CN102199148A

CN102199148A - 苯磺酰胺衍生物及其医药组合物

Info

Publication number: CN102199148A
Application number: CN2010101495234A
Authority: CN
Inventors: 陈基旺; 陈香惠; 张佩德; 陈冠妤; 陈孟伶; 李学耘; 黄琼嬅; 邱俊棠
Original assignee: Purzer Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Purzer Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-03-25
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2011-09-28

Abstract

本发明系有关于一种苯磺酰胺衍生物及其医药组合物，如下式(I)所示，其中，R₁、R₂、R₃、及D的定义如说明书中所示。另外，本发明提供的苯磺酰胺衍生物，可作为细胞周期的抑制剂，因此能作为针对细胞周期抗癌药物的苯磺酰胺衍生物及其医药组合物。特别是本发明的苯磺酰胺衍生物能作为治疗固态瘤的抗癌药物。

Description

苯磺酰胺衍生物及其医药组合物

技术领域

本发明是关于一种苯磺酰胺衍生物及其医药组合物，尤其指一种适用于治疗固态瘤的细胞周期标的抑制剂的苯磺酰胺衍生物及其医药组合物。

背景技术

由于讲求精致饮食且环境污染日益恶化，加上吸烟人口的不断增加，癌症在中国台湾，乃至全世界所有先进国家的罹患率都相当高。根据美国癌症协会(American Cancer Society)统计数据显示，癌症是现今仅次于心脏疾病的主要公众卫生问题。另根据行政院卫生署的相关数据显示，自1982年起，癌症年年高踞中国台湾十大死因的第一位，且恶性肿瘤死因排名前三项的肺癌、肝癌及结肠直肠癌这三类固态癌死亡的人数则可达总癌症死亡人数约50％。自从发现如etoposide及cisplatin等抗癌新药后，对于治疗白血病、淋巴癌的效果良好，但化学疗法对于肺癌、胃癌及结肠癌等固态癌的疗效仍十分有限。

目前，一般治疗癌症的治疗方法，除了对固态癌(例如胃癌)实施外科手术将癌细胞及局部淋巴腺切除的外科疗法外，也发展出其它的治疗方法，例如放射线治疗法、化学治疗法、生物及免疫疗法等。近年来，化学治疗法已研发出多种利用新抗癌机制的治疗制剂，并在临床上证实能有效提高病人生存率。而这些药物的作用原理，多是采用抑制细胞周期运行、血管新生(angiogenesis)、脂肪酸转移酵素(farnesyl transferase)、酪胺酸激酶(tyrosine kinases)等方式，对于肿瘤细胞进行治疗。其中针对抑制细胞周期的药物，例如wortmanni、5-fluorouracil、daunomycin及colchicine等，为近年来研究治疗癌症药物中的主要发展方向之一。

目前，卫采(Eisai)公司已有两种苯磺酰胺衍生物进入临床试验中，此两种苯磺酰胺衍生物为：

此两种苯磺酰胺衍生物皆为细胞周期抑制剂，使得细胞凋亡。E7010于老鼠体内抗肿瘤活性试验方面，有显著的效果，目前进行第二期临床实验。而E7070在这类衍生物中抗肿瘤效果最佳，用于抑制人类的结肠癌细胞(colon 38)其IC₅₀为0.26M(Owa et.al.，J.Med.Chem.1999，42，3789-3799)，且目前已进入第二期临床实验。然而，虽已进入临床实验中，但将来是否能真正应用于实际癌症治疗中，仍属一个未知数。

目前临床上已有几种用于治疗固态瘤的药物，不过针对不同部位的癌细胞、不同的患者及所产生的副作用等，并非所有的药物皆能有效的发挥其效用。有鉴于癌症高居国人十大死因的冠，且固态瘤更为癌症死因之首，发展出抑制固态瘤的药物仍然是当务之急。因此，本发明希望能发展出一种能有效治疗固态瘤的新药，期望这些药物对肿瘤细胞能具有良好的抑制能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苯磺酰胺衍生物。

本发明的另一目的在于提供一种作为细胞周期标的抑制剂的医药组合物，以能有效针对固态瘤达到抑制效果，且对于胃癌细胞(TSGH)、肝癌细胞(Hepa G2)、大肠癌细胞(HT29)、及鼻咽癌细胞(KB)等肿瘤细胞具有良好的疗效。

