat tcgatatcag tgagaaggct aaaggaaacg   2280

aaagatggtt ttatgttttt gacggaccag tcctacattg atgttttacc tgagttcaga   2340

gattcttacc ccattaagta tgtccatgcc tttgaaagca acaattttat ttacttcttg   2400

acggtccaaa gggaaactct agatgctcag acttttcaca caagaataat caggttctgt   2460

tccataaact ctggattgca ttcctacatg gaaatgcctc tggagtgtat tctcacagaa   2520

aagagaaaaa agagatccac aaagaaggaa gtgtttaata tacttcaggc tgcgtatgtc   2580

agcaagcctg gggcccagct tgctagacaa ataggagcca gcctgaatga tgacattctt   2640

ttcggggtgt tcgcacaaag caagccagat tctgccgaac caatggatcg atctgccatg   2700

tgtgcattcc ctatcaaata tgtcaacgac ttcttcaaca agatcgtcaa caaaaacaat   2760

gtgagatgtc tccagcattt ttacggaccc aatcatgagc actgctttaa taggacactt   2820

ctgagaaatt catcaggctg tgaagcgcgc cgtgatgaat atcgaacaga gtttaccaca   2880

gctttgcagc gtgttgactt attcatgggt caattcagcg aagtcctctt aacatctata   2940

tccaccttca ttaaaggaga cctcaccata gctaatcttg ggacatcaga gggtcgcttc   3000

atgcaggttg tggtttctcg atcaggacca tcaacccctc atgtgaattt tctcctggac   3060

tcccatccag tgtctccaga agtgattgtg gagcatacat taaaccaaaa tggctacaca   3120

ctggttatca ctgggaagaa gatcacgaag atcccattga atggcttggg ctgcagacat   3180

ttccagtcct gcagtcaatg cctctctgcc ccaccctttg ttcagtgtgg ctggtgccac   3240

gacaaatgtg tgcgatcgga ggaatgcctg agcgggacat ggactcaaca gatctgtctg   3300

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct   3360

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg   3420

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac   3480

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag   3540

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc   3600

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag   3660

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc   3720

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg   3780

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg   3840

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg   3900

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                3933

 

<210>  6

<211>  1310

<212>  PRT

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  6

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1               5                   10                  15     

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

            20                  25                  30         

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

        35                  40                  45             

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

    50                  55                  60                  

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65                  70                  75                  80 

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

                85                  90                  95      

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

            100                 105                 110        

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

        115                 120                 125             

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

    130                 135                 140                

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145                 150                 155                 160

 

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

                165                 170                 175    

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

            180                 185                 190        

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

        195                 200                 205            

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

    210                 215                 220                

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225                 230                 235                 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

                245                 250                 255    

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

            260                 265                 270        

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

        275                 280                 285            

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

    290                 295                 300                

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305                 310                 315                 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

                325                 330                 335    

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

            340                 345                 350        

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

        355                 360                 365            

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

    370                 375                 380                

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385                 390                 395                 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

                405                 410                 415    

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

            420                 425                 430        

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

        435                 440                 445            

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

    450                 455                 460                

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465                 470                 475                 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

                485                 490                 495    

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

            500                 505                 510        

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

        515                 520                 525            

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

    530                 535                 540                

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545                 550                 555                 560

Cys Leu Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn

                565                 570                 575    

Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn

            580                 585                 590        

Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile

        595                 600                 605            

Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr

    610                 615                 620                

Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser

625                 630                 635                 640

Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met

                645                 650                 655    

Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly

            660                 665                 670        

Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His

        675                 680                 685            

Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile

    690                 695                 700                

Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala

705                 710                 715                 720

Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly

                725                 730                 735    

Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile

            740                 745                 750        

Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr

        755                 760                 765            

Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro

    770                 775                 780                

Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu

785                 790                 795                 800

Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile

                805                 810                 815    

Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met

            820                 825                 830        

Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys

        835                 840                 845            

Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly

    850                 855                 860                

Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu

865                 870                 875                 880

Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp

                885                 890                 895    

Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe

            900                 905                 910        

Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr

        915                 920                 925            

Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser

    930                 935                 940                

Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr

945                 950                 955                 960

Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu

                965                 970                 975    

Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn

            980                 985                 990        

Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe  Met Gln Val Val Val  Ser Arg Ser

