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CN102212109B - 从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物及其应用 - Google Patents

从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物及其应用 Download PDF

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CN102212109B
CN102212109B CN201110110515A CN201110110515A CN102212109B CN 102212109 B CN102212109 B CN 102212109B CN 201110110515 A CN201110110515 A CN 201110110515A CN 201110110515 A CN201110110515 A CN 201110110515A CN 102212109 B CN102212109 B CN 102212109B
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丛艳
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Abstract

本发明涉及从动物骨提取有效部位后制成的注射剂中分离的骨多肽化合物，具体讲，涉及从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物、以及其制备方法和应用。其中，骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。骨多肽化合物A、B、C、D、E的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。本发明还涉及含有骨多肽化合物的制剂。本发明还涉及所述的骨多肽化合物在制备抗炎、镇痛、促进骨折愈合药物中的应用。经过动物实验及临床试验证实，本发明的骨多肽化合物具有良好的效果。

Description

从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物及其应用
技术领域
本发明涉及从动物骨提取有效部位后制成的注射剂中分离的骨多肽化合物，具体讲，涉及从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物、以及其制备方法和应用。
背景技术
骨肽注射剂是以健康猪或胎牛的四肢骨为原料，经提取、去蛋白、提纯及超滤等工艺制得的注射剂，内含多种成分，具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖、促进新骨形成以及调节钙磷代谢、增加骨钙沉淀等药理作用，临床用于促进骨折愈合，也可用于治疗增生性骨关节疾病及风湿、类风湿关节炎等。目前关于动物骨中提取多肽的研究很多，市场上也出现了很多相关产品。
但目前针对动物骨提取物的产品还都是混合物，其组成成分不确切，随着其临床应用的不断推广，有关其不良反应的报道时有所见。其中包括变态反应、关节痛、血眼血尿、高血钙等。这是由于动物骨提取物的动物来源、工艺条件的细小变化均有可能导致物质基础的变化，而物质基础变化可能会引起不可预测的临床不良反应，因此为保证药品质量稳定，提高临床用药安全性，分离分析动物骨提取物的内在成分非常必要。因而，发明人对由动物骨提取物制得的骨肽注射剂做了进一步的研究，分离其有效成分，为骨肽注射剂的安全用药奠定了基础。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供从骨肽注射剂中分离出来的骨多肽化合物。
本发明的第二发明目的在于提供从骨肽注射剂中分离出来的骨多肽化合物的分离方法。
本发明的第三发明目的在于提供从骨肽注射剂中分离出来的骨多肽化合物的应用。
本发明的第四发明目的在于提供含有从骨肽注射剂中分离出来的骨多肽化合物的注射剂。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A，所述的骨多肽化合物的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。
本发明涉及一种从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物B，所述的骨多肽化合物的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。
本发明涉及一种从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物C，所述的骨多肽化合物的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。
本发明涉及一种从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物D，所述的骨多肽化合物的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。
本发明涉及一种从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物E，所述的骨多肽化合物的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。
其中：
SEQ ID NO：1的氨基酸序列为：Arg-Glu-Asp-Arg-Val-Ala-Tyr-Phe-Phe-Glu-Pro-Arg；
SEQ ID NO：2的氨基酸序列为：Thr-Pro-Leu-Val-Gly-Lys-Thr-Thr-Trp-Pro-Leu-Lys；
SEQ ID NO：3的氨基酸序列为：
Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-Leu；
SEQ ID NO：4的氨基酸序列为：
Lys-Leu-Leu-Gly-Val-Ala-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Arg；
SEQ ID NO：5的氨基酸序列为：Arg-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Gln-Pro-Pro-Arg。
