CN102199603B

CN102199603B - 多靶位干扰rna分子及其应用

Info

Publication number: CN102199603B
Application number: CN201110056947A
Authority: CN
Inventors: 李铁军; 朱远源
Original assignee: Biomics Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Study on molecular medicine 100 Kechuang source (Nantong) Co., Ltd.
Priority date: 2011-03-10
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2031-03-10
Also published as: CN102199603A

Abstract

本发明涉及一种RNA分子及其应用，尤其是指一种多靶位干扰RNA分子及其应用。所述的多靶位干扰RNA分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成双链，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA的不同位点，该RNA分子进入细胞后不会引起干扰素效应。该RNA分子能干扰转录后翻译过程，从而抑制或阻断基因的表达，且该干扰RNA分子不会引发体内的干扰素反应。所述的RNA分子是制备调节细胞中一种或多种基因功能的药物中的活性成份。

Description

多靶位干扰RNA分子及其应用

技术领域

本发明涉及一种干扰RNA分子及其应用，尤其是多靶位干扰RNA分子及其应用。

背景技术

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）引发其同源信使RNA（messenger RNA，mRNA）酶解的一种转录后基因沉默形式（Nature. 1998, 391: 806-811）。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20～25bp（base pair，碱基对），且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）。siRNA的一条链掺入到RNA-诱导的沉默复合物中（RNA-induced silencing complex，RISC），与互补RNA的序列配对。RISC首先介导siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。

RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。

RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，目前国际上已有十余种siRNA药物进入临床阶段。其中有应用siRNA治疗老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、呼吸道合胞病毒病、实体肿瘤、肝癌、以及急性肾损伤等疾病。

RNAi效应的dsRNA可设计成能被Dicer剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是不需Dicer剪切可直接作为RISC底物的短siRNA形式。在哺乳动物细胞中，由于长dsRNA容易引发非特异性的干扰素效应。因此，普遍认为应用于哺乳动物时，干扰RNA双链必须短于30 bp。但是，设计长双链干扰RNA用于RNAi仍有实用价值，长干扰RNA双链可带有多个治疗靶标，靶向多个不同靶基因的mRNA或同一靶基因的mRNA的不同位点，增加基因沉默效果，扩大应用范围。疾病的发生、发展往往是多种基因共同参与的复杂生物学过程，受到多种因素的影响，在疾病的治疗中，单一基因的抑制不可能完全抑制或逆转疾病的发生和发展，单靶标治疗有其局限性。那么，研发多靶标、无干扰素反应的长干扰核酸双链，同时抑制多个疾病基因的表达，多层次、多途径治疗疾病，能有效提高治疗效果，可以作为治疗疾病的新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干扰RNA分子及其应用，尤其是多靶位干扰RNA分子及其应用。该干扰RNA分子的反义链靶向不同靶基因的RNA或同一个靶基因RNA的不同位点，该RNA可以是mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）或是mRNA或miRNA的子序列，并且该干扰RNA分子不引起体内的干扰素反应。

为了达到上述目的，本发明公开了一种多靶位干扰RNA分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成双链，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA的不同位点，所述的双链中存在至少一个不互补的环状核苷酸结构，该RNA分子进入细胞后不会引起干扰素效应。

优选地，所述的不互补的环状核苷酸结构至少包含3个核苷酸。

优选地，所述的双链中含有至少一个糖环修饰或骨架修饰的核糖核苷酸。

通常，干扰RNA分子由一条反义链和一条正义链组成，分子的总长度至少为30个核苷酸，且该RNA分子的双链上存在至少一个不互补的环状核苷酸结构，应用这种具有二级结构的、由正义链和反义链构成的长干扰RNA没有激发哺乳动物细胞的干扰素反应。

本发明还公开了上述多靶位干扰RNA分子在制备调节细胞中至少一种基因功能的药物中的应用，所述的基因是一种疾病相关基因，包括病原体相关基因如病毒基因，以及非传染性疾病相关基因如肿瘤相关基因等。所述的肿瘤为肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤、鼻咽癌和口腔癌中的至少一种。本发明有望在抑制、缓解或减轻病情或防止某些疾病症状的复发方面取得更显著的效果。

本发明与现有技术相比，该RNA分子能够同时抑制多个靶基因的表达，或者靶向一个靶基因的多个位点。此外，并未引起干扰素效应，可应用于哺乳动物细胞。本发明公开的RNA分子是一种新的siRNA的应用形式，在对疾病的基因治疗方面有广泛的应用前景。

附图说明

图1是RNA分子Mid-Cir结构示意图。该分子正义链的5’端和3’端分别与反义链的3’端和5’端互补，在双链中存在一个不互补的环状核苷酸结构。图中，1为正义链，2为反义链，3为不互补的环状核苷酸结构。

图2是SMMC-7721肝癌细胞中Survivin基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示Survivin基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。

图3是SMMC-7721肝癌细胞中Bcl-2基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示Bcl-2基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。

图4是SMMC-7721肝癌细胞中干扰素相关基因OAS1基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示OAS1基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。

图5是SMMC-7721肝癌细胞的生长曲线图。图中，纵坐标表示紫外吸光值（OD值），横坐标表示不同RNA分子作用细胞的不同时间。

图6是不同RNA分子对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制率柱形图。图中，纵坐标表示细胞生长抑制率，横坐标表示不同实验组。

图7是HepG2肝癌细胞的生长曲线图。图中，纵坐标表示紫外吸光值（OD值），横坐标表示不同RNA分子作用细胞的不同时间。

图8是不同RNA分子对肝癌细胞HepG2的生长抑制率柱形图。图中，纵坐标表示细胞生长抑制率，横坐标表示不同实验组。

具体实施方式

本发明中术语的定义并非是对本发明进行限制。

为了方便起见，在下文中，术语“RNA分子”、“核酸分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。

本发明中术语“多靶位”是指干扰RNA分子的反义链靶向不同靶基因的RNA或同一个靶基因RNA的不同位点，该RNA可以是mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）或是mRNA或miRNA的子序列。

miRNA是调节基因表达的21～23个核苷酸长度的单链RNA分子。miRNA由从DNA转录的基因编码，但不翻译成蛋白质（非编码RNA）；miRNA形成过程是由称做pri-miRNA原始转录本加工成pre-miRNA的短茎环结构，最终形成功能性的miRNA。成熟的miRNA分子部分互补到一个或多个mRNA分子，它们的主要功能是下调基因的表达。

本发明的干扰RNA分子的反义链、正义链可以是糖环或骨架修饰的核苷酸类似物。

在本领域中有很多实施例说明在核苷酸中引入糖、碱基和磷酸修饰可以显著增加核酸酶稳定性和有效性。如，修饰寡核苷酸的核酸酶耐受基团来增强稳定性和/或增强生物学活性，如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-甲氧基、2’-氧-烯丙基、2’-氢的核苷酸碱基修饰（Usman和Cedergren，TIBS 17:34，1992；Usman等，Nucleic Acids Symp. Ser. 31:163，1994；Burgin等，Biochemistry 35：14090，1996）。核苷酸分子糖修饰（Perrault等， Nature 344：565-568，1990；Pieken等，Science 253：314-317，1991；Usman和Cedergren，Trends in Biochem. Sci. 17：334-339，1992；Burlina等，Bioorg. Med. Chem. 5：1999-2010，1997）。

在一些具体实施例中，干扰RNA分子包括独立的正义或反义链，该正义或反义链通过核苷酸或非核苷酸接头共价连接，或者通过离子反应、氢键结合、范德华力、疏水反应或叠加反应进行非共价结合。

本发明的RNA分子由独立的正义链和反义链组成，且正义链和反义链核苷酸序列互补形成双链。反义链可以包含与靶核苷酸互补或部分互补的核苷酸序列，正义链可以包含与靶序列一致或部分一致的核苷酸序列。

本发明中术语“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及由其形成的单链或双链的聚合物。该术语中核苷酸包括熟知的核苷酸类似物或修饰的后键残基或连接，可以是人工合成的、天然的和非天然的，含有与核苷酸类似的结合性质和新陈代谢性质。

本发明中术语“RNA”是指一种至少包含一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D呋喃核糖基团的2’位上有一个羟基基团的核苷酸。该术语包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、完全纯化的RNA、合成的RNA、重组体产生的RNA，可以通过添加、删除、替换或改变一个或多个核苷酸来改变RNA，使其不同于天然的RNA。这些改变可以包括添加非核苷酸原料，如添加在干扰RNA的末端或中间，如RNA的一个或多个核苷酸。本发明的RNA分子的核苷酸也可以包括非标准的核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核糖核苷酸，这些改变的RNA可以是RNA的类似物。

本发明中互补核苷酸碱基是指通过氢键互相连接一对核苷酸碱基。腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）配对或与尿嘧啶（U）配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对。互相杂交（通过氢键结合）的互补片段或核苷酸链。“互补”是指一条核苷酸链与另一条核苷酸链可以通过Watson-Crick法则或其它非常规结合方式形成氢键。

本发明中“不互补的环状核苷酸结构”是指RNA双链分子中，在正义链和反义链的对应部位存在一段不互补的核苷酸序列，其长度至少为3个核苷酸，且该段核苷酸序列中不存在自身互补序列；该序列在正义链和反应链退火后形成一个环状的二级结构。

本发明中RNA分子可以和RNA运输载体及其它已知的治疗成份一起来治疗疾病。

本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持干扰RNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。

任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持干扰RNA分子的活性。

本发明中的干扰RNA分子可以以任何形式给药，如经皮肤或局部注射。

本发明中干扰RNA分子的剂型可以是口服给药的片剂、胶囊或酏剂，可以是直肠给药的栓剂，可以是注射给药的灭菌溶液、悬液，或是其它在本领域中知晓的剂型。

在一个优选的实施方式中，该干扰RNA分子由一条反义链和一条正义链组成，正义链和反义链通过退火形成双链，在双链中存在一个不互补的环状核苷酸结构，其中反义链靶向两个或多个不同靶基因的RNA或同一靶基因RNA的两个或多个不同位点，且转染进入细胞中不会引起干扰素效应。

下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。

实施例l

设计靶向Survivin 和Bcl-2基因的干扰RNA分子Mid-Cir

细胞凋亡抑制基因Survivin 和Bcl-2，在恶性肿瘤细胞中广泛高表达。研究发现，通过抑制肿瘤细胞中过表达的Survivin或Bcl-2基因，可以抑制肿瘤细胞的生长。用靶向性的siRNA抑制Survivin或Bcl-2基因的表达可以用来治疗肿瘤。

设计干扰RNA分子Mid-Cir，其包含一条正义链和一条反义链，反义链的3’端部分靶向到Survivin基因的mRNA，5’端部分靶向到Bcl-2基因的mRNA，结构如图1所示。

序列SEQ ID NO: 1是干扰RNA分子Mid-Cir的正义链序列。

正义链：5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUUCAGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’

（SEQ ID NO: 1）

序列SEQ ID NO: 2是与SEQ ID NO: 1互补且存在不互补环状核苷酸结构的RNA分子Mid-Cir的反义链序列。

反义链：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCGAGAGAAACACUGGGCCAAGUC-3’

（SEQ ID NO: 2）

用于对比实验的siRNA：1）Sur-2是靶向Survivin基因的siRNA，其正义链序列是序列（SEQ ID NO: 1）中5’端开始的1～19个核苷酸，反义链是序列（SEQ ID NO: 2）中3’端开始的1～19个核苷酸。2）Bcl-1是靶向Bcl-2基因的siRNA，其正义链序列是序列（SEQ ID NO: 1）中3’端开始的1～19个核苷酸，反义链是序列（SEQ ID NO: 2）中5’端开始的1～19个核苷酸。

实施例2

实时定量PCR检测干扰RNA分子Mid-Cir对Survivin靶基因的沉默效果

细胞培养：肝癌细胞SMMC-7721在含10％FBS的DMEM培养基（Gibco公司）中，37℃、5％CO₂培养箱培养。

细胞铺板并转染：将细胞按1×10⁵/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin^TM2000（Invitrogen公司）的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。

实时定量PCR检测Survivin基因mRNA表达：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA Kit（QIAGEN公司）提取纯化细胞mRNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μL无RNase水/孔溶解RNA，取4 μL RNA为模板进行实时定量PCR反应。

检测Survivin基因的实时定量PCR引物：

5’正向引物：ACCGCATCTCTACATTCAAG （SEQ ID NO: 3）

3’反向引物：CAAGTCTGGCTCGTTCTC （SEQ ID NO: 4）

用上述Survivin基因特异性引物检测样本中Survivin基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下反应体系：4 μL模板RNA，12.5 μL 2×SensiMix One-Step（Quantance公司），1 μL 5’正向引物（10 μM），1 μL 3’反向引物（10 μM），0.5 μL 50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μL。反应条件：42℃反转录30 min，95℃预变性7 min，95℃变性20 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，循环45次。

用2^-ΔΔCt分析法分析实验结果，并作柱状图，如图2所示，干扰RNA分子Mid-Cir显示对肝癌细胞中Survivin基因较好的沉默效果，与相应的Sur-2实验组和共转染实验组Sur-2+Bcl-1相比，其抑制效率无明显差异。

实施例3

实时定量PCR检测干扰RNA分子Mid-Cir对Bcl-2靶基因的沉默效果

实时定量PCR检测Bcl-2基因mRNA表达：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA Kit（QIAGEN公司）提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μL无RNase水/孔溶解RNA，取4 μL RNA为模板进行实时定量PCR反应。

检测Bcl-2基因的实时定量PCR引物：

5’正向引物：GGCTGGGATGCCTTTGTG （SEQ ID NO: 5）

3’反向引物：GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG （SEQ ID NO: 6）

用上述Bcl-2基因特异性引物检测样本中Bcl-2基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μL反应体系：4 μL 模板RNA，12.5 μL 2×SensiMix One-Step，1 μL 5’正向引物（10 μM），1 μL 3’反向引物（10 μM），0.5 μL 50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μL。反应条件：42℃反转录30 min，95℃预变性7 min，95℃变性20 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，循环45次。

用2^-ΔΔCt分析法分析实验结果，并作柱状图，如图3所示，干扰RNA分子Mid-Cir显示对肝癌细胞中Bcl-2基因较好的沉默效果，与相应的Bcl-1实验组和共转染实验组Sur-2+Bcl-1相比，其抑制效率无明显差异。

实施例4

检测干扰素反应

实时定量PCR检测干扰素相关基因OAS1的mRNA表达：用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA Kit（QIAGEN公司）提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μL无RNase水/孔溶解RNA，取4 μL RNA为模板进行实时定量PCR反应。

检测干扰素相关基因OAS1的实时定量PCR引物：

5’正向引物：GTGAGCTCCTGGATTCTGCT （SEQ ID NO: 7）

3’反向引物：TGTTCCAATGTAACCATATTTCTGA （SEQ ID NO: 8）

用上述OAS1基因特异性引物检测样本中OAS1基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μL反应体系：4 μL模板RNA，12.5 μL 2×SensiMix One-Step，1 μL 5’正向引物（10 μM），1 μL 3’反向引物（10 μM），0.5 μL 50×SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μL。反应条件：42℃反转录30 min，95℃预变性7 min，95℃变性20 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，循环45次。

用2^-ΔΔCt分析法分析实验结果，并作柱状图，如图4所示。实验中，用上述转染方法按5 ng/孔同时转染Poly（I:C）作为阳性对照。聚肌胞（Poly（I:C））是一种类似于感染性病毒的核糖核酸的合成化学物质，可以刺激细胞的免疫系统产生干扰素。与正常组相比，阳性对照组OAS1基因的mRNA有明显的升高，其它不同RNA分子转染实验组OAS1基因没有高表达，该结果表明干扰RNA分子Mid-Cir未引起干扰素反应。

实施例5

CCK-8法检测干扰RNA分子Mid-Cir对肝癌细胞SMMC-7721的抑制率

CCK-8测定：每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液（同仁化学）。在细胞培养箱内继续孵育0.5～4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

根据所测得的A₄₅₀值（OD值），作生长曲线图，如图5所示。根据公式：细胞增殖抑制率 =（l－实验组平均A₄₅₀值/对照组平均A₄₅₀值）×100%，计算细胞生长抑制率，并作柱状图，如图6所示。结果表明干扰RNA分子Mid-Cir在作用肝癌细胞48 h、72 h、96 h后有显著的抑制效果，与其它实验组相比无明显差异。

实施例6

CCK-8法检测干扰RNA分子Mid-Cir对肝癌细胞HepG2的抑制率

细胞培养：肝癌细胞HepG2在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂培养箱培养。

根据所测得的A₄₅₀值（OD值），作生长曲线图，如图7所示。根据公式：细胞增殖抑制率=（l－实验组平均A₄₅₀值/对照组平均A₄₅₀值）×100%，计算细胞生长抑制率，并作柱状图，如图8所示。结果表明干扰RNA分子Mid-Cir在作用肝癌细胞48 h、72 h、96 h后有显著的抑制效果，与其它实验组相比无明显差异。

<110> 百奥迈科生物技术有限公司

<120> 多靶位干扰RNA分子及其应用

<130> BIOMICS20110201

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacuuggccc aguguuucuu caggaugacu gaguaccuga a 41

<210> 2

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uucagguacu cagucauccg agagaaacac ugggccaagu c 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accgcatctc tacattcaag 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caagtctggc tcgttctc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctgggatg cctttgtg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccaggagaa atcaaacaga gg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgagctcct ggattctgct 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgttccaatg taaccatatt tctga

Claims

1.一种多靶位干扰RNA分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成双链，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA的不同位点，所述的双链中存在至少一个不互补的环状核苷酸结构，该RNA分子进入细胞后不会引起干扰素效应；

其正义链为：

5’-GACUUGGCCCAGUGUUUCUUCAGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’，

反义链为：

5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCGAGAGAAACACUGGGCCAAGUC-3’。

2.权利要求1所述的多靶位干扰RNA分子在制备调节细胞中Survivin基因和Bcl-2基因功能的药物中的应用。