        995                 1000                 1005            

Gly Pro  Ser Thr Pro His Val  Asn Phe Leu Leu Asp  Ser His Pro

    1010                 1015                 1020            

Val Ser  Pro Glu Val Ile Val  Glu His Thr Leu Asn  Gln Asn Gly

    1025                 1030                 1035            

Tyr Thr  Leu Val Ile Thr Gly  Lys Lys Ile Thr Lys  Ile Pro Leu

    1040                 1045                 1050            

Asn Gly  Leu Gly Cys Arg His  Phe Gln Ser Cys Ser  Gln Cys Leu

    1055                 1060                 1065            

Ser Ala  Pro Pro Phe Val Gln  Cys Gly Trp Cys His  Asp Lys Cys

    1070                 1075                 1080            

Val Arg  Ser Glu Glu Cys Leu  Ser Gly Thr Trp Thr  Gln Gln Ile

    1085                 1090                 1095            

Cys Leu  Pro Ser Val Phe Leu  Phe Pro Pro Lys Pro  Lys Asp Thr

    1100                 1105                 1110            

Leu Met  Ile Ser Arg Thr Pro  Glu Val Thr Cys Val  Val Val Asp

    1115                 1120                 1125            

Val Ser  His Glu Asp Pro Glu  Val Lys Phe Asn Trp  Tyr Val Asp

    1130                 1135                 1140            

Gly Val  Glu Val His Asn Ala  Lys Thr Lys Pro Arg  Glu Glu Gln

    1145                 1150                 1155            

Tyr Asn  Ser Thr Tyr Arg Val  Val Ser Val Leu Thr  Val Leu His

    1160                 1165                 1170            

Gln Asp  Trp Leu Asn Gly Lys  Glu Tyr Lys Cys Lys  Val Ser Asn

    1175                 1180                 1185            

Lys Ala  Leu Pro Ala Pro Ile  Glu Lys Thr Ile Ser  Lys Ala Lys

    1190                 1195                 1200            

Gly Gln  Pro Arg Glu Pro Gln  Val Tyr Thr Leu Pro  Pro Ser Arg

    1205                 1210                 1215            

Asp Glu  Leu Thr Lys Asn Gln  Val Ser Leu Thr Cys  Leu Val Lys

    1220                 1225                 1230            

Gly Phe  Tyr Pro Ser Asp Ile  Ala Val Glu Trp Glu  Ser Asn Gly

    1235                 1240                 1245            

Gln Pro  Glu Asn Asn Tyr Lys  Thr Thr Pro Pro Val  Leu Asp Ser

    1250                 1255                 1260            

Asp Gly  Ser Phe Phe Leu Tyr  Ser Lys Leu Thr Val  Asp Lys Ser

    1265                 1270                 1275            

Arg Trp  Gln Gln Gly Asn Val  Phe Ser Cys Ser Val  Met His Glu

    1280                 1285                 1290            

Ala Leu  His Asn His Tyr Thr  Gln Lys Ser Leu Ser  Leu Ser Pro

    1295                 1300                 1305            

Gly Lys 

    1310

 

