CN102258807B - 一种组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)的调孔方法，是将阴离子生物大分子或阳离子生物大分子加入充分润湿的猪脱细胞真皮基质水溶液中，通过调节胶原的动电电位即zeta电位实现；其中：所述阴离子生物大分子为聚天门冬氨酸钠，所述阳离子生物大分子为水溶性壳聚糖；所述生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比例是1∶5～1∶25。本发明的方法不但有效调节猪脱细胞真皮基质的孔径尺寸，而且调整胶原束的结构形貌，得到的猪脱细胞真皮基质保持了胶原的天然结构，预示这类材料将在修复医学中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)的调孔方法，尤其涉及一种用生物大分子调控组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)孔径的方法，属生物材料领域。
背景技术
皮肤及骨修复材料的研制开发一直是组织工程领域大批科学工作者努力的方向。自体移植一直在临床上占主导地位。但自体骨来源有限，而异体移植又有免疫排斥和感染疾病的危险。人们已经开发各种材料用于皮肤及骨组织工程领域。但是这些材料各有不足，不能完全达到临床上的要求。由于皮肤和骨中的有机成分都主要是由I型胶原构成，因此胶原基支架材料便成了研究热点。但传统的胶原来源为从鼠尾及牛、马的肌腱中提取而来，提取过程不仅破坏了胶原的天然结构，降低了其生物相容性及机械性能，且提取成本高。
组织工程支架材料原理提示一个具有和原组织相似的组成和结构的材料将会有更优异的生物学性能。
猪脱细胞真皮基质(PADM)主要由I型胶原构成，组成与天然骨及皮肤中有机组成十分相似。它的提取和纯化方法较为成熟，美国已有部分产品被FDA认证并应用于临床(Permacol，Covedien)。而且它在骨组织工程上的研究也开始引起研究学者们的注意。作为组织工程支架材料，其孔径尺寸非常重要，它关系到细胞的迁移、组织的长入和代谢产物及营养物质的运输。传统的控制PADM孔形貌及尺寸的方法主要有化学交联剂交联法、机械打孔法和激光造孔法。这些方法都在不同程度上对PADM有损伤或改变了其天然的结构，因此，开发新的、更实用的组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)的调孔方法势在必行。
发明内容
针对现有的PADM孔径调控方法中存在的不足，本发明目的是提出一种用生物大分子调控组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)孔尺寸的方法。
本发明所述的组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)的调孔方法，是将阴离子生物大分子或阳离子生物大分子加入充分润湿的猪脱细胞真皮基质水溶液(pH＝7)中，通过调节胶原的动电电位即zeta电位实现；其特征在于：所述阴离子生物大分子为聚天门冬氨酸钠，所述阳离子生物大分子为水溶性壳聚糖；所述生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比例是1∶5～1∶25。
其中：所述聚天门冬氨酸钠选分子量2000-3500道尔顿，密度1.1g/cm3(20℃)，pH(1％)为4-7的聚天门冬氨酸钠；所述水溶性壳聚糖选脱乙酰度为85-87％，粘度(1％)为30-300mpa.s，pH(1％)为4-7的水溶性壳聚糖。
上述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，进一步具体的实施步骤是：
(1)称取一定量猪脱细胞真皮基质，然后按猪脱细胞真皮基质与超纯水为1∶100～1∶200的重量比例混合，然后在恒温摇床中以80-150转/分的速度，将猪脱细胞真皮基质支架充分润湿12-24小时；
(2)按生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比为1∶5～1∶25的比例将阴离子生物大分子或阳离子生物大分子溶于上述含有支架的水中，继续在恒温摇床中以80-150转/分的速度反应12-24小时；
(3)取出支架，以去离子水并用速度为80-130转/分钟的摇床对其洗涤3-5次，每次30-120分钟；
(4)对洗涤后的支架在零下70℃条件下进行冷冻，然后在零下50-60℃下冷冻干燥12-16小时，得孔径为50-300微米、孔壁厚为5-10微米的片状或松散胶原束结构的猪脱细胞真皮基质支架。
上述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法中：猪脱细胞真皮基质(PADM)是采用中国专利031390633所述的方法制备的。
上述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法中：所述猪脱细胞真皮基质与超纯水的重量比优选1∶120～1∶170。
上述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法中：所述生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比优选1∶7～1∶15。
上述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法中：所述阴离子生物大分子为聚天门冬氨酸钠，所述阳离子生物大分子为水溶性壳聚糖。
上述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法中：所述洗涤时的摇床速度优选90-120转/分钟，洗涤时间每次为45-90分钟，此步骤即要保证去除残留生物大分子，又要防止支架受到机械破坏。
