CN102206611B

CN102206611B - 一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法

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Publication number: CN102206611B
Application number: CN201110107432A
Authority: CN
Inventors: 郑月茂; 贺小英; 刘军; 郑艳玲; 赵晓娥; 张涌
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2031-04-27
Also published as: CN102206611A

Abstract

本发明公开了一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，首先分离到羊水细胞，然后再在羊水细胞中添加分离培养基，分离得到的神经干细胞生长形成神经球，将其消化分离为单细胞后进行传代培养。本发明提供的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养神经干细胞的新途径，应用本发明方法从羊水中分离培养神经干细胞成功率高。所分离到的羊水源性神经干细胞在体外诱导后分化为星形胶质细胞和神经元细胞等功能细胞；所分离到的羊水源性神经干细胞具有可行性和有效性，具有自我更新、增殖和分化潜能。

Description

一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明属于神经干细胞技术领域，涉及一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法。

背景技术

神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)是指一类具有自我复制更新能力，高度增殖和多种分化潜能的细胞，由于它在研究神经系统发育、分化以及治疗神经系统疾病中具有重要的作用，所以备受关注。Anderson D J等首先提出了神经干细胞的概念，并通过试验首先证实神经干细胞的存在，随后Cattaneo、Reynolds等分别在Science及Nature上刊登了有关神经干细胞的发现及其有关特性的论著。神经干细胞的发现，是神经科学的重大发展，标志着多年来“中枢神经细胞不可再生”理论的结束，对神经系统的损伤修复、退行性疾病的治疗以及深入研究动物的生长发育和分化具有重要意义。

神经干细胞的发现是神经系统疾病治疗的一个里程碑，大部分神经缺损是由于疾病或损伤而使神经系统中的某些类型细胞的数目减少所致，而这些细胞又不能自我修复，如神经退行性疾病(帕金森病)和脱髓鞘疾病。由于神经干细胞特有的生物学特性是既在体外的可持续增殖，又具有多分化的潜能，给人类多年来一直未能解决的使损伤或病变的中枢神经组织恢复相应功能的治疗难题提供了可能的途径。Flax J D等从人胎儿全脑分离出神经干细胞并成功的灌注入发育中的小鼠大脑后，细胞能存活、迁移，毫无接缝地与宿主大脑组织连为一体并产生3种基本的神经细胞，这些被灌注的细胞还能替补小鼠小脑神经元退行性变性神经元缺陷。

迄今为止，国内外的神经科学工作者已经使用神经干细胞移植技术对脑缺血性疾病、脑出血性疾病、中枢神经系统创伤、中枢神经系统慢性退变性疾病(帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病)以及中枢神经系统肿瘤等进行动物治疗试验，展示了十分诱人的临床应用前景。脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是临床治疗的世界性难题。SCI治疗的难点是如何使缺损的神经元再生及如何恢复功能性轴突的传导功能。神经干细胞因具备自我更新和多分化潜能的两个基本特性以及迁移功能和良好的组织融合性的优点，而成为细胞移植治疗神经系统疾病良好的移植材料，为SCI的治疗提供了新的方法。

但是，神经干细胞的研究、应用、相关技术的发展还受到干细胞来源的影响，大部分神经干细胞由胚胎干细胞培养分化而来。胚胎干细胞有两种分离方法，其一由体外受精治疗不孕症患者提供的临床需要之余的早期胚胎，其二来自终止妊娠的死亡胎儿。采用该类来源的神经干细胞进行研究是否有伦理问题，一直争论不休，且胚胎来源非常有限。另外，干细胞在动物实验及临床观察时，均发现移植细胞存活时间较短、存活率不高、治疗效果不确切等缺陷，帕金森病患者接受移植后数年内症状出现反复。因而，需要对神经干细胞的来源进行更为广泛和深入的研究，以期在较短时间内取得突破性进展。