<210>  7

<211>  1956

<212>  DNA

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  7

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg ggaatggctt gggctgcaga catttccagt cctgcagtca atgcctctct    120

gccccaccct ttgttcagtg tggctggtgc cacgacaaat gtgtgcgatc ggaggaatgc    180

ctgagcggga catggactca acagatctgt ctgcctgcaa tctacaaggt tttcccaaat    240

agtgcacccc ttgaaggagg gacaaggctg accatatgtg gctgggactt tggatttcgg    300

aggaataata aatttgattt aaagaaaact agagttctcc ttggaaatga gagctgcacc    360

ttgactttaa gtgagagcac gatgaataca ttgaaatgca cagttggtcc tgccatgaat    420

aagcatttca atatgtccat aattatttca aatggccacg ggacaacaca atacagtaca    480

ttctcctatg tggatcctgt aataacaagt atttcgccga aatacggtcc tatggctggt    540

ggcactttac ttactttaac tggaaattac ctaaacagtg ggaattctag acacatttca    600

attggtggaa aaacatgtac tttaaaaagt gtgtcaaaca gtattcttga atgttatacc    660

ccagcccaaa ccatttcaac tgagtttgct gttaaattga aaattgactt agccaaccga    720

gagacaagca tcttcagtta ccgtgaagat cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa    780

tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt    840

gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa    900

catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg    960

caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt   1020

gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca   1080

atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa   1140

ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc   1200

gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg   1260

aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc   1320

acaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc   1380

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac   1440

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac   1500

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc   1560

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc   1620

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat   1680

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac   1740

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc   1800

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg   1860

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac   1920

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                             1956

 

<210>  8

<211>  651

<212>  PRT

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  8

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1               5                   10                  15     

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe

            20                  25                  30         

Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly

        35                  40                  45             

Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr

    50                  55                  60                 

Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn

65                  70                  75                  80 

Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp

                85                  90                  95     

Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val

            100                 105                 110        

Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met

        115                 120                 125            

Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn

    130                 135                 140                

Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr

145                 150                 155                 160

Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly

                165                 170                 175    

Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn

            180                 185                 190        

Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu

        195                 200                 205            

Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr

    210                 215                 220                

Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg

225                 230                 235                 240

Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile

                245                 250                 255    

His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val

            260                 265                 270        

Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val

        275                 280                 285            

His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn

    290                 295                 300                

Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu

305                 310                 315                 320

Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu

                325                 330                 335    

Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro

            340                 345                 350        

Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu

        355                 360                 365            

Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu

    370                 375                 380                

Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala

385                 390                 395                 400

Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu

                405                 410                 415    

Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val

            420                 425                 430        

Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

        435                 440                 445            

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

    450                 455                 460                

 

 

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

465                 470                 475                 480

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

                485                 490                 495    

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

            500                 505                 510        

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

        515                 520                 525            

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

    530                 535                 540                

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

545                 550                 555                 560

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

                565                 570                 575    

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

            580                 585                 590        

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

        595                 600                 605            

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

    610                 615                 620                

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

625                 630                 635                 640

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                645                 650    

 

<210>  9

<211>  1815

<212>  DNA

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  9

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg ggcctgcaat ctacaaggtt ttcccaaata gtgcacccct tgaaggaggg    120

