CN102206638A - 组织特异表达启动子及其获得方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织特异表达启动子及其获得方法和应用。本发明首次通过筛选分离到一些多核苷酸，所述的多核苷酸在与启动子连接后，可指导下游的目的基因特异性地表达在植物的胚、胚乳或种子中，可应用这些多核苷酸来调控植物组织中基因的表达，从而实现植物品种改良。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及组织特异表达启动子及其获得方法和应用。
背景技术
启动子是指基因中一段能准确有效起始基因转录的DNA序列，通常位于基因上游。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子(转录因子)相互作用来调控基因转录的水平及其时空表达的特异性。目前使用最广泛的组成型启动子是烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子。同时，人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子并初见成效，肌动蛋白(Actin)和泛素(Ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。Mariani等成功地利用烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA29驱动核酸酶Barnase、RnaseT1基因在花药中特异表达，破坏绒毡层，获得雄性不育油菜，这是首次通过基因工程创造出雄性不育系。小麦叶中表达ipt基因，提高细胞分裂素含量，可使叶绿素降解减缓，叶衰老变慢。水稻种子中富含谷蛋白(Glutelin)，分析发现GluB，GluD均在种子中特异表达。对GluB启动子区的详细分析还鉴定了决定其表达特异性的GCN4等核心元件。以往已经利用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动八氢番茄红素合酶基因PSY，在水稻胚乳中成功合成了本不存在的β胡萝卜素(维生素A原)；也利用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且促使铁蛋白主要在胚乳中而不是本来的糊粉层积累。然而，目前为止分离得到的水稻种子特异启动子并不多，并集中于谷蛋白基因家族。
传统的获得启动子元件的方法往往存在通量低，针对性差，工作量大等缺点，而随着测序技术的发展，许多植物的全基因组序列已经测序完成，生物芯片技术的进步以及生物信息学分析方法的完善使人们能够从基因组学层面对植物基因的表达模式有一个全面的了解，而不是像以往只能局限于有限的基因。Haberer等通过对拟南芥和油菜基因组水平同源基因启动子区的种间序列分析，利用类似的生物信息学方法得到了384个新的顺式元件，并检测到了大部分的已知转录调控序列的存在，证明了该方法的可行性。而目前，尚未见有基因组层面寻找水稻种子特异启动子(调控序列)或增强子的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供组织特异表达启动子及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6任一所示。
在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于与启动子或启动子片段操作性连接，调控目的基因在植物组织特异性表达；
其中，所述的启动子片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点。
在另一优选例中，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的胚乳中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4任一所示。
在另一优选例中，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的胚中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在另一优选例中，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的种子中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在另一优选例中，所述的植物是具有胚、胚乳和/或种子结构的植物。
在另一优选例中，所述的植物是被子植物；较佳地，所述的植物是单子叶植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。
在本发明的另一方面，提供一种用于调控目的基因在植物组织特异性表达的构建物，所述构建物依次具有如下元件(5’→3’)：(多核苷酸-X)n，启动子或其片段；
其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一所示；
其中，n为1-100的正整数；较佳地，n为1-50的正整数；更佳地为1-30的正整数；如n可以为2，3，4，6，8，10，12，16，20；
其中X为无，或长度在1-100bp；较佳地1-50bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp，更佳地1-5bp，如2、3bp的核酸；
其中，启动子的片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点。
在一个优选例中，所述的启动子或其片段含有TATA-盒结构。
在另一优选例中，所述的启动子选自(但不限于)：烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子，或烟草花叶病毒(CaMV)35S基本启动子(CAMV35S mini promoter)。
在另一优选例中，所述的烟草花叶病毒35S基本启动子具有SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的构建物的启动子或其片段下游还包括一目的基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。
在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述启动子序列的下游，且是与所述的启动子序列直接邻近的编码基因的序列。通常，所述的核酸序列与目的基因序列的间隔小于1000bp(优选的，小于500bp；更优选的，小于200bp；更优选的，小于100bp；最优选的，小于50bp)。
