CN102229996B

CN102229996B - 转Bar基因植物的环介导等温扩增鉴定引物及其鉴定方法

Info

Publication number: CN102229996B
Application number: CN2011101454027A
Authority: CN
Inventors: 王彩霞; 吴绍强; 林祥梅
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-05-31
Also published as: CN102229996A

Abstract

本发明提供一种用于检测转Bar基因植物的环介导等温扩增引物及其环介导等温扩增检测方法。所述的引物的核苷酸序列如SEQID No.1所示。本发明还进一步提供了转Bar基因植物的环介导等温扩增检测方法，该方法以样品总DNA为模板，用上述的引物于浊度仪中进行环介导等温扩增，根据扩增产物判定样品是否为转Bar基因植物。本发明引物特异性好，检测方法操作简便、仪器简单、反应快速、结果判定方便，为转Bar基因植物检测提供了有效且快速的筛检方法。

Description

转Bar基因植物的环介导等温扩增鉴定引物及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，涉及一种转基因植物检测方法，具体涉及一种用于检测转Bar基因植物的环介导等温扩增引物及其环介导等温扩增检测方法。

背景技术

链霉菌（streptomyces）能产生许多种不同的抗生素，而产生抗生素的链霉菌能通过一定的机制避免自身产物对本身产生毒性。这些菌株通常含有修饰酶，可以使他们本身产生的抗生素失活。通过对抗生素敏感的宿主S.lividans中选择性地克隆基因，可从多种产生抗生素的有机体中分离出编码这些酶的基因。Bar基因（biolaphos resistance基因，即双丙胺酰磷抗性基因）最初就是从S.hygroscopicus野生型ATCC21705的基因组中克隆出来的。Bar基因全长约为0.59kb，其结构基因是从GTG开始，TGA作为终止信号。Bar基因的核苷酸组成中，GC含量约为68.3%，且存在长的连续GC序列，这对Bar基因的检测造成一定的困难，尤其对PCR反应。Bar基因的功能是编码phosphinothricin acetyltransferase（即磷化麦黄酮乙酰转移酶，简写为PAT）。PAT是由183个氨基酸组成，大小为22KD的蛋白质。PAT可使PPT（即磷化麦黄酮）的NH₂自由基乙酰化，从而消除对细胞的毒性。

Bar基因广泛用作一种显性的选择标记，主要用于高等植物、几种丝状真菌以及细菌中。将它与其它目的基因构建到同一载体上，选择培养基中加入一定量的除草剂就能筛选到含目的基因的转化细胞。它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少；Bar基因还能给作物带来抗除草剂的特性。使用与抗除草剂基因相配的除草

目前，转基因产品(GMO)的检测方法主要有PCR、多重PCR、巢式PCR、热不对称PCR、荧光定量PCR方法等检测方法，以及PCR-免疫层析、基因芯片和胶体金试纸条等检测方法。上述方法可以有效灵敏的检测转基因产品，但是随着GMO类型的增多及消费者生活节奏的加快，检验检疫把关、商品检验等检测工作也需要提高速度和质量，而上述方法一般不是操作繁琐，耗时长，就是需要专业的技术人员来进行检测，这给检验工作带来了一定的局限性。随着分子生物学的发展，环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的发展解决了这一难题。LAMP技术是日本学者Notomi等在2000年开发的一种新颖的核酸扩增技术，该技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件下(60-65℃)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。反应过程中不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP反应过程中可以用浊度仪实时监测其生成沉淀的数量，也可采用恒温水浴锅，在反应完毕后观察沉淀或在反应前加入染料，通过反应结束后颜色的变化来判定是否有扩增。LAMP是一种新兴的DNA扩增方法，具有简便、快速、特异性强的特点，具有替代PCR的可能性，由于其具有以上优点，近几年受到了很多学者的关注，越来越多的研究者开始采用这种方法来检测疫病。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于检测转Bar基因植物的环介导等温扩增引物及其环介导等温扩增检测方法。

本发明提供的转Bar基因植物鉴定用环介导等温扩增的引物，包含有外引物(BarF3/BarB3)、内引物(BarFIP3/BarBIP3)、环引物(BarUP/BarLP)，其中上述引物的核苷酸序列分别为：

