CN102212538B - 一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用。本发明提供的用于编码腺苷酸环化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO.：1所示的碱基序列。此外，本发明还提供了该DNA序列编码的腺苷酸环化酶，包含该DNA序列的重组载体，包含该重组载体的宿主细胞，以及它们在生产腺苷酸环化酶中的应用。本发明的大肠杆菌基因工程菌株可以高效表达腺苷酸环化酶，其诱导酶活可达到为7U/mg或10U/mg。将该菌株应用于生产环磷酸腺苷，具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点。

Description

一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种腺苷酸环化酶、其编码基因、载体、菌株及应用。

背景技术

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是人体内广泛存在的一种具有生理活性的物质，其作为细胞内的第二信使，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成等发挥着重要的调节作用。临床上cAMP用于治疗慢性充血性心力衰竭、肺心病、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓解；此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。cAMP也可作为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。cAMP亦可用于畜禽饲料添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。

cAMP的生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三种，目前国内外产业化生产全部采用以AMP为原料的化学合成法。化学合成法所涉及的试剂昂贵，且采用大量的吡啶作为溶剂，对人体的皮肤及呼吸道有刺激性，对人体危害很大，并造成环境污染，而且合成对工艺要求很高。生产原料和试剂价格较高、生产成本偏高。利用液化短杆菌、小杆菌、棒状杆菌、节杆菌等以发酵法制备cAMP也存在限制，如产率较低，关键酶腺苷酸环化酶的高效表达机制不清，离子环境与细胞活性的关系以及调节机制有待进一步研究。

酶法即以腺苷酸环化酶为酶源催化生产cAMP。腺苷酸环化酶(E.C.4.6.1.1)在Mg²⁺参与下，可催化ATP生成cAMP和PPi，是cAMP生物合成的关键酶。因此，开发以基因工程为手段，克隆高活性的腺苷酸环化酶基因，构建工程菌株大量表达腺苷酸环化酶，以ATP为原料一步生产cAMP，是cAMP合成的一条可行途径。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种高效表达腺苷酸环化酶的基因。

本发明的另一个目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的又一个目的是提供包含上述重组载体的宿主细胞及其制备方法。

此外，本发明的还一个目的是提供上述基因、重组载体和宿主细胞的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供了一种用于编码腺苷酸环化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO.：1所示的碱基序列。

本发明还提供了一种腺苷酸环化酶，具有如SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供一种用于表达腺苷酸环化酶的重组载体，其含有上述的DNA序列。

优选地，所述重组载体为融合型表达载体，优选为pET28a。

又一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

更优选地，所述大肠杆菌的保藏编号为CGMCC No.4706，已于2011年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所(邮编：100101)。

本发明还提供了制备上述宿主细胞的方法，其包括构建上述的重组载体，并利用该重组载体转化宿主细胞。

优选地，所述方法包括构建包含上述的DNA序列的重组载体pET28a，利用该重组载体通过热击转化大肠杆菌，并根据产物表达量筛选菌株。

还一方面，本发明提供了上述的DNA序列、上述的重组载体、或者上述的宿主细胞在生产腺苷酸环化酶中的应用。优选地，所述腺苷酸环化酶具有如SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列。

此外，本发明提供了一种腺苷酸环化酶的生产方法，其包括采用上述的DNA序列、上述的重组载体、或者上述的宿主细胞来生产腺苷酸环化酶。优选地，所述腺苷酸环化酶具有如SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种环磷酸腺苷的生产方法，其包括采用上述的DNA序列、上述的重组载体、或者上述的宿主细胞生产的腺苷酸环化酶催化腺苷三磷酸来生产环磷酸腺苷。优选地，所述腺苷酸环化酶具有如SEQ IDNO.：2所示的氨基酸序列。

综上所述，本发明提供了一种高效表达腺苷酸环化酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示(以下又称为cya基因)，该腺苷酸环化酶cya基因长度为1125bp，编码374个氨基酸和一个终止密码子。本发明还提供了一种表达载体，其含有上述核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的基因。该表达载体优选含有如SEQ IDNO：1所示基因的分泌型表达载体pET28a-cya。本发明又提供了一种宿主细胞，含有上述表达载体。该宿主细胞优选含有pET28a-cya表达载体的大肠杆菌。上述宿主细胞更优选表达腺苷酸环化酶的大肠杆菌工程菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号CGMCC No.4706。本发明还提供了构建宿主细胞的方法，通过基因步移从节杆菌(Arthrobacter A302)提取cya基因，构建重组表达质粒载体pET28a-cya，将重组质粒热击转化大肠杆菌Rosetta，然后进行诱导表达，筛选到一株产酶量最高的菌株CGMCCNo.4706。此外，本发明还提供了上述高效表达腺苷酸环化酶的基因在生产cAMP中的应用。上述应用具体表现为利用重组工程菌CGMCC No.4706生产cAMP，其方法如下：培养重组菌，利用IPTG或乳糖诱导重组质粒中腺苷酸环化酶基因cya的表达，收集菌体，超声破碎细胞，得到的上清作为粗酶液。在Mg²⁺存在下，以ATP为底物，以粗酶液作为催化剂，催化生成cAMP。