在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)：β-葡萄糖苷酶(GUS)基因、改善稻米或种子品质相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、直链与支链淀粉合成酶基因等)。
在另一优选例中，所述的多核苷酸、启动子、目的基因可操作性地相连。
在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。
在本发明的另一方面，提供一种植物细胞(优选为非繁殖材料)，所述的细胞中含有所述的多核苷酸或所述的构建物。
在本发明的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于调控目的基因在植物组织特异性表达。
在另一优选例中，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4任一所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的胚乳中特异性表达。
在另一优选例中，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的胚中特异性表达。
在另一优选例中，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO：6所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的种子中特异性表达。
在本发明的另一方面，提供一种调控目的基因在植物组织(胚乳、胚或种子中)特异性表达的方法，所述方法包括：
(1)提供一构建物(表达载体)，所述构建物依次具有如下元件(5’→3’)：(多核苷酸-X)n，启动子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6任一所示；n为1-100的正整数；X为无，或长度在1-100bp的核酸；其中启动子的片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点；
(2)将目的基因可操作性地插入到步骤(1)的构建物的下游；
(3)将步骤(2)插入目的基因的构建物转入到植物细胞或组织中；和
(4)将步骤(3)获得的转入了所述多核苷酸的植物细胞或组织再生成植物，从而目的基因在该植物的组织(胚乳、胚或种子)中特异性表达。
在一个优选例中，调控目的基因在植物胚乳中特异性表达，在步骤(1)中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4任一所示。
在另一优选例中，调控目的基因在植物胚中特异性表达，在步骤(1)中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：5任一所示。
在另一优选例中，调控目的基因在植物种子中特异性表达，在步骤(1)中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：6任一所示。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了构建的表达载体的示意图。
图2显示了35S基本启动子不会使GUS在种子中表达。
图3显示了胚乳特异基序(pES1，3，4)的组织特异性表达情况。图片第一行为种子，第二行为花，第三行为叶，第四行为茎，第五行为根。如箭头所示区域为发生GUS染色的区域。
图4胚乳特异基序(pES2)，胚特异基序(pBY1)、种子特异基序(pRS1)的组织特异性表达情况。图片第一行为种子，第二行为叶，第三行为花，第四行为茎，第五行为根。如箭头所示区域为发生GUS染色的区域。
图5显示了顺式作用元件(cis-element)预测的主要流程。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次通过筛选分离到一些指导基因在特定植物组织中特异性表达的多核苷酸(基序)，所述的多核苷酸在与启动子或启动子片段(如基本启动子)连接后，可指导下游的目的基因特异性地表达在植物的胚、胚乳或种子中。因此，可应用这些多核苷酸来调控植物组织中基因的表达，从而实现植物品种改良等。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，除非另外说明，所述的“多核苷酸”或“基序(motif)”是指一条对于调控基因的表达有用的核苷酸序列(序列单位)，其可以作为一种顺式元件，也可以作为一种增强子。
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。所述的“启动子片段”是指具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点的该启动子的片段；也即，该“启动子片段”保留了其相应的启动子的基本功能。较佳地，所述的启动子片段可以是基本启动子或核心启动子。
如本文所用，“顺式调控元件”或“顺式元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的基序和启动子指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于：β-葡萄糖苷酶(GUS)基因、改善植物品质或性状或表型相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、直链与支链淀粉合成酶基因等)、以及种子中激素合成相关基因等。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性”又称“器官特异性”，在一些调控元件的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出其相关的发育调节的特性。本发明中，所述的“组织特异性表达”是指在植物胚乳、胚或种子中特异表达。通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平被表达，则认为相关基因的表达是组织或器官特异性的。