本发明所述的骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D和骨多肽化合物E是由骨肽注射剂经过高效液相色谱分离得到，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液，是由健康猪和/或胎牛的四肢骨经提取、去蛋白、提纯及超滤等工艺制得的骨肽提取物制备而成的制剂。
本发明中采用的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。其中，本发明可采用专利申请200610150890.X中所制备的注射用骨肽及专利申请200610150891.4中所制备的骨肽氯化钠注射液。
其中，在分离骨多肽化合物中，高效液相色谱分离的条件为：C18色谱柱，250mm×50.0mm，5u；流动相A：含0.05％甲酸的水溶液；流动相B：MeCN(乙腈)；流速：1ml/min；柱温：40℃；
梯度洗脱：
Figure BDA0000058517190000021
Figure BDA0000058517190000031
洗脱时间依次为化合物A 13～14分钟，化合物B 15.5～16.5分钟，化合物C 18～19分钟，化合物D 28～29分钟，化合物E 36～37分钟。
本发明还涉及从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A在制备抗炎、镇痛、促进骨折愈合药物中的应用；
从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物B在制备抗炎、镇痛、促进骨折愈合药物中的应用；
从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物C在制备抗炎、镇痛、促进骨折愈合药物中的应用；
从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物D在制备抗炎、镇痛、促进骨折愈合药物中的应用；
从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物E在制备抗炎、镇痛、促进骨折愈合药物中的应用。
本发明还涉及含有骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D、骨多肽化合物E中至少一种的注射剂，所述注射剂包括水针、粉针、输液。其中包括：含有骨多肽化合物A的注射剂，含有骨多肽化合物B的注射剂，含有骨多肽化合物C的注射剂，含有骨多肽化合物D的注射剂，含有骨多肽化合物E的注射剂，含有骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D、骨多肽化合物E中至少两种的注射剂，含有骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D、骨多肽化合物E中至少三种的注射剂，含有骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D、骨多肽化合物E中至少四种的注射剂，含有骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D和骨多肽化合物E的注射剂。
本发明的含有骨多肽化合物的注射剂中还可含有赋形剂，所述的赋形剂选自葡萄糖、甘露醇、左旋糖酐、木糖醇、蔗糖、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖醛酸及盐、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、烟酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇1000-4000、环糊精或其衍生物，但并不限于此；
本发明的含有骨多肽化合物的注射剂中还可含有稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、PH调节剂、等渗调节剂等，所述的抗氧化剂和稳定剂选自亚硫酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、硫代硫酸盐、谷胱甘肽、二硫基丙醇、硫代山梨醇、硫代水杨酸、EDTA、EDTA一钠、EDTA二钠、EDTA四钠等。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的骨多肽化合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明骨多肽化合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001～3mg/Kg体重，优选为0.01～2mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的骨多肽化合物可单独使用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
其中本发明的骨多肽化合物A、B、C、D、E可用于治疗骨折、股骨头坏死、骨愈合不良、骨质疏松、风湿、类风湿性关节炎、颈椎病、腰椎病、跟痛症、骨不连等疾病等疾病，及其辅助治疗。
其中，本发明的动物骨选自新鲜健康的猪骨和/或胎牛骨，还可以选自鹿骨、羊骨等；其中，对健康检疫的要求为：
1.宰前检验：测量体温、观察精神状态，进行细菌学检验、血清学检验和变态反应，选用各项指标均无异常的动物；
2.宰后检验：应符合《肉品卫生检验施行规程》的有关规定。
①肉尸检验：皮肤、脂肪、肌肉、胸膜及腹膜等无异常；剖检浅腹股沟淋巴结及深股沟淋巴结，剖检浅颈淋巴结及深颈淋巴结，都无异常；
②内脏检验：色泽正常，无肿大、出血、充血、炎症、脓肿、结节等病变；
③寄生虫检验：无旋毛虫、囊尾拗、住肉包子虫等寄生虫；
④疫病检疫：无炭疽、鼻疽、口蹄疫、结核病、猪瘟、猪丹毒、猪巴氏杆菌病等疾病；
⑤其他检疫：无脓毒症、尿毒症、急性及慢性中毒、全身性肿瘤、无腐败、过度瘠瘦及肌肉变质、水肿等现象。
同时，本发明中所选用的动物骨新鲜的标准为：宰杀取骨后24小时内使用或者-18℃冻存。
因而，发明人对用动物骨提取物制得的骨肽注射剂做了进一步的研究，分离其有效成分，为骨肽注射剂的安全用药奠定了基础。通过动物实验和临床实验显示，本发明的从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A、B、C、D、E具有良好的治疗效果。
附图说明：
图1为骨肽注射剂的液相分离色谱图；
图2为骨多肽化合物A的质谱分析图谱；
图3为骨多肽化合物B的质谱分析图谱；
图4为骨多肽化合物C的质谱分析图谱；
图5为骨多肽化合物D的质谱分析图谱；
图6为骨多肽化合物E的质谱分析图谱。
本发明的具体实施方式仅限于对本发明的内容进行进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。