为实现上述目的，本发明提供的苯磺酰胺衍生物，其结构如式(I)所示：

其中，

R₁为氢、或C_1-6烷基；

R₂与R₃分别为氢、

或共同键结为

D为

R₄为氢、或硝基；

X、Y、每一R₅各自独立为氢、或C_1-6烷基；

每一R₆各自独立为氢、卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、经卤素取代的C_1-6烷基、经卤素取代的C_1-6烷氧基、硝基、-NR₈R₉、或-SO₂NR₁₀R₁₁；

R₇为氢、或卤素；

R₈、R₉、R₁₀与R₁₁各自独立为氢、或C_1-6烷基；以及

i、n各自独立为0-3的整数。

于本发明的苯磺酰胺衍生物中，R₈、R₉、R₁₀、R₁₁较佳可为氢，而R₁较佳可为氢、或C_1-3烷基，且R₁更佳可为氢、甲基、乙基、丙基、或异丙基。

于本发明的一实施态样中，R₁可为氢、或C_1-3烷基，D为

且R₆可为氢、卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、-NH₂、或-SO₂NH₂。于此实施态样中，R₆较佳为氢、氯、甲基、甲氧基、硝基、-NH₂、或-SO₂NH₂。此外，R₂与R₃较佳共同键结为

或R₂与R₃均为氢；或R₂为氢，而R₃为

于本发明的另一实施态样中，R₁可为氢、或C_1-3烷基，D为

且R₆可为氢、经卤素取代的C_1-6烷基、或经卤素取代的C_1-6烷氧基。于此实施态样中，R₆较佳为-CF₃。此外，R₂与R₃较佳共同键结为

于本发明的再一实施态样中，R₁可为氢，D可为

且R₆可为氢、卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、-NH₂、或-SO₂NH₂。于此实施态样中，R₆较佳为硝基。此外，R₂与R₃较佳系共同键结为

或R₂与R₃均为氢。

于本发明的更一实施态样中，R₁可为氢、或C_1-3烷基，D可为

且R₇可为氢、或卤素。于此实施态样中，R₁较佳为氢、或甲基，且R₇较佳为氯；且R₂与R₃较佳系共同键结为

「烷基」一词是指一直链或支链的非芳香碳氢基团。

「烷氧基」一词是指一直链或是分支，饱和或是不饱和，包含一氧基的非芳香碳氢基团。

「卤素」一词是指包含氟、氯、溴、或碘的卤素基团。

上述苯磺酰胺衍生物，主要是通过作为细胞周期标的抑制剂，而具有治疗固态瘤的功效。此外，此苯磺酰胺衍生物，更具有抑制胃癌细胞、肝癌细胞、大肠癌细胞、及鼻咽癌细胞等肿瘤细胞的功效。

综合以上所述，本发明提供的作为细胞周期标的抑制剂的医药组合物，包括至少一有效剂量的式(I)化合物、其盐类、或其前驱药物，及医药可接受的稀释液、载体、或赋型剂，以达成治疗固态瘤的目的。

「治疗」一词是指投予一种或多种如式(I)的苯磺酰胺衍生物、其盐类、或其前驱药物于一个患有上述疾病的个体，以达治疗的效果，例如，治愈、减缓、改变、影响、或是改善。

「有效剂量」一词是指一种或多种苯磺酰胺衍生物、其盐类、或其前驱药物，对接受治疗的病患有治疗效果所需的量。有效剂量决定于化合物、投药途径、疾病种类、患者年龄、及体重等等。

一含有式(I)化合物的医药组合物可以口服、非经肠道、或以吸入剂形式投药。

以口服方式投予的组合物可以是任何一种可接受的口服方式，包含但不限于：胶囊，锭剂，乳状液以及水样悬浮液，分散液及液体等。常用的锭剂载体包含：乳糖与玉米淀粉。润滑剂如硬脂酸镁，也常被应用于锭剂中。以胶囊型式口服时，有效稀释剂为乳糖与干玉米淀粉。在以水样悬浮液或乳状液型式提供口服时，可利用乳化法或悬浮剂将活性物质悬浮或稀释于油相中。如有需要，可添加入特定的甜味剂，风味剂或着色剂。