各种干细胞的发育年龄是不一样的，发育年龄越早的干细胞发育方向越多，增殖能力越强。成体干细胞发育的多向性和增殖能力都远远不如胚胎干细胞。由于胚胎干细胞来源少以及伦理上的限制，研究者希望能够找到成体干细胞中发育年龄尽可能早的干细胞，或者说更接近于胚胎干细胞的成体干细胞。胎儿在母体中进行新陈代谢，脱落的细胞存在于羊水中，这些细胞中就有可能存在干细胞，而这种干细胞的发育年龄要比脐带血和胎盘更早。研究发现，羊水细胞中含有多种干细胞的标记物，且在体外通过诱导能够分化成多种不同类型的细胞，这使羊水来源干细胞成为干细胞研究的一个新的热点。从羊水中获得的羊水干细胞的分化能力仅次于胚胎干细胞的发育的多向性和增殖能力。

羊水干细胞(Amniotic Fluid-derived Stem Cells，AFS细胞)是干细胞一个新的来源，它不仅容易获取，而且避开了伦理学争议，同时具有很大的治疗性应用前景。2006年11月，瑞士苏黎世大学西蒙·赫斯特鲁普博士在美国心脏协会会议上曾宣称，他已成功利用羊水干细胞培育出心瓣膜细胞。2007年1月7日，美国Atala等人于《Nature Biotechnology》上发表文章宣称，他们从人羊水中提取的干细胞含有大量与胚胎干细胞相同的成分，它们比成体干细胞生长的速度更快，并且具有更高的分化度，可以培育成各种组织，如大脑、肝脏和骨骼等。2007年，朱哲等人发表文章报道，他们采用免疫磁珠细胞分选法去除羊水细胞中CD44和SSEA4阳性细胞，使Oct4阳性胎儿干细胞间接得到分离。2008年王晗等人报道，他们分离培养的羊水干细胞表达Oct4等胚胎干细胞和CD29等成体干细胞的特异基因，细胞生长迅速，增殖能力较强，并可分化为Nestin阳性的神经细胞和α-actin阳性的心肌细胞。目前已经证实，羊水中包含许多已分化和未分化状态的细胞，间充质干细胞等多能干细胞存在于羊水中，羊水细胞还表达神经干细胞的表面标记和端粒酶及Oct4等多能干细胞的表面标记。可以采用单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等分离培养羊水干细胞。

羊水来源的干细胞具有多向分化能力，羊水作为干细胞的一个新来源，将为干细胞研究揭开一个新的研究领域，为组织工程提供新的种子细胞来源。但是，羊水来源干细胞的研究尚处于初始阶段，它的许多生物学特性还不清楚。迄今为止，未见有关于羊水源性神经干细胞(Amniotic Fluid-derivedNeural Stem Cells，AFNS细胞)分离培养的报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养神经干细胞的新途径，应用本发明方法从羊水中分离培养神经干细胞成功率高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1)将无菌的胎儿羊水用细胞筛网过滤，分别收集滤液和沉淀，将滤液离心后收集上清，获得羊水上清液，将羊水上清液与羊水细胞培养液按照1∶0.5～2的体积比混合后，得到混合培养液；用混合培养液将沉淀物重悬，制成细胞悬浮液，并接种于贴壁细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔4天换液；当培养瓶铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，分散细胞，收集细胞悬液后离心去除上清，收集细胞得到羊水细胞；

所述的羊水细胞培养液是以MEMα-medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10～20％的胎牛血清、质量分数1～2％的L-谷氨酰胺、100～200IU/mL青霉素、100～200μg/mL链霉素和质量分数2～5％的ChangMedium；

2)用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5％CO₂培养箱中培养；待羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液时，吸取神经球转移至培养板中，加入神经球消化液消化成絮状物，再将絮状物转移至羊水源性神经干细胞培养液中，用吸管吹吸絮状物，使其分散为单个细胞形成细胞悬液，然后接种于包含有羊水源性神经干细胞培养液的培养板中，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加终浓度为0.1～1ng/L的EGF和终浓度为0.01～0.1ng/L的bFGF；5d以后吸取形成的神经球，将神经球用神经球消化液消化分离后，得到羊水源性神经干细胞；

所述的50mL羊水源性神经干细胞培养液包含1～2mL B27培养液、0.5～2mL N2培养液、5～10×10^-3ng的表皮生长因子、5～10×10^-4ng的碱性成纤维细胞生长因子、50～100IU的青霉素、50～100μg的链霉素和50～100μg的L-谷氨酰胺，其余为Neurobasal medium；

所述的20mL消化液包含1.5～3mmol Na₂SO₄、0.6～1mmol K₂SO₄、0.1～0.5mmol MgCl₂、0.005～0.01mmol CaCl₂、0.02～0.05mmol N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸，0.4～1.0mmol葡萄糖、0.0025～0.005mmol NaOH、6.0～8.0mg半胱氨酸和200～300μg木瓜蛋白酶，其余为水。

所述的羊水细胞培养液是以MEMα-medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数15％的胎牛血清、质量分数1％的L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和体积分数2％的Chang Medium C。

所述的50mL羊水源性神经干细胞培养液包含1mL B27培养液、0.5mLN2培养液、2mmol/L的表皮生长因子、2mmol/L的碱性成纤维细胞生长因子、50IU的青霉素、50μg的链霉素和50μg的L-谷氨酰胺，其余为Neurobasalmedium。

所述的20mL消化液包含1.96mmol Na₂SO₄、0.6mmol K₂SO₄、0.116mmol MgCl₂、0.005mmol CaCl₂、0.02mmol N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸，0.4mmol葡萄糖、0.0025mmol NaOH、6.4mg半胱氨酸和200μg木瓜蛋白酶，其余为水。

所述的羊水细胞的扩增培养为：用羊水细胞培养液稀释羊水细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5％CO₂培养箱中扩增培养；当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，分散细胞，收集细胞悬液后离心去除上清，得到扩增后的羊水细胞。

羊水源性神经干细胞的传代培养为：用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水源性神经干细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5％CO₂培养箱中培养；待羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液时，吸取神经球转移至六孔培养板中，加入神经球消化液消化成絮状物，再将絮状物转移至羊水源性神经干细胞培养液中，用吸管吹吸使絮状物分散为单个细胞形成细胞悬液，并将其接种于包含有羊水源性神经干细胞培养液中的培养板中，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加终浓度为0.1～1ng/L的EGF和终浓度为0.01～0.1ng/L的bFGF。

所述的羊水源性神经干细胞的体外分化为：将传代培养后的羊水源性神经干细胞的单细胞接种于用纤粘连蛋白包被的培养板中，加入基本培养液，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养2～3d后，再更换为诱导培养液继续培养，诱导2周后收获已分化的细胞；

所述的基本培养液是以低糖DMEM作为培养基，还包含以下组分：100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素；

所述的诱导培养液以低糖DMEM作为培养基，还包含以下组分：100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、体积分数10％的胎牛血清和25ng/mL的神经生长因子。

所述的胎儿羊水为妊娠时期猪或山羊的胎儿羊水。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养神经干细胞的新途径，应用本发明方法从羊水中分离培养神经干细胞成功率高；已成功的从猪、山羊的胎儿羊水中分离到了神经干细胞，而且在体外进行了诱导分化。

所分离到的羊水源性神经干细胞培养3d后形成神经球，将神经球分离成单细胞并重新以克隆密度培养，细胞自我更新、增殖，又很快形成新的神经球。神经球形状比较规则，边界清晰，折光性好，立体感强。

对分离得到的猪羊水源性神经干细胞、山羊羊水源性神经干细胞，经PR-PCR检测到相关的干细胞标志物，对体外分化诱导的神经细胞，也检测到了相关的标志物。

所分离到的羊水源性神经干细胞在体外诱导后分化为星形胶质细胞和神经元细胞等功能细胞；所分离到的羊水源性神经干细胞具有可行性和有效性，具有自我更新、增殖和分化潜能。

附图说明

图1为分离的猪羊水细胞的显微视图，10×；

图2为第0代猪羊水源性神经干细胞，培养3d的显微视图，10×；

图3为第1代猪羊水源性神经干细胞的显微视图；图3-1为培养0d，10×；图3-2为3d，10×；

图4为第2代猪羊水源性神经干细胞的显微视图；图4-1为培养0d，10×；图4-2为3d，10×；图4-3为5d，10×；图4-4为7d，10×；

图5为猪羊水源性神经干细胞分化而来的神经细胞的显微视图，培养14d，10×。

图6猪羊水源性神经干细胞及其分化细胞表面标志RT-PCR产物电泳结果；

图a：作为阳性对照的β-Actin检测结果；

图b～e：猪羊水源性神经干细胞表面标志Nanog、Sox2、Oct4和Nestin的RT-PCR产物电泳结果(图下数字为产物长度，单位为bp)；

图f～j：猪羊水源性神经干细胞来源神经细胞表面标志GFAP、NF、NSE、MAP2和GalC的RT-PCR产物电泳结果(图下数字为产物长度，单位为bp)；

图7为分离的山羊羊水细胞的显微视图，10×；

图8为第0代山羊羊水源性神经干细胞，培养3d的显微视图，10×；

图9为第1代山羊羊水源性神经干细胞的显微视图；图9-1为培养0d，10×；图9-2为3d，10×；

图10为第2代山羊羊水源性神经干细胞的显微视图；图10-1为培养0d，10×；图10-2为5d，10×；

图11为山羊羊水源性神经干细胞分化而来的神经细胞的显微视图，培养14d，10×。

图12山羊羊水源性神经干细胞及其分化细胞表面标志RT-PCR产物电泳结果。

图a：作为阳性对照的GAPDH检测结果；

图b～e：山羊羊水源性神经干细胞表面标志Nanog、Sox2、Oct4和Nestin的RT-PCR产物电泳结果(图下数字为产物长度，单位为bp)；

图f～g：山羊羊水源性神经干细胞来源神经细胞表面标志GFAP和NSE的产物电泳结果(图下数字为产物长度，单位为bp)。

具体实施方式

本发明所提供的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，首先分离到羊水细胞，然后再在羊水细胞中添加分离培养基，分离得到神经干细胞生长形成的神经球，将其消化后进行传代培养；所分离的神经干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1猪羊水源性神经干细胞分离培养和诱导分化

1.1猪羊水源性神经干细胞分离培养

1)羊水细胞的分离培养

从妊娠30天的猪无菌采集胎儿羊水，将采集的胎儿羊水依次采用200目和400目细胞筛网过滤，收集滤液，1000r/min离心8min后收集羊水上清液；然后利用混合培养液(体积比为1∶1的羊水上清液和羊水细胞培养液)重悬沉淀物(细胞颗粒)，制备细胞悬浮液。

将2mL细胞悬浮液接种于25平方厘米贴壁细胞培养瓶(或将6mL细胞悬浮液接种于75平方厘米贴壁细胞培养瓶)，加入15mL(或50mL)混合培养液，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔4天换液。当培养瓶铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入3～6mL细胞分离无酶缓冲液(CellDissociation Buffer，enzyme free，PB S-based，Invitrogen，CatalogNo.13151-014)，用弯头吸管吸取培养瓶中细胞分离无酶缓冲液反复吹打细胞，待全部细胞脱壁后，再用吸管反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，收集的细胞为羊水细胞；其显微视图如图1所示。

用羊水细胞培养液稀释羊水细胞，制成1×10⁴个细胞/mL的细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于6孔培养板，每孔加入2mL细胞悬浮液，在37℃、5％CO₂培养箱中扩增培养。当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养液，每孔加入0.5mL细胞分离无酶缓冲液，用吸管吸取培养瓶中细胞分离无酶缓冲液反复吹打细胞，待全部细胞脱壁后，再用吸管反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，收集的细胞为羊水细胞。继续扩增培养，方法同上。

2)羊水源性神经干细胞分离培养方法

用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水细胞，制成5×10⁴个细胞/mL的细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于未包被的6孔培养板，每孔加入2mL细胞悬浮液，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液。

显微镜下用吸管吸取神经球，转移至另一未包被的6孔培养板的中，加入2mL神经球消化液，37℃消化，神经球被消化形成絮状物，用吸管吸取絮状物转移至未包被的6孔培养板的另一孔中，加入2mL羊水源性神经干细胞培养液，用吸管轻轻反复吹吸絮状物，使絮状物分散为单个细胞，形成细胞悬液，将该细胞悬液转移至未包被的6孔培养板的另四孔中，每孔加入0.5mL细胞悬液，然后每孔加入1.5mL羊水源性神经干细胞培养液，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加10μL浓度为100ng/L的EGF和10μL浓度为10ng/L的bFGF；5d以后在显微镜下用吸管吸取神经球，将神经球消化分离为单个细胞继续传代培养(方法同上：神经球-絮状物-单个细胞)。