具体实施方式
实施例1
本发明所述的骨多肽化合物A、B、C、D、E是由健康猪的四肢骨经提取、去蛋白、提纯及超滤等工艺制得的骨肽提取物后，制成骨肽注射剂，再经过高效液相色谱分离得到；
1.制备骨肽注射剂：
取新鲜冷冻的健康猪四肢骨110kg，用纯化水清洗三遍后，置液压机上压碎，将压碎的四肢骨，置夹层锅中，按原料重量1∶1加入5％NaOH溶液，加热30℃水解12小时后取上清液。上清液置夹层锅中用6M HCl调pH值3.0，加热至70℃40min，冷却降温至30℃，静置12小时后用滤布过滤，取过滤液置夹层锅中用5M NaOH溶液调pH值8.0，加热至70℃40min，冷却降温至30℃，静置12小时后用滤布过滤，得粗滤液，粗滤液置夹层锅中用6M HCl调pH值4.0，按药液量加入0.01％药用活性炭加热至80℃搅拌吸附30min后，冷却降温至30℃，0.45um微孔滤膜过滤除炭，再用0.22um微孔滤膜过滤得精滤液，精滤液用5M NaOH调pH值6.0，药液温度15℃，分别用10000和6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；
收集超滤液，量取，加入赋形剂及适量的注射用水，搅拌使其溶解，加入1％的针用活性炭，80℃搅拌20分钟，过滤至澄明；调节pH值，补加注射用水至全量，微孔滤膜过滤，半检后，灌装；冷冻干燥，条件为先降温至-50～-20℃，维持2～4小时，抽真空，并按1～2℃/小时升温，维持2～4小时，压盖。最后得到骨肽粉针(即注射用骨肽)。
2.高效液相色谱进行分离：
条件为：Agilent SB-Aq C18色谱柱，250mm×50.0mm，5u；流动相A：含0.05％甲酸的水溶液；流动相B：MeCN(乙腈)；流速：1ml/min；柱温：40℃；
采用梯度洗脱：
Figure BDA0000058517190000051
Figure BDA0000058517190000061
洗脱时间依次为化合物A 13～14分钟，化合物B 15.5～16.5分钟，化合物C 18～19分钟，化合物D 28～29分钟，化合物E 36～37分钟。
液相色谱图显示，在此色谱条件下，骨肽注射剂中有5种化合物含量比较高，我们依次分别命名为骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D、骨多肽化合物E。见图1。
3、质谱分析：
将用高效液相色谱法分离得到的5种化合物用电喷雾质谱进行分析，根据质谱分析结果，通过数据识别确认化合物A的氨基酸序列为：Arg-Glu-Asp-Arg-Val-Ala-Tyr-Phe-Phe-Glu-Pro-Arg，其质谱图如图2所示；化合物B的氨基酸序列为：Thr-Pro-Leu-Val-Gly-Lys-Thr-Thr-Trp-Pro-Leu-Lys，其质谱图如图3所示；化合物C的氨基酸序列为：Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-Leu，其质谱图如图4所示；化合物D的氨基酸序列为：Lys-Leu-Leu-Gly-Val-Ala-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Arg，其质谱图如图5所示；化合物E的氨基酸序列为：Arg-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Gln-Pro-Pro-Arg，其质谱图如图6所示。
实施例2
采用新鲜冷冻的健康胎牛四肢骨80kg，采用实施例1的制备方法，经过提取、高效液相色谱分离，得到了5种骨多肽化合物，采用实施例1相同的条件用电喷雾质谱进行分析，得到的5种骨多肽化合物的氨基酸序列分别为：
骨多肽化合物A：Arg-Glu-Asp-Arg-Val-Ala-Tyr-Phe-Phe-Glu-Pro-Arg，其质谱图如图2所示；
骨多肽化合物B：Thr-Pro-Leu-Val-Gly-Lys-Thr-Thr-Trp-Pro-Leu-Lys，其质谱图如图3所示；
骨多肽化合物C：Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-Leu，其质谱图如图4所示；
骨多肽化合物D：Lys-Leu-Leu-Gly-Val-Ala-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Arg，其质谱图如图5所示；
骨多肽化合物E：Arg-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Gln-Pro-Pro-Arg，其质谱图如图6所示。
实施例3
将实施例1制备的骨多肽化合物A25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A的冻干粉针。
将实施例1制备的骨多肽化合物B 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物B的冻干粉针。
将实施例1制备的骨多肽化合物C 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物C的冻干粉针。
将实施例1制备的骨多肽化合物D 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物D的冻干粉针。
将实施例1制备的骨多肽化合物E 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物E的冻干粉针。
实施例4
将实施例2制备的骨多肽化合物A25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物B 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物B的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物C 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物C的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物D 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物D的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物E 25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物E的冻干粉针。
实施例5
将实施例1制备的骨多肽化合物A25克，加注射用水5000ml溶解后，分装成1000支，制备成骨多肽化合物A的水针。
