CN102265924A - 高抗氧化及降血压活性乳酸菌发酵乳制品的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用基因工程技术在乳酸菌中生产超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）及S型褶皱臂尾轮虫血管紧张素转化酶抑制（Angiotensin-ConvertingEnzymeInhibitor，ACEI）肽，进而制备具有高效抗氧化、降血压功效的发酵乳制品的新方法。具体内容包括：通过PCR方法扩增获得大肠杆菌Fe-SOD编码基因，进一步采用重叠延伸（splicingbyoverlapextension，SOE）PCR法，构建Usp45信号肽-SOD-(G4S)3-ACEI肽融合蛋白基因，连接到乳酸菌表达质粒pMG36e后，转入乳酸菌中，培养并发酵纯牛乳。本发明所获得的基因工程菌可以高效表达SOD及ACEI肽，同时其培养液及牛乳发酵产品均具有明显的SOD与ACEI活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药及食品领域中的功能食品发酵生产技术，具体涉及一种具有高抗氧化及降血压活性的乳酸菌发酵乳制品的生产方法。
背景技术
O2 -自由基的产生是炎症、肿瘤、心脑血管病等慢性疾病以及衰老的重要原因。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是体内O2 -自由基的天然清除剂，在正常情况下，O2 -自由基与SOD间保持着动态平衡关系，从而维持着机体的健康。但在衰老及慢性疾病演进过程中，O2 -自由基将过量产生，机体自身产生的SOD无法完全清除这些过多的自由基，因此便最终产生衰老或疾病。
另一方面，高血压是最常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中、冠心病的主要危险因素，被称为人类健康无形的杀手。恰当有效的降压治疗不仅可以稳定血压、减轻症状，同时可以防止心、脑、肾等严重并发症的出现，特别是预防中风的发生。血管紧张素转换酶（Angiotension Convening Enzyme，ACE）是机体血压调节的关键酶，目前已成为抗高血压药物研发的重要靶点，卡托普利等ACE抑制剂在临床上已广泛应用并取得了很好的降压效果。然而，这些化学合成的ACE抑制剂容易引发血管神经性水肿、顽固性咳嗽等多种副作用。来源于生物体及食品的天然ACE抑制肽具有安全性高，毒副作用小，易吸收等特点，有着合成化学药物不可比拟的优越性，成为高血压防止药物及功能食品研究的热点之一。
乳酸菌是一类以糖为原料产生乳酸的细菌。大量事实证明：乳酸菌具有提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间并对人体具有多方面保健功能的益生菌。但是，乳酸菌是厌氧或兼性厌氧的细菌，其SOD活性很低甚至无SOD活性，因此其抗氧化能力及对氧的耐受力往往较弱，而且导致在发酵及储存中对氧的控制要求升高。另一方面，尽管研究发现瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳酸菌在发酵过程中可通过其细胞壁上的蛋白酶降解乳蛋白产生ACE抑制肽，但这种间接产物的产量不是十分稳定，而且在不同乳酸菌种属间差异较大，因此很难获得稳定高效的降血压活性产品。
发明内容
本发明目的之一是提供一种新的高抗氧化及降血压活性乳酸菌发酵乳制品的生产方法。
本发明构建Usp45信号肽-SOD-(G4S)3 -ACEI肽融合蛋白基因，连接到乳酸菌表达质粒pMG36e后，转入乳酸菌中，培养并发酵纯牛乳，所获得的基因工程乳酸菌可以高效表达SOD及ACEI肽，同时其培养液及牛乳发酵产品均具有明显的SOD与ACEI活性。
为实现此目的，本发明提供如下的技术方案：
一种高SOD及ACEI活性乳酸菌发酵乳制品的生产方法，其特征在于包括如下的步骤：
（1）表达载体的构建：构建Usp45信号肽-SOD-(G4S)3 -ACEI肽融合蛋白基因（如NO1所示），将其插入到乳酸菌表达质粒pMG36e的多克隆位点，获得pMG36e-SOD-ACEI重组质粒；
（2）将pMG36e-SOD-ACEI质粒转化乳酸菌，得到重组乳酸菌；其中重组乳酸菌pMG36e-SOD-ACEI表达产物的氨基酸序列如NO2所示。
（3）培养该重组乳酸菌，并发酵纯牛乳；
（4）收集发酵液，对SOD及ACEI活性进行检测；
本发明所述的方法，其中步骤（1）中的SOD为从大肠杆菌BL21（DE3）基因组中克隆获得的Fe-SOD，ACEI为源自S型褶皱臂尾轮虫的ACEI肽，且SOD与ACEI肽间通过(G4S)3的柔性连接肽相连。同时在SOD-(G4S)3-ACEI肽前添加了Usp45信号肽。
本发明所述的方法，其中步骤（2）中所述的乳酸菌包括乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌等菌株。