其中，上述方法涉及到的培养用液为：

①羊水细胞培养液：以Minimum Essential Medium(MEM)α-medium(1×)(Gibco，Invitrogen，Cat.No.32561-037)、15％FBS(Fetal Bovine Serum胎牛血清)(Invitrogen)、1％L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2％Chang Medium C(Irvine Scientific，Catalog No.T101-019)。

②羊水源性神经干细胞培养液：在50mL容量瓶中先加入30mLNeurobasal medium(Gibco)，依次添加1mL B27培养液(Gibco)，0.5mL N2培养液(Gibco)，50μL浓度为100ng/L的EGF(epidermal growing factor，表皮生长因子)，50μL浓度为10ng/L的bFGF(basic fibroblast growthfactor，碱性成纤维细胞生长因子，Gibco)，0.5mL 100IU/mL青霉素，0.5mL100μg/mL链霉素和L-谷氨酰胺(终浓度为2mmol/L)，最后添加Neurobasalmedium(Gibco)至50mL。

③神经球消化液：在20mL容量瓶中加入10mL双纯水，依次添加1.96mmol Na₂SO₄，0.6mmol K₂SO₄，0.116mmol MgCl₂，0.005mmol CaCl₂，0.02mmol Hepes{2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸}，0.4mmol葡萄糖，0.0025mmol NaOH，6.4mgCysteine(半胱氨酸)和200μg Papain(木瓜蛋白酶)，最后添加双纯水至20mL。

以上所分离的猪羊水源性神经干细胞及扩增培养的猪羊水源性神经干细胞的显微视图分别为图2～4所示，其中：

图4为第2代猪羊水源性神经干细胞的显微视图；图4-1为培养0d，10×；图4-2为3d，10×；图4-3为5d，10×；图4-4为7d，10×。

从猪胎儿羊水中分离获得神经干细胞(AFNS细胞)培养3d后形成神经球(图2)，将神经球分离成单细胞(图3-1、图4-1)并重新以克隆密度培养，细胞自我更新、增殖，又很快形成新的神经球(图3-2、图4-2、图4-3、图4-4)。神经球形状比较规则，边界清晰，折光性好，立体感强。

1.2猪AFNS细胞体外向神经细胞诱导分化

将培养板用纤粘连蛋白包被，将消化分离为单细胞的第2代AFNS细胞以3×10³个细胞/cm²接种于24孔培养板，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中，先用基本培养液培养2d，再用诱导培养液培养。各诱导孔每周换液2次，诱导2周后收获细胞，利用RT-PCR技术检测已分化细胞的表面标志。

基本培养液：低糖DMEM(Low Glucose Dulbecco′s Modified EagleMedium)添加100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

诱导培养液：对照培养液添加10％FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)和25ng/mL NGF(Nerve Growth Factor，神经生长因子)。

将猪AFNS细胞体外向神经细胞诱导分化14d，获得神经细胞，其显微视图如图5所示。

1.3猪AFNS细胞及已分化细胞(神经细胞)表面标志检测

利用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)技术检测猪AFNS细胞及其分化细胞(神经细胞)的表面标志。待检测的AFNS干细胞表面标志有Nestin、Oct4、Nanog和Sox2，待检测已分化细胞(神经细胞)的表面标志有GFAP、GalC、NF、NSE和MAP2；内参照用管家基因β-Actin。

神经干细胞通常通过其表面标记分子与分化表型的缺少来鉴定。神经巢蛋白(Nestin)是细胞的骨架蛋白，主要在神经干细胞表达，随着神经干细胞逐渐分化成熟，Nestin表达减弱，故可用于神经干细胞的鉴定。Oct4、Nanog和Sox2是调节胚胎干细胞基因转录的三个具有代表性的转录因子，对维持细胞多能性具有重要作用。Oct4的主要功能之一是抑制一系列细胞分化因子的表达来维持其自我更新。Nanog是维持干细胞自我更新和保持全能性的重要转录因子，与Oct4、Sox2共同位于细胞全能性调控网络的顶端。神经元特异性烯醇化酶(NSE)是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，是神经元的特异性标记物。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)属于三型中间丝蛋白家族成员，为星形胶质细胞特异性蛋白。