本发明经过试验筛选提出了一种组织工程用猪脱细胞真皮基质(PADM)的调孔方法，通过选择生物相容性好、带不同电荷的生物大分子(如聚天门冬氨酸钠或水溶性壳聚糖)来调节猪脱细胞真皮基质(PADM)胶原分子的动电电位，从而调节胶原束的收缩、溶胀来达到控制孔径的目的，得到具有优异结构和组成的皮肤及骨组织用胶原支架，实验证实：本发明所述猪脱细胞真皮基质支架孔径为50-300微米、孔壁厚为5-10微米的片状或松散胶原束结构，且所述支架孔径、孔壁厚利用本方法可调，使PADM在组织工程上有更广阔的应用前景。总之，本发明的方法不但有效调节猪脱细胞真皮基质的孔径尺寸，而且调整胶原束的结构形貌，得到的猪脱细胞真皮基质保持了胶原的天然结构，预示这类材料将在修复医学中具有重要的临床应用价值和社会效益。
附图说明
图1壳聚糖调节孔径100-150微米的PADM多孔支架。
图2壳聚糖调节孔径150-300微米的PAMD多孔支架。
图3聚天门冬氨酸钠调节孔径50-100微米的PADM多孔支架。
图4聚天门冬氨酸钠调节孔径100-250微米的PADM多孔支架。
具体实施方式
实施例1：孔径在100-150微米的PADM天然支架的制备。
(1)称取一定量PADM，然后将其浸入其重量120倍的超纯水中，在恒温摇床中以80转/分的速度，将支架充分润湿15小时。
(2)准确称量其重量7％的壳聚糖溶于含有支架的水中，继续在恒温摇床中以120转/分的速度，反应12小时。
(3)取出支架，用去离子水洗涤3次，60分钟/次，洗涤时摇床速度为80转/分钟。
(4)零下70℃下进行冷冻，最后在零下60℃冷冻干燥16小时。
经上述步骤后得到的PADM孔径在100-150微米，孔壁厚为5-10微米纤维束组成的组织工程用PADM。
实施例2：孔径在150-300微米的PADM天然支架的制备。
同实施例1，步骤(2)中水溶性壳聚糖的质量为PADM重量的20％；
步骤(3)中洗涤时间5次。
经上述步骤后得到的PADM孔径在150-300微米，孔壁由5-10微米松散胶原片组成的组织工程用PADM。
实施例3：孔径在50-100微米的PADM天然支架的制备。
同实施例1，将水溶性壳聚糖改为聚天门冬氨酸钠；
步骤(2)中聚天门冬氨酸钠的质量为PADM重量的8％；
经上述步骤后得到的PADM孔径在50-100微米，孔壁由厚为30-50微米的片状胶原组成的组织工程用PADM支架。
实施例4：孔径在100-250微米的PADM天然支架的制备。
同实施例1，将水溶性壳聚糖改为聚天门冬氨酸钠；
步骤(2)中聚天门冬氨酸钠的质量为PADM重量的20％；
步骤(3)中洗涤时间5次。
经上述步骤后得到的PADM孔径在100-250微米，孔壁为10-30微米松散胶原纤维束组成的组织工程用PADM。
Claims (8)
1.一种组织工程用猪脱细胞真皮基质（PADM）的调孔方法，是将阴离子生物大分子或阳离子生物大分子加入充分润湿的猪脱细胞真皮基质水溶液中，通过调节胶原的动电电位即zeta电位实现；其特征在于：所述阴离子生物大分子为聚天门冬氨酸钠，所述阳离子生物大分子为水溶性壳聚糖；所述生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比例是1：5～1：25。
2.如权利要求1所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其特征在于：所述聚天门冬氨酸钠选分子量2000－3500道尔顿，密度1.1g/cm3(20℃),pH为4－7的聚天门冬氨酸钠。
3.如权利要求1所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其特征在于：所述水溶性壳聚糖选脱乙酰度为85－87%，粘度为30-300mpa.s，pH为4-7的水溶性壳聚糖。
4.如权利要求1所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其步骤是：
（1）称取一定量猪脱细胞真皮基质，然后按猪脱细胞真皮基质与超纯水为1：100～1：200的重量比例混合，然后在恒温摇床中以80－150转/分的速度，将猪脱细胞真皮基质支架充分润湿12－24小时；
（2）按生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比为1：5～1：25的比例将阴离子生物大分子或阳离子生物大分子溶于上述含有支架的水中，继续在恒温摇床中以80－150转/分的速度反应12－24小时；
（3）取出支架，以去离子水并用速度为80－130转/分钟的摇床对其洗涤3－5次，每次30－120分钟；
（4）对洗涤后的支架在零下70℃条件下进行冷冻，然后在零下50－60℃下冷冻干燥12－16小时，得孔径为50－300微米、孔壁厚为5－10微米的片状或松散胶原束结构的猪脱细胞真皮基质支架。
5.如权利要求4所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其特征在于：所述猪脱细胞真皮基质与超纯水的重量比选1：120～1：170。
6.如权利要求4所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其特征在于：所述生物大分子与猪脱细胞真皮基质的重量比为1：7～1：15。
7.如权利要求4所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其特征在于：所述阴离子生物大分子为聚天门冬氨酸钠，所述阳离子生物大分子为水溶性壳聚糖。
8.如权利要求4所述组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，其特征在于：所述洗涤时的摇床速度选90－120转/分钟，洗涤时间每次为45－90分钟。
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| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130724 Termination date: 20160715 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |