CN102212139A - 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，森林脑炎病毒是一种毒力极强的嗜神经病毒，引起的森林脑炎为急性中枢神经系统传染病。目前的森林脑炎粗制疫苗和纯化疫苗均属于灭活疫苗，存在抗原成分复杂，有效抗原的含量较低，副作用较多等问题。包膜E蛋白是森林脑炎病毒的重要结构蛋白，该蛋白诱导的中和抗体是机体抗森林脑炎病毒的主要免疫保护机制。本发明利用分子克隆方法构建了森林脑炎病毒包膜E蛋白与人IgG1Fc段的融合基因，然后转染CHO细胞，表达出了重组的融合蛋白。本发明证明与人IgG1Fc段融合能明显提高E蛋白的表达水平，并方便蛋白的纯化；能明显提高E蛋白的免疫原性，增强E蛋白诱导的E抗体和细胞免疫应答。本发明的融合蛋白作为森林脑炎疫苗抗原具有应用前景。

Description

森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Ig G1 Fc段融合蛋白，及其在制备森林脑炎疫苗中的应用。

背景技术

森林脑炎病毒也称蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)，是一种毒力极强的嗜神经病毒，主要侵犯人的中枢神经系统，引起的森林脑炎为急性中枢神经系统传染病，病死率和致残率相当高。森林脑炎病毒为重要的病毒类生物战剂之一，美国国家疾病控制中心将该病毒分类为C类病毒类生物武器。我国，森林脑炎是法定的由生物因素引起的职业病。森林脑炎疫苗是国家应急储备疫苗之一。

森林脑炎病毒至少有三个亚型，即西欧亚型、远东亚型和西伯利亚亚型，主要分布于中国、俄罗斯、捷克、保加利亚、波兰和奥地利等国。我国主要分布于东北、西北、西南三大疫区的长白山、大兴安岭、小兴安岭、天山、阿尔泰山及横断山六个自然疫源地，其中东北疫区最为严重。近几年来疫情由林区向草原、丘陵、农业区蔓延，另外随着林区经济的发展和森林游、探险游、野外生存游的兴起以及林区生态环境的改变，进入林区的人群逐年增加，致使森林脑炎的流行范围逐年上升，对疫苗接种的需要也逐年增大。

目前的森林脑炎粗制疫苗和纯化疫苗均属于灭活疫苗，抗原成分复杂，有效抗原的含量较低，副作用较多，制备过程中涉及生物安全问题，大规模制备存在技术困难。

森林脑炎病毒包膜E蛋白是森林脑炎病毒的重要结构蛋白，介导病毒与受体结合与膜融合的生物学功能，该蛋白诱导的中和抗体是机体抗森林脑炎病毒的主要免疫保护机制(司炳银、祝庆余，森林脑炎病毒E蛋白研究的进展，军事医学科学院院刊，1998；22(4)：305-308)。开发基于包膜E蛋白为靶抗原的重组疫苗在理论上是可行的，是新一代森林脑炎疫苗的发展方向。

目前尚无基于包膜E蛋白为靶抗原的重组疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Ig G1 Fc段融合蛋白，以及所述蛋白在制备森林脑炎疫苗中的应用。

森林脑炎病毒包膜E蛋白是森林脑炎病毒的主要结构蛋白之一，位于病毒体的表面，能诱导保护性抗体，包膜E蛋白免疫动物能保护动物免受病毒的攻击，因此发明人认为：该蛋白理论上可作为森林脑炎疫苗的重要抗原。为了使该蛋白能高水平表达，本发明对E蛋白的编码基因进行了优化，使用哺乳动物偏爱密码子合成E基因，可提高E蛋白的翻译效率，从而提高其表达水平。

抗体是由分化成熟的B细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白，即免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。免疫球蛋白可分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的70％。免疫球蛋白具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。重链和轻链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。免疫球蛋白分子可被许多蛋白酶水解，产生不同的片段。木瓜蛋白酶将IgG分子降解成两个相同的Fab段和一个Fc段。Fab段即抗原结合片段(antigen binding fragment)，仍具有抗原结合活性。Fc段即可结晶片段(crystallizable fragment)，在一定条件下可形成结晶，Fc段不能与抗原结合，但具有许多其他生物学活性，如固定补体、亲和细胞(巨噬细胞、NK细胞和粒细胞等)、介导与细菌蛋白(如金黄色葡萄球菌蛋白A和链球菌蛋白G)的结合等。多种基因工程药物将抗体Fc段融合在活性蛋白的羧基端，能提高蛋白的表达和稳定性，并方便蛋白的纯化。

本发明提供了一种融合蛋白，该融合蛋白是在森林脑炎病毒包膜E蛋白的羧基端融合了人抗体IgG1的Fc段，其中编码森林脑炎病毒包膜E蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码人抗体IgG1的Fc段的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供的融合蛋白，编码该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

另外，发明人认为，由于E蛋白为糖基化蛋白，会被宿主细胞加工修饰形成复杂的空间构象。E蛋白的天然空间构象对于介导病毒感染以及诱导中和抗体均有重要影响。选择合适的宿主细胞表达E蛋白，使之具有天然的糖基化修饰和形成天然的功能性空间构象，是作为有效疫苗抗原的重要条件。因此，发明人认为：用哺乳动物细胞表达E蛋白是可取的选择。CHO细胞是目前常用的哺乳动物工程细胞，表达产物能被修饰、加工形成天然的构象和具有天然生物学功能和活性，是国际公认可用于人用基因工程药物生产的细胞株。与大肠杆菌相比，CHO细胞表达外源蛋白的总体水平较低，但抗体除外。目前每升CHO细胞培养体系中表达出克级的抗体在技术上已不是问题。

本发明用分子克隆方法，利用哺乳动物偏爱密码子合成了我国森张株森林脑炎病毒包膜E基因，然后分别构建了E基因表达质粒和E基因与人抗体IgG1Fc段融合基因表达质粒，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，构建成功稳定分泌表达E蛋白或E-Fc融合蛋白的细胞株，用亲和层析的方法纯化蛋白，然后用ISA720为佐剂，免疫小鼠和家兔，检测小鼠和家兔血清中的E抗体，并分析小鼠脾细胞在体外对于E蛋白刺激所分泌的细胞因子。

本发明提供的融合蛋白，是通过以下方法得到的：首先构建含有如SEQ IDNO：3所示的基因的表达质粒，然后转染中国仓鼠卵巢细胞，分泌表达该融合蛋白，并分离纯化。

本发明具体技术方案如下：

1.我国森张株森林脑炎病毒包膜E基因胞外段的合成：根据我国森张株森林脑炎病毒E基因编码的氨基酸序列，利用哺乳动物细胞偏爱的密码子设计出优化的E基因序列，然后合成得到该基因(如SEQ ID NO：1所示)。

2.人抗体IgG1 Fc段基因的克隆：从人外周血分离B细胞，抽提细胞总RNA，然后用逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)克隆得到人IgG1 Fc段基因(如SEQ ID NO：2所示)。

3.森林脑炎病毒包膜E与人IgG1 Fc段融合基因的构建：用酶切、连接的方法将森林脑炎病毒包膜E基因与人IgG1 Fc段拼接为一段融合基因(如SEQ IDNO：3所示)。E基因羧基端是BamHI酶切位点，而IgG1 Fc段氨基端也是BamHI酶切位点，该位点有6个核苷酸GGATCC，将两段基因融合在一起后两个BamHI酶切位点变成一个。

4.森林脑炎病毒E基因和E-IgG1 Fc融合基因表达质粒的构建：分别将E基因和E-IgG1 Fc融合基因插入具有自主知识产权的CHO细胞表达质粒pCIDA-GS-neo(见本申请人已授权的中国专利ZL 200610024202.5，发明名称为：一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，发明人为：赵平、廖小玲、曹洁、戚中田。)，得到E蛋白以及E-Fc融合蛋白表达质粒。