将实施例1制备的骨多肽化合物B 25克，加注射用水5000ml溶解后，分装成1000支，制备成骨多肽化合物B的水针。
将实施例1制备的骨多肽化合物C 25克，加注射用水5000ml溶解后，分装成1000支，制备成骨多肽化合物C的水针。
将实施例1制备的骨多肽化合物D 25克，加注射用水5000ml溶解后，分装成1000支，制备成骨多肽化合物D的水针。
将实施例1制备的骨多肽化合物E 25克，加注射用水5000ml溶解后，分装成1000支，制备成骨多肽化合物E的水针。
实施例6
将实施例1制备的骨多肽化合物A 100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A的氯化钠输液。
将实施例1制备的骨多肽化合物B 100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物B的氯化钠输液。
将实施例1制备的骨多肽化合物C 100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物C的氯化钠输液。
将实施例1制备的骨多肽化合物D 100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物D的氯化钠输液。
将实施例1制备的骨多肽化合物E 100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物E的氯化钠输液。
实施例7
将实施例2制备的骨多肽化合物A100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物B 100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物B的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物C100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物C的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物D100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物D的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物E100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物E的氯化钠输液。
实施例8
将实施例2制备的骨多肽化合物A50克，骨多肽化合物B50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A和B的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A50克，骨多肽化合物C50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A和C的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A50克，骨多肽化合物D50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A和D的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A50克，骨多肽化合物E50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A和E的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物B50克，骨多肽化合物C50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物B和C的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物B50克，骨多肽化合物D50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物B和D的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物B50克，骨多肽化合物E50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物B和E的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物C50克，骨多肽化合物E50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物C和E的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物D50克，骨多肽化合物E50克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物D和E的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A33克，骨多肽化合物B33克，骨多肽化合物C34克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A、B和C的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A33克，骨多肽化合物B33克，骨多肽化合物D34克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A、B和D的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A33克，骨多肽化合物B33克，骨多肽化合物E34克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A、B和E的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物C33克，骨多肽化合物B33克，骨多肽化合物D34克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物C、B和D的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A25克，骨多肽化合物B25克，骨多肽化合物C25克，骨多肽化合物D25克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A、B、C和D的氯化钠输液。