可见，本发明首次发现了节杆菌(本实验室命名为Arthrobacter A302)中腺苷酸环化酶的基因cya，并实现了腺苷酸环化酶基因在大肠杆菌Rosetta中的高效表达。重组工程菌株能够高效表达腺苷酸环化酶基因cya，表达可溶性的腺苷酸环化酶，将其应用于生产cAMP，取得了良好的效果。IPTG诱导表达重组大肠杆菌，酶活为10U/mg；乳糖自诱导表达重组大肠杆菌，酶活为7U/mg。将该重组大肠杆菌应用于生产腺苷酸环化酶，能以ATP为原料一步生成cAMP，具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点，而且清洁无污染，能实现cAMP生产过程的节能、降耗、减排。

生物材料的保藏

节杆菌(Arthrobacter sp.)A302，已于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所(邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.3584。

重组工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Rosetta(pET28a-cya)，已于2011年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所(邮编：100101)，保藏编号CGMCC No.4706。

附图说明

图1为cya全长基因PCR的电泳结果，其中泳道1为2000bp Marker，泳道2为PCR产物。

图2为重组质粒的构建及验证的电泳结果，其中图2A为质粒双酶切验证的电泳结果，泳道1为pET28a-cya重组质粒双酶切产物；泳道2为2000bp Marker；图2B为质粒PCR验证的电泳结果，泳道1为以pET28a-cya重组质粒为模板得到的PCR产物；泳道2为以水为模板得到的PCR产物；泳道3为2000bp Marker。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

除非另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌株、试剂、试剂盒等均可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、酶切消化、片段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等，均为本领域内的常规操作或参照相应产品的说明书进行操作。

实施例1节杆菌Arthrobacter A302的筛选

以从土壤中分离得到的产环磷酸腺苷的菌株为出发菌株，将经N⁺离子束诱变(低能离子注入机靶室内真空度为2×10^-4，注入能量为20kev，剂量为5×10¹³ions·cm^-2.s^-1)后的孢子悬浮液经无菌水稀释100倍后，取0.1ml涂布于牛肉膏平板培养基上30℃下培养3天，从中挑选单菌落在牛肉膏斜面培养2天。转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL摇瓶中，于30℃下250rpm摇床培养20小时。再转接4mL于装有40mL液体发酵培养基(葡萄糖50g/L，K₂HPO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MgSO₄ 1g/L，尿素5g/L，蛋白胨5g/L)的500mL摇瓶中，于30℃下280rpm摇床发酵培养72小时。经过初筛，得到88株比出发菌株产量高的突变株。用同样的条件下进行复筛，最终得到产量最高的菌株A302，环磷酸苷产量最高产量达到2.4g/L，比原始菌株的1.2g/L提高2倍。

目前该菌株A302已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3584，保藏日期为2010年1月18日。关于节杆菌A302(Arthrobacter sp.)的详细信息，可参见本申请人2010年6月4日提交的中国发明专利申请201010191515.6。

实施例2节杆菌腺苷酸环化酶基因cya的克隆

1、节杆菌基因组的提取

将节杆菌(Arthrobacter)A302接种于30mL培养基(培养基组成(g.L^-1)如下：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酸水解酪蛋白10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，氯化钠3g，补蒸馏水至1L)中，30℃培养至对数生长期，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京盖宁金诺生物技术有限公司)提取基因组。

2、扩增保守序列

根据NCBI数据库中已有的腺苷酸环化酶的氨基酸序列，设计扩增保守序列的简并引物如下：

S220：5’-GCTCTCCGCCCGGAA(A/G)(A/C/T)T(A/G/C/T)TGG(A/C)G-3’

AS1：5’-CAGCCGGGCGGC(A/G/C/T)A(A/G/T)(A/G)TT(A/G/C/T)AC-3’