acaaggctga ccatatgtgg ctgggacttt ggatttcgga ggaataataa atttgattta    180

aagaaaacta gagttctcct tggaaatgag agctgcacct tgactttaag tgagagcacg    240

atgaatacat tgaaatgcac agttggtcct gccatgaata agcatttcaa tatgtccata    300

attatttcaa atggccacgg gacaacacaa tacagtacat tctcctatgt ggatcctgta    360

ataacaagta tttcgccgaa atacggtcct atggctggtg gcactttact tactttaact    420

ggaaattacc taaacagtgg gaattctaga cacatttcaa ttggtggaaa aacatgtact    480

ttaaaaagtg tgtcaaacag tattcttgaa tgttataccc cagcccaaac catttcaact    540

gagtttgctg ttaaattgaa aattgactta gccaaccgag agacaagcat cttcagttac    600

cgtgaagatc ccattgtcta tgaaattcat ccaaccaaat cttttattag tggtgggagc    660

acaataacag gtgttgggaa aaacctgaat tcagttagtg tcccgagaat ggtcataaat    720

gtgcatgaag caggaaggaa ctttacagtg gcatgtcaac atcgctctaa ttcagagata    780

atctgttgta ccactccttc cctgcaacag ctgaatctgc aactccccct gaaaaccaaa    840

gcctttttca tgttagatgg gatcctttcc aaatactttg atctcattta tgtacataat    900

cctgtgttta agccttttga aaagccagtg atgatctcaa tgggcaatga aaatgtactg    960

gaaattaagg gaaatgatat tgaccctgaa gcagttaaag gtgaagtgtt aaaagttgga   1020

aataagagct gtgagaatat acacttacat tctgaagccg ttttatgcac ggtccccaat   1080

gacctgctga aattgaacag cgagctaaat atagagtgga agcaagcaat ttcttcaacc   1140

gtccttggaa aagtaatagt tcaaccagat cagaatttca caccgtcagt cttcctcttc   1200

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg   1260

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag   1320

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc   1380

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc   1440

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc   1500

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc   1560

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc   1620

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc   1680

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc   1740

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg   1800

tctccgggta aatga                                                    1815

<210>  10

<211>  604

<212>  PRT

<213>  artificial

<220>

<223>  artificial

<400>  10

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1               5                   10                  15     

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro

            20                  25                  30         

Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp

        35                  40                  45             

Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg

    50                  55                  60                 

Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr

65                  70                  75                  80 

Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe

                85                  90                  95     

Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser

            100                 105                 110        

Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr

        115                 120                 125            

Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu

    130                 135                 140                

Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr

145                 150                 155                 160

Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln

                165                 170                 175    

Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn

            180                 185                 190        

Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu

        195                 200                 205            

Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly

    210                 215                 220                

Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn

225                 230                 235                 240

Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser

                245                 250                 255    

Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn

            260                 265                 270        

Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile

        275                 280                 285            

Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys

    290                 295                 300                

Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu

305                 310                 315                 320

Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val

                325                 330                 335    

Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu

            340                 345                 350        

Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu

        355                 360                 365            

Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys

    370                 375                 380                

Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Pro Ser Val Phe Leu Phe

385                 390                 395                 400

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

                405                 410                 415    

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

            420                 425                 430         

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

        435                 440                 445            

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

    450                 455                 460                 

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

465                 470                 475                 480

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

                485                 490                 495    

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

            500                 505                 510        

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

        515                 520                 525            

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

    530                 535                 540                

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

545                 550                 555                 560

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

                565                 570                 575    

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

            580                 585                 590        

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

        595                 600                

 

<210>  11

<211>  633

<212>  DNA

<213>  hIgG Fc

<400>  11

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct     60

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg    120

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac    180

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag    240

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc    300

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag    360

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc    420

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg    480

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg    540

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg    600

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                 633

 

<210>  12

<211>  210

<212>  PRT

<213>  hIgG Fc

<400>  12

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1               5                   10                  15     

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

            20                  25                  30         

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

        35                  40                  45             

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

    50                  55                  60                 

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

65                  70                  75                  80 

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

                85                  90                  95     

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

            100                 105                 110        

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

        115                 120                 125            

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

    130                 135                 140                

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

145                 150                 155                 160

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

                165                 170                 175    

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

            180                 185                 190        

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

        195                 200                 205            

Gly Lys

    210

 

<210>  13

<211>  72

<212>  DNA

<213>   cMet 前导序列

<400>  13

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg gg                                                         72

 

<210>  14

<211>  4173

<212>  DNA

<213>   cMet

<400>  14

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag     60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag    120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat    180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag    240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac    300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta    360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc    420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc    480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg    540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc    600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag    660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag    720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac    780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg    840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc    900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg    960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac   1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct   1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa   1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg   1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt   1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca   1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt   1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc   1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc   1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc   1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg   1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc   1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg   1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa   1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat   1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt   1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca   1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat   2040

tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa   2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt   2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa   2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata   2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat   2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt   2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt   2460

ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg   2520

tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt   2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag   2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg   2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt   2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca   2820

atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa   2880

attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg   2940

gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct   3000

gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca   3060

tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct   3120

gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca   3180

gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc   3240

aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat   3300

gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa   3360

gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc   3420

tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg   3480

aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat   3540

cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt   3600

gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt   3660

gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa   3720

acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt   3780

accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga   3840

gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga   3900

agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg   3960

caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc   4020

ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa   4080

tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata acgctgatga tgaggtggac   4140

acacgaccag cctccttctg ggagacatca tag                                4173

 

<210>  15

<211>  1390

<212>  PRT

<213>   cMet

<400>  15

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1               5                   10                  15     

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

            20                  25                  30         

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

        35                  40                  45             

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

    50                  55                  60                 

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65                  70                  75                  80 

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

                85                  90                  95     

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

            100                 105                 110        

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

        115                 120                 125             

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

    130                 135                 140                

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145                 150                 155                 160

 

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

                165                 170                 175    

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

            180                 185                 190        

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

        195                 200                 205            

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

    210                 215                 220                 

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225                 230                 235                 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

                245                 250                 255    

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

            260                 265                 270        

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

        275                 280                 285            

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

    290                 295                 300                

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305                 310                 315                 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

                325                 330                 335    

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

            340                 345                 350        

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

        355                 360                 365            

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

    370                 375                 380                

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385                 390                 395                 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

                405                 410                 415    

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

            420                 425                 430        

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

        435                 440                 445            

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

    450                 455                 460                

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465                 470                 475                 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

                485                 490                 495    

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

            500                 505                 510        

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

        515                 520                 525            

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

    530                 535                 540                

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545                 550                 555                 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

                565                 570                 575    

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

            580                 585                 590        

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

        595                 600                 605            

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

    610                 615                 620                

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625                 630                 635                 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

                645                 650                 655    

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

            660                 665                 670        

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

        675                 680                 685            

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

    690                 695                 700                

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705                 710                 715                 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

                725                 730                 735    

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

            740                 745                 750        

 

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

        755                 760                 765            

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

    770                 775                 780                

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785                 790                 795                 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

                805                 810                 815    

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

            820                 825                 830        

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

        835                 840                 845            

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

    850                 855                 860                

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865                 870                 875                 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

                885                 890                 895    

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

            900                 905                 910        

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

        915                 920                 925            

Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala

    930                 935                 940                

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln

945                 950                 955                 960

Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His

                965                 970                 975    

Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr

            980                 985                 990        

Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser  Val Asp Tyr Arg Ala  Thr Phe Pro