BarF3：5’-acccacctgctgaagtcc-3’(SEQ ID No.1)；

BarB3：5’-gcaggctgaagtccagc-3’(SEQ ID No.2)；

BarFIP：5’-tcgtgcatgcgcacgctcaggcacagggcttcaaga-3’(SEQ IDNo.3)；

BarBIP：5’-gatatgccccccgcggcatgaaacccacgtcatgccagt-3’(SEQ IDNo.4)；

BarUP：5’-tcgttgggcagcccgat-3’(SEQ ID No.5)；

BarLP：5’-cggcttcaagcacggga-3’(SEQ ID No.6)。

本发明还提供一种鉴定转Bar基因植物的方法，其以样品总DNA为模板，用上述的引物于浊度仪中进行环介导等温扩增，根据扩增产物判定样品是否为转Bar基因植物。

25μL的反应体系含有成分如下：10×Thermopol缓冲液2.5μL；100mM MgSO₄ 2μL；3.2M Betaine 3μL；10mM dNTP 4μL；5μMBarF3/B3 1μL；20μM BarFIP/BIP 3μL，20μM BarUP/LP 1μL，BST DNA聚合酶16U；DNA模板20～200ng，优选为50～100ng，余量为无菌双蒸水；60～65℃恒温90min。

导出浊度仪采集的浊度值数据，利用Excel表绘制梯度扩增曲线图，将80min之前出现扩增曲线的均判定为阳性，80-90min之间出现扩增的判定为可疑，需复检，复检仍在此区间的判定为阳性，90min内始终未见扩增曲线的则判定为阴性。

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明采用环介导等温扩增方法进行转Bar基因产品的快速筛查，具有以下优点：

(1)反应快速：LAMP技术敏感性极高，特别是在存在环引物的情况下，10-15分钟的短时间内DNA模板数量可增加至10⁹倍，是一种反应快速，操作简便的快速检测技术，适应于转基因产品的快速筛检。

(2)灵敏度高：LAMP技术是一种很灵敏的检测技术，检测灵敏度比荧光PCR技术还要高一到两个数量级。

附图说明

图1显示的是Bar基因标准质粒梯度扩增曲线图。

图2显示的是转Bar基因玉米模拟样品的扩增曲线图。

图3显示的是转Bar基因大豆模拟样品的扩增曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物的设计

在美国国立生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中检索获得Bar基因的保守序列，登录号为(X05822.1)。采用Primer Explorer V4在线设计2条外引物、2条内引物和2条环引物。设计原则为：

(1)Tm值：对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为60-65℃，而对于AT富集的引物Tm值为55-60℃。在设计引物时，F1c和B1c的Tm值大概是65℃，F2，B2，B31的Tm值大概是60℃。

(2)引物末端稳定性：自由能改变值(ΔG)越小，引物与模板之间的退火反映越容易发生。一般在进行引物设计是，F2/B2\F3/B3的3’端和F1c/B1c的5’端的自由能改变值小于或等于-4kcal/mol。F1c的5’端扩增以后相当于F1的3’端，所以它的稳定性很重要。

(3)GC含量：当引物的GC含量介于50％-60％时，引物的质量相对好一些。

(4)二级结构：引物设计时尽量防止形成二级结构，特别是内引物。

经过多轮筛选，意外地发现以下引物的特异性显著优于其他引物，该引物序列为：外引物(BarF3/BarB3)、内引物(BarFIP3/BarBIP3)、环引物(BarUP/BarLP)，其中

BarF3：5’-acccacctgctgaagtcc-3’；

BarB3：5’-gcaggctgaagtccagc-3’；

BarFIP：5’-tcgtgcatgcgcacgctcaggcacagggcttcaaga-3’；

BarBIP：5’-gatatgccccccgcggcatgaaacccacgtcatgccagt-3’；

BarUP：5’-tcgttgggcagcccgat-3’；

BarLP：5’-cggcttcaagcacggga-3’。

上述六条引物均由英维捷基(上海)贸易有限公司合成，外引物稀释至5μM，内引物稀释至20μM，环引物稀释至20μM，-20℃保存备用。

实施例2标准质粒的构建

在美国国立生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中检索获得Bar基因的保守序列，化学合成后连入克隆载体pGEM-T中，转化大肠杆菌感受态BL21，经蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌，阳性菌液经测序后提取质粒，测浓度为1.0×10⁹拷贝/μL，制备成含Bar基因保守序列的标准质粒。以Dilution缓冲液(TaKaRa)将该质粒依次10倍倍比稀释至1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μL，制备成一系列梯度浓度的标准质粒。

