CN102227506A - 用于鉴定bace2抑制剂的筛选测定法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于鉴定BACE2抑制剂的筛选测定法。

Description

用于鉴定BACE2抑制剂的筛选测定法

本发明涉及用于鉴定BACE2抑制剂的筛选测定法。可以将这些化合物用于治疗代谢紊乱。

缺陷型的葡萄糖-刺激的胰岛素分泌和减少的β-细胞量是2型糖尿病中高血糖症的主要病因。跨膜蛋白Tmem27(Collectrin)在胰腺β-细胞中表达，其中所述蛋白调节胰腺β-细胞的量，以及胰岛素的分泌。Tmem27在质膜上通过蛋白水解裂解和释放而被失活。

血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种多结构域的膜蛋白，其具有包括将血管紧张素II裂解为血管紧张素的生理作用。由此增加的ACE2活性具有针对代谢疾病提供保护的潜力，所述代谢疾病包括高血压(Ingelfinger“Angiotensin-converting enzyme 2：implications for blood pressure and kidney disease.(血管紧张素-转化酶2：提示血压和肾病)”Curr Opin Nephrol Hypertens.(2009)18(1)：79-84.)。在胰腺中，减少的ACE2与受损的葡萄糖稳态相关(Niu等.“Loss of Angiotensin-converting enzyme 2 leads to impaired glucose homeostasis in mice.(血管紧张素-转化酶2的损失导致小鼠中受损的葡萄糖稳态)”Endocrine(内分泌).(2008)，34(1-3)：56-61.)。因此，ACE2的保持也可以在糖尿病中具有有利作用。ACE2和TMEM27在它们的细胞外结构域上具有接近的序列同源性，并且因此它们可以享有相同的释放蛋白酶。

BACE1是一种β-分泌酶(APP裂解酶的β-位点)，属于一类天冬氨酸蛋白酶，并且涉及阿尔茨海默病的发病机制，以及在外周神经细胞中形成髓鞘。它是这样的跨膜蛋白，在其细胞外蛋白结构域中包含两个活性位点天冬氨酸残基，并且可以作为二聚体发挥功能。

在阿尔茨海默病患者的脑中聚集的40或42个氨基酸长的淀粉状蛋白β-蛋白的产生需要两次连续的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的裂解。BACE1对APP的细胞外裂解释放可溶性的细胞外片段并且随后在其跨膜结构域中通过γ-分泌酶(早老蛋白)进行APP裂解。第二次裂解释放APP的细胞内结构域和淀粉状蛋白-β。由于与BACE1相比，α-分泌酶裂解与细胞膜更接近的APP，其去除淀粉状蛋白-β肽的片段。由α-分泌酶而不是BACE1对APP进行起始裂解防止了最终产生淀粉状蛋白-β。

不像APP和在γ-分泌酶中重要的早老蛋白，在编码BACE1的基因中没有已知的突变导致早期发作的家族性阿尔茨海默病。然而，该酶的水平已经显示在阿尔茨海默病中升高。APP和其它跨膜蛋白的BACE1裂解的生理学目的还是未知的。BACE2是BACE1的近缘同系物。

本发明的目的是提供用于鉴定治疗代谢紊乱的化合物的新测定法。

本发明基于BACE2是裂解Tmem27的蛋白酶的发现。抑制BACE2导致对Tmem27释放的抑制并增加全长蛋白。在其增殖依赖于全长Tmem27蛋白存在的细胞中，抑制BACE2介导的Tmem27裂解导致了细胞增殖的增加。

在第一个方面中，本发明提供用于鉴定BACE2抑制剂的方法，所述方法包括：提供表达Tmem27多肽的细胞，其中所述细胞的增殖依赖于BACE2介导的Tmem27裂解，使包含BACE2多肽和表达所述Tmem27多肽的细胞的混合物与候选化合物接触，并且确定所述候选化合物是否调节细胞增殖，其中细胞增殖的增加是BACE2抑制剂的指示。