本发明所述的方法，其中步骤（3）中所述的主要过程为：将重组乳酸菌以1%体积比在MRS液体培养基中连续培养活化3代后，以3%体积比的接种量转接到纯牛乳中，连续培养活化3代后作为发酵种子液。然后将发酵种子液以10%体积比接入到纯牛乳中，37℃发酵24 h。
本发明所述的方法，其中所述的基因克隆所用PCR引物序列包括：
| P1（NO3） | ACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCAATGTCATTCGAATT |
| P2（NO4） | ACCACTGCCACCACCGCCTGAGCCACCGCCACCTGCAGCGAGATTTTTCGCTAC |
| P3（NO5） | GCGGAGCTCATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC |
| P4（NO6） | AATCATGACCGGTGTCATCTGAACCGCCGCCACCACTGCCACCACCGCCTGAGC |
| P5（NO7） | GCGTCTAGATCATTACATAGCTTCACCGGTATCTTCAAAATCATGACCGGTGTCATC |
其中在上下游引物中分别引入SacI和XbaI酶切位点（下划线部分）。
本发明为了确保发酵产物能够同时具有高效的SOD及ACEI活性，将SOD与ACEI肽间通过(G4S)3的柔性连接肽相连，可使彼此形成独立的空间构象及功能。同时在SOD-(G4S)3-ACEI肽前添加了Usp45信号肽，使整个融合蛋白可以以分泌形式表达到发酵液中。从而大大提高了发酵产物的抗氧化及降血压功效。
本发明的方法成功实现了SOD与ACEI肽在乳酸菌中的高效、高活性共表达。检测结果显示SOD-ACEI重组乳酸菌MRS发酵液及牛乳发酵产物均具有显著的SOD及ACEI活性，其SOD活性高达136.1U/mL，ACE抑制率高达70.7% （以干酪乳杆菌1.2435为例），分别达到转化pMG36e空质粒菌株发酵产物活性的3.7倍和2.2倍。
本发明的方法所适用的乳酸菌菌种类型较广，不仅为大规模工业化生产具有高抗氧化及降血压作用的发酵乳制品奠定了坚实的基础，而且提供了为SOD及ACEI的工业化生产也提供了一种新的基因工程表达方法。
附图说明
图1是重组质粒pMG36e-SOD-ACEI的PCR验证。泳道M: 100 bp DNA marker。泳道1: 重组质粒pMG36e-SOD-ACEI用P3、P5引物进行的PCR验证结果。
图2是干酪乳杆菌1.2345转化重组质粒pMG36e-SOD-ACEI前后发酵液SOD和ACEI活性的升高情况。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。在下述实施例中所给出的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。其中所用试剂均有市售。
实施例1
SOD-ACEI基因工程菌的构建
以大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
| P1（NO3） | ACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCAATGTCATTCGAATT |
| P2（NO4） | ACCACTGCCACCACCGCCTGAGCCACCGCCACCTGCAGCGAGATTTTTCGCTAC |
| P3（NO5） | GCGGAGCTCATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC |
| P4（NO6） | AATCATGACCGGTGTCATCTGAACCGCCGCCACCACTGCCACCACCGCCTGAGC |
| P5（NO7） | GCGTCTAGATCATTACATAGCTTCACCGGTATCTTCAAAATCATGACCGGTGTCATC |
首先用P1和P2进行扩增，将扩增得到的657 bp的PCR产物作为模板，再次用P3和P4进行扩增，继续用获得的733 bp的扩增产物为模板，再次用P3和P5进行扩增，最终获得771 bp的Usp45信号肽-SOD-(G4S)3 -ACEI肽融合蛋白基因。其中，在P3和P5中分别引入了SacI和XbaI酶切位点（下划线部分）。
经过序列比对证实，PCR扩增得到的Usp45信号肽-SOD-(G4S)3 -ACEI肽融合蛋白基因与预期结果完全一致，具体序列如下（NO1）所示：
