CN102203616A

CN102203616A - 用于预测初次不利事件的生物标志物

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Publication number: CN102203616A
Application number: CN2009801399285A
Authority: CN
Inventors: 安德烈亚斯·贝格曼; 约阿希姆·斯特鲁克; 奥勒·米兰德; 克里斯托弗·牛顿-陈; 托马斯·J·王
Original assignee: BRAHMS GmbH
Current assignee: BRAHMS GmbH
Priority date: 2008-10-07
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2011-09-28
Also published as: JP2012505388A; CN107085114B; ES2795003T3; JP5711131B2; EP2353011A1; US20120003751A1; WO2010040564A1; CN107085114A; EP2353011B1

Abstract

本发明的主题是用于预测初次冠状血管和心血管事件的测定方法和体外方法，以及可用于其中的生物标志物。

Description

用于预测初次不利事件的生物标志物

本发明涉及对象中初次不利事件的预测、诊断测定方法及其应用。

心血管疾病的有效预防依赖于风险个体的准确鉴定，但是心血管事件经常发生在传统风险因子载荷低的个体中(Khot UN等：“冠心病患者中常规风险因子的流行性”(Prevalence ofconventional risk factors in patients with coronary heart disease)，JAMA，2003；290：898-904)。因此，近年来，潜在地使用血液循环中的生物标志物以扩大常规风险评估，吸引了越来越多的注意。然而，当前的研究在生物标志物用于心血管风险预测的功效方面得出不同的结论。一些报告指出，生物标志物例如C反应蛋白(CRP)和N端前B型利尿钠肽(NT-proBNP)有助于风险预测(Ridker PM等：“用于在妇女中评估全面心血管风险的改进算法的开发和验证：Reynolds风险评分”( Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk

许多因素影响生物标志物预测结果的好坏，包括所研究的群体和所选的具体生物标志物。聚焦于老年或高风险群体的研究通常得出生物标志物性能的良好估计(Zethelius B等：“使用多种生物标志物改进心血管疾病引起的死亡的预测”(Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes)，N Engl J Med.2008；358：2107-2116；Blankenberg S等：“在心脏结果预防评估(HOPE)研究中多种生物标志物和N端前脑利尿钠肽在使用常规风险因子预测复发心血管事件的情形下的比较性影响”(Comparative impact of multiple biomarkers and N-Terminal pro-brain natriuretic peptide in the context of conventional risk factors for the prediction of recurrent cardiovascular events in the Heart Outcomes Prevention Evaluation (HOPE)Study.Circulation.2006；114：201-208)，但是对新风险标志物的最大需求存在于低到中风险群体中，对于这些群体来说数据最为冲突(de Lemos JA，Lloyd-Jones DM：“用于心血管风险评估的多种生物标志物组”(Multiple biomarker panels for cardiovascular risk assessment.N Engl J Med.2008；358：2172-2174)。对于用于评估新生物标志物的统计学判据来说，广范接受的是基本关联性度量例如风险比或优势比不足以评估预后功效，但是对于使用何种度量存在争论(Cook NR：“受试者工作特性曲线在风险预测中的使用和误用”(Use and misuse of the receiver operating characteristic curve in risk prediction)，Circulation.2007；115：928-935)。较新的标准评估生物标志物为患者指派临床风险类别的恰当性(Ridker PM等：“用于在妇女中评估全面心血管风险的改进算法的开发和验证：Reynolds风险评分”(Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk in women：the Reynolds Risk Score)，JAMA，2007；297：611-619；Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)，但是只有几项研究引入了这些标准(Zethelius B等：“使用多种生物标志物改进心血管疾病引起的死亡的预测”(Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes)，N Engl J Med.2008；358：2107-2116)。另一个重要的考虑因素是生物标志物的选择。尽管几种生物标志物在针对传统风险因子进行调整后一致地预测了心血管事件(Vasan RS.：“心血管疾病的生物标志物：分子基础和实践考虑”(Biomarkers of cardiovascular disease：molecular basis and practical considerations)，Circulation.2006；113：2335-2362)，但很少有初级预防研究同时引入多种提供信息的生物标志物，而这种方法对于提供增加的信息来说具有最大前景(de Lemos JA，Lloyd-Jones DM：“用于心血管风险评估的多种生物标志物组”(Multiple biomarker panels for cardiovascular risk assessment.N Engl J Med.2008；358：2172-2174)。

肾上腺髓质素(ADM)这种肽，作为一种从人类嗜铬细胞瘤分离的包含52个氨基酸的新的降血压肽，在1993年首次被描述(Kitamura等，(1993)，Biochem.Biophys.Res.Commun.192：553-560)。同年，包含185个氨基酸的前体肽的编码cDNA和该前体肽的完整氨基酸序列也被描述(Kitamura等，(1993)，Biochem.Biophys.Res.Commun.194：720-725)。前体肽特别在N端包含有21个氨基酸的信号序列，被称为“前肾上腺髓质素原”(pre-pro-ADM)。

ADM肽包含pre-pro-ADM的95到146位氨基酸，其由pre-pro-ADM通过蛋白水解切割而形成。在pre-pro-ADM的切割中形成的某些肽片段已进行了详细的表征，特别是生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，后者是包含在pre-pro-ADM中紧随信号肽的21个氨基酸之后的20个氨基酸(22-41位)的肽。另一个未知功能并具有高的离体稳定性的片段是中段肾上腺髓质素原(MR-proADM)(Struck等，(2004)，Peptides 25(8)：1369-72)，对其已开发出一种可靠的定量方法(Morgenthaler等(2005)，Clin.Chem.51(10)：1823-9)。