将实施例2制备的骨多肽化合物A20克，骨多肽化合物B20克，骨多肽化合物C20克，骨多肽化合物D20克，骨多肽化合物E20克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成骨多肽化合物A、B、C、D和E的氯化钠输液。
实施例9
将实施例2制备的骨多肽化合物A12.5克，骨多肽化合物B 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A和B的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物A12.5克，骨多肽化合物C 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A和C的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物A12.5克，骨多肽化合物D 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A和D的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物A12.5克，骨多肽化合物E 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A和E的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物B12.5克，骨多肽化合物C 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物B和C的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物B12.5克，骨多肽化合物D12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物B和D的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物B12.5克，骨多肽化合物E 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物B和E的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物E12.5克，骨多肽化合物C 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物C和E的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物D12.5克，骨多肽化合物E 12.5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物D和E的冻干粉针。
将实施例2制备的骨多肽化合物骨多肽化合物A 5克，骨多肽化合物B 5克，骨多肽化合物C 5克，骨多肽化合物D 5克，骨多肽化合物E 5克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨多肽化合物A、B、C、D和E的冻干粉针。
实施例10
对实施例3制备的骨多肽化合物A的粉针进行检测
1、性状：为白色疏松状块状物；
2、鉴别：取骨多肽化合物A的粉针一支，加水2ml溶解，加茚三酮约2mg，加热，溶液显蓝紫色；
3、检查：
(1)酸碱度：取化合物A的粉针，加水制成每1ml中含有化合物A 1mg的溶液，依据中国药典2010年版二部附录VI H，pH值为6.9；
(2)溶液的澄清度与颜色：取骨多肽化合物A的粉针，加水制成每1ml中含有化合物A 5mg的溶液，溶液澄清无色；
(3)干燥失重：取骨多肽化合物A的粉针，在60℃减压真空干燥4小时，减失重量为2.0％；
(4)蛋白质：取骨多肽化合物A的粉针，加水制成每1ml中含有化合物A 5mg的溶液，取1ml，加30％磺基水杨酸溶液1ml，溶液澄清；
(5)高分子量物质：照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定
色谱条件与系统适用性试验用凝胶色谱柱(如TSK GEL 2000SWx1，7.8mm×300mm，5um)；流动相为三氟醋酸-乙腈-水(0.05∶10∶90)；检测波长为214nm。理论板数按胰岛素峰计算应不得低于3000。
对照品溶液的制备称取胰岛素(分子量5800)适量，加水溶解制成每1ml中含1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取骨多肽化合物A的粉针，加水制成每1ml中含有化合物A 1mg的溶液。
测定法取供试品及对照品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，供试品色谱图中先于胰岛素峰保留时间的峰未检出。
(6)异常毒性：取骨多肽化合物A的粉针，加0.9％氯化钠注射液制成每1ml中含有化合物A 5mg的溶液，依照中国药典2010年版二部附录XI C，静脉注射给药，符合规定；
(7)热原：取骨多肽化合物A的粉针，加0.9％氯化钠注射液制成每1ml中含有化合物A 5mg的溶液，依照中国药典2010年版二部附录XI D，静脉注射给药，符合规定；
(8)过敏性实验：取骨多肽化合物A的粉针，加0.9％氯化钠注射液制成每1ml中含有化合物A 5mg的溶液，作为致敏溶液及供试品溶液.取体重250～350g的豚鼠6只，连续三天，间日腹腔注射0.5ml，两周后，在自静脉注射1.0ml，注射15分钟后，均未出现过敏反应。
(9)其他：均符合注射剂项下有关的各项规定(2010年版二部附录I B)
4、含量测定取本品5支，混匀，用水制成每1ml中含有化合物A 5mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取2ml，置于试管中，精密加入双缩脲试液4ml，混匀，室温放置30分钟，照分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)，在540nm的波长处测定吸收度，另精密称取酪蛋白对照品适量，加0.05mol/L氢氧化钠溶液制成每1ml中含7mg的溶液，精密量取2ml，同法操作，测定吸收度，计算，测得含量为24.8mg/支
对实施例3制备的化合物B、C、D、E采用相同的方法检测，得到了相同的结果，各项指标均符合规定。
对其他实施例制备的粉针按照相同的方法检测，得到了相同的结果，各项指标均符合规定。
实验例1药理作用：抗炎活性试验：
1.实验材料：
实验动物：体重200～230g雄性大白鼠70只，随机分成7组，每组10只：