GAG CTC ATG AAA AAA AAG ATT ATC TCA GCT ATT TTA ATG TCT ACA GTG ATA CTT TCT GCT GCA GCC CCG TTG TCA GGT GTT TAC GCA ATG TCA TTC GAA TTA CCT GCA CTA CCA TAT GCT AAA GAT GCT CTG GCA CCG CAC ATT TCT GCG GAA ACC ATC GAG TAT CAC TAC GGC AAG CAC CAT CAG ACT TAT GTC ACT AAC CTG AAC AAC CTG ATT AAA GGT ACC GCG TTT GAA GGT AAA TCA CTG GAA GAG ATT ATT CGC AGC TCT GAA GGT GGC GTA TTC AAC AAC GCA GCT CAG GTC TGG AAC CAT ACT TTC TAC TGG AAC TGC CTG GCA CCG AAC GCC GGT GGC GAA CCG ACT GGA AAA GTC GCT GAA GCT ATC GCC GCA TCT TTT GGC AGC TTT GCC GAT TTC AAA GCG CAG TTT ACT GAT GCA GCG ATC AAA AAC TTT GGT TCT GGC TGG ACC TGG CTG GTG AAA AAC AGC GAT GGC AAA CTG GCT ATC GTT TCA ACC TCT AAC GCG GGT ACT CCG CTG ACC ACC GAT GCG ACT CCG CTG CTG ACC GTT GAT GTC TGG GAA CAC GCT TAT TAC ATC GAC TAT CGC AAT GCA CGT CCT GGC TAT CTG GAG CAC TTC TGG GCG CTG GTG AAC TGG GAA TTC GTA GCG AAA AAT CTC GCT GCA GGT GGC GGT GGC TCA GGC GGT GGT GGC AGT GGT GGC GGC GGT TCA GAT GAC ACC GGT CAT GAT TTT GAA GAT ACC GGT GAA GCT ATG TAA TGA TCT AGA
2、将Usp45信号肽-SOD-(G4S)3 -ACEI肽融合蛋白基因和pMG36e质粒用SacI和XbaI双酶切后，经T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，在含有25 μg/mL红霉素的LB培养基平板上，培养12 h后挑取单克隆，提取质粒用SacI和XbaI双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测有0.77 kb目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为pMG36e-SOD-ACEI（如图1所示）。在该重组质粒pMG36e-SOD-ACEI中，SOD与ACEI间被通过(G4S)3柔性肽相连接，且置于Usp45信号肽下游，以同一读码框以融合蛋白形式表达。具体序列（NO2）如下所示：
MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAMSFELPALPYAKDALAPHISAETIEYHYGKHHQTYVTNLNNLIKGTAFEGKSLEEIIRSSEGGVFNNAAQVWNHTFYWNCLAPNAGGEPTGKVAEAIAASFGSFADFKAQFTDAAIKNFGSGWTWLVKNSDGKLAIVSTSNAGTPLTTDATPLLTVDVWEHAYYIDYRNARPGYLEHFWALVNWEFVAKNLAAGGGGSGGGGSGGGGSDDTGHDFEDTGEAM
3、采用电转化法，将pMG36e-SOD-ACEI质粒转化到乳酸菌感受态细胞（天津科技大学工业发酵微生物教育部暨天津市重点实验室提供）中，获得SOD-ACEI重组乳酸菌。实验同时转化pMG36e空质粒作为对照。
4、SOD-ACEI基因工程菌的构建完全成功（图1）。
实施例2
SOD-ACEI重组乳酸菌发酵乳制品的制备
1、将SOD-ACEI重组乳酸菌及转化pMG36e空质粒的乳酸菌分别以1%的接种量，接种到10 mL含红霉素（购自上海生工生物工程有限公司）25 μg/mL的MRS液体培养集中，37℃厌氧培养箱中培养，至活力达到108 CFU/mL。以此方法连续活化3代。
2、以3%体积比的接种量转接到含红霉素25 μg/mL的纯牛乳中，活化2代后，再次以3%体积比转接到无红霉素的纯牛乳中活化1代，作为发酵种子液。
3、将发酵种子液以10%体积比的接种量接入到无红霉素的纯牛乳中，37℃厌氧培养24 h。
4、实验结果表明：SOD-ACEI重组乳酸菌及转化pMG36e空质粒的乳酸菌均可发酵纯牛乳获得具有粘稠形态、酸爽口感的发酵乳制品。
实施例3
发酵乳制品SOD及ACEI活性检测
1、将SOD-ACEI重组乳酸菌及转化pMG36e空质粒的乳酸菌经MRS液体培养基活化至第3次的培养液，以及最终所得的发酵乳制品，通过12000 r/min，4℃离心20 min，取上清液，用0.22 μm针式过滤器过滤。所得滤液用于测定SOD及ACEI活性。
2、采用SOD酶活试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）测定样品SOD活性。
3、从新鲜大鼠肺中提取获得ACE，利用ACE活性试剂盒（购自海军总医院）测定样品的ACEI活性。
4、实验结果表明：SOD-ACEI重组乳酸菌MRS发酵液及牛乳发酵产物均具有显著的SOD及ACEI活性，其中SOD活性高达136.1 U/mL，ACE抑制率高达70.7% （以干酪乳杆菌1.2435为例），分别达到转化pMG36e空质粒菌株发酵产物活性的3.7倍和2.2倍（图2）。
SEQUENCE LISTING（序列表）
<110> 天津科技大学
<120> 高抗氧化及降血压活性乳酸菌发酵乳制品的生产方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 765
<212> DNA
<213> 基因序列
<400> 1
gagctcatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct 60
gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgcaatg tcattcgaat tacctgcact accatatgct 120
aaagatgctc tggcaccgca catttctgcg gaaaccatcg agtatcacta cggcaagcac 180
catcagactt atgtcactaa cctgaacaac ctgattaaag gtaccgcgtt tgaaggtaaa 240
tcactggaag agattattcg cagctctgaa ggtggcgtat tcaacaacgc agctcaggtc 300
tggaaccata ctttctactg gaactgcctg gcaccgaacg ccggtggcga accgactgga 360
aaagtcgctg aagctatcgc cgcatctttt ggcagctttg ccgatttcaa agcgcagttt 420
actgatgcag cgatcaaaaa ctttggttct ggctggacct ggctggtgaa aaacagcgat 480
ggcaaactgg ctatcgtttc aacctctaac gcgggtactc cgctgaccac cgatgcgact 540
ccgctgctga ccgttgatgt ctgggaacac gcttattaca tcgactatcg caatgcacgt 600
cctggctatc tggagcactt ctgggcgctg gtgaactggg aattcgtagc gaaaaatctc 660
gctgcaggtg gcggtggctc aggcggtggt ggcagtggtg gcggcggttc agatgacacc 720
ggtcatgatt ttgaagatac cggtgaagct atgtaatgat ctaga 765
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> 氨基酸
<400> 2
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Met Ser Phe Glu Leu
20 25 30
Pro Ala Leu Pro Tyr Ala Lys Asp Ala Leu Ala Pro His Ile Ser Ala
35 40 45
Glu Thr Ile Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His Gln Thr Tyr Val Thr
50 55 60
Asn Leu Asn Asn Leu Ile Lys Gly Thr Ala Phe Glu Gly Lys Ser Leu
65 70 75 80
Glu Glu Ile Ile Arg Ser Ser Glu Gly Gly Val Phe Asn Asn Ala Ala
85 90 95
Gln Val Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Asn Cys Leu Ala Pro Asn Ala
100 105 110
Gly Gly Glu Pro Thr Gly Lys Val Ala Glu Ala Ile Ala Ala Ser Phe
115 120 125
Gly Ser Phe Ala Asp Phe Lys Ala Gln Phe Thr Asp Ala Ala Ile Lys
130 135 140
Asn Phe Gly Ser Gly Trp Thr Trp Leu Val Lys Asn Ser Asp Gly Lys
145 150 155 160
Leu Ala Ile Val Ser Thr Ser Asn Ala Gly Thr Pro Leu Thr Thr Asp