1993年ADM的发现和定性引发了大量研究活动和无数出版物，它们的结果最近已被总结在多篇综述文章中，在本说明书的情况下，具体来说参考在“Peptides”杂志的ADM专刊(Peptides 22(2001))中发现的文章，特别是(Takahashi(2001)，Peptides 22，1691和Eto(2001)，Peptides 22，1693-1711)。该主题进一步综述在Hinson等的文章中(Hinson等，(2000)，Endocr.Rev.21(2)，138-167)。ADM可以被当作多功能调控肽。它以带有C端甘氨酸的无活性形式释放到循环中(Kitamura等，(1998)，Biochem.Biophys.Res.Commun.244(2)，551-555)。

ADM是有效的血管舒张剂。降血压效应已与ADM的C端部分中的肽区段具体相关联。另一方面，ADM的N端肽序列表现出升血压效应(Kitamura等，(2001)，Peptides 22，1713-1718)。

本发明的主题是用于在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的提高风险的对象的方法，以及测定方法和捕获探针的应用。

本发明的主题是用于在健康对象中预测发生不利事件的风险或鉴定具有发生不利事件的提高风险的健康对象的方法，所述方法包含：

·测定从所述对象获得的样品中肾上腺髓质素原或其片段的水平；以及

·将所述肾上腺髓质素原或其片段的水平单独或与其他预后临床和/或实验室参数联合使用，用于预测初次不利事件或由此推断发生不利事件的风险。

在一个具体实施方案中，这种不利事件可能是初次在该对象中诊断到。在一种情况下，初次事件可能是例如冠状血管事件，这意味着该对象以前没有过冠状血管事件。在本发明的优选实施方案中，预测了发生初次不利事件的风险，并鉴定了具有发生初次不利事件的提高风险的对象。

在本发明的上下文中，术语“肾上腺髓质素原”和术语“肾上腺髓质素原或其片段”是指肾上腺髓质素原的完整分子或其至少12个氨基酸的片段，包括但不限于肾上腺髓质素、PAMP和MR-proADM。在优选实施方案中，肾上腺髓质素原是指肾上腺髓质素原的完整分子或其除了成熟肾上腺髓质素之外的至少12个氨基酸的片段。在其他优选实施方案中，肾上腺髓质素原是指肾上腺髓质素原的完整分子或其除了成熟肾上腺髓质素或成熟肾上腺髓质素的片段之外的至少12个氨基酸的片段。因此，在本发明的一个具体实施方案中，“测定肾上腺髓质素原或其片段的水平”是指测定肾上腺髓质素原或其片段的水平，其中不测定成熟肾上腺髓质素和/或成熟肾上腺髓质素的片段的水平。

肾上腺髓质素的前体肽(前肾上腺髓质素原)的氨基酸序列在图1中给出(SEQ ID NO：1)。肾上腺髓质素原涉及前肾上腺髓质素原序列的22到185位氨基酸残基。肾上腺髓质素原(pro-ADM)的氨基酸序列在图2中给出(SEQ ID NO：2)。pro-ADM的N端20肽(PAMP)涉及pre-pro-ADM的22-41位氨基酸残基。PAMP的氨基酸序列在图3中给出(SEQ ID NO.3)。MR-肾上腺髓质素原(MR-pro-ADM)涉及pre-pro-ADM的45-92位氨基酸残基。MR-pro-ADM的氨基酸序列提供在图4中(SEQ ID NO：4)。成熟肾上腺髓质素(ADM)的氨基酸序列在图5中给出(SEQ ID NO：5)。

在本文中，当在蛋白或肽的上下文中提到时，术语“片段”是指可以从较大蛋白或肽得到的较小蛋白或肽，因此其包含较大蛋白或肽的部分序列。所述片段从较大蛋白或肽通过其一个或多个肽键的皂化作用而产生。

在本发明的文本中，在表述例如“蛋白酶水平”、“被分析物水平”和类似的表述中，术语“水平”是指在相应上下文中提到的分子实体的量，或在酶的情况下它也可以是指酶活性。

不利事件被定义为损害个体健康的事件。

所述不利事件不受限制，但可以选自冠状血管事件、心血管事件、死亡、心力衰竭、糖尿病、高血压。在本发明的文本中，除非另有陈述，否则术语“糖尿病(diabetes)”是指糖尿病(diabetes mellitus)。优选情况下，糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。在本文中，优选情况下初次不利事件是初次冠状血管事件或初次心血管事件。

冠状血管事件被定义为致死或非致死急性冠状血管综合征，包括心肌梗塞或由缺血性心脏病引起的死亡。

心血管事件被定义为致死或非致死急性冠状血管综合征，包括心肌梗塞、致死或非致死中风、或由心血管疾病引起的死亡。

在本发明的优选实施方案中，本发明的方法是用于在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的提高风险的对象的方法，其中所述不利事件是冠状血管或心血管事件，特别优选为冠状血管事件。