如本文所用，所述的“植物”是具有胚、胚乳结构的植物。本领域人员熟知，植物胚或胚乳的组成成分是相似的，具有胚或胚乳结构的植物具有共同的特性，其基因组中存在许多保守的调控基因转录、表达的基因或调节元件，例如一系列调控植物形成胚或胚乳的元件。因此可以确定：可以调控目的基因在禾本科植物的胚或胚乳或种子中特异性表达的基序(或基序-启动子)也可以调控目的基因在禾本科植物以外其它具有胚或胚乳结构的植物产生同样的表达特性。作为本发明的优选方式，所述的植物是被子植物；较佳地，所述的植物是单子叶植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。
如本文所用，所述的“非繁殖材料”是指一种生物材料，其不具有借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的特性。
本发明提供一种调控目的基因在植物组织特异性表达的基序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一所示。其中，如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4任一所示的基序可驱动目的基因在禾本科植物的胚乳中特异性表达，其核苷酸序列；如SEQ ID NO：5所示的基序可驱动目的基因在禾本科植物的胚中特异性表达，其核苷酸序列；如SEQ ID NO：6所示的基序可驱动目的基因在禾本科植物的种子中特异性表达。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少80％，较佳地至少90％，更佳地至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
“严格条件”或“严紧条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有SEQ ID NO：1-6任一所示基序相同的调控作用。
本发明还包括与本发明的任一种基序序列具有80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO：1-6任一所示基序相同的调控作用。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。
本发明人发现，在所述的基序-启动子的指导下，可以使β-葡萄糖苷酶(GUS)基因特异地在植物的胚乳、胚或种子中表达。因此可见，本发明的基序是一种组织或器官特异性的调控序列。其对于定点地改良植物的品质(通过驱动目的基因特异性表达)是特别有用的。β-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。
本发明的组织特异性表达相关基序在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。这些基序可以被应用于标记特定组织，引导特定的功能基因在特定的组织中表达，以及应用于特有组织的生长发育研究和针对性改良。所述的基序可以是多次重复(如2-100次)的，一般多次重复可以使功能加强，即增强子的效果是可以累加的，增强子序列合在一起，即使其中间插入一些别的序列，转录加强的作用也会大大增强(参见朱玉贤，李毅，郑晓峰；现代分子生物学；高等教育出版社；2007)。通常，多次重复序列中，两个基序之间插入其它序列(间隔序列)的长度在1-100bp，较佳地1-50bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp，更佳地1-5bp，如2、3bp。所述的间隔序列例如是酶切位点等。多次重复序列对于转录作用的加强还可参见陈俊，杨之帆，张文隽；4×35s增强子的克隆及其功能验证；华中科技大学学报(自然科学版)，2006，02，118-121；Wu等亦发现，对于水稻基因Glu-B1的启动子中决定其胚乳表达特异性的GCN4基序，随着人工构建使其重复次数的增多，其驱动的报告基因的表达水平也相应得到增强(Wu CY，Suzuki A，Washida H，Takaiwa F.The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated byOpaque-2in transgenic rice plants.Plant J.1998，14，673-83)。
本发明的基序通常与启动子(如基本启动子)操作性连接，再与目的基因操作性连接，从而驱动目的基因的特异性表达。
所述的启动子或其片段没有特别的限制，只要其含有TATA-盒结构，可引发转录，且在与所述基序连接后对于启动下游基因表达是有用的。所述的TATA-盒结构序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并被本领域广泛应用于启动子研究中。在启动子上，TATA盒一般处于非常接近转录起始点(通常于50个碱基对以内)的位置。
本发明所述的启动子含有TATA-盒结构，如烟草花叶病毒35S基本启动子(CAMV35S mini promoter)。35S基本启动子区主要即TATA-盒结构区，该结构序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在(朱玉贤，李毅，郑晓峰；现代分子生物学；高等教育出版社；2007)，并被广泛应用于启动子研究中，Shen等(Shen H，Yang HJ，Wang ZY.Inducible Expression of OsEBP-89 Gene inRice.Journal Of Plant Physiology and Molecular Biology，2004，30(1)：87-93)，Wu等(Wu CY，Suzuki A，Washida H，Takaiwa F.The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated byOpaque-2 in transgenic rice plants.Plant J.1998，14，673-83；Wu C，Washida H，Onodera Y，Harada K，Takaiwa F.Quantitative nature of the Prolamin-box，ACGTand AACA motifs in a rice glutelin gene promoter：minimal cis-elementrequirements for endosperm-specific gene expression.Plant J.2000，23，415-21)，Yoshihara等(Yoshihara T，Washida H，Takaiwa F.A 45-bp proximal regioncontaining AACA and GCN4 motif is sufficient to confer endosperm-specificexpression of the rice storage protein glutelin gene，GluA-3.FEBS Lett.1996，383，213-8)人在研究中均将不同启动子(增强子)与35S基本启动子融合来启动目的基因的表达。
作为本发明的一个实例，所述的启动子是烟草花叶病毒(CaMV)35S的基本启动子(CAMV35S mini promoter)，其含有TATA-盒结构区，该结构序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并已被广泛应用于启动子研究中。所述的35S的基本启动子的序列如CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG AGAG(SEQID NO：27)。
所述的启动子与基序之间直接相连，或者，它们之间还含有其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列的长度在1-1000bp，较佳地1-500bp，更佳地1-200bp，如100bp，50bp，20bp，10bp。当然，其它长度(如更长)的间隔序列也是可以存在的，只要其存在不影响上述各元件之间的操作性相连，不抑制基因的转录和表达。所述的间隔序列例如是酶切位点或随机序列等。
所述的目的基因相对于基序和启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合适的目的基因包括但不限于：改良植物品质、性状或代谢相关的基因。
所述的基序和启动子还可以与被改进的目的基因序列可操作地连接，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，所述的基序和启动子可以设计成下调特定基因。这一般是通过将基序和启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组构建物(重组载体)中。
作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的基序，在所述的基序的下游包括启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与基序-启动子可操作地连接。
作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的基序-启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。
重组载体中除了含有本发明的基序-启动子，还可含有一种或多种其它基序或启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带基序-启动子和目的基因(可操作地连接)的表达载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、小麦、大麦和玉米。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、表达特异性的基序的初步筛选
本发明取材营养组织(根，叶，苗)，以及不同发育阶段的水稻种子并将其分为胚和胚乳，制作affymatrix芯片。利用该芯片，可以比较准确的分离出在水稻种子中特异表达的基因。本发明人将胚(或者胚乳)作为一个分析元素，将营养组织作为另一个分析元素，找出相对营养组织特异表达(显著高表达)的基因，对其进行非监督聚类，得到表达模式相近的基因组，对每一组基因启动子区进行比对(根据基序的相似性，所处位置，以及gibbs能量等原则)，获得候选的可能决定了基因表达特异性的基序(motif，可能为顺式元件，也可能属增强子)。对这部分候选基序本发明人要进行二次过滤筛选。首先，计算候选基序在整个基因组范围内以及在种子特异表达基因中的超几何分布，检验其是否高度集中在种子特异高表达的基因里，选出有显著差异的基序作后续分析；其次，根据第一次筛选的结果，将其与PLACE(Plant cis-acting Regulatory DNAElements)和AGRIS(The Arabidopsis Gene Regulatory Information Server)数据库中已知植物顺式元件相比对，去掉已知元件，得到的成员即为最后的计算结果，用于下一步实验验证。顺式作用元件预测的主要流程见图5。
过滤筛选前得到结果中，包含有大部分已知的水稻胚或胚乳特异顺式元件，超几何分布差异分析表明其在种子特异表达基因中显著密集(p＜0.05)，证明了本计算方法的可行性。另外根据对PLACE和AGRIS中已知元件长度的统计，本发明人选取分析的基序长度处于6～31bp范围内。
最终，计算得出胚乳特异基序13个，胚特异基序18个，见表1。
表1、p＜0.05且在数据库中没有匹配序列的基序
胚(pBY)和种子(pRS)
| motif01 | GGCCTGG | 0.04924 | SEQ ID NO：5 |
| motif02 | AACCCTAG | 0.019805 | SEQ ID NO：28 |
| motif03 | TAGACTG | 0.000184 | SEQ ID NO：29 |
| motif04 | AGCTAGC | 0.006183 | SEQ ID NO：30 |
| motif05 | CGTCCGAT | 0.025469 | SEQ ID NO：31 |
| motif06 | TACATACA | 0.043309 | SEQ ID NO：32 |
| motif07 | GTGCGTGCG | 0.042511 | SEQ ID NO：33 |
| motif08 | AATAAGACGAATGGTC | 0.018682 | SEQ ID NO：34 |
| motif09 | TGTAATTACA | 0.012906 | SEQ ID NO：35 |
| motif10 | TAAGCCTAATT | 0.003255 | SEQ ID NO：36 |
| motif11 | TAATAGCTAA | 1.14E-06 | SEQ ID NO：37 |
| motif12 | CTGGTCTGACCGGC | 2.06E-19 | SEQ ID NO：38 |
| motif13 | GAAACGGAGGGAGTA | 0.048481 | SEQ ID NO：39 |
| motif14 | GTCCGTGCTGCAGCTGGCTACAA | 0.007973 | SEQ ID NO：6 |
| motif15 | CGCACGCA | 0.003825 | SEQ ID NO：40 |
| motif16 | ACGAATGAT | 1.98E-05 | SEQ ID NO：41 |
| motif17 | GCTCGA | 0.009138 | SEQ ID NO：42 |
| motif18 | GTCCTTGCC | 1.91E-09 | SEQ ID NO：43 |
胚乳(pES)
| motif01 | CTACCT | 0.002866 | SEQ ID NO：44 |
| motif02 | GCTGTA | 0.000468 | SEQ ID NO：1 |
| motif03 | CGCTCGC | 0.006339 | SEQ ID NO：45 |
| motif04 | GCATGCGC | 0.013418 | SEQ ID NO：46 |
| motif05 | CGATTCGT | 0.035906 | SEQ ID NO：47 |
| motif06 | AGGGGAGGG | 0.0001 | SEQ ID NO：2 |
| motif07 | TGTGTGTGTG | 0.032963 | SEQ ID NO：48 |
| motif08 | CCTCCTCCTCCTC | 0.021831 | SEQ ID NO：49 |
| motif09 | TCGGACTATCTGA | 0.00642 | SEQ ID NO：50 |
| motif10 | ATATATATATATATAT | 0.022662 | SEQ ID NO：51 |
| motif11 | ACCTGATAGGTATCAT | 0.004162 | SEQ ID NO：52 |
| motif12 | TCACAAAACTACAGATTTA | 0.000129 | SEQ ID NO：3 |
| motif13 | TAGGCTTAAAAGATTCGTCTCGC | 0.00072 | SEQ ID NO：4 |
实施例2、表达实验确定表达特异性的基序
分别构建4重复序列启动GUS表达，完成载体构建和植物转化，通过检测报告基因GUS的在水稻中的表达部位及相应的表达量来检测基序对基因时空表达特异性的决定作用。
转化水稻的质粒构建按照以下思路：将上述基序构建4次重复序列，后接烟草花叶病毒35S的基本启动子，再与报告基因GUS相连(如图1所示)。通过报告基因表达部位的检测，反映基序对基因表达的决定作用。
共筛选到4个胚乳特异基序(pES1～4)、1个胚特异基序(pBY1)、1个种子特异基序(pRS1)如下：
pES1：GCTGTA(SEQ ID NO：1)；
pES2：AGGGGAGGG(SEQ ID NO：2)；
pES3：TCACAAAACTACAGATTTA(SEQ ID NO：3)；
pES4：TAGGCTTAAAAGATTCGTCTCGC(SEQ ID NO：4)；
pBY1：GGCCTGG(SEQ ID NO：5)；
pRS1：GTCCGTGCTGCAGCTGGCTACAA(SEQ ID NO：6)。
所用材料：
pCAMBIA1300+pBI101质粒由pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司)改造而成，具体改造方法如下：将pBI101(购自Clontech公司)的GUS-NOS编码区以HindIII/EcoRI切出，连入pCAMBIA1300对应酶切位点中。改造后的载体具Kan抗性(菌株)和Hyg抗性(植株)，用于构建启动子驱动的GUS报告基因载体，研究基因启动子的表达模式。
合成以下DNA序列(DNA oligo)：
35S基本启动子：
正向(SEQ ID NO：7)：
CTAGACGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACCC
负向(SEQ ID NO：8)：
GGGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGT
pES1：
正向(SEQ ID NO：9)：agcttGCTGTAtcgaGCTGTAtcgaGCTGTAtcgaGCTGTA
负向(S EQ ID NO：10)：ctagTACAGCTCGATACAGCTCGATACAGCTCGATACAGCa
pES2：
正向(S EQ ID NO：11)：agctt AGGGGAGGG tcga AGGGGAGGG tcga AGGGGAGGGtcga AGGGGAGGG
负向(SEQ ID NO：12)：
ctag CCCTCCCCTTCGACCCTCCCCTTCGACCCTCCCCTTCGACCCTCCCCT a
pES3-1：
正向(SEQ ID NO：13)：
g TCACAAAACTACAGATTTA tcga TCACAAAACTACAGATTTA
负向(SEQ ID NO：14)：
ctag TAAATCTGTAGTTTTGTGATCGATAAATCTGTAGTTTTGTGA ctgca
pES3-2：
正向(SEQ ID NO：15)：
Agctt TCACAAAACTACAGATTTA tcga TCACAAAACTACAGATTTA tgca
负向(SEQ ID NO：16)：TAAATCTGTAGTTTTGTGATCGATAAATCTGTAGTTTTGTGAa
pES4-1：
正向(SEQ ID NO：17)：
g TAGGCTTAAAAGATTCGTCTCGC tcga TAGGCTTAAAAGATTCGTCTCGC
负向(SEQ ID NO：18)：
Ctag GCGAGACGAATCTTTTAAGCCTATCGAGCGAGACGAATCTTTTAAGCCTA ctgca
pES4-2：
正向(SEQ ID NO：19)：
Agctt TAGGCTTAAAAGATTCGTCTCGC tcga TAGGCTTAAAAGATTCGTCTCGC tgca
负向(SEQ ID NO：20)：
GCGAGACGAATCTTTTAAGCCTATCGAGCGAGACGAATCTTTTAAGCCTA a
pBY1：
正向(SEQ ID NO：21)：
agctt GGCCTGG tcga GGCCTGG tcga GGCCTGG tcga GGCCTGG
负向(SEQ ID NO：22)：
ctag CCAGGCCTCGACCAGGCCTCGACCAGGCCTCGACCAGGCC a
pRS1-1：
正向(SEQ ID NO：23)：
g GTCCGTGCTGCAGCTGGCTACAA TCGA GTCCGTGCTGCAGCTGGCTACAA
负向(SEQ ID NO：24)：
ctag TTGTAGCCAGCTGCAGCACGGACTCGATTGTAGCCAGCTGCAGCACGGAC ctgca
pRS1-2：
正向(SEQ ID NO：25)：
agctt GTCCGTGCTGCAGCTGGCTACAA TCGA GTCCGTGCTGCAGCTGGCTACAA tgca
负向(SEQ ID NO：26)：
TTGTAGCCAGCTGCAGCACGGACTCGATTGTAGCCAGCTGCAGCACGGAC a
每一组正负向DNA退火形成双链结构。建立的体系如下：
| 去核酸酶的水 | 50μl |
| DNA Oligos的退火缓冲液(5×) | 10μl |
| DNA oligo A(50μM) | 20μl |
| DNA oligo B(50μM) | 20μl |
| 总体积 | 100μl |
其中，退火缓冲液：1M NaCl；100mM Tris-HCl，pH 7.4。
把待退火的DNA oligo用经灭菌的MiliQ水或重蒸水配制成50μM。溶解DNA Oligos的退火缓冲液(10X)，混匀备用。
按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。如果所用的PCR仪没有热盖，滴加矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
如下设置PCR仪进行退火反应：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 说明 |
| 1 | 95℃ | 2分钟 | 让oligo充分变性 |
| 2 | 每8秒下降O.1℃，降至25℃(注1) | 约90分钟 | 退火 |
| 3 | 4℃ | 长时间保持 | 存放 |
注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。
退火结束后可以直接用于连接反应，也可以在-20℃冻存备用。如果退火结束后打算进行酶切等其它反应，最好用纯化试剂盒进行纯化，或者确保退火产物在反应体系中体积不超过5％，以避免退火缓冲液对后续的酶反应体系的干扰。
对pCAMBIA1300+pBI101质粒以XbaI/SmaI双酶切，将烟草花叶病毒(CaMV)35S的基本启动子连接进入，构建成pCAMV46-GUS质粒。
对pCAMV46-GUS质粒以HindIII/SmaI双酶切，对pES1、pES2、pBY1，将褪火片段与线性化质粒连接；对pES3、pES4、pRS1，两段褪火片段经末端磷酸化混匀后同时与线性化质粒做连接反应。完成pX-CAMV46-GUS构建。
质粒构建完成后，利用农杆菌EHA105(参见Hood，E.E.等，1993，NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgen.Res.2：208-218)侵染转化的方法，转化水稻品种中花11；以转化pCAMV46-GUS质粒的植株作为对照。对T1代转化植株通过染色方法检测报告基因GUS在各组织中的表达，此处取种子、小花、叶片为代表。
GUS基因表达检测方法：
试剂：Gus底物X-GlucA(X-glucronide，B-6650，Sigma公司)用二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，配成5mg/ml的母液，-20℃保存。反应缓冲液：100mmol/L。
NaH2PO4/Na2HPO4(PH 7.0)，O.5mmol/L K3[Fe(CN)6]，0.5mmol/LK4[Fe(CN)4]，10mmol/L EDTA。
Gus基因表达分析：
取转基因水稻植株叶片放入含X-Gluc(终浓度为0.5mg/ml)底物的缓冲液中，抽气使其下沉后于37℃保温两小时。用95％乙醇在60℃快速脱色后观察GUS染色情况，显蓝色为阳性。结果如图2-4。
转化pCAMV46-GUS质粒的植株的GUS染色情况如图2所示，可见35S基本启动子不会使GUS在种子中表达。
胚乳特异基序(pES1，3，4)的组织特异性表达情况如图3所示，胚乳特异基序(pES2)的组织特异性表达情况如图4所示。图片第一行为种子，第二行为花，第三行为叶，第四行为茎，第五行为根。如箭头所示区域为发生GUS染色的区域，可见GUS特异性在胚乳中表达。
胚特异基序(pBY1)的组织特异性表达情况如图4所示。图片第一行为种子，第二行为花，第三行为叶，第四行为茎，第五行为根。如箭头所示区域为发生GUS染色的区域，可见GUS特异性在胚中表达。
种子特异基序(pRS1)的组织特异性表达情况如图4所示。图片第一行为种子，第二行为花，第三行为叶，第四行为茎，第五行为根。如箭头所示区域为发生GUS染色的区域，可见GUS特异性在种子中表达。
综上，pES1～4驱动基因在胚乳中表达，pBY1驱动基因在胚中表达，pRS1驱动基因在种子中表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>组织特异表达启动子及其获得方法和应用
<130>100416
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>6
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>1
gctgta 6
<210>2
<211>9
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>2
aggggaggg 9
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>3
tcacaaaact acagattta 19
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>4
taggcttaaa agattcgtct cgc 23
<210>5
<211>7
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>5
ggcctgg 7
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>6
gtccgtgctg cagctggcta caa 23
<210>7
<211>56
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>7
ctagacgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggaccc 56
<210>8
<211>52
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>8
gggtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gt 52
<210>9
<211>41
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>9
agcttgctgt atcgagctgt atcgagctgt atcgagctgt a 41
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>多核苷酸
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ctagtacagc tcgatacagc tcgatacagc tcgatacagc a 41
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<211>53
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>11
agcttagggg agggtcgaag gggagggtcg aaggggaggg tcgaagggga ggg 53
<210>12
<211>53
<212>DNA
<213>多核苷酸
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ctagccctcc ccttcgaccc tccccttcga ccctcccctt cgaccctccc cta 53
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gtcacaaaac tacagattta tcgatcacaa aactacagat tta 43
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<211>51
<212>DNA
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ctagtaaatc tgtagttttg tgatcgataa atctgtagtt ttgtgactgc a 51
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<211>51
<212>DNA
<213>多核苷酸
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agctttcaca aaactacaga tttatcgatc acaaaactac agatttatgc a 51
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taaatctgta gttttgtgat cgataaatct gtagttttgt gaa 43
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<213>多核苷酸
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ctagccaggc ctcgaccagg cctcgaccag gcctcgacca ggcca 45
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ggtccgtgct gcagctggct acaatcgagt ccgtgctgca gctggctaca a 51
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ctagttgtag ccagctgcag cacggactcg attgtagcca gctgcagcac ggacctgca 59
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agcttgtccg tgctgcagct ggctacaatc gagtccgtgc tgcagctggc tacaatgca 59
<210>26
<211>51
<212>DNA
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<400>26
ttgtagccag ctgcagcacg gactcgattg tagccagctg cagcacggac a 51
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<400>29
tagactg 7
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<211>7
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>30
agctagc 7
<210>31
<211>8
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>31
cgtccgat 8
<210>32
<211>8
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>32
tacataca 8
<210>33
<211>9
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>33
gtgcgtgcg 9
<210>34
<211>16
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>34
aataagacga atggtc 16
<210>35
<211>10
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>35
tgtaattaca 10
<210>36
<211>11
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>36
taagcctaat t 11
<210>37
<211>10
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>37
taatagctaa 10
<210>38
<211>14
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>38
ctggtctgac cggc 14
<210>39
<211>15
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>39
gaaacggagg gagta 15
<210>40
<211>8
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>40
cgcacgca 8
<210>41
<211>9
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>41
acgaatgat 9
<210>42
<211>6
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>42
gctcga 6
<210>43
<211>9
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>43
gtccttgcc 9
<210>44
<211>6
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>44
ctacct 6
<210>45
<211>7
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>45
cgctcgc 7
<210>46
<211>8
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>46
gcatgcgc 8
<210>47
<211>8
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>47
cgattcgt 8
<210>48
<211>10
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>48
tgtgtgtgtg 10
<210>49
<211>13
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>49
cctcctcctc ctc 13
<210>50
<211>13
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>50
tcggactatc tga 13
<210>51
<211>16
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>51
atatatatat atatat 16
<210>52
<211>16
<212>DNA
<213>多核苷酸
<400>52
acctgatagg tatcat 16
Claims (17)
1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一所示。
2.权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于与启动子或启动子片段操作性连接，调控目的基因在植物组织特异性表达；
其中，所述的启动子片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的胚乳中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4任一所示。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的胚中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的种子中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.一种构建物，其特征在于，所述构建物依次具有如下元件(5’→3’)：(多核苷酸-X)n，启动子或其片段；
其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一所示；
其中，n为1-100的正整数；
其中，X为无，或长度在1-100bp的核酸；
其中，启动子的片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点。
7.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的启动子或其片段含有TATA-盒结构。
8.如权利要求6或7所述的构建物，其特征在于，所述的启动子或启动子片段选自：烟草花叶病毒35S启动子，或烟草花叶病毒35S基本启动子。
9.如权利要求8所述的构建物，其特征在于，所述的烟草花叶病毒35S基本启动子具有SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列。
10.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的构建物的启动子或其片段下游还包括一目的基因。
11.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的构建物是表达载体。
12.一种植物细胞，其特征在于，所述的细胞中含有权利要求1所述的多核苷酸或权利要求6-11任一所述的构建物。
13.权利要求6-11任一所述的构建物的用途，用于调控目的基因在植物组织特异性表达。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4任一所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的胚乳中特异性表达。
15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的胚中特异性表达。
16.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的种子中特异性表达。
17.一种调控目的基因在植物组织特异性表达的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供一构建物，所述构建物依次具有如下元件(5’→3’)：(多核苷酸-X)n，启动子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一所示；n为1-100的正整数；X为无，或长度在1-100bp的核酸；其中启动子的片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点；
(2)将目的基因可操作性地插入到步骤(1)的构建物的下游；
(3)将步骤(2)插入目的基因的构建物转入到植物细胞或组织中；和
(4)将步骤(3)获得的转入了所述多核苷酸的植物细胞或组织再生成植物，从而目的基因在该植物的组织中特异性表达。
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