165 170 175
Ala Thr Pro Leu Leu Thr Val Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Ile
180 185 190
Asp Tyr Arg Asn Ala Arg Pro Gly Tyr Leu Glu His Phe Trp Ala Leu
195 200 205
Val Asn Trp Glu Phe Val Ala Lys Asn Leu Ala Ala Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Thr Gly His
225 230 235 240
Asp Phe Glu Asp Thr Gly Glu Ala Met
245
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acagtgatac tttctgctgc agccccgttg tcaggtgttt acgcaatgtc attcgaatt 59
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
accactgcca ccaccgcctg agccaccgcc acctgcagcg agatttttcg ctac 54
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcggagctca tgaaaaaaaa gattatctca gctattttaa tgtctacagt gatactttc 59
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatcatgacc ggtgtcatct gaaccgccgc caccactgcc accaccgcct gagc 54
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgtctagat cattacatag cttcaccggt atcttcaaaa tcatgaccgg tgtcatc 57
Claims (9)
1.一种新的高抗氧化及降血压活性乳酸菌发酵乳制品的生产方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）构建SOD-ACEI肽融合蛋白基因，将其插入到乳酸菌表达质粒pMG36e的多克隆位点，获得pMG36e-SOD-ACEI重组质粒；
（2）将pMG36e-SOD-ACEI质粒转化乳酸菌，得到重组乳酸菌；
（3）培养该重组乳酸菌，并发酵纯牛乳；
（4）收集发酵液，对SOD及ACEI活性进行检测。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中的SOD为从大肠杆菌BL21（DE3）基因组中克隆获得的Fe-SOD，ACEI为源自S型褶皱臂尾轮虫的ACEI肽。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中SOD与ACEI肽间通过(G4S)3的柔性连接肽相连，可确保彼此形成独立的空间构象。
4.权利要求1所述的方法，其步骤（1）中在SOD-(G4S)3-ACEI肽前添加了Usp45信号肽，使整个融合蛋白可以以分泌形式表达到发酵液中。
5.权利要求1所述的方法，其步骤（1）的SOD-(G4S)3 -ACEI肽融合蛋白基因序列如NO1所示。
6.权利要求1所述的方法，其中重组乳酸菌pMG36e-SOD-ACEI表达产物的氨基酸序列如NO2所示。
7.权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中所述的乳酸菌包括乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌或植物乳杆菌菌株。
8.权利要求1所述的方法，其中步骤（3）中所述过程为：将重组乳酸菌以1%体积比在MRS液体培养基中连续培养活化3代后，以3%体积比的接种量转接到纯牛乳中，连续培养活化3代后作为发酵种子液，然后将发酵种子液以10%体积比接入到纯牛乳中，37℃发酵24 h。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的基因克隆所用PCR引物序列为：
其中在上下游引物中分别引入SacI和XbaI酶切位点。
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2011
- 2011-05-30 CN CN 201110140908 patent/CN102265924B/zh not_active Expired - Fee Related
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