RT-PCR操作步骤简述如下：

用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取待测细胞的总RNA；紫外吸收定量后，进行RT-PCR反应，采用Superscript III(Gibco BRL)试剂盒反转录成cDNA；根据GeneBank的cDNA序列，利用引物设计软件primer 5.0设计引物，并委托上海生物工程技术有限公司合成(具体序列如表1所示)；以cDNA为模板按照以下程序进行PCR扩增：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度退火15s(引物不同退火温度亦不同，具体如表1所示)，72℃延伸45s，循环40次后，72℃延伸5min。PCR产物以1.5％的琼脂糖凝胶进行分离，溴化乙锭染色后在紫外凝胶成像系统下分析产物条带，照相。

表1猪AFNS及其分化细胞表面标志RT-PCR检测用引物序列

猪羊水源性神经干细胞及其分化细胞表面标志RT-PCR产物电泳结果如图6所示，其中，图a：作为阳性对照的β-Actin检测结果；采用50bp DNA梯度标记作为marker；

图b～e：猪羊水源性神经干细胞表面标志Nanog、Sox2、Oct4和Nestin的RT-PCR产物电泳结果；

图f～j：猪羊水源性神经干细胞来源神经细胞表面标志GFAP、NF、NSE、MAP2和GalC的RT-PCR产物电泳结果；

检测结果显示：AFNS细胞中Oct4、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性(b～e均可以看到目的条带)；分化后的细胞表达神经细胞特异性标志GFAP、GalC、NF、NSE和MAP2(f～j均可以看到目的条带)；说明体外诱导的AFNS细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2)，即AFNS细胞可转变为神经的3种功能细胞。

这表明从猪胎儿羊水中分离培养神经干细胞具有可行性和有效性，具有自我更新、增殖和分化潜能。

实施例2山羊羊水源性神经干细胞分离培养和诱导分化

2.1山羊羊水源性神经干细胞分离培养

1)羊水细胞的分离培养

从妊娠末期的关中奶山羊无菌采集胎儿羊水，将采集的胎儿羊水依次采用200目和400目细胞筛网过滤，收集滤液，1000r/min离心8min后收集羊水上清液；然后利用混合培养液(体积比为1∶2的羊水上清液和羊水细胞培养液)重悬沉淀物(细胞颗粒)，制备细胞悬浮液。

将2mL细胞悬浮液接种于25平方厘米贴壁细胞培养瓶(或将6mL细胞悬浮液接种于75平方厘米贴壁细胞培养瓶)，加入15mL(或50mL)混合培养液，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔4天换液。当培养瓶铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入3～6mL细胞分离无酶缓冲液(CellDissociation Buffer，enzyme free，PB S-based，Invitrogen，CatalogNo.13151-014)，用弯头吸管吸取培养瓶中细胞分离无酶缓冲液反复吹打细胞，待全部细胞脱壁后，再用吸管反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，收集的细胞为羊水细胞；其显微视图如图7所示。

2)羊水源性神经干细胞分离培养方法

显微镜下用吸管吸取神经球，转移至另一未包被的6孔培养板的中，加入2mL神经球消化液，37℃消化，神经球被消化形成絮状物，用吸管吸取絮状物转移至未包被的6孔培养板的另一孔中，加入2mL羊水源性神经干细胞培养液，用吸管轻轻反复吹吸絮状物，使絮状物分散为单个细胞，形成细胞悬液，将该细胞悬液转移至未包被的6孔培养板的另四孔中，每孔加入0.5mL细胞悬液，然后每孔加入1.5mL羊水源性神经干细胞培养液，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加10μL浓度为100ng/L的EGF和10μL浓度为10ng/L的bFGF；5d以后在显微镜下用吸管吸取神经球，将神经球消化分离为单个细胞继续传代培养(方法同上)。

其中，上述方法涉及到的培养用液为：

①羊水细胞培养液：以Minimum Essential Medium(MEM)α-medium(1×)(Gibco，Invitrogen，Cat.No.32561-037)、20％FBS(Fetal Bovine Serum胎牛血清)(Invitrogen)、2％L-谷氨酰胺、200IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和5％Chang Medium C(Irvine Scientific，Catalog No.T101-019)。

②羊水源性神经干细胞培养液：在50mL容量瓶中先加入30mLNeurobasal medium(Gibco)，依次添加2mL B27培养液(Gibco)，1mL N2培养液(Gibco)，100μL浓度为100ng/L的EGF(epidermal growing factor，表皮生长因子)，150μL浓度为10ng/L的bFGF(basic fibroblast growth factor，碱性成纤维细胞生长因子，Gibco)，1mL 100IU/mL青霉素，1mL 100μg/mL链霉素和L-谷氨酰胺(终浓度为2.5mmol/L)，最后添加Neurobasal medium(Gibco)至50mL。

③神经球消化液：在20mL容量瓶中加入10mL双纯水，依次添加2mmol Na₂SO₄，0.5mmol K₂SO₄，0.5mmol MgCl₂，0.01mmol CaCl₂，0.02mmolHepes{2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸}，0.5mmol葡萄糖，0.005mmol NaOH，8mg Cysteine(半胱氨酸)和300μL Papain(木瓜蛋白酶)，最后添加双纯水至20mL。

上所分离的山羊羊水源性神经干细胞及扩增培养的山羊羊水源性神经干细胞的显微视图分别为图8～10所示，其中：

图10为第2代山羊羊水源性神经干细胞的显微视图；图10-1为培养0d，10×；图10-2为5d，10×。

从山羊胎儿羊水中分离获得神经干细胞(图8)形成神经球，将神经球分离成单细胞(图9-1，图10-1)并重新以克隆密度培养，细胞自我更新、增殖，又很快形成新的神经球(图9-2，图10-2)。神经球形状比较规则，边界清晰，折光性好，立体感强。

2.2山羊AFNS细胞体外向神经细胞诱导分化

将培养板用纤粘连蛋白包被，将消化分离为单细胞的第2代AFNS细胞以3×10³个细胞/cm²接种于24孔培养板，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中，先用基本培养液培养2d，再用诱导培养液培养。各诱导孔每周换液2次，诱导2～4周后收获细胞，利用RT-PCR技术检测已分化细胞的表面标志。

将山羊AFNS细胞体外向神经细胞诱导分化14d，获得神经细胞，其显微视图如图11所示。

2.3山羊AFNS细胞及已分化细胞(神经细胞)表面标志检测

利用RT-PCR技术检测山羊AFNS细胞及其分化细胞(神经细胞)的表面标志。待检测的干细胞表面标志有Nestin、Oct4、Nanog和Sox2，待检测已分化细胞(神经细胞)的表面标志有GFAP和NSE。阳性对照用GAPDH。

RT-PCR操作步骤简述如下：

用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取待测细胞的总RNA；紫外吸收定量后，进行RT-PCR反应，采用Superscript III(Gibco BRL)试剂盒反转录成cDNA；根据GeneBank的cDNA序列，利用引物设计软件primer 5.0设计引物，并委托上海生物工程技术有限公司合成(具体序列如表1所示)；以cDNA为模板按照以下程序进行PCR扩增：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度退火15s(引物不同退火温度亦不同，具体如表2所示)，72℃延伸45s，循环40次后，72℃延伸5min。PCR产物以1.5％的琼脂糖凝胶进行分离，溴化乙锭染色后在紫外凝胶成像系统下分析产物条带，照相。

表2山羊AFNS及其分化细胞表面标志RT-PCR检测用引物序列

山羊羊水源性神经干细胞及其分化细胞表面标志RT-PCR产物电泳结果如图12所示，其中，图a：作为阳性对照的GAPDH检测结果；采用50bp DNA梯度标记作为marker；

检测结果显示：AFNS细胞中Oct4、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性(b～e均可以看到目的条带)；分化后的细胞表达神经细胞特异性标志GFAP、GalC、NF、NSE和MAP2(f～j均可以看到目的条带)；说明体外诱导的AFNS细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)和神经元细胞(表达NSE)等功能细胞。

这表明从山羊胎儿羊水中分离培养神经干细胞具有可行性和有效性，具有自我更新、增殖和分化潜能。

Claims

1.一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将无菌的胎儿羊水用细胞筛网过滤，分别收集滤液和沉淀，将滤液离心后收集上清，获得羊水上清液，将羊水上清液与羊水细胞培养液按照1：0.5～2的体积比混合后，得到混合培养液；用混合培养液将沉淀物重悬，制成细胞悬浮液，并接种于贴壁细胞培养瓶中，在37℃、5% CO₂培养箱中培养，每隔4天换液；当培养瓶铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，分散细胞，收集细胞悬液后离心去除上清，收集细胞得到羊水细胞；

所述的羊水细胞培养液是以MEM α-medium为基础培养基，还加入以下组分：体积分数10～20%的胎牛血清、质量分数1～2%的L-谷氨酰胺、100～200IU/mL青霉素、100～200μg/mL链霉素和质量分数2～5%的ChangMedium；

2）用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5% CO₂培养箱中培养；待羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液时，吸取神经球转移至培养板中，加入神经球消化液消化成絮状物，再将絮状物转移至羊水源性神经干细胞培养液中，用吸管吹吸絮状物，使其分散为单个细胞形成细胞悬液，然后接种于包含有羊水源性神经干细胞培养液的培养板中，在37℃、5% CO₂和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加终浓度为0.1～1ng/L的EGF和终浓度为0.01～0.1ng/L的bFGF；5d以后吸取形成的神经球，将神经球用神经球消化液消化分离后，得到羊水源性神经干细胞；

50mL的所述的羊水源性神经干细胞培养液由以下组分组成：1～2mLB27培养液、0.5～2mL N2培养液、5～10×10^-3ng的表皮生长因子、5～10×10^-4ng的碱性成纤维细胞生长因子、50～100IU的青霉素、50～100μg的链霉素和50～100μg的L-谷氨酰胺，其余为Neurobasal medium；

20mL的所述的消化液由以下组分组成：1.5～3mmol Na₂SO₄、0.6～1mmol K₂SO₄、0.1～0.5mmol MgCl₂、0.005～0.01mmol CaCl₂、0.02～0.05mmol N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙磺酸，0.4～1.0mmol葡萄糖、0.0025～0.005mmol NaOH、6.0～8.0mg半胱氨酸和200～300μg木瓜蛋白酶，其余为水。

2.如权利要求1所述的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的羊水细胞培养液是以MEM α-medium为基础培养基，还加入以下组分：体积分数15%的胎牛血清、质量分数1%的L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和体积分数2%的Chang Medium C。

3.如权利要求1所述的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，50mL的所述的羊水源性神经干细胞培养液由以下组分组成：1mL B27培养液、0.5mL N2培养液、2mmol/L的表皮生长因子、2mmol/L的碱性成纤维细胞生长因子、50IU的青霉素、50μg的链霉素和50μg的L-谷氨酰胺，其余为Neurobasal medium。

4.如权利要求1所述的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，20mL的所述的消化液由以下组分组成：1.96mmol Na₂SO₄、0.6mmolK₂SO₄、0.116mmol MgCl₂、0.005mmol CaCl₂、0.02mmol N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙磺酸，0.4mmol葡萄糖、0.0025mmol NaOH、6.4mg半胱氨酸和200μg木瓜蛋白酶，其余为水。

5.如权利要求1所述的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的羊水细胞的扩增培养为：用羊水细胞培养液稀释羊水细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5% CO₂培养箱中扩增培养；当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，分散细胞，收集细胞悬液后离心去除上清，得到扩增后的羊水细胞。

6.如权利要求1所述的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，羊水源性神经干细胞的传代培养为：用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水源性神经干细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5%CO₂培养箱中培养；待羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液时，吸取神经球转移至六孔培养板中，加入神经球消化液消化成絮状物，再将絮状物转移至羊水源性神经干细胞培养液中，用吸管吹吸使絮状物分散为单个细胞形成细胞悬液，并将其接种于包含有羊水源性神经干细胞培养液中的培养板中，在37℃、5% CO₂和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加终浓度为0.1～1ng/L的EGF和终浓度为0.01～0.1ng/L的bFGF。

7.如权利要求1所述的羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的胎儿羊水为妊娠时期猪或山羊的胎儿羊水。

8.利用权利要求1所述的分离培养方法得到的羊水源性神经干细胞的体外分化方法，其特征在于，将传代培养后的羊水源性神经干细胞的单细胞接种于用纤粘连蛋白包被的培养板中，加入基本培养液，在5% CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养2～3d后，再更换为诱导培养液继续培养，诱导2周后收获已分化的细胞；

所述的基本培养液是以低糖DMEM作为培养基，还加入以下组分：100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素；

所述的诱导培养液以低糖DMEM作为培养基，还加入以下组分：100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、体积分数10%的胎牛血清和25ng/mL的神经生长因子。