非经肠道一词是指皮下的、皮内的、脉内的(例如：静脉内)、肌肉内的、脊椎内的、颅内以及其它的输注技术。无菌注射组合物的制备可以是一无菌注射液或悬浮液，含无毒性、经由非肠道途径可接受的稀释液或溶剂，例如1，3-丁二醇溶液。在这些可接受的载体与溶剂中，可利用的为甘露糖醇，水，Ringer’s溶液，以及等张氯化钠溶液。此外，不易挥发的油在公知作为溶剂或悬浮介质(如合成的单甘油酯或双甘油酯)。脂肪酸，如油酸及其甘油衍生物也有助于注射剂的制备，为天然的医药上可接受油脂，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是在其为聚氧化乙烯的形式下。这些油脂液体或悬浮液也可包含一长链的醇类稀释剂，分散剂，羧甲基纤维素或是其它相似的分散剂。其它一般使用的接口活性剂如Tweens或是Spans或其它相似的乳化剂或是一般医药制造业所使用于医药可接受的固态、液态或其它可用于剂型开发目的的剂量型式的生物可利用增强剂。

一吸入剂组合物可依医药配方的公知技术制备，如制成食盐水溶液的组成物，使用苯甲醇或其它适合的防腐剂，增加生体可用率的吸收促进剂，氟碳化合物，及/或其它技艺中已知的溶解剂或分散剂。

医药组成物的载体必须为「可接受」，意为与配方中的活性成分相容(且较佳是使配方安定)及对接受治疗的病患无害。一或多种安定剂可用以作为医药赋形剂，以递送一具活性的7-杂氮吲哚化合物。其它载体的实例包括胶状二氧化硅，硬酯酸镁，纤维素，十二烷基硫酸钠，及D&C黄色10号。

附图说明

图1是本发明的GM119对4T1乳腺癌细胞的体外细胞毒杀作用测试结果图。

图2是短期给予药物对老鼠存活时间的统计结果图。

图3是长期给予药物对老鼠存活时间的统计结果图。

具体实施方式

本发明的苯磺酰胺衍生物，其合成反应机制大致如反应流程式I所示。

式I

本发明于合成化合物时，所使用的分析仪器与鉴定方法如下：

熔点测定：使用Laboratory Devices，INC.USA所制造的熔点测定仪(Box 6402，HOLLISTON，MA 01740-6402.USA)进行熔点分析。

核磁共振光谱分析：使用Brucker AMX-400光谱仪或Brucker DPX-200spectrometer光谱仪进行化合物1～7的¹H及¹³C核磁共振光谱分析，化学位移以ppm(ppm，δ)表示。

质谱测定：分为低解析及高解析质谱。低解析质谱均采电子撞击游离法，使用JEOL JMS-SX102A气相/液相层析质谱仪进行分析。高解析质谱也采电子撞击游离法，使用MAT-95XL HRMS高效能质谱仪进行分析。

元素分析测定：C、H、及N等元素的测定，使用Haraeus CHN-O RapidElemental Anallyzer的快速元素分析仪，容许误差值为±0.4％。

薄层色层分析：以表层被覆硅胶(Kieselgel 60F254，Merck)的薄层展开，并经由UV灯源照射显示，以确定反应完全。

管柱层析分析：使用硅胶管柱(Merck Kieselgel 60 230-400or 70-230mesh)进行纯化。

实施例1：制备化合物5a(N-(1H-吲哚-7-基)苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)benzenesulfonamide)

(1)制备例1：制备化合物1a及1b(丙酮酸乙酯o-硝基苯基腙，Ethylpyruvate o-nitrophenylhydrazone)

首先在冰浴中先制备重氮盐(diazonium salt)溶液：将2-硝基苯胺(2-nitroaniline，25.47g，0.18mmol)加入水(64.6mL)后再与浓盐酸(76.4mL)均匀混合，搅拌十分钟。逐滴加入由水(50mL)与亚硝酸钠(13.37g)所组成的亚硝酸钠水溶液。滴入后有气泡生成，搅拌至溶液成黄褐色澄清，且无气泡生成。另在冰浴中将3-氧代-2甲基丁酸乙酯(2-methyl-3-oxobutyric acidethyl ester，26.10g，0.14mmol)溶在乙醇(191mL)中，再缓缓加入由氢氧化钾(32.47g)所组成的50％氢氧化钾水溶液，接着倒入冰水(380mL)搅拌十分钟，再到入先前所制备的重氮盐溶液，当两溶液混合后，立即有鲜黄色固体生成。搅拌十分钟，将溶液过滤。并用纯水洗至滤液经石蕊试纸测试呈中性后，取固体干燥，再用乙醇作再结晶。即可得鲜黄色针状的化合物1(30.00g，85％)，此为Z(1a)及E(1b)两种型态异构物的混合物。

1a：mp 93-94℃(lit.94-95.5℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ1.38(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃)，2.24(s，3H，CH₃)，4.37(q，J＝7.2Hz，2H，CH₂)，6.92(t，J＝7.2Hz，ArH，1H)，7.54(t，J＝7.2Hz，1H，ArH)，8.18(dd，J＝1.4，7.2Hz，1H，ArH)，8.18(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，13.85(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ10.9，14.8，62.0，116.8，120.5，122.6，130.1，130.6，131.1，131.4，133.9，161.2；

MS(EI)m/z 252(M+1，100％)，251(M⁺，84％)，136(M-115，58％)。

1b：mp 113-114℃(lit.117-118℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ1.37(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃)，2.21(s，3H，CH₃)，4.33(q，J＝7.2Hz，2H，CH₂)，6.96(dt，J＝1.2，7.7Hz，ArH，1H)，7.58(t，J＝7.2Hz，ArH，1H)，8.00(d，J＝8.6Hz，ArH，1H)，8.15(dd，J＝1.4，8.6Hz，ArH，1H)，10.91(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ11.6，14.2，61.6，116.8，120.2，125.7，132.7，136.2，139.2，140.6，164.5；

MS(EI)m/z 251(M⁺，100％)，43(M-208，63％)。

(2)制备例2：制备化合物2(7-硝基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯，Ethyl7-nitro-1H-indole-2-carboxylate)

将已经干燥的化合物1a及1b(12.00g，47.76mmol)倒入三颈瓶(250mL)中，再倒入聚磷酸(64.56g，191.05mmol)。首先加热至70℃使溶液搅拌均匀后，再将温度上升至80℃。反应12小时经TLC确定反应完全，趁热将黑色黏稠溶液倒入冰水(400g)中，搅拌至聚磷酸完全水解，此时溶液成黑色，且有棕黑色固体生成。将溶液过滤、取棕黑色固体将的干燥，再使用连续萃取装置，以石油醚(bp 60-90℃)当溶剂萃取十二小时后，将石油醚溶液浓缩，可得一黄色固体。经乙醇作再结晶，即可得淡黄色针状结晶的化合物2(10.5g，94％)。

mp 92-93℃(lit.91-93℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ1.41(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃)，4.42(q，J＝7.2Hz，2H，CH₂)，7.20(t，J＝7.9Hz，1H，ArH)，7.28(d，J＝2.1Hz，1H，ArH)，7.97(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，8.21(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，10.25(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ14.8，62.0，109.7，120.5，122.6，130.0 130.6，131.1，131.3，133.8，161.1；

MS(EI)m/z 235(M+1，100％)，234(M⁺，69％)，189(M-45，38％).

(3)制备例3：制备化合物3(7-硝基-1H-吲哚-2-羧酸，7-Nitro-1H-indole-2-carboxylic acid)

取化合物2(13.79g，58.88mmol)倒入锥形瓶(250mL)中，再加入40℃的乙醇(72.7mL)于锥形瓶搅拌五分钟，接着加入由氢氧化钾(7.25g，189.59mmol)与水(17.40g)所调配的氢氧化钾水溶液，搅拌五分钟后溶液呈红棕色澄清。待温度缓缓下降，开始有黄褐色固体沈淀，持续搅拌三小时后，加入热水(295mL)将黄褐色固体溶解，此时溶液呈红棕色澄清状态。再取3N稀盐酸缓缓加入溶液，即有乳黄色固体沉淀生成，搅拌十分钟，直至乳黄色固体不再生成，将溶液过滤。用水冲涤乳黄色固体后取固体干燥，用乙醇作再结晶，即可得到淡黄色棉絮状的化合物3(11.57g，96％)。

mp 269-271℃(lit.269-272℃)；

¹H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ7.35(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.40(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.22(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，8.27(dd，J＝0.8，8.0Hz，1H，ArH)，11.16(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ109.6，110.0，120.6，122.3，130.1，131.3，131.8，134.0，161.6；

MS(EI)m/z 206(M⁺，100％)，188(M-18，65％)，142(M-64，49％)，114(M-92，43％).

(4)制备例4：制备化合物4(7-硝基-1H-吲哚，7-Nitro-1H-indole)

取化合物3(1.63g，7.91mmol)溶在喹啉(quinoline，13mL)中，再加入氧化铜(0.19g)。搅拌均匀后加热至194℃。加热过程中有气体生成，待反应两小时后不再有气体生成，且经TLC测试反应完全时。将溶液倒入由浓盐酸(21.3mL)加入冰水(42.6mL)所组成的盐酸水溶液中，搅拌后溶液有黑色固体生成。将溶液过滤，分别用乙醚将黑色沈淀物与滤液进行萃取。收集两相的萃取液，再分别经饱和的碳酸氢钠水溶液与纯水清洗，取有机层加入硫酸钠脱水后过滤、浓缩，得一黄色固体。取固体用乙醇作再结晶，即可得到淡黄色针状的化合物4(0.87g，69％)。

mp 96-97℃(lit.⁷¹95-96℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.63(dd，J＝2.2，1.0Hz，1H，ArH)，7.08-7.18(m，1H，ArH)，7.32(t，J＝3.0Hz，1H，ArH)，7.90(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，8.08(d，J＝8.1Hz，1H，ArH)，9.88(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ103.7，118.9，119.2，128.4，129.1，129.3，132.9，133.5；

MS(EI)m/z 162(M⁺，100％)，116(M-46，87％)，104(M-58，41％)，89(M-73，53％).

(5)制备例5：制备化合物5a(N-(1H-吲哚-7-基)苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)benzenesulfonamide)

将化合物4(1.44g，8.88mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(0.10g，1.87mmol)加水(4mL)所组成的氯化氨水溶液与铁粉(1.50g，26.86mmol)，搅拌均匀后升温至60℃，加热两小时后，经TLC确定反应完全，再加入活性碳搅拌三分钟，然后将溶液过滤，并使用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达100mL。随即将苯磺酰氯(benzenesulfonyl chloride，1.90g，10.76mmol)与吡啶(pyridine，4.0mL，49.68mmol)依次加入溶液。在室温下搅拌十小时，经TLC确定反应完全，再加入乙酸乙酯稀释至200mL，将溶液依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗，清洗后有机层呈红棕色。加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩后得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得白色针状结晶的化合物5a(2.28g，94％)。

mp 178-179℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.41(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，6.54(dd，J＝2.2，3.1Hz，1H，ArH)，6.86(t，J＝7.8Hz，1H，ArH)，6.90(s，1H，NH)，7.24-7.26(m，2H，ArH)，7.31-7.32(m，1H，ArH)，7.34-7.36(m，1H，ArH)，7.50(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.54-7.59(m，2H，ArH)，9.20(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ103.2，118.5，120.2，120.3，120.4，125.8，127.9，129.5，130.6，132.4，133.7，138.3；

MS(EI)m/z 272(M⁺，63％)，131(M-141，100％)，104(M-168，94％)，77(M-195，85％)；

HRMS(m/z)for C₁₄H₁₂N₂O₂S(M⁺)：Calcd，272.0620；Found，272.0617.Anal.(C₁₄H₁₂N₂O₂S)：Calcd，C，61.75；H，4.44；N，10.29；Found，C，61.48；H，4.52；N，10.22.

实施例2：制备化合物5b(N-(1H-吲哚-7-基)-4-甲基苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)

将实施例1中的化合物4(2.00g，12.33mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(0.13g，2.43mmol)加水(7mL)所组成的氯化氨水溶液与铁粉(2.07g，37.06mmol)。于60℃加热三小时三十分后，经TLC确定反应完全，再加入活性碳搅拌三分钟，将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达100mL。随即加入由4-甲基苯磺酰氯(4-methylbenzenesulfonyl chloride，3.29g，17.26mmol)与吡啶(3.00mL，37.27mmol)所配置的溶液。在室温下搅拌三小时后，经TLC确定反应完全，以乙酸乙酯稀释至250mL，再依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗，清洗后有机层呈红棕色。加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩后得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得白色针状结晶的化合物5b(2.27g，64％)。

mp 159-160℃(lit.157-159℃)；

¹H NMR(200MHz，acetone-d₆)δ2.34(s，1H，CH₃)，6.47(dd，J＝3.1，2.0Hz，1H，ArH)，6.73(dd，J＝7.6，1.2Hz，1H，ArH)，6.84(dt，J＝7.6，1.6Hz，1H，ArH)，7.26(dd，J＝4.0，0.4Hz，2H，NH)，7.34-7.41(m，2H，ArH)，7.57(t，J＝1.8Hz，1H，ArH)，7.61(t，J＝1.6Hz，1H，ArH)，8.71(s，1H，NH)，10.10(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ21.4，102.9，117.7，119.4，120.0，122.3，126.2，128.1，130.2，131.0，132.4，137.7，144.3；

MS(EI)m/z 286(M⁺，56％)，131(M-155，100％)，104(M-182，38％).