供试药品：实施例3制备的骨多肽化合物A的冻干粉针，骨多肽化合物B的冻干粉针，骨多肽化合物C的冻干粉针，骨多肽化合物D的冻干粉针，骨多肽化合物E的冻干粉针，以及骨肽注射剂。
2.实验分组
共5个给药组
化合物A组：每只腹腔注射化合物A 10mg/kg；
化合物B组：每只腹腔注射化合物B 10mg/kg；
化合物C组：每只腹腔注射化合物C 10mg/kg；
化合物D组：每只腹腔注射化合物D 10mg/kg；
化合物E组：每只腹腔注射化合物E 10mg/kg；
对照组1给等量的生理盐水溶液；
对照组2给等量的实施例1中制备的骨肽注射剂：10mg/kg。
3.实验过程：给药后1小时向大鼠右后足掌皮内注入新鲜蛋清0.1ml，注射后立即测量左侧踝关节周长。在注入蛋清后1、2、3、4、5和6小时各测量一次肿胀的右踝关节周长，左右周长之差为肿胀程度，在各时间内进行统计学比较。
4.实验结果：
数据见表1～5，结果表明在注射蛋清1/2、1、2、4小时后，给药组与对照组比较差异非常显著(p＜0.01)，给药组肿胀程度较对照组显著减轻。通过统计学分析，化合物A组较对照组1相比具有显著性差异，并且化合物A组较对照组2相比也具有显著性差异，同样，化合物B、C、D、E也得到了相同的实验结果，说明本发明的5种化合物具有明显的抗炎活性，并且其活性要高于骨肽注射剂，差异显著。
表1骨多肽化合物A对大鼠蛋清性关节肿的作用
其中，化合物A组VS对照组1：**P＜0.01；化合物A组VS对照组2：ΔP＜0.05。
表2骨多肽化合物B对大鼠蛋清性关节肿的作用
Figure BDA0000058517190000132
其中，化合物B组VS对照组1：**P＜0.01；化合物A组VS对照组2：ΔP＜0.05。
表3骨多肽化合物C对大鼠蛋清性关节肿的作用
Figure BDA0000058517190000133
其中，化合物C组VS对照组1：**P＜0.01；化合物A组VS对照组2：ΔP＜0.05。
表4骨多肽化合物D对大鼠蛋清性关节肿的作用
其中，化合物D组VS对照组1：**P＜0.01；化合物A组VS对照组2：ΔP＜0.05。
表5骨多肽化合物E对大鼠蛋清性关节肿的作用
Figure BDA0000058517190000141
其中，化合物E组VS对照组1：**P＜0.01；化合物A组VS对照组2：ΔP＜0.05。
采用本发明其他实施例制备的制剂进行试验，取得了相同的效果。
实验例2镇痛试验：
采用本领域技术人员公知的热板法分别对本发明的化合物A、B、C、D、E的镇痛作用进行试验。
1.实验材料：
实验动物：体重雌性小白鼠70只，随机分成7组，每组10只：
供试药品：实施例7制备的骨多肽化合物A，骨多肽化合物B，骨多肽化合物C，骨多肽化合物D，骨多肽化合物E，以及实施例1中制备的骨肽注射剂。
2.实验分组
共5个给药组
化合物A组：每只腹腔注射化合物A 10mg/kg；
化合物B组：每只腹腔注射化合物B 10mg/kg；
化合物C组：每只腹腔注射化合物C 10mg/kg；
化合物D组：每只腹腔注射化合物D 10mg/kg；
化合物E组：每只腹腔注射化合物E 10mg/kg；
阳性药组：腹腔注射吗啡10mg/kg；
对照组1给等量的生理盐水溶液；
对照组2给等量的骨肽注射剂：10mg/kg。
3.实验过程：开启超级恒温器，调节超级恒温器温度恒定于55±0.1℃。取雌性小白鼠，于实验前预先挑选合格者。
3.1.将筛选合格的小白鼠分组，测每只小白鼠的正常痛阈值一次，作为该鼠给药前痛阈值。
3.2.分组给药后15min、30min各测小白鼠痛阈一次，如果用药后放入瓷罐内60秒钟仍无反应，即将小白鼠取出，以免时间太长把脚烫伤，其痛阈可按60秒计算。
3.3.实验完毕，计算各给药组的用药前后各次的小鼠热痛反应时间(即痛阈值)的平均值，并按下列公式计算痛阈提高百分率。
Figure BDA0000058517190000151
4.实验结果：实验结果如表6～10所示：通过统计学分析，化合物A组较对照组1相比具有显著性差异，并且化合物A组较对照组2相比也具有显著性差异，同样，化合物B、C、D、E也得到了相同的实验结果，说明本发明的5种化合物具有明显的镇痛作用，并且其活性要高于骨肽注射剂，差异显著。
表6：骨多肽化合物A对热板法致痛小鼠痛阈的影响
Figure BDA0000058517190000152
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表7：骨多肽化合物B对热板法致痛小鼠痛阈的影响
Figure BDA0000058517190000153
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表8：骨多肽化合物C对热板法致痛小鼠痛阈的影响
Figure BDA0000058517190000154
Figure BDA0000058517190000161
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表9：骨多肽化合物D对热板法致痛小鼠痛阈的影响
Figure BDA0000058517190000162
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表10：骨多肽化合物E对热板法致痛小鼠痛阈的影响
Figure BDA0000058517190000163
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
试验结果表明：本发明从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A、B、C、D和E和吗啡组均有镇痛作用，从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A、B、C、D和E与生理盐水组相比差异极显著，与骨肽注射剂相比差异显著。
采用本发明其他实施例制备的制剂进行试验，取得了相同的效果。
实验例3镇痛试验
采用本领域技术人员公知的扭体法分别对本发明的化合物A、B、C、D、E的镇痛作用进行试验。
1.实验材料：
实验动物：体重雌性小白鼠70只，随机分成7组，每组10只：
供试药品：实施例3制备的骨多肽化合物A，骨多肽化合物B，骨多肽化合物C，骨多肽化合物D，骨多肽化合物E，以及实施例1中制备的骨肽注射剂。
2.实验分组
共5个给药组
化合物A组：每只腹腔注射化合物A 10mg/kg；
化合物B组：每只腹腔注射化合物B 10mg/kg；
化合物C组：每只腹腔注射化合物C 10mg/kg；
化合物D组：每只腹腔注射化合物D 10mg/kg；
化合物E组：每只腹腔注射化合物E 10mg/kg；
阳性药组：腹腔注射安痛定0.1mg/kg；
对照组1给等量的生理盐水溶液；
对照组2给等量的实施例1中制备的骨肽注射剂：10mg/kg。
3.实验步骤和结果