5.稳定表达E蛋白和E-IgG1 Fc融合蛋白的CHO细胞株的构建以及细胞培养与蛋白纯化：用脂质体分别将上述两种表达质粒转染CHO-K1细胞，用免疫印迹方法检测细胞培养上清中的E蛋白。用甲硫氨酸亚砜(MSX)筛选得到稳定转染的CHO-K1细胞克隆，然后进行无血清培养。收集细胞培养上清，离心，超滤，然后用镍柱亲和纯化E蛋白，用金黄色葡萄球菌蛋白A树脂亲和纯化E-IgG1 Fc融合蛋白。

6.免疫小鼠和家兔：分别将E蛋白和E-IgG1 Fc融合蛋白联合免疫佐剂ISA720，免疫小鼠和家兔，免疫三次。

7.小鼠和家兔血清抗体检测：用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠和家兔免疫血清中的E抗体。

8.检测小鼠脾细胞在体外对E蛋白的特异性反应：处死小鼠，无菌取小鼠脾脏，分离培养单个脾细胞，以重组表达的E蛋白刺激，用ELISA检测小鼠脾细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-12。

结果显示：森林脑炎病毒E基因和人IgG1 Fc段基因融合可显著提高E蛋白的表达水平，且融合蛋白诱导的E抗体水平显著高于E蛋白诱导的E抗体水平。融合蛋白可以用金黄色葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白偶联的树脂进行高效亲和层析纯化。该融合蛋白作为森林脑炎疫苗靶抗原具有应用前景。

本发明证明了人IgG1 Fc段与森林脑炎病毒包膜E蛋白融合不仅有助于用亲和层析的方法纯化E蛋白，还能提高E蛋白的表达水平，并增强E蛋白的免疫原性，显著提高E蛋白诱导的抗体和细胞免疫应答，为开发重组亚单位森林脑炎疫苗提供了一种有效的候选抗原。

附图说明

图1是质粒pCIDA-E-Fc的结构

其中：PCMV为巨细胞病毒CMV启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，E为森林脑炎包膜E基因，Fc为人抗体IgG1 Fc段基因，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。图2是质粒pCIDA-E的结构

其中：PCMV为巨细胞病毒CMV启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，E为森林脑炎包膜E基因，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

图3是E蛋白和E-Fc蛋白的免疫印迹检测

用免疫印迹检测质粒pCIDA-E、pCIDA-E-Fc转染的CHO细胞培养上清中的E蛋白，用未转染质粒的CHO细胞培养上清作为对照。

图4是还原型E和E-Fc蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

图5是还原型E-Fc蛋白和氧化型E-Fc蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

图6是小鼠血清中E抗体的检测

分别用E、E-Fc和牛血清白蛋白联合ISA720佐剂免疫小鼠，于0、2、4周各免疫一次，在不同时间点用ELISA检测小鼠血清中的E抗体(血清1∶200稀释，10只小鼠血清检测值的平均值)。

图7是家兔血清中E抗体的检测

分别用E、E-Fc和牛血清白蛋白联合ISA720佐剂免疫家兔，于0、2、4周各免疫一次，在不同时间点用ELISA检测家兔血清中的E抗体(血清1∶200稀释，10只家兔血清检测值的平均值)。

图8是ELISA检测小鼠脾细胞针对E蛋白刺激所分泌的细胞因子

第三次免疫后2周，处死小鼠，分离培养脾细胞，用E蛋白刺激，三天后用ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ(5只小鼠脾细胞检测值的平均值)。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1.我国森张株森林脑炎病毒包膜E基因的合成：

根据我国森张株森林脑炎病毒E基因所编码的氨基酸序列(GenbankAccession：AY182009)，利用哺乳动物细胞偏爱的密码子设计出优化的E基因序列(如SEQ ID NO：1所示)，其5’端含NheI酶切位点GCTAGC和起始密码子ATG，3’末端含BamHI酶切位点GGATCC，委托上海捷瑞生物技术有限公司用常规重叠延伸聚合酶链反应合成该基因，将该基因插入克隆载体T载体(美国Promega公司产品)，命名为pGEM-E。