        995                 1000                 1005            

Glu Asp  Gln Phe Pro Asn Ser  Ser Gln Asn Gly Ser  Cys Arg Gln

    1010                 1015                 1020            

Val Gln  Tyr Pro Leu Thr Asp  Met Ser Pro Ile Leu  Thr Ser Gly

    1025                 1030                 1035            

Asp Ser  Asp Ile Ser Ser Pro  Leu Leu Gln Asn Thr  Val His Ile

    1040                 1045                 1050            

Asp Leu  Ser Ala Leu Asn Pro  Glu Leu Val Gln Ala  Val Gln His

    1055                 1060                 1065            

Val Val  Ile Gly Pro Ser Ser  Leu Ile Val His Phe  Asn Glu Val

    1070                 1075                 1080            

Ile Gly  Arg Gly His Phe Gly  Cys Val Tyr His Gly  Thr Leu Leu

    1085                 1090                 1095            

Asp Asn  Asp Gly Lys Lys Ile  His Cys Ala Val Lys  Ser Leu Asn

    1100                 1105                 1110            

Arg Ile  Thr Asp Ile Gly Glu  Val Ser Gln Phe Leu  Thr Glu Gly

    1115                 1120                 1125            

Ile Ile  Met Lys Asp Phe Ser  His Pro Asn Val Leu  Ser Leu Leu

    1130                 1135                 1140            

Gly Ile  Cys Leu Arg Ser Glu  Gly Ser Pro Leu Val  Val Leu Pro

    1145                 1150                 1155            

Tyr Met  Lys His Gly Asp Leu  Arg Asn Phe Ile Arg  Asn Glu Thr

    1160                 1165                 1170            

His Asn  Pro Thr Val Lys Asp  Leu Ile Gly Phe Gly  Leu Gln Val

    1175                 1180                 1185            

Ala Lys  Gly Met Lys Tyr Leu  Ala Ser Lys Lys Phe  Val His Arg

    1190                 1195                 1200            

Asp Leu  Ala Ala Arg Asn Cys  Met Leu Asp Glu Lys  Phe Thr Val

    1205                 1210                 1215            

Lys Val  Ala Asp Phe Gly Leu  Ala Arg Asp Met Tyr  Asp Lys Glu

    1220                 1225                 1230            

Tyr Tyr  Ser Val His Asn Lys  Thr Gly Ala Lys Leu  Pro Val Lys

    1235                 1240                 1245            

Trp Met  Ala Leu Glu Ser Leu  Gln Thr Gln Lys Phe  Thr Thr Lys

    1250                 1255                 1260            

Ser Asp  Val Trp Ser Phe Gly  Val Leu Leu Trp Glu  Leu Met Thr

    1265                 1270                 1275            

Arg Gly  Ala Pro Pro Tyr Pro  Asp Val Asn Thr Phe  Asp Ile Thr

    1280                 1285                 1290            

Val Tyr  Leu Leu Gln Gly Arg  Arg Leu Leu Gln Pro  Glu Tyr Cys

    1295                 1300                 1305            

Pro Asp  Pro Leu Tyr Glu Val  Met Leu Lys Cys Trp  His Pro Lys

    1310                 1315                 1320            

Ala Glu  Met Arg Pro Ser Phe  Ser Glu Leu Val Ser  Arg Ile Ser

    1325                 1330                 1335            

Ala Ile  Phe Ser Thr Phe Ile  Gly Glu His Tyr Val  His Val Asn

    1340                 1345                 1350            

Ala Thr  Tyr Val Asn Val Lys  Cys Val Ala Pro Tyr  Pro Ser Leu

    1355                 1360                 1365            

Leu Ser  Ser Glu Asp Asn Ala  Asp Asp Glu Val Asp  Thr Arg Pro

    1370                 1375                 1380            

Ala Ser  Phe Trp Glu Thr Ser 

    1385                 1390  

Claims (10)

1.一种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：由来自肝细胞生长因子受体的直接作为功能基团的活性基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，或者由来自肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，其中肝细胞生长因子受体的功能基团在氮端，人免疫球蛋白Fc片段在碳端；所述肝细胞生长因子受体的活性基团包括Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团；所述活性基团经组合后的功能基团包括复数个相同的活性基团组合而成的功能基团以及其中2～3种活性基团单个或复数个任意组合而成的功能基团；

所述肝细胞生长因子受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所述，肝细胞生长因子受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所述；

肝细胞生长因子受体的Sema蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1-1546核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的Sema蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中1-516氨基酸序列所述；

肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1547-1686核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中517-772氨基酸序列所述；

肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.14中1687-2796核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO.15中773-932氨基酸序列所述。

2.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团为由Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团，或者为MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为2～3组Sema蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团。

3.根据权利要求2所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述人免疫球蛋白为hIgG1，其Fc片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所述，其Fc片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所述。

4.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述功能基团由Sema蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。

5.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述功能基团由Sema蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.3所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。

6.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述功能基团由两组Sema蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.5所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所述。

7.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述功能基团由MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.7所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所述。

8.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于：所述功能基团为IPT蛋白活性基团时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.9所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所述。

9.根据权利要求1至8之一所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于其与肝细胞生长因子结合。

10.权利要求9所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

Images