PCR反应体系如下：

PCR条件如下：

94℃变性5min；按如下参数循环30次：94℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。

简并引物PCR扩增得到长度为约750bp的片段，与预期长度相近，凝胶电泳分离纯化此片段并进行胶回收。将胶回收产物连接到PMD18T-vector(购自TAKARA公司)，连接产物转化采用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板。

挑取LB平板上的单菌落，接种到装有5mLLB液体培养基的50mL离心管中，37℃，220rpm下培养8-12小时。利用质粒提取试剂盒(购自上海申能博彩生物科技有限公司)提取质粒，并委托金斯瑞科技(南京)有限公司测序，保守序列长度为768bp，其核酸序列见SEQ IDNO：3。

3、基因步移

1)C端步移

根据上述所得的768bp保守序列设计C端步移三轮PCR的引物如下：

SP1：5’-TGGACGCCCTCGAAGAAGTACTGGT-3’

SP2：5’-CCCGGCGCATGAACGAAAAAACCCT-3’

SP3：5’-TCCTGTACATCGCAGAAACCCCCGC-3’

以基因组为模板，扩增所需的其它试剂及简并引物采用Genomewalking kit(购自TAKARA公司)，第一轮PCR体系如下：

以第一轮PCR产物的100倍稀释液为模板，第二轮PCR反应体系如下：

以第二轮PCR产物的50倍稀释液为模板，第三轮PCR反应体系如下：

三轮PCR的反应条件分别如下：

将第三轮PCR产物所得的约900bp的片段进行凝胶电泳分离纯化及胶回收，并委托金斯瑞科技(南京)有限公司测序。所得片段含有354bp的腺苷酸环化酶基因序列，与保守序列重叠180bp，表明成功向C端步移174bp直至终止子，其序列见SEQ IDNO：4。

2)N端步移

根据NCBI数据库中已有的腺苷酸环化酶及其之前的膜结合蛋白的氨基酸序列设计简并引物如下：

J200：5’-GGAGGGCGGCCGG(A/G)A(C/T)GA(A/G)(A/C)G(A/G/C/T)AT-3’

AS941：5’-TAGTCCAGCACAAGCCCCTTGC-3’

以基因组为模板，PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃变性5min；按如下参数循环30次：94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。

凝胶电泳分离纯化PCR产物，并将1000-2000bp的产物进行胶回收，并委托金斯瑞科技(南京)有限公司测序。结果显示，成功向N端步移183bp直至起始密码子，其序列见SEQ IDNO：5。

3)腺苷酸环化酶基因cya的克隆

根据拼接后得到的全长序列设计扩增cya全长序列的引物如下：

uAC2：5’-CAGTCCGGCGGGGCGTTGGATTAC-3’

dAC：5’-TTAGTCCAGCACAAGCCCCTTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃变性5min；按如下参数循环30次：94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸80s；最后72℃延伸10min。

凝胶电泳分离纯化约1100bp的PCR产物(电泳结果见图1)，进行胶回收后，委托金斯瑞科技(南京)有限公司测序。结果显示，cya基因长度1125bp，编码374个氨基酸残基和一个终止子，其序列如SEQ IDNO：1。

实施例3cya基因表达载体的构建

根据获得的cya基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端和3’端分别引入NdeI和EcoRI酶切位点(见横线部分)，引物序列如下：

sAC：5’-TTCCATATGATGAACGATGAGGACCAGCA-3’

asAC：5’-CCGGAATTCTTAGTCCAGCACAAGCCCCT-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃变性5min；按如下参数循环30次：94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸80s；最后72℃延伸10min。

凝胶电泳分离纯化约1100bp的PCR产物，进行胶回收。将胶回收产物连接到PMD18T-simple，构建PMD18T-cya重组质粒。

采用NdeI和EcoRI双酶切PMD18T-cya重组质粒和几种不同的质粒(包括pET28a质粒、pET15b质粒、pET22b质粒等)，并连接酶切产物，获得相应的重组质粒。结果显示质粒pET28a明显优于其他质粒。

采用该重组质粒pET28a-cya转化不同的宿主(包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母等)，结果显示大肠杆菌明显优于其他宿主。

采用该重组质粒pET28a-cya转化大肠杆菌DH5a，挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的50mL离心管中，37℃，220rpm下培养8-12小时。提取质粒，经PCR和双酶切筛选获得含有cya基因的重组表达质粒，电泳验证结果见图2A和2B，并经过测序确认重组质粒的阅读框正确。