实施例2.人抗体IgG1 Fc段基因的克隆：

用CD19单抗标记的磁珠(德国Miltenyibiotec公司产品)从20ml新鲜人血浆中分离B细胞，操作参照使用说明进行。用Trizol Reagent(美国Invitrogen产品)抽提细胞总RNA，操作参照使用说明进行。得到的细胞总RNA溶解于DEPC处理的灭菌双蒸水。然后用逆转录反应(RT)-聚合酶链反应(PCR)扩增人IgG1Fc段基因。所用试剂为美国Promega公司产品。取RNA2μl(约5μg)，置于一0.5毫升离心管内，再加入以下各组分：5μl AMV逆转录反应缓冲液、1μl dNTP(浓度10mM)、1μl oligo(dT)15(浓度5pmol/μl)，于70℃热水浴5分钟，再迅速置于冰水浴，加入以下组分：2μl RNA酶抑制剂(30U/μl)、1μl AMV逆转录酶(5U/μl)，加DEPC处理的灭菌重蒸水至终体积25μl。混匀，于42℃水浴40分钟，再95℃5分钟灭活逆转录酶，立即取5μl逆转录产物置于一只50μl离心管内，然后加入引物FcF(5’-GGATCCGAACCCAAATCTTGTGACA-3’，下划线为BamHI酶切位点)和FcR(5’-GTCGACAACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’，下划线为SalI酶切位点)各0.1μl，以及5μl Pfu聚合酶反应缓冲液，1μl dNTP(浓度10mM)和1μl Pfu聚合酶(3U/μl)，补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用PCR仪进行热循环反应，共30个循环，然后加入Taq酶1U，72℃10分钟，然后温度降至4℃结束反应，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，与PCR产物克隆载体T载体(美国Promega公司产品)连接，连接得到的克隆委托上海捷瑞生物技术有限公司进行DNA测序鉴定，得到的正确克隆命名为pGEM-Fc。Fc基因序列见如SEQ ID NO：2所示。

实施例3.森林脑炎病毒包膜E与人IgG1 Fc段融合基因表达质粒的构建：

用NheI和BamHI酶切质粒pGEM-E，琼脂糖凝胶电泳回收1400个碱基对的E基因片段。用BamHI和SalI酶切质粒pGEM-Fc，琼脂糖凝胶电泳回收700个碱基对的Fc基因片段。用NheI和SalI酶切本发明人构建的具有自主知识产权的CHO细胞表达载体pCIDA-GS-neo(构建方法参见见本申请人已授权的中国专利ZL 200610024202.5，发明名称为：一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，发明人为：赵平、廖小玲、曹洁、戚中田。)，琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体，将回收的线性化载体以及E基因和Fc基因连接，得到的质粒先用NheI和SalI酶切鉴定，然后委托上海捷瑞生物技术有限公司进行DNA测序鉴定，序列正确的质粒命名为pCIDA-E-Fc。

E-Fc融合序列见如SEQ ID NO：3所示。质粒pCIDA-E-Fc结构如图1所示：PCMV为巨细胞病毒CMV启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，E为森林脑炎包膜E基因，Fc人IgG1 Fc段基因，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

实施例4.森林脑炎病毒E基因表达质粒的构建：

以质粒pGEM-E为模板，PCR扩增E基因，上游引物中含NheI酶切位点(5’-GCTAGCCGCCACCATGGAGAGCGTGGTGACCCGCGTG-3’，下划线为NheI酶切位点)，下游引物中加入6个组氨酸的编码序列以及终止密码子和SalI酶切位点，序列为5’-GTCGACAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAGGCGCCG CCCAGCACGG-3’，下划线为SalI酶切位点和6个组氨酸的编码序列)，PCR反应体系以及热循环条件参照实施例2中所述。PCR产物与克隆载体T载体连接，连接得到的克隆委托上海捷瑞生物技术有限公司进行DNA测序鉴定，得到完全正确的克隆，命名为pGEM-E6H。用NheI和SalI酶切pGEM-E6H，切出E基因插入CHO细胞表达载体pCIDA-GS-neo，用酶切、测序鉴定质粒，命名为pCIDA-E，结构如图2所示：PCMV为巨细胞病毒CMV启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，E为森林脑炎包膜E基因，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。