在优选实施方案中，所述对象是具有低负荷传统风险因子的对象，所述传统风险因子选自但不限于：吸烟(被定义为在过去一年中的任何吸烟)、糖尿病、高脂血症、高血压、高体重指数(BMI)(即优选情况下所述对象具有低于30、优选低于28、更优选低于27、更优选低于26、最优选低于25的BMI)、男性、抗高血压治疗和年龄(风险随着年龄而增加；优选情况下所述对象的年龄低于55岁、优选低于60岁、更优选低于65岁、更优选低于70岁、最优选低于75岁)。

在另一个优选实施方案中，对于本发明的所有情况来说，所述对象是“健康的”或“表观健康的”。

当在本文中使用时，“健康的”或“表观健康的”是指个体以前不具有或可选地未察觉到具有心血管或冠状血管事件或心力衰竭，并且其不正患有急性传染病。优选情况下，健康的或表观健康的是指个体以前不具有心血管或冠状血管事件或心力衰竭，并且其不正患有急性传染病。

因此，在本发明的优选实施方案中，“健康的”或“表观健康的”对象是以前不具有或可选地未察觉到具有心血管或冠状血管事件的个体。此外，优选情况下，“健康的”或“表观健康的”对象未患有糖尿病和/或高血压。

在特定实施方案中，表观健康的对象可能患有糖尿病、高脂血症和/或高血压。在这种情况下，不利事件可以不选自糖尿病和/或高血压。在一个实施方案中，表观健康的对象正患有糖尿病。在这种情况下，不利事件不是糖尿病。

在另一个实施方案中，健康的对象正患有高血压。在这种情况下，不利事件不是高血压。最优选情况下，表观健康的对象不现实任何疾病的任何症状。

在一个优选实施方案中，不利事件是冠状血管事件，并且“健康的”或“表观健康的”对象可以患有糖尿病、高脂血症和/或高血压。在另一个优选实施方案中，不利事件是心血管事件，并且“健康的”或“表观健康的”对象可以患有糖尿病、高脂血症和/或高血压。

在其他优选实施方案中，不利事件是心血管或冠状血管事件，并且“健康的”或“表观健康的”对象正患有糖尿病。在另一个优选实施方案中，不利事件是心血管或冠状血管事件，并且“健康的”或“表观健康的”对象正患有高血压。

在另一个优选实施方案中，不利事件是心肌梗塞，并且“健康的”或“表观健康的”对象正患有糖尿病、高脂血症和/或高血压。在其他优选实施方案中，不利事件是心肌梗塞，并且“健康的”或“表观健康的”对象不显示任何疾病的任何症状。

在另一个优选实施方案中，不利事件是由缺血性心脏病引起的死亡，并且“健康的”或“表观健康的”对象正患有糖尿病、高脂血症和/或高血压。在其他优选实施方案中，不利事件是缺血性心脏病，并且“健康的”或“表观健康的”对象不显示任何疾病的任何症状。

然而，一般来说，在“健康的”或“表观健康的”对象正患有特定疾病的情况下，本发明的以及如本文中定义的初次不利事件不能是该特定疾病。例如，如果“健康的”或“表观健康的”对象正患有糖尿病，则本文所定义的初次不利事件不是糖尿病。如果表观健康的对象正患有高血压，则本文所定义的初次不利事件不是高血压。

根据本发明，健康的和表观健康的对象的亚组是同一个对象亚组，因为表观健康的人是还未被诊断为具有或已具有涉及所述对象的健康的事件或病症的人，这意味着表观健康的人是被认为是健康的人。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，测定所述肾上腺髓质素原或其片段的水平并将其用作单一标志物。

在本发明的另一个优选实施方案中，对象中初次不利事件的预测或具有发生不利事件的提高风险的对象的鉴定，通过附加地测定和使用实验室参数来改进，所述实验室参数选自：CRP、LpLA2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP的A型与B型利尿钠肽及其前体和片段、甘油三酯、HDL胆固醇或其亚组分、LDL胆固醇或其亚组分、GDF 15、ST2、降钙素原及其片段、血管加压素原及其包括和肽素、血管加压素和神经垂体激素运载蛋白的片段、内皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段。

当在本文中提到时，在CRP、LpLA2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP的A型与B型利尿钠肽及其前体和片段、GDF 15、ST2、降钙素原或其片段、血管加压素原及其包括和肽素、血管加压素和神经垂体激素运载蛋白的片段、内皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段，上下文中，这些术语是指完整分子或其至少12个氨基酸的片段。

术语“附加地测定”不暗示、尽管也不排除这些测定在技术上组合。术语“附加地使用”被定义为参数——它可以是实验室和/或临床参数——的任何类型的数学组合，其为对象经历不利事件的风险或鉴定具有发生不利事件的提高风险的对象进行描述。这种数学组合的一个实例是Cox比例风险分析，从其可以推导出对象经历不利事件的风险，但是也可以使用其他方法。

本发明还包括将个体的标志物水平与预定值进行比较。预定值可以采取各种形式。它可以是单一截止值，例如群体的中位数或平均值或75^th、90^th、95^th或99^th百分位数。它可以根据对比组来建立，例如一个规定组中的风险为另一个规定组中的风险的两倍。它可以是范围，例如将测试群体等量(或不等量)地分组，例如低风险组、中风险组和高风险组，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低风险的个体，最高的四分之一是是具有最高风险的个体。

在所选的特定群体中，预定值可以随着他们的嗜好、种族、遗传等而变化。例如，“健康的”或“表观健康的”非吸烟者群体(没有可检测到的疾病并且没有心血管障碍既往病史)与吸烟群体或其成员以前患有心血管障碍的群体相比，可以具有不同的标志物“正常”范围。因此，所选的预定值可以考虑个体所属类别。本技术领域的普通专业人员可以使用不超出常规的实验来选择适合的范围和类别。

上面提到的标志物的水平可以通过任何本技术领域公认的方法来获得。典型情况下，水平通过测量体液例如血液、淋巴、唾液、尿液等中标志物的水平或活性来测定。水平可以通过免疫测定法或用于测定标志物水平的其他常规技术来测定。公认的方法包括将患者的体液样品送往商业化实验室进行测量，但是也可以在现场进行测量。

标志物的特定组合对于在对象中预测不利事件或鉴定具有发生不利事件的提高风险的对象，似乎特别有价值。

因此，在本发明的一种情况下，只测定并使用下列标志物的水平：proBNP或其具有至少12个氨基酸的片段或前体、CRP、LpLA2与肾上腺髓质素原或其片段的组合。该特定组合似乎特别有价值，其中在对象中预测初次心血管事件，或鉴定具有发生初次心血管事件的提高风险的对象。

可选地或此外，测定到的肾上腺髓质素原或其片段的水平可以与临床参数组合。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的提高风险的对象，通过除了肾上腺髓质素原或其片段之外还测定和使用临床参数来改进，所述临床参数选自：年龄、性别、收缩压、舒张压、抗高血压治疗、体重指数、糖尿病的存在、当前吸烟。

在本发明的另一个优选实施方案中，在对象中预测不利事件或鉴定具有发生不利事件的高风险的对象，通过除了肾上腺髓质素原或其片段之外还测定和使用选自上面提到的临床和实验室参数来改进。

在本发明的方法的另一种情况下，只测定并使用下列标志物的水平：proBNP或其具有至少12个氨基酸的片段或前体与肾上腺髓质素原或其片段的组合。该特定组合似乎特别有价值，其中在对象中预测冠状血管事件，或鉴定具有发生冠状血管事件、特别是初次冠状血管事件的提高风险的对象。

在本发明的方法的特定实施方案中，肾上腺髓质素原或其片段的所述水平的使用，包括将肾上腺髓质素原或其片段的所述水平与阈值水平进行比较，由此，当肾上腺髓质素原或其片段的所述水平超过所述阈值水平时，在对象中预测了心血管事件或初次心血管事件，或鉴定了具有发生(初次)不利事件的提高风险的对象。

这种阈值水平可以从例如Kaplan-Meier分析(图6)来获得，其中所调查群体中冠状血管事件随时间的发生根据群体的MR-proADM四分位数来描述。根据这种分析，所调查群体中具有高于75^th百分位数、即高于0.52nmol/L的MR-proADM水平的对象，具有显著增加的发生初次不利冠状血管事件的风险。该结果得到伴有对经典风险因子进行全面调整的Cox回归分析的支持：MR-proADM最高的四分位(所有对象的MR-proADM水平高于0.52nmol/L)与所有其他对象相比，与发生初次不利冠状血管事件的增加的风险(HR＝1.6 95％CI 1.2-2.2)非常显著地相关。

其他优选的截止值是例如正常群体的90^th、95^th或99^th百分位数。通过使用比75^th百分位数更高的百分位数，人们减少了鉴定到的假阳性对象的数量，但是人们可能错过鉴定具有中等、尽管仍然升高的风险的对象。因此，人们可以根据被认为更加合适的是以也鉴定到“假阳性”为代价而鉴定大多数有风险对象，还是以错过几个具有中等风险的对象为代价而主要鉴定高风险对象，来挑选截止值。

通过使用个体的MR-proADM值和其他预后性实验室和临床参数来计算个体风险的其他数学可能性是例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)。所述指数可以按照Pencina的文献来计算(Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)。

简单来说，NRI(净重新分类指数)(基于按照ATPIII风险算法的CVD风险类型，10年风险＜10、10-＜20和20+％)通过向经典风险因子的模型添加例如MR-proADM，来计算是否人们将事实上具有事件的显著数量的对象移动到更高风险类型，并将没有事件的对象移动到更低风险类型。IDI(综合鉴别指数)功能类似，但是不使用10年风险＜10、10-＜20和20+％的界限，并且代之以计算“全部综合移动”，即添加MR-proADM是否使具有事件的对象在连续风险等级中向上移动，并使不具有事件的对象在连续风险等级中向下移动。

NRI具有临床关联性，当越过20％的“魔力(magical)边界”时，意味着患者应该作为次级预防患者进行治疗，因此意味着需要进行某种治疗(根据心脏病学预防准则)。

因此，本发明还涉及前述权利要求任一项的用于在对象中预测发生不利事件的风险或鉴定具有发生不利事件的提高风险的对象的方法，其中肾上腺髓质素原或其片段的水平单独或与其他可用于预后的实验室或临床参数联合使用，通过可以选自下列可选方案的方法用来预测对象发生不利事件的风险：

·与“健康”或“表观健康”对象群体中全部预定样品中的肾上腺髓质素原或其片段的水平的中位数进行比较，

·与“表观健康”对象群体中全部预定样品中的肾上腺髓质素原或其片段的水平的分位数(例如75^th、90^th、95^th或99^th百分位数)进行比较，

·根据Cox比例风险分析或使用风险指数计算例如NRJ(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。

在本发明方法的优选实施方案中，所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品和尿液样品或任何上面提到的样品的提取物。

在本发明的另一个优选实施方案中，测量MR-proADM的水平。MR-proADM包含Pre-Pro-ADM的第45-92位氨基酸。

在本发明的另一个优选实施方案中，使用诊断测定方法测量肾上腺髓质素原或其片段的水平，所述测定方法使用一个或多个针对位于Pre-pro-ADM的第45-92位中的一个或多个表位的捕获探针。

当在本文中提到时，“测定方法”或“诊断测定方法”可以是在诊断学领域中应用的任何类型的测定方法。这样的测定方法可以基于待检测被分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。对于捕获分子与靶分子或目标靶分子之间的相互作用来说，亲和常数优选大于10⁸M^-1。

在本发明的文本中，“捕获分子”是可用于结合来自样品的目标靶分子、即被分析物的分子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体是否存在等方面适当改形(shaped)，以特异性结合靶分子或目标靶分子。因此，结合可以由例如捕获分子与靶分子或目标靶分子之间的离子、范德华、π-π、δ-π、疏水或氢键相互作用或两种或以上上面提到的相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选情况下，捕获分子是抗体，包括其与目标靶或分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。

优选的检测方法包括各种格式的免疫测定法，例如放射免疫测定法、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法，以及快速检测格式例如免疫层析条样试验。

测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争性夹心测定法。在特别优选的实施方案中，测定法采用夹心测定法形式，其是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量分子与第一抗体并与第二抗体结合。第一抗体可以结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或条上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与被分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”所涉及的通用组合物和步骤是已确立的，并为专业技术人员所公知。(《免疫测定手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006 Feb；10(1)：4-10.PMID：16376134)，在此引为参考。

在特别优选实施方案中，测定方法包含两种捕获分子，优选为都作为分散相存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一种标记组分附着在第一种捕获分子上，其中所述第一种标记组分是基于荧光或化学发光淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二种标记组分附着于第二种捕获分子上，使得当两种捕获分子与被分析物结合后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。

更优选情况下，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青素类型染料的组合。

在本发明的情形中，基于荧光的测定方法包含使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。

在本发明的情形中，基于化学发光的测定方法包含根据化学发光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant编辑，John Wiley&Sons，1993，vol.15，p.518-562中，在此引为参考，包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。

在特别优选实施方案中，使用具有低于0.3nmol/L的检测极限以及在正常范围内＜30％CV的测定间精确度的MR-proADM测定方法，在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的高风险的对象。

本发明的另一个实施方案是使用针对肾上腺髓质素原或其片段的捕获探针、例如抗体，在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的高风险的对象。

在本发明的情形中，特别优选的是使用针对包含在Pre-pro-ADM的第45-92位氨基酸中的表位的一种或多种抗体。

实施例

下面的实施例对本发明进行了更详细的概述，但是不应将其理解为对本发明的主题内容的限制。

方法

研究群体

饮食与癌症(The

Diet and Cancer)(MDC)研究是基于社区的、前瞻性流行病学组群，包含在1991年至1996年间登记的28,449人。从该组群中随机选择6,103人参加MDC心血管组群(MDC Cardiovascular Cohort)，该组群被设计用于调查动脉粥样硬化的流行病学。4,707个对象的心血管风险因子和血浆生物标志物的完整数据可用。将在基线时患有流行的心血管疾病的参加者排除后，在冠状血管事件分析中有4,601位参加者，在所有心血管事件分析中有4,483位参加者。

临床检查和测定法

所有参加者经历了病史、身体检查和标准心血管风险因子的实验室评估。在仰卧位休息10分钟后使用水银血压计测量血压。糖尿病被定义为空腹血糖高于6.0mmol/L、自己报告的糖尿病医生诊断或使用抗糖尿病药物。吸烟由自己提供的调查问卷引出，其中当前吸烟被定义为在过去一年中的任何吸烟。我们在大学医院临床化学科(Department of Clinical Chemistry，University Hospital

)按照标准步骤测量了空腹总胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯。LDL胆固醇按照Friedewald的公式计算。

使用在收集后立即在-80℃下冷冻的空腹血浆样本，评估了所有参加者的心血管生物标志物。C反应蛋白通过高灵敏度测定法测量(Tina-quant CRP，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)。LpPLA2活性使用[3H]-血小板活化因子作为底物进行双份测量(Persson M等：“在中年非糖尿病对象中升高的Lp-PLA2水平为心血管事件发生时的代谢综合征添加了预后信息”(Elevated Lp-PLA2 levels add prognostic information to the metabolic syndrome on incidence of cardiovascular events among middle-aged nondiabetic subjects)，Arterioscler Thromb Vase Biol.2007；27：1411-1416)。MR-proANP和MR-proADM使用靶向相应肽中间区中的氨基酸的免疫发光夹心测定法测量(BRAHMS，AG，Germany)(Morgenthaler NG等：“用于人类血浆中心房利尿钠肽原中间区的免疫发光测定法”(Immunoluminometric assay for the midregion of pro-atrial natriuretic peptide in human plasma)，Clin Chem.2004；50：234-236；Morgenthaler NG等：“使用免疫发光测定法测量血浆中的中段肾上腺髓质素原”(Measurement of midregional proadrenomedullin in plasma with an immunoluminometric assay)，Clin Chem.2005；51：1823-1829)。NT-proBNP使用Dimension RxL N-BNP方法(Dade-Behring，Germany)测定(Di SF等：“Dade Behring Dimension RxL自动化N端proBNP(NT-proBNP)方法的分析评估以及与Roche Elecsys 2010的比较”(Analytical evaluation of the Dade Behring Dimension RxL automated N-Terminal proBNP(NT-proBNP)method and comparison with the Roche Elecsys 2010)，Clin Chem Lab Med.2005；43：1263-1273)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C使用粒子增强的免疫浊度测定法测量(N Latex Cystatin C，Dade Behring，IL)(Shlipak MG等：“半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与老年人中死亡和心血管事件的风险”(Cystatin C and the risk of death and cardiovascular events among elderly persons)，N Engl J Med.2005；352：2049-2060)。

临床终点

我们研究了两种主要结果：冠状血管事件和所有心血管事件。确定结果事件的步骤以前已经详细描述(Rosvall M等：“冠状血管事件的发病率和病例致死率与颈总动脉内膜-中层厚度相关”(Incident coronary events and case fatality in relation to common carotid intima-media thickness)，J Intern Med.2005；257：430-437；Rosvall M等：“中风发病率与即使不存在斑块情况下的颈动脉IMT相关”(Incidence of stroke is related to carotid IMT even in the absence of plaque)，Atherosclerosis.2005；179：325-331)。冠状血管事件被定义为致死或非致死急性冠状血管综合征，包括心肌梗塞或由缺血性心脏病引起的死亡。所有心血管事件被定义为致死或非致死急性冠状血管综合征，包括心肌梗塞、致死或非致死性中风或由心血管疾病引起的死亡。事件通过将每位瑞典公民的10位数个人身份证号与两个登记中心——瑞典医院出院登记中心(Swedish Hospital Discharge Register)和瑞典死亡原因登记中心(Swedish Cause of Death Register)进行联络来鉴定。心肌梗塞分别根据《国际疾病分类》第9和第10修订版(International Classification of Diseases 9^th and 10^th Revisions)(ICD9和ICD10)的代码组410和I21来定义。由缺血性心脏病引起的死亡根据代码组412和414(ICD9)或I22-I23和I25(ICD10)在瑞典死亡原因登记中心中定义。致死或非致死中风使用代码组430、431和434(ICD9)。使用这些登记中心的结果的分类以前已验证过(Engstrom G等：“都市群体中中风发病的地理分布：与社会经济环境和心血管风险因子的流行性的关联”(Geographic distribution of stroke incidence within an urban population：relations to socioeconomic circumstances and prevalence of cardiovascular risk factors)，Stroke.2001；32：1098-1103)。结果的随访延伸到2003年12月31日。

统计分析

具有非正态分布的连续生物标志物变量在分析前进行对数转换。我们执行了多变量Cox比例风险模型，以检测生物标志物与事件发生率之间的关联。我们证实，风险假定的均衡性得到满足。风险比被表示成相应生物标志物的每1SD的增量。每种生物标志物针对每个终点进行单独测试，并对传统风险因子(年龄、性别、收缩压、舒张压、抗高血压疗法的使用、当前吸烟、糖尿病、LDL胆固醇、HDL胆固醇和体重指数)进行调整。接下来，将与结果显示出显著关联性的所有生物标志物包含在逆向剔除模型中，并强制加入传统风险因子。P＜0.05被用作将生物标志物保留在该模型中的标准。

为了评估模型的差别，我们为使用传统风险因子并使用或不使用生物标志物的模型计算c-统计数值。c-统计数值是受试者工作特征曲线下面积的概括(Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)。我们使用10年时冠状血管或心血管事件的发生率作为结果。为了评估风险模型的全局校准，我们为使用或不使用生物标志物的模型计算Hosmer-Lemeshow统计数值。Hosmer-Lemeshow统计数值的不显著的p-值表示在预测的风险十分位数中预测和观察到的事件率之间的良好一致性。

我们还按照以前检建议的方法(Ridker PM等：“用于在妇女中评估全面心血管风险的改进算法的开发和验证：Reynolds风险评分”(Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk in women：the Reynolds Risk Score)，JAMA，2007；297：611-619；Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)，评估了在国家胆固醇教育项目成年人治疗组III(National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III)(ATP3)中生物标志物重新分类风险的能力。根据传统风险因子分值，参加者最初被分类为低、中或高风险，如果他们的预测冠状血管事件10年风险分别＜10％、10％到＜20％或≥20％的话。然后允许使用添加的生物标志物数据将参加者重新分类到不同类别中。我们评估了被重新分类的参加者的数量，也按照(Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)的描述计算了净重新分类指数(NRI)和综合鉴别指数(IDI)。在NRI的计算中，如果个体被重新分类到更高类别并在后来发生冠状血管事件，或者如果他们被重新分类到更低类别并在随访期间保持未发生事件，则认为个体被准确重新分类。IDI是模型性能的类似度量，当风险模型为发生事件的个体指派更高概率并为保持无事件的个体指派更低概率时，模型性能得到改进。与NRI相反，IDI是基于连续概率，因此指数的改进不依赖于扩过风险类别阈值的移动。

所有分析使用Stata软件8.0版(StataCorp)进行，例外的是用于风险假定的均衡性的检验，其使用用于R的存活率包来进行，以及c-统计数值，其使用用于R的ROCR包来产生(www.r-project.org)。如果双边P-值小于0.05，检验被认为是显著的。

结果

研究样品的特征显示在表1中。样品的平均年龄是58岁。

使用单一生物标志物预测心血管事件

在平均10.6年的随访期间，分别在288位和169位参加者中发生了初次心血管和初次冠状血管事件。用于单个生物标志物与心血管事件的关联的Cox比例风险模型的结果显示在表2中。在对传统风险因子进行调整后，6种生物标志物中的5种(NT-proBNP、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、MR-proADM、LpPLA2)是心血管事件发生的显著预测因子。

使用了几种标准来总结向经典风险因子添加单个生物标志物的预后功效(表2)。基于经典风险因子的模型的c-统计数值为0.772，并且添加单个生物标志物导致c-统计数值的少量增加(＜0.005)。模型的校准良好，包含或不包含生物标志物时Hosmer-Lemeshow p-值＞0.05。对于所有生物标志物来说，NRI和IDI都不显著。

使用单一生物标志物预测冠状血管事件

用于冠状血管事件的Cox比例风险模型的结果显示在表3中。当与经典风险因子一起单个加入到模型中时，6种生物标志物中的4种(NT-proBNP、MR-proANP、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、MR-proADM)是冠状血管事件发生的显著预测因子。NT-proBNP和MR-proADM的升高与冠状血管事件的最高风险相关，调整过的风险比每SD增量分别为1.24(95％置信区间，1.07-1.44)和1.25(95％置信区间，1.10-1.42)。

与经典风险因子相结合用于预测冠状血管事件的c-统计数值是0.777。对于心血管事件来说，添加单个生物标志物不显著提高c-统计数值(表3)。包含或不包含生物标志物时模型校准良好(Hosmer-Lemeshow p＞0.05)，并且NRI不显著。对于MR-proADM来说IDI显著(p＝0.02)，对于NT-proBNP来说边界显著(p＝0.05)。

多种生物标志物用于心血管和冠状血管事件

通过将生物标志物成组加入到用于心血管事件和冠状血管事件的预测模型中，测试了生物标志物的组合。然后使用逐步逆向剔除来除去提供信息较少的生物标志物，使用p＜0.05作为保留的标准。保留了三种生物标志物用于预测心血管事件(NT-proBNP、CRP和LpPLA2)，并保留了两种生物标志物用于预测冠状血管事(NT-proBNP和MR-proADM)。用于两种结果的多变量Cox比例风险模型的结果显示在表4中。将显著生物标志物的组掺入到用于心血管和冠状血管事件的预测模型中，导致c-统计数值的少量增加(约0.01)。对于任一种结果来说NRI不显著。另一方面，IDI的p-值对于心血管事件来说为0.06，对于冠状血管事件为0.02。

表5分别显示了使用用于心血管事件(A组)和冠状血管事件(B组)的生物标志物重新分类的参加者的数量。对于心血管事件来说，使用生物标志物将273位参加者(6％)移动到更高或更低风险类别中。只有39位参加者(0.8％)被移动到高风险类别中(10年预测风险≥20％)。对于冠状血管事件来说，137位(3％)参加者被重新分类到更高或更低风险类别中，其中只有22位(0.5％)被移动到高风险类别中。

为每种终点构建了简单生物标志物风险分值。三种生物标志物预测心血管事件的β系数在量值上相似，两种生物标志物预测冠状血管事件的β系数也是如此。因此，我们选择在生物标志物风险打分时对每种生物标志物进行同等权重。对于心血管疾病来说，每位参加者被指派0、1、2或3的分值，对应于升高的生物标志物的数量，升高被定义为水平高于平均值1SD。通过类似方式，对于冠状血管事件来说，每位参加者被指派0、1或2的分值。图6描述了根据生物标志物风险计分值得到的心血管(图A)或冠状血管(图B)事件的累积发生率。

表1：研究样品的特征(n＝4,601)

正态分布数据作为平均值±SD给出，非正态分布变量以中位数(IQR)给出。

表2：单个生物标志物和心血管事件的发生(n＝4,481)

所有风险比表示成生物标志物浓度的每SD增量。多参数Cox比例风险模型对年龄、性别、抗高血压治疗、收缩压、舒张压、体重指数、糖尿病、LDL、HDL和当前吸烟进行了调整。^*在使用经典风险因子和生物标志物的模型中，与单独的经典风险因子相比C-统计数据的增量(C＝0.772)。

在使用经典风险因子和生物标志物的模型中，与单独的经典风险因子相比净重新分类指数(NRI)或综合鉴别指数(IDI)的增加的P-值。CI，置信区间；HR，风险比。

表3：单个生物标志物和冠状血管事件的发生(n＝4,601)

所有风险比表示成生物标志物浓度的每SD增量。多参数Cox比例风险模型对年龄、性别、抗高血压治疗、收缩压、舒张压、体重指数、糖尿病、LDL、HDL和当前吸烟进行了调整。^*在使用经典风险因子和生物标志物的模型中，与单独的经典风险因子相比C-统计数据的增量(C＝0.777)。

在使用经典风险因子和生物标志物的模型中，与单独的经典风险因子相比净重新分类指数(NRI)或综合鉴别指数(IDI)的增加的P-值。CI，置信区间；HR，风险比；NA，未分析。

表4：多个生物标志物和心血管与冠状血管事件的发生

所有风险比表示成生物标志物浓度的每SD增量。多参数Cox比例风险模型对年龄、性别、抗高血压治疗、收缩压、舒张压、体重指数、糖尿病、LDL、HDL和当前吸烟进行了调整。对于每种终点来说，显示的所有生物标志物被一起输入到Cox模型中。^*在使用经典风险因子和生物标志物组的模型中C-统计数据的增量。

在使用经典风险因子和生物标志物组的模型中，与单独的经典风险因子相比净重新分类指数(NRI)或综合鉴别指数(IDI)的增加的P-值。CI，置信区间；HR，风险比。

表5：向传统心血管风险因子添加生物标志物对参加者的重新分类

A组：心血管事件

B组：冠状血管事件

附图说明

图1：肾上腺髓质素(ADM)前体肽(pre-pro-ADM)的氨基酸序列。1-21位氨基酸形成信号肽。22-41位氨基酸形成pro-ADM N-20末端肽(pro-ADM N20)。45-92位氨基酸形成MR-proADM肽。成熟ADM包含95-146位氨基酸。148-185位氨基酸形成pro-ADM C端片段。

图2：肾上腺髓质素原肽(pro-ADM)的氨基酸序列。

图3：肾上腺髓质素原N-端20肽(pro-ADM N20；PAMP)的氨基酸序列。PAMP肽可以具有酰胺化的C-端。

图4：MR肾上腺髓质素原(MR-pro-ADM)的氨基酸序列。

图5：成熟肾上腺髓质素肽(ADM)的氨基酸序列。ADM肽可以具有酰胺化的C-端和/或可以被糖基化。

图6：以MR-proADM四分位数分组的被调查群体的冠状血管事件的Kaplan-Meier作图。

Claims

1.一种用于在健康对象中预测发生不利事件的风险或鉴定具有发生不利事件的提高风险的健康对象的方法，所述方法包含：

·测定从所述对象获得的样品中肾上腺髓质素原或其至少12个氨基酸的片段的水平；以及

·使用所述肾上腺髓质素原或其片段的水平预测初次不利事件或由其推断发生初次不利事件的风险，其中对象是健康的。

2.权利要求1的方法，其中所述不利事件是冠状血管或心血管事件。

3.权利要求1或2的方法，其中对象是具有低负荷传统风险因子的对象，所述传统风险因子选自：吸烟、糖尿病、高脂血症、高血压、高体重指数、男性、抗高血压治疗和年龄。

4.权利要求1到3的方法，其中测定肾上腺髓质素原或其片段的水平并将其用作单一标志物。

5.权利要求1到3的方法，其中对象中初次不利事件的预测或具有发生初次不利事件的提高风险的对象的鉴定，通过附加地测定和使用至少一种其他标志物的水平来改进，所述其他标志物选自：CRP、LpLA2、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP的A型与B型利尿钠肽及其前体和片段、甘油三酯、HDL胆固醇或其亚组分、LDL胆固醇或其亚组分、GDF 15、ST2、降钙素原及其片段、血管加压素原及其包括和肽素、血管加压素和神经垂体激素运载蛋白的片段、内皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段。

6.权利要求5的方法，其中只测定并使用下列标志物的水平：proBNP或其具有至少12个氨基酸的片段或前体、CRP、LpLA2与肾上腺髓质素原或其片段的组合。

7.权利要求6的方法，其中在对象中预测初次心血管事件或鉴定具有发生初次心血管事件的提高风险的对象。

8.权利要求5的方法，其中只测定并使用下列标志物的水平：proBNP或其具有至少12个氨基酸的片段或前体，与肾上腺髓质素原或其至少12个氨基酸的片段的组合。

9.权利要求8的方法，其中在对象中预测初次冠状血管事件或鉴定具有发生初次冠状血管事件的提高风险的对象。

10.权利要求1到9的方法，其中附加地测定选自下列的至少一种临床参数：年龄、性别、收缩压、舒张压、抗高血压治疗、体重指数、糖尿病的存在、当前吸烟。

11.前述权利要求任一项的用于在对象中预测发生不利事件的风险或鉴定具有发生不利事件的提高风险的对象的方法，其中肾上腺髓质素原或其片段的水平单独或与其他可用于预后的实验室或临床参数联合使用，通过可以选自下列可选方案的方法用来预测对象发生不利事件的风险：

与“健康”或“表观健康”对象群体中全部预定样品中的肾上腺髓质素原或其片段的水平的中位数进行比较，

与“健康”或“表观健康”对象群体中全部预定样品中的肾上腺髓质素原或其片段的水平的分位数进行比较，

根据Cox比例风险分析或使用风险指数计算例如NRJ(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。

12.前述权利要求任一项的方法，其中使用诊断测定方法测量MR-proADM的水平，所述诊断测定方法包含一个或多个针对位于Pre-pro-ADM的第45-92位氨基酸中的一个或多个表位的捕获探针。

13.MR-proADM测定方法在对象中预测不利事件或鉴定具有发生不利事件的提高风险的对象中的应用，所述测定方法具有低于0.3nmol/L和/或低于健康对象群体的中位数的检测极限，以及在正常范围内＜30％CV的测定间精确度。

14.针对肾上腺髓质素原或其片段的捕获探针在对象中预测不利事件或鉴定具有发生不利事件的提高风险的对象中的应用。

15.权利要求14的应用，其中捕获探针针对位于Pre-pro-ADM的第45-92位氨基酸中的一个或多个表位。