在优选的实施方案中，所述细胞表达Tmem27多肽和BACE2。

在另一个优选的实施方案中，所述细胞是β细胞系，优选是MIN6B1细胞系或INS-1e细胞系。

在又一个优选的实施方案中，细胞增殖通过共焦显微术进行测量。

在第二个方面中，本发明提供用于鉴定BACE2抑制剂的方法，所述方法包括：使BACE2和包含来自Tmem27的BACE2裂解位点(cleavage site)或来自ACE2的BACE2裂解位点的肽与候选化合物接触并且确定所述肽的裂解。

在优选的实施方案中，所述Tmem27衍生的肽包含具有在Seq.Id.No.1中所显示序列(QTLEFLKIPS)的肽。

在又一个优选的实施方案中，所述ACE2衍生的肽包含具有在Seq.Id.No.14中显示的序列(NSLEFLGIQP)的肽。

在又一个优选的实施方案中，Tmem27衍生的肽或ACE2衍生的肽的裂解在荧光团荧光共振能量转移((FRET))测定法中确定。

在又一个优选实施方案中，所述Tmem27衍生的肽或ACE2衍生的肽在N-端用丹磺酰(dabsyl)标记并且在C-端用荧光染料标记。

在又一个优选的实施方案中，荧光染料是萤光黄。

在又一个优选的实施方案中，Tmem27衍生的肽或ACE2衍生的肽的裂解在荧光猝灭测定法中确定。

在又一个优选的实施方案中，所述Tmem27衍生的肽或ACE2衍生的肽在N-端用MR121标记，并且在C端用色氨酸标记。

在另一个方面中，本发明涉及ACE2肽用于鉴定BACE2抑制剂的应用。

在另一个方面中，本发明提供选自由Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.5-18组成的组的肽。

用于本发明的方法中的BACE2可以分离自细胞膜(获自表达BACE2的细胞)，或可以分离自表达BACE2的细胞。备选地，BACE2可以部分或完全通过传统化学合成和/或重组DNA技术进行合成。

术语“Tmem27”用于本文时，指来自任何动物，例如哺乳动物物种(包括人)的天然Tmem27序列，和Tmem27变体。所述Tmem27多肽可以分离自多种来源，包括人组织类型，或通过重组和/或合成方法进行制备。

″天然序列Tmem27″指无论其制备方式如何，与天然存在的Tmem27多肽具有相同氨基酸序列的多肽。天然序列Tmem27可以分离自自然，或通过重组和/或合成方法进行制备。术语“天然序列Tmem27”具体地涵盖Tmem27的天然存在的截短或分泌的形式，天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)，以及天然存在的等位基因变体。人Tmem27多肽在swissprot数据库中的标识符为Q9HBJ8(Seq.Id.No.2)。

术语″Tmem27变体″指在天然序列中包含一个或多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入的天然序列Tmem27的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体通常与天然序列Tmem27的氨基酸序列具有至少约75％，优选地至少约80％，更优选地至少约85％，甚至更优选地至少约90％，最优选地至少约95％的序列同一性。术语“Tmem27变体”还指可以通过BACE2进行处理的Tmem27片段，例如仍旧是BACE2的底物的截短的Tmem27多肽。

术语″BACE2″用于本文时，指来自任何动物，例如哺乳动物物种，包括人的天然序列BACE2，和BACE2变体(其在下面进一步定义)。BACE2多肽可以分离自多种来源，包括人组织类型，或通过重组和/或合成方法进行制备。

″天然序列BACE2″指无论其制备方式如何，与天然存在的BACE2多肽具有相同氨基酸序列的多肽。天然序列BACE2可以分离自自然，或通过重组和/或合成方法进行制备。术语“天然序列BACE2”具体地涵盖BACE2的天然存在的截短的或分泌的形式，天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)，和天然存在的等位基因变体。人BACE2多肽在swissprot数据库中的标识符为Q9Y5Z0(Seq.Id.No.3)。