实施例5：稳定表达E蛋白以及E-Fc融合蛋白的CHO细胞株的构建以及蛋白纯化：

用含10％胎牛血清的DMEM培养液传代培养CHO-K1细胞，以0.25％胰蛋白酶消化细胞，接种于35mm细胞培养皿，次日分别将4μg pCIDA-E质粒和pCIDA-E-Fc质粒与10μl脂质体转染试剂Lipofectamine(美国Invitrogen产品)混匀，转染CHO-K1细胞，操作按照使用说明进行。8小时后加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48小时。用免疫印迹法检测培养上清中的E蛋白，操作参照《分子克隆实验指南第三版》(科学出版社，2002)进行。将培养上清与含β巯基乙醇(破坏由两个半胱氨酸形成的二硫键)的上样缓冲液混合，煮沸，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将凝胶中的蛋白电转移至尼龙膜，与含有10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液室温反应1小时，然后与森林脑炎病毒E蛋白抗体(用森林脑炎纯化灭活疫苗(长春生物制品研究所生产，批号为：20070901-2。)免疫家兔，免疫三次，然后用亲和层析纯化兔IgG，用含有10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液1∶1000稀释)室温反应1小时，然后与辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(美国Sigma公司产品)室温反应1小时，用化学发光法检测反应条带，操作参照《分子克隆实验指南第三版》(科学出版社，2002)进行。

结果于图3所示，两种质粒转染的CHO细胞培养上清中均可检测到E蛋白，E蛋白分子量在50kDa和70kDa之间，E-Fc蛋白分子量在70kDa和100kDa之间，与预期一致。pCIDA-E-Fc质粒转染的细胞上清中的E蛋白含量明显高于pCIDA-E质粒转染的细胞上清中的E蛋白含量。

将转染的CHO细胞以0.25％胰蛋白酶消化，接种于5个100mm细胞培养皿，用含有10％透析的胎牛血清的GMEM-S培养液(美国Sigma公司产品)培养，加甲硫氨酸亚砜(MSX)(美国Sigma公司产品)至终浓度25μmol/L，3-4天后细胞开始死亡，两周后培养皿形成由单个细胞增殖而形成的克隆，挑单个克隆接种于96孔板，继续用含25μmol/L MSX的GMEM-S培养液培养，一周后培养上清用免疫印记法检测E2蛋白的表达，对表达水平最高的克隆以胰蛋白酶消化，有限稀释接种96孔板，继续用25μmol/L MSX的GMEM-S培养液培养，二周后，将长有单克隆的孔内细胞转移至24孔板，继续培养，细胞铺满孔板以后转移至小方瓶内放大培养，随后用无血清培养基(美国Sigma公司产品)逐渐替代GMEM-S培养基，使细胞逐渐适应完全无血清培养基，从贴壁生长转变为悬浮生长。将悬浮细胞改用摇瓶培养，培养体积逐渐增大，当体积增加至100毫升时转移至WAVE生物反应器(美国GE公司产品)中培养，并逐渐放大培养体积至4升。收获细胞培养上清，离心去除细胞，再以超滤进行浓缩，随后用镍离子金属鳌合层析的方法纯化E蛋白，用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析的方法纯化E-Fc蛋白，每一百毫升培养液中可得到E蛋白35毫克，E-Fc蛋白210毫克。图4为还原型E和E-Fc蛋白(上样缓冲液中含β巯基乙醇，破坏二硫键)的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。两个Fc单体可通过半胱氨酸形成分子间二硫键从而形成二聚体，氧化型(上样缓冲液中不含β巯基乙醇，不破坏二硫键)和还原型(上样缓冲液中含β巯基乙醇，破坏二硫键)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明E-Fc蛋白为二聚体，与预期一致，如图5所示。