将分组动物腹腔注射0.6％的醋酸生理盐水溶液，观察扭体反应。平均安排观察人员，统一扭体标准，得到实验数据如表11～15所示。
表11化合物A对小鼠扭体反应的影响
  组别   动物个数   剂量(mg/kg)   15min扭体次数(x±s)
  阳性对照组：安痛定   10   0.01   2.6±0.9*Δ
  化合物A组   10   10   1.1±1.2**Δ
  对照组1：生理盐水   10   10   14.3±3.1
  对照组2：骨肽注射剂   10   10   2.8±0.3
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表12化合物B对小鼠扭体反应的影响
  组别   动物个数   剂量(mg/kg)   15min扭体次数(x±s)
  阳性对照组：安痛定   10   0.01   2.6±0.9*Δ
  化合物B组   10   10   1.2±1.4**Δ
  对照组1：生理盐水   10   10   14.3±3.1
  对照组2：骨肽注射剂   10   10   2.8±0.3
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表13化合物C对小鼠扭体反应的影响
  组别   动物个数   剂量(mg/kg)   15min扭体次数(x±s)
  阳性对照组：安痛定   10   0.01   2.6±0.9*Δ
  化合物C组   10   10   1.1±1.5**Δ
  对照组1：生理盐水   10   10   14.3±3.1
  对照组2：骨肽注射剂   10   10   2.8±0.3
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表14化合物D对小鼠扭体反应的影响
  组别   动物个数   剂量(mg/kg)   15min扭体次数(x±s)
  阳性对照组：安痛定   10   0.01   2.6±0.9*Δ
  化合物D组   10   10   1.2±1.3**Δ
  对照组1：生理盐水   10   10   14.3±3.1
  对照组2：骨肽注射剂   10   10   2.8±0.3
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
表15化合物E对小鼠扭体反应的影响
  组别   动物个数   剂量(mg/kg)   15min扭体次数(x±s)
  阳性对照组：安痛定   10   0.01   2.6±0.9*Δ
  化合物E组   10   10   1.4±1.1**Δ
  对照组1：生理盐水   10   10   14.3±3.1
  对照组2：骨肽注射剂   10   10   2.8±0.3
注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05
统计结果表明，安痛定组和骨多肽化合物A、B、C、D、E组与对照组1(生理盐水组)比较，数据均有显著差异，说明本发明中的从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A、B、C、D、E均有一定的镇痛作用，并且骨多肽化合物组A、B、C、D、E与骨肽注射剂相比均有显著性差异，说明骨多肽化合物A、B、C、D、E其活性要高于骨肽注射剂。
采用本发明其他实施例制备的制剂进行试验，取得了相同的效果。
实验例4促进骨折愈合试验：
将实验大鼠分为6组(5个实验组，一个对照组)，将其小腿人为造成闭合性人工骨折，每组分别隔天腹腔注射实施例4制备的化合物A、B、C、D、E的制剂，对照组隔天腹腔注射生理盐水，然后分别于给药后的第10天和第20天处死实验大鼠，观察骨折愈合处情况。
结果给药后10天：
生理盐水组：大鼠骨折断端仅有少量纤维成骨，仍可见碎骨片，骨折断端明显不连续；
化合物A组、B组、C组、D组、E组：均可见大量纤维成骨，可见新生骨质；
给药后20天；
生理盐水组：可见中等量纤维成骨，有大量肉芽组织爬行替代骨折断端骨质缺损，但新生骨质不明显；
化合物A组、B组、C组、D组、E组：均可见大量新生骨质，且新生骨质排列规则，骨折线已不可见。
试验结果表明：从骨肽注射剂中分离的化合物A、B、C、D、E：具有明显的促进骨折愈合作用。
采用本发明其他实施例制备的制剂进行试验，取得了相同的效果。
实验例5
用含10％的小牛血清MEM-aa培养液常规培养MG-63细胞，0.05％胰蛋白酶-0.08％EDTA的消化传代培养，消化后收集到的细胞用含10％的小牛血清的MEM-aa培养液调整细胞密度至5×104，接种到96孔细胞培养板，每孔100μL；
其中10孔加含10％的小牛血清的MEM-aa培养液100μL不加细胞作为空白对照，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养过夜，弃培养液，加入实施例4制备的骨多肽化合物A200μL(0.1mg/ml)、骨多肽化合物B 200μL(0.1mg/ml)、骨多肽化合物C 200μL(0.1mg/ml)、骨多肽化合物D 200μL(0.1mg/ml)、骨多肽化合物E 200μL(0.1mg/ml)、实施例1中制备的骨肽注射剂200μL(0.1mg/ml)；每个供试品做10孔(n＝10)；
细胞对照组和空白对照组每孔分别加入MEM-aa培养基200μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，结束培养前4小时，弃培养液，每孔加入0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.3)洗涤两次，每孔加入100μL、0.1％的Triton X-100溶液，放置在-20℃冰箱中反复冻融2次以完全裂解细胞，每孔加入3×10-3mol·L-1对硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)溶液及DEA缓冲液各50μL，于37℃温箱内反应30min后，每孔加入0.2mol·L-1的NaOH 50μL终止反应，于酶标仪405nm处测定OD值。
比较化合物A、B、C、D、E与细胞对照间的统计学差异并按照下列公式计算刺激指数。
公式为：
Figure BDA0000058517190000191
经过计算，各待测药物的刺激指数如表16所示：
表16：
Figure BDA0000058517190000192
Figure BDA0000058517190000201
从实验结果可以看出，本发明的骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D、骨多肽化合物E的刺激指数高于骨肽注射剂。