术语″BACE2变体″指在天然序列中包含一个或多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入的天然序列BACE2的氨基酸序列变体。所述氨基酸序列变体通常与天然序列BACE2的氨基酸序列具有至少约75％，优选地至少约80％，更优选地至少约85％，甚至更优选地至少约90％，最优选地至少约95％的序列同一性。

术语″化合物″在“测试化合物”或“药物候选化合物”的背景下用于本文，所述“测试化合物”或“药物候选化合物”与本发明的测定法相关进行描述。象这样，这些化合物包含合成来源或来自天然来源的有机或无机化合物。所述化合物包括无机或有机化合物如由相对低分子量表征的多核苷酸、脂质或激素类似物。其它的生物聚合有机测试化合物包括含有约2-约40个氨基酸的肽和包含约40-约500个氨基酸的更大的多肽，如抗体或抗体缀合物。

术语“Tmem27衍生的肽”指与Tmem27多肽的至少5个氨基酸的连续片段具有至少80％的序列同一性的肽，并且所述肽可通过BACE2裂解。

术语“血管紧张素转化酶2(ACE2)”用于本文时，指来自任何动物，例如哺乳动物物种(包括人)的天然ACE2序列，和ACE2变体。所述ACE2多肽可以分离自多种来源，包括人组织类型，或通过重组和/或合成方法制备。

″天然序列ACE2″指无论其制备方式如何，与天然存在的ACE2多肽具有相同氨基酸序列的多肽。天然序列ACE2可以分离自天然，或通过重组和/或合成方法进行制备。术语″天然序列ACE2″具体地涵盖ACE2的天然存在的截短或分泌形式，天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)，和天然存在的等位基因变体。人ACE2多肽在swissprot数据库中的标识符是Q9BYF1(Seq.Id.No.4)。

术语″ACE2变体″指在天然序列中包含一个或多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入的天然序列ACE2的氨基酸序列变体。所述氨基酸序列变体通常与天然序列ACE2的氨基酸序列具有至少约75％，优选地至少约80％，更优选地至少约85％，甚至更优选地至少约90％，最优选地至少约95％的序列同一性。术语“ACE2变体”还指可以由BACE2处理的ACE2片段，例如仍旧是BACE2的底物的截短的ACE2多肽。

术语“ACE2衍生的肽”指与ACE2多肽的至少5个氨基酸的连续片段具有至少80％序列同一性的肽，并且所述肽可通过BACE2裂解。

由本发明的测定法鉴定的化合物可以用于开发用于治疗代谢紊乱，优选2型糖尿病的药物。

可以用于本发明的方法中鉴定BACE2抑制剂的荧光团荧光共振能量转移(FRET)测定法是本领域技术人员公知的。适合的FRET测定法例如在Grüninger-Leitch等[Substrate and inhibitor profile of BACE(beta-secretase)and comparison with other mammalian aspartic proteases(BACE(β-分泌酶)的底物和抑制剂模式和与其它哺乳动物天冬氨酸蛋白酶的比较).Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)(2002)277(7)4687-93]中进行描述。简言之，设计通过蛋白酶裂解的肽。所述肽在N端用例如丹磺酰(dabsyl)进行标记，并且在C端例如用萤光黄进行标记，从而对于完整的肽，萤光黄的荧光被丹磺酰(dabsyl)猝灭。当所述肽被BACE2切割时，猝灭被去除，产生荧光信号。

可以用于本发明方法中鉴定BACE2抑制剂的荧光猝灭测定法是本领域技术人员公知的。适合的测定法例如在MarméN.等[Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，3798-3801]中进行描述。

附图简述

图1显示蛋白质印迹分析的结果，其显示用(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮(抑制剂)以剂量依赖性方式保持细胞测定法(INS-TMEM27/BACE2细胞系)中的全长TMEM27。

图2显示来自稳定表达人TMEM27和用BACE2抑制剂处理的INS1e细胞的培养物上清液的TMEM27ELISA读数。

图3显示蛋白质印迹分析的结果，其显示(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮对全长TMEM27的保持以及伴随的对其释放到培养物上清液中的抑制。在处于CMV启动子控制下稳定转染TMEM27和BACE2的HEK293细胞中获得。

图4显示细胞测定法的结果。用BACE2抑制剂(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮处理的人胰岛显示全长TMEM27的保持。～2000胰岛用和不用1μM抑制剂温育48小时(雄性，BMI＝23.4；19y/o)。

图5a显示通过测量Min6细胞的增殖率变化关于BACE2抑制剂的细胞测定的结果。

图5b显示在图5a的测定法中所用的细胞的蛋白质印迹。

图6显示通过测量Ins1e细胞的增殖率的变化，关于BACE2抑制剂的细胞测定的结果。

图7显示用衍生自APP，TMEM27的肽和不相关蛋白进行的FRET测定结果。

图8显示关于TMEM27肽和参照BACE2抑制剂的FRET测定法剂量反应曲线和

图9显示在FRET测定法中，BACE2关于衍生自相关肽的肽底物的活性。

实验部分

通过测量细胞TMEM27裂解的关于BACE2抑制的测定法

1.稳定的细胞系：

INS-TMEM27/BACE2表示这样的稳定细胞系，其允许hTMEM27和hBACE2以多西环素-依赖性方式可诱导的进行表达(使用TetOn系统)，所述细胞系通过分别关于新霉素(G418)、潮霉素和Zeocin的连续稳定选择的三个步骤来建立。

2.培养，传代和贮存：

a).培养

基础INS-1细胞培养基：

-完全培养基：将INS-TMEM27/BACE2三重稳定细胞系在包含选择压力：100μg/ml G418；100μg/ml潮霉素，250μg/ml zeocin的基础INS-1培养基中培养。

-每周两次改变细胞培养基

b).传代：

每周一次用胰蛋白酶消化细胞：用PBS漂洗细胞一次，在室温用2ml胰蛋白酶温育3分钟，加入10ml完全培养基，接着由1代传代为3代。

c)贮存：

-重悬～10x10⁶细胞在1ml包含10％DMSO的FCS中

-将它们置于冷冻舱中

-将细胞置于-80℃过夜

-将细胞贮存于液氮中

3.测定法：

a).诱导hTMEM27表达及其通过BACE2的裂解：

-将INS-TMEM27/BACE2细胞接种在96孔板中。

-在完全培养基中培养后2-3天，加入多西环素，至500ng/ml的终浓度。(多西环素应该新鲜制备并且溶解在H2O中)

b).测量BACE2的抑制

-在施用多西环素前2小时加入需要浓度的BACE2化合物。

-再温育46小时。

-使用蛋白质印迹或ELISA来检测在细胞培养基中释放的hTMEM27或通过蛋白质印迹法测量细胞裂解物中的全长TMEM27。

4.蛋白质印迹读出的结果

图1：蛋白质印迹显示由BACE2抑制剂(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮以剂量依赖性方式对细胞测定中全长TMEM27的保持。

5.关于ELISA读出的结果

图2：图表显示从如在方案中所述的稳定表达人TMEM27并用BACE2抑制剂处理的INS1e细胞的培养上清液中的TMEM27ELISA读数。更高浓度的BACE2抑制剂减少释放的TMEM27，并且关于所述抑制剂的IC50可以用标准的曲线-拟合程序如Xlfit推导。在该情形中，确定1.112微摩的IC50。

6.备选的细胞系统

图3：在用处于CMV启动子控制下的TMEM27和BACE2稳定转染的HEK293细胞中获得类似的结果。蛋白质印迹显示(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮对全长TMEM27的保持和释放到培养物上清液中的伴随抑制。

7.通过测量分离的人胰岛中的TMEM27裂解来检测BACE2抑制

图4：用BACE2抑制剂(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮处理的人胰岛显示保持全长TMEM27。将～2000胰岛(雄性；BMI＝23.4；19y/o)在有和无1μM抑制剂的情况下温育48小时。在上清液中没有检测到TMEM27，但是关于裂解的细胞的作用是显而易见的。

通过测量Min6细胞中的增殖率的变化关于BACE2抑制剂的测定

1.细胞培养，传代和贮存

a).培养

将MIN6B1或INS-1e分别培养在如下表所述的标准MIN6培养基中，或分别培养在如前所述的基础INS-1培养基中。

标准的完全MIN6细胞培养基：

每周2次更换培养基。

b).传代：

每周一次用胰蛋白酶消化细胞：用PBS漂洗细胞1次，在室温用2ml胰蛋白酶温育3分钟，加入10ml的完全培养基，接着由1代传代为3代。

如果需要，在将细胞重悬于10ml的完全培养基中后，使用Neubauer室对细胞进行计数，并将其稀释到需要的细胞密度。

c)贮存：

-将～10x10⁶细胞重悬于1ml包含10％DMSO的FCS中

-将它们置于冷冻舱中

-将细胞置于-80℃过夜

-将细胞贮存在液氮中

2.细胞制备方案

使用标准的胰蛋白酶消化方法将50’000MIN6B1细胞/孔接种在96-孔板中。次日，去除血清补充的完全培养基(前述)并将其用补充了如下的化合物的无血清和低葡萄糖培养基(Invitrogen)替换：将10nM exendin-4(Sigma-Aldrich)作为阳性对照每12小时加入细胞，以避免降解。实验开始时，加入1μM RO519996。作为绝对的阳性对照，还将细胞在FCS补充的标准培养基中培养。将细胞温育48小时。

在此次温育后，丢弃培养基并将其用包含10nM EdU(Invitrogen)的血清补充的培养基进行替换，并在37℃温育1小时。接着，小心去除上清液，并将细胞固定、透化和根据生产商的方法用适当的染料(Invitrogen，Click-It EdU kit)进行染色。

3.增殖测定法：图像获得，显微术

在高通量的自动成像系统Opera^TM QEHS(PerkinElmer Cellular Technologies，Hamburg，Germany)上进行96-孔板的旋盘式共焦荧光显微术。通过固态激光器的405nm线或通过宽视野照明的UV汞灯激发核染色(Hoechst或DAPI)。通过488nm的固态激光器激发Alexa Fluor 488标记的增殖标记。在每个实验中调节所有的照明光源的激发强度和延续时间来造成在标记效率中的差异，最优化亮度和对比度，并且使脱色最小化(典型地，50mW的激光输出，40-400ms的积分时间(integration time))。在每个孔中，典型地通过UAPO 20x NA 0.7水浸物镜透镜(Olympus)和优化的滤波器组，用2个独立的高量子效率12位CCD照相机(1.3兆像素单色)记录12对扫描图像。使用单独获得的来自校正样品的图像校正任何残余的照明异质性，像移位或扭曲。

4.增殖测定法：图像分析

使用PerkinElmer’s Opera(Acapella 1.8，PerkinElmer Cellular Technologies，Hamburg，Germany)的专门软件环境分析共焦显微图像。首先通过将核染色图像分区来确定每个细胞的定位。一旦核已经定位并且已经确定了它们的外形和区域，关于每个细胞量化在核位置的EdU染色图像的强度。以这种方法，可以忽视任何非特异性的EdU染色。在应用适合的阈值后，通过将EdU-阳性细胞的数量除以鉴定的细胞的总数计算增殖率，并且因此其不依赖于激光强度、标记效率或荧光团亮度。

5.增殖测定法：统计学分析

关于不同的处理条件，计算实验确定的增殖率，包括阳性对照(高FCS浓度)和阴性对照(饥饿细胞)。使用反正弦变换的增殖率的双侧t检验以及关于多重测试的Bonferroni-校正，针对虚假设H0(即两个条件具有相同的增殖率)测试了在不同条件之间的差异显著性，并通过相应的p-值进行量化。

6.结果：增殖测定法

与饥饿细胞的基础增殖率相比，所有的三种测试条件，即FCS，Exendin-4，和(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮(图5a)，显示了高度显著的增殖增加(p＜10-6)。而且，罗氏(Roche)化合物在增殖增加上甚至明显地超过Exendin-4。两种不同的制备物(板A，板B)显示对于增殖没有任何影响(p＝0.21)，说明该测定法的可重复性。

图5a：Min6细胞增殖的诱导。数据来自饥饿的Min6细胞的三个独立制备物，所述细胞转化了BACE2siRNA、TMEM27siRNA或对照siRNA，以调节TMEM27浓度。增殖与TMEM27水平强相关。该测定法还可以用作关于增殖的BACE2活性的读出，所述增殖与BACE2抑制的水平相关。

图5b显示用在图5a的测定法中的细胞的蛋白质印迹。

7.备选的细胞系统：Ins-1e细胞

用与关于Min6细胞相同的方案进行Ins1e测定法，除了将标准的Ins1e培养基用于细胞培养。通过用10μM BrdU温育30分钟并根据生产商的说明书用Alexa488-抗-BrdU(Invitrogen)抗体染色细胞来测量增殖。

图6：显示通过BACE2的抑制诱导Ins1e的增殖。在低葡萄糖培养基上培养2天后，用BACE2抑制剂(BACE2Inh)处理的细胞与具有基础增殖率的对照细胞相比具有显著更高(p＜0.05)的增殖率。

通过测量TMEM27-衍生的肽和ACE2-衍生的肽的裂解进行关于BACE2抑制剂的测定法

1.FRET测定法的描述

基本如在Grüninger-Leitch等[Substrate and inhibitors profile of BACE(beta-secretase)and comparison with other mammalian aspartic proteases (BACE(β-分泌酶)的底物和抑制剂模式以及与其它哺乳动物天冬氨酸蛋白酶的比较).Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)(2002)277(7)4687-93]中所述进行FRET测定法。简言之，设计被蛋白酶裂解的肽。将所述肽在N端用丹磺酰(dabsyl)标记，并且在C端用萤光黄标记，从而使对于完整的肽，萤光黄的荧光被丹磺酰(dabsyl)猝灭。当所述肽被BACE2切割时，猝灭被去除并且产生荧光信号。

如在Grueninger等2002中所述在pH 4.5，使用5μM的底物浓度进行该测定法。所有的FRET-肽具有所述形式。

设计基于TMEM27序列的FRET肽。丹磺酰(dabsyl)-QTLEFLKIPS-LucY(Seq.Id.No.1)。BACE2具有针对该序列的高度活性，其与已知的基于APP的底物不相关。相反，BACE1具有针对该肽的不显著的活性。

图7：针对不同的FRET肽的BACE1和BACE2活性的比较。用丹磺酰(dabsyl)和萤光黄标记的肽取得的FRET测定法结果来自APP，TMEM27和不相关的蛋白。用于该测定法中的肽具有下列氨基酸序列：

图8：关于丹磺酰(dabsyl)和萤光黄标记的TMEM27肽(Seq.Id.No.1)和参照BACE2抑制剂的FRET测定法剂量反应曲线。在相同的测定法中测量BACE2抑制。在该实施例中，通过将不同浓度的(R)-2-氨基-6-[2-(3′-甲氧基-联苯基-3-基)-乙基]-3，6-二甲基-5，6-二氢-3H-嘧啶-4-酮加入该测定法中来抑制BACE2。针对在没有抑制剂的情况下获得的最大值对FRET活性进行标准化。通过Excel XLFit add-in(加入)来计算关于0.084μM的该化合物的IC50。

图9：还在与TMEM27中的BACE2裂解位点等价的位点，基于ACE2的序列设计肽，其具有序列丹磺酰(dabsyl)-NSLEFLGIQP-萤光黄(Seq.Id.No.14)。该底物以大于TMEM27底物的效率被BACE2裂解。来自TMEM27、APP和支链淀粉的不同区域的备选底物以更低的效率被裂解。用于该测定法中的肽具有下列氨基酸序列：

2.MR121测定法的描述

在相关的测定法中，设计具有相同序列的肽，其在N-端用MR121标记并且在C端用色氨酸标记。

底物肽来自在MR121-肽裂解测定法中具有活性的TMEM27。

制备用于测定的BACE2

如在Ostermann等[“Crystal Structure of Human BACE2 in Complex with a Hydroxyethylamine Transition-state inhibitor(与羟基乙胺过渡态抑制剂复合的人BACE2的晶体结构).Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)355(2006)249-261]″中所述制备BACE2酶胞外结构域。。

制备表达系统

将对应于BACE2翻译的氨基酸序列中的氨基酸20-465的DNA序列克隆到pET17b的NdeI和XhoI位点中从而使BACE2序列符合读框地具有5’ATG并且被终止密码子所终止。将质粒命名为pET 17b-BACE2(ecd)。

将BL21(DE3；pLysS)细胞用pET17b-BACE2(ecd)转化从而得到IPTG-可诱导的大肠杆菌表达系统。

将这些细胞在补充了氨苄青霉素和氯霉素的标准LB表达培养基中培养至OD600～0.5。将IPTG加入到1mM的终浓度。温育在37℃持续3小时。将细胞通过在3000g离心10分钟来收集。

IB制备

●通过超声处理或使用恒定系统细胞破碎器(Constant Systems cell disrupter)来机械破碎细胞。

●通过在5000g离心10分钟来收集包含体。

●在50mM Tris，pH 8.0中洗涤沉淀物4次

●将沉淀物重悬于最小体积的变性缓冲液中。

●重折叠

●将溶解的蛋白在变性缓冲液中稀释到10-21mg/ml之间。

●将稀释的变性蛋白快速稀释到20x体积的重折叠缓冲液I中。

●伴随轻柔搅拌温育过夜。

●将稀释液快速稀释到20x体积的重折叠缓冲液II中。

●伴随轻柔搅拌温育2-5天。

纯化

加入300ml饱和的硫酸铵(～4M)/升重折叠的蛋白溶液

应用于用HIC缓冲液B预平衡的Amersham HiPrep丁基琼脂糖6FF HIC柱。用3CV HIC缓冲液B洗涤，接着用以梯度施加的缓冲液A洗脱。

合并最具活性的级分并针对＞20x体积的10mM Tris，pH8.0；150mM NaCl进行透析。

缓冲液

变性缓冲液：50mM Tris，pH 8.0，8.0M GuHCL，30mM dithioethyritol

重折叠缓冲液I：3M GuHCl，0.7M精氨酸碱，0.5mM GSSG，1.0mM具有HCl的GSH pH 10.4

重折叠缓冲液II：1M NaCl，0.7M精氨酸碱，0.5mM GSSG，1.0mM具有HCl的GSH pH 9.4

HIC缓冲液A：10mM Tris，pH8.0

HIC缓冲液B：10mM Tris，pH 8.0，1M NaCl，1.5M AmSO4

测定缓冲液：10mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl

所用的抗体及其生产的描述

1.完全的细胞免疫用于生产9/24抗体

用稳定表达hTMEM27的INS-1e细胞通过重复注射于活细胞来进行Swiss albino小鼠的免疫。一旦动物显示针对hTMEM27的特异性免疫应答，移去脾细胞并将其根据G.

和C.Milstein(1975)″Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity(分泌预定的特异性的抗体的融合细胞的连续培养)″.Nature(自然)256：495-497与Ag8细胞融合。

2.蛋白免疫用于生产3/3和1/33抗体

以2-3周间隔用纯化的hTMEM蛋白(在大肠杆菌中产生)皮下免疫动物随后将其如所述进行脾细胞的融合来获得一些单克隆抗体。

3.抗体的应用

将9/24抗体专门用于ELISA。将1/33用于检测释放的蛋白的蛋白质印迹和ELISA。将3/3用于检测全长蛋白的蛋白质印迹。使用如方案所需要的标准方法，将1/33和3/3抗体缀合于辣根过氧化物酶。

关于可溶的TMEM27的ELISA测定法的描述

1.测定方案

在标准的96孔免疫测定板中

包被：TMEM27-9/24抗体，5μg/ml在PBS中，100μl/孔，在4℃过夜

洗涤：用PBS-吐温洗涤2次

封闭：B-缓冲液，200μl/孔，1h在37℃

洗涤：用PBS-吐温洗涤2次

样品：培养物上清液，在B-缓冲液中稀释，50μl/孔，1h在37℃

洗涤：用PBS-吐温洗涤4次

缀合物：Ec-1/33-HRPO，1μg/ml在B-缓冲液中，50μl/孔，1小时，在室温

洗涤：用PBS-吐温洗涤4次

底物：100μl/孔，5min，用100μl/孔的1M硫酸终止底物反应

读出：在450nm的OD测量

尽管目前已经显示和描述了本发明的优选实施方案，需要清楚地理解本发明并不限于此，而可以在下述权利要求的范围内有各种不同的实施方案和实践。

Claims (14)

1.鉴定BACE2抑制剂的方法，所述方法包括：提供表达Tmem27多肽的细胞，其中所述细胞的增殖依赖于BACE2介导的Tmem27裂解；使包含BACE2多肽和表达所述Tmem27多肽的细胞的混合物与候选化合物接触，并且确定所述候选化合物是否调节细胞增殖，其中细胞增殖的增加是BACE2抑制剂的指示。

2.权利要求1的方法，其中所述细胞表达Tmem27多肽和BACE2。

3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞是β细胞系，优选是MIN6B1细胞系或INS-1e细胞系。

4.权利要求1-3的方法，其中细胞增殖通过共焦显微术测量。

5.表达Tmem27多肽的细胞及其依赖于BACE2介导的Tmem27多肽裂解的增殖用于鉴定BACE2抑制剂的应用。

6.用于鉴定BACE2抑制剂的方法，所述方法包括：使BACE2和包含来自Tmem27的BACE2裂解位点或来自ACE2的BACE2裂解位点的肽与候选化合物接触并且确定所述肽的裂解。

7.权利要求6的方法，其中所述Tmem27衍生的肽或所述ACE2衍生的肽包含具有在Seq.Id.No.1中所显示序列或在Seq.Id.No.12中所显示序列的肽。

8.权利要求6或7的方法，其中所述Tmem27衍生的肽或所述ACE2衍生的肽的裂解在FRET测定法中确定。

9.权利要求8的方法，其中所述Tmem27衍生的肽或所述ACE2衍生的肽在N端用丹磺酰标记，并且在C端用荧光染料标记。

10.权利要求9的方法，其中所述荧光染料是萤光黄。

11.权利要求6或7的方法，其中所述Tmem27衍生的肽或所述ACE2衍生的肽的裂解在荧光猝灭测定法中确定。

12.权利要求11的方法，其中所述Tmem27衍生的肽或所述ACE2衍生的肽在N端用MR121标记，并且在C端用色氨酸标记。

13.ACE2多肽用于鉴定BACE2抑制剂的应用。

14.基本如上文所述，特别地参考实施例的所述方法和应用。

Images