实施例6：用E和E-Fc蛋白免疫小鼠和家兔：

分别将重组表达的E和E-Fc蛋白用磷酸盐缓冲液调整浓度至0.25mg/ml，与等体积油/水乳剂型佐剂ISA720(法国Seppic公司产品)充分混匀，室温放置30分钟，然后于皮下多点注射免疫雌性BALB/c小鼠(体重20克)和雄性家兔(体重2.5公斤)，每只小鼠每次免疫剂量折合E或E-Fc蛋白5μg，每只家兔每次免疫剂量折合E或E-Fc蛋白20μg，二周一次，共免疫三次。用同样剂量牛血清白蛋白(美国Sigma公司产品)联合ISA720佐剂免疫小鼠和家兔作为对照。每组小鼠15只，每组家兔10只。

实施例7.小鼠和家兔血清中的抗体检测：

每次免疫前一天(时间分别为0、2、4周，首次采血时间定为0周)以及末次免疫后每隔二周(共7次，时间分别为6、8、10、12、14、16、18周)从小鼠眼眶和家兔耳缘静脉取血，用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠和家兔血清中的E抗体。

E抗体检测：将纯化的E蛋白用磷酸盐稀释至浓度0.05mg/ml，加入酶标微孔板，每孔0.1ml，置于4℃冰箱过夜，次日吸除E蛋白溶液，每孔用0.2ml磷酸盐缓冲液洗一次，然后每孔加入含3％牛血清白蛋白及0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(封闭液)0.1ml，室温放置2小时，然后吸除封闭液，每孔加入用封闭液稀释的小鼠或兔血清0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除血清，用含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(洗液)洗孔5次，然后每孔加入用封闭液稀释的HRP标记的羊抗小鼠或羊抗兔IgG(美国Sigma公司产品)0.1ml，室温放置40分钟，然后吸除抗体，用洗液洗孔5次，每孔加入含TMB的底物液0.1ml，室温避光放置10分钟后，加入2M硫酸和30％过氧化氢溶液各0.05ml，混匀，用酶标仪检测450nm波长的光吸收值，参考波长630nm。相同稀释度下，E及E-Fc蛋白免疫血清光吸收值超过BSA免疫血清平均光吸收值的2.1倍为抗体阳性。

结果：在第一次免疫后二周，E和E-Fc免疫的小鼠血清中E抗体的阳性率(血清以最低稀释度1∶50稀释时的阳性率)分别为70％和100％，E和E-Fc免疫的家兔血清中E抗体的阳性率分别为80％和100％。随后至第18周，E和E-Fc免疫的小鼠和家兔血清中E抗体阳性率均为100％。根据ELISA检测结果(图6、7)，E-Fc蛋白免疫的小鼠和家兔血清中的E抗体抗体水平均高于E蛋白免疫的小鼠和家兔，表明IgG1 Fc段能显著提高E蛋白诱导的抗体应答。

实施例8.检测小鼠脾细胞在体外对E蛋白的特异性反应：

第三次免疫后二周，E蛋白和E-Fc免疫的小鼠各取5只，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取小鼠脾脏，于尼龙网上研磨，然后用淋巴细胞分离液(深圳达科为公司产品)为介质，以梯度离心分离出单个淋巴细胞，悬浮于含15％胎牛血清的RPMI 1640培养液，接种于24孔板培养，每孔培养液1ml，含有10⁵细胞。同时加入重组表达的E蛋白，浓度20μg/ml。于37℃ CO₂孵箱培养，三天后取上清，用ELISA检测上清中的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ，检测试剂为深圳达科为公司产品。

结果：如图8所示，E-Fc融合蛋白免疫的小鼠脾细胞分泌的这三种细胞因子水平都显著高于E蛋白免疫的小鼠脾细胞所分泌的细胞因子，表明与人IgG1Fc段融合能增强E蛋白诱导的细胞免疫应答。

Claims (4)

1.一种融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是在森林脑炎病毒包膜E蛋白的羧基端融合了人抗体IgG1的Fc段，其中编码森林脑炎病毒包膜E蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码人抗体IgG1的Fc段的基因序列如SEQ ID NO：2所不。

2.一种融合蛋白，其特征在于编码该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是通过以下方法得到的：首先构建含有如SEQ ID NO：3所示的基因的表达质粒，然后转染中国仓鼠卵巢细胞，分泌表达该融合蛋白，并分离纯化。

4.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白在制备森林脑炎疫苗中的应用。

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