Claims (5)

1.一种从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A，其特征在于，所述的骨多肽化合物的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述的骨肽注射剂包括粉针、水针和输液。
2.根据权利要求1所述的从骨肽注射剂中分离的骨多肽化合物A，其特征在于，所述的骨肽注射剂是由健康猪和/或胎牛的四肢骨经提取、去蛋白、提纯及超滤工艺制得的骨肽提取物制备而成的制剂。
3.权利要求1所述的骨多肽化合物A在制备抗炎，镇痛，促进骨折愈合药物中的应用。
4.含有权利要求1所述的骨多肽化合物A的注射剂，其特征在于，所述的注射剂包括水针、粉针、输液。
5.根据权利要求4所述的含有骨多肽化合物A的注射剂，其特征在于，所述的注射剂中还含有赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂中的至少一种。
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Assignee: H.H.T WHITE SWAN PHARMACY GROUP Co.,Ltd.

Assignor: Yu Jialin

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Denomination of invention: Bone polypeptide compound separated from ossotide injection and application thereof

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License type: Exclusive License

Record date: 20140422

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Inventor before: Wu Jingjing

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Assignee: H.H.T WHITE SWAN PHARMACY GROUP Co.,Ltd.

Assignor: Yu Jialin

Contract record no.: 2014230000144

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Effective date of registration: 20230105

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Patentee after: Heilongjiang three Yuanyang General Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: 5/F, No. 2, Longshun Street, Nangang District, Harbin, Heilongjiang 150090

Patentee before: Yu Jialin

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