实施例4表达节杆菌cya基因的大肠杆菌工程菌株的构建及筛选

将获得的重组质粒通过热击转化大肠杆菌Rosetta，具体操作如下：取1μL重组质粒，加入到100μL大肠杆菌Rosetta感受态细胞液中，冰上放置30min后，42℃热击90s，立即取出放冰上2min，加入900μLLB液体培养基，37℃，220rpm下培养1小时后，取150μL培养液涂布含有氯霉素和卡拉霉素的LB固体培养基，37℃培养12小时后所得的单菌落即为重组菌。

提取质粒，以质粒为模板，进行PCR验证。

进行诱导表达之后，经过筛选得到一株产酶量最高的菌株Rosetta(pET28a-cya)，其保藏编号为CGMCC No.4706。

实施例5IPTG诱导表达重组大肠杆菌

挑取实施例4中筛选出的重组菌大肠杆菌Rosetta(pET28a-cya)及含有pET28a空质粒的对照菌大肠杆菌Rosetta(DE3)至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。

按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8mM，30℃，220rpm，诱导表达7h后，8000rpm，4℃离心5min，菌泥用200mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声破碎细胞(功率200W，超声3s，间歇4s，共3min)，6500rpm，4℃离心5min，测定上清液的酶活。

酶反应体系包括1mM ATP和5mM MgSO₄，30℃反应15min，沸水中煮5min灭酶，离心，上清液过膜。HPLC检测cAMP的含量，具体为江苏淮阴汉邦科技有限公司Lichrospher C18[4.6x250mm，5um]色谱柱；流动相：V(甲醇)∶V(pH6.6的磷酸三乙胺溶液)＝15∶85；柱温：室温；检测波长：254nm；流速：0.8mL·min^-1；进样量：20μL。

酶活定义为在30℃下每分钟生成1微摩尔cAMP所需要的酶量定义为一个酶活单位U。

经检测，重组菌大肠杆菌Rosetta(pET28a-cya)中cya的酶活为10U/mg，对照菌中cya的酶活为7.4×10^-4U/mg。

实施例6乳糖自诱导表达重组大肠杆菌

挑取实施例4中筛选出的重组菌大肠杆菌Rosetta(pET28a-cya)及含有pET28a空质粒的对照菌大肠杆菌Rosetta(DE3)至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。

按2％接种量分别接种到至含乳糖的LB液体培养基中，组成(g.L^-1)如下：2g葡萄糖，3g乳糖，10gNaCl，15g蛋白胨，25g酵母膏。37℃，220rpm培养至3h。然后30℃，220rpm，诱导表达12h。8000rpm，4℃离心5min，收集菌泥，用200mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声破碎细胞(功率200W，超声3s，间歇4s，共3min)，6500rpm，4℃离心5min，测定上清液的酶活，具体参照实施例5中的定义和方法。

经检测，重组菌大肠杆菌Rosetta(pET28a-cya)中cya的酶活为7U/mg，对照菌中cya的酶活为8.9×10^-4U/mg。

Claims (13)

1.一种用于编码腺苷酸环化酶的DNA序列，其碱基序列如SEQ IDNO.:1所示。

2.一种腺苷酸环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

3.一种用于表达腺苷酸环化酶的重组载体，其含有权利要求1所述的DNA序列。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为融合型表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pET28a。

6.一种宿主细胞，其含有权利要求3至5中任一项所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述大肠杆菌的保藏编号为CGMCC No.4706。

9.制备权利要求6或7所述宿主细胞的方法，其包括构建权利要求3至5中任一项所述的重组载体，并利用该重组载体转化宿主细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括构建包含权利要求1所述DNA序列的重组载体pET28a，并利用该重组载体通过热击转化大肠杆菌，并根据产物表达量筛选菌株。

11.权利要求1所述的DNA序列、权利要求3至5中任一项所述的重组载体、或者权利要求6或7所述的宿主细胞在生产腺苷酸环化酶中的应用。

12.一种腺苷酸环化酶的生产方法，其包括采用权利要求1所述的DNA序列、权利要求3至5中任一项所述的重组载体、或者权利要求6或7所述的宿主细胞来生产腺苷酸环化酶。

13.一种环磷酸腺苷的生产方法，其包括采用权利要求1所述的DNA序列、权利要求3至5中任一项所述的重组载体、或者权利要求6或7所述的宿主细胞生产的腺苷酸环化酶催化腺苷三磷酸来生产环磷酸腺苷。

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