实施例3Bar基因环介导等温扩增反应的优化

以Bar基因克隆质粒DNA10⁶拷贝/μL为模板，利用仪器Loopampreal-time Turbidimeter(LA-320C)建立Bar基因的LAMP检测方法，并对反应体系(dNTP、Betaine、MgSO₄、BST DNA聚合酶等成分的用量)和反应温度进行优化。最终优化后的环介导等温扩增反应体系为：每25μL的反应体系中含有10×Thermopol缓冲液2.5μL；100mM MgSO₄2μL；3.2M甜菜碱3μL；10mM dNTP 4μL；5μM BarF3/B3 1μL； 20μM BarFIP/BIP 3μL，20μM BarUP/LP 1μL，BST DNA聚合酶16U；DNA模板20～200ng，优选为50～100ng，余量为无菌双蒸水。

用实施例2中制备的标准质粒，采用前述建立的Bar基因LAMP反应体系进行试验，反应时间设定为100min。结果发现10拷贝质粒在77.1min时出现扩增曲线(图1)。在实际样品检测时，考虑到样品DNA对LAMP扩增反应的影响，扩增曲线实际出现时间可能稍有滞后，为避免漏检及保证最低量的检出率，经过多次重复试验，最后确定将80min之前出现扩增曲线的均判定为阳性，80-90min之间出现扩增的判定为可疑，需复检，复检仍在此区间的判定为阳性，90min内始终未见扩增曲线的则判定为阴性。Bar基因LAMP反应的检测时间为90min。

实施例4利用环介导等温扩增检测方法检测转Bar基因玉米模拟样品

取纯的转Bar基因玉米(BT176，拜耳作物科学)粉末按10％的比例与非转基因玉米粉末混合，充分混匀后以非转基因玉米粉末倍比(质量比)稀释至5％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％，0.005％，0.001％，另外设100％和0％两个梯度。以商品化的植物基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司的离心柱型新型快速植物基因组DNA提取试剂盒)提取模拟样品的基因组DNA，测浓度标记后分装保存备用。

以优化后的环介导等温扩增检测反应体系和反应条件对模拟样品的DNA进行检测。反应结束后，将仪器采集的浊度值导出，在Excel表格中处理数据并绘制扩增曲线图。试验表明，Bar基因的环介导等温扩增检测方法可以检测到0.05％的转基因样品掺入量，即用0.05％×30mg(每个模拟样品取30mg提取DNA)＝15ng的转基因样品即可检测到(图2)，表明本发明的方法灵敏度非常好。

实施例5利用环介导等温扩增检测方法检测转Bar基因大豆模拟样品

取纯的转Bar基因大豆(W98，先正达种苗公司)粉末按10％的比例与非转基因大豆粉末混合，充分混匀后以非转基因大豆粉末倍比(质量比)稀释至5％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％，0.005％，0.001％，另外设100％和0％两个梯度。以商品化的植物基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司的离心柱型新型快速植物基因组DNA提取试剂盒)提取模拟样品的基因组DNA，测浓度标记后分装保存备用。

以优化后的环介导等温扩增检测反应体系和反应条件对模拟样品的DNA进行检测。反应结束后，将仪器采集的浊度值导出，在Excel表格中处理数据并绘制扩增曲线图。试验表明，Bar基因的环介导等温扩增检测方法可以检测到0.05％的转基因样品掺入量，即用15ng的转基因样品即可检测到(图3)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种转Bar基因植物鉴定用环介导等温扩增的引物，其核苷酸序列为：

BarF3：5’-acccacctgctgaagtcc-3’；

BarB3：5’-gcaggctgaagtccagc-3’；

BarFIP：5’-tcgtgcatgcgcacgctcaggcacagggcttcaaga-3’；

BarBIP：5’-gatatgccccccgcggcatgaaacccacgtcatgccagt-3’；

BarUP：5’-tcgttgggcagcccgat-3’；

BarLP：5’-cggcttcaagcacggga-3’。

2.一种鉴定转Bar基因植物的方法，该方法以样品总DNA为模板，用权利要求1所述的引物于浊度仪中进行环介导等温扩增，根据扩增产物判定样品是否为转Bar基因植物；环介导等温扩增反应体系为：每25μL的反应体系中含有10×Thermopol缓冲液2.5μL；100mMMgSO₄ 2μL；3.2M甜菜碱3μL；10mM dNTP 4μL；5μM BarF3/B3 1μL；20μM BarFIP/BIP 3μL，20μM BarUP/LP 1μL，BST DNA聚合酶16U；DNA模板20～200ng，余量为无菌双蒸水；环介导等温扩增反应温度为60～65℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据浊度仪的浊度值绘制扩增曲线，将80min之前出现扩增曲线的均判定为阳性，80-90min之间出现扩增的判定为可疑，需复检，复检仍在此区间的判定为阳性，90min内始终未见扩增曲线的则判定为阴性。

4.含有权利要求1所述引物的转Bar基因植物鉴定试剂盒。