实施例3：制备化合物5c(N-(1H-吲哚-7-基)-4-甲氧基苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)-4-methoxybenzenesulfonamide)

将实施例1中的化合物4(2.00g，12.33mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(0.13g，2.47mmol)加水(7mL)所配置的氯化氨水溶液与铁粉(2.07g，37.00mmol)。于60℃加热两小时后，经TLC确定反应完全，加入活性碳搅拌三分钟，将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达150mL。随即加入由4-甲氧基苯磺酰氯(4-methoxybenzenesulfonyl chloride，3.56g，17.23mmol)与吡啶(4.00mL，49.70mmol)所配置的溶液。在室温下搅拌三小时后经TLC确定反应完全，加入乙酸乙酯稀释至250mL，再依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗，清洗后有机层呈红棕色。加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩后得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得黄色片状结晶化合物5c(1.54g，30％)。

mp 161-162℃(lit.⁶² 161-162℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ3.7(s，3H，CH₃)，6.43-6.46(m，2H，ArH)，6.72(s，1H，ArH)，6.76(s，1H，ArH)，6.78(t，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.05(s，1H，NH)，7.16(t，J＝2.6Hz，1H，ArH)，7.39(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，7.52(s，1HArH)，7.56(s，1H ArH)，9.23(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ56.0，103.0，114.6，118.1，120.1，120.5，125.5，125.7，129.8，123.0，130.4，132.1，163.6；

MS(EI)m/z 302(M⁺，59％)，131(M-171，100％)，104(M-182，51％).

实施例4：制备化合物5d(4-氯-N-(1H-吲哚-7-基)苯磺酰胺，4-Chloro-N-(1H-indol-7-yl)benzenesulfonamide)

将实施例1中的化合物4(2.48g，15.30mmol)溶于异丙醇(45mL)中，再加入由氯化氨(0.16g，9mmol)加水(9mL)所组成的氯化氨水溶液与铁粉(2.56g，45.8mmol)。于60℃加热两小时后，经TLC确定反应完全，加入活性碳搅拌三分钟，将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达150mL。随即加入4-氯苯磺酰氯(4-chlorobenzenesulfonyl chloride，3.38g，16.00mmol)与吡啶(3.70mL，45.97mmol)所配置的溶液。在室温下搅拌七小时三十分后经TLC确定反应完全，以乙酸乙酯稀释至250mL，再依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗，清洗过程中有严重乳化现象，清洗后有机层呈红棕色。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩后得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得针状白色结晶的化合物5d(3.13g，67％)。

mp 163-164℃(lit.163-164.5℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.44(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，6.54(dd，J＝2.2，3.0Hz，1H，ArH)，6.84(t，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.96(s，1H，NH)，7.34-7.41(m，2H，ArH)，7.46-7.55(m，2H，ArH)，7.64-7.69(m，2H，ArH)，9.28(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ103.2，118.7，119.8，120.2，120.7，125.8，129.3，129.7，130.7，132.3，136.6，140.2；

MS(EI)m/z 306(M⁺，25％)，131(M-171，90％)，104(M-182，100％).

实施例5：制备化合物5e(N-(1H-吲哚-7-基)-4-硝基苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)-4-nitrobenzenesulfonamide)

将实施例1中的化合物4(1.36g，8.39mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(0.09g，1.68mmol)加水(5mL)所配置的氯化氨水溶液与铁粉(1.40g，25.16mmol)。于60℃加热一小时三十分后，经TLC确定反应完全，加入活性碳搅拌三分钟，将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达100mL。随即依次加入4-硝基苯磺酰氯(4-nitrobenzenesulfonyl chloride，2.60g，11.74mmol)与吡啶(3.00mL，33.55mmol)。在室温下搅拌三小时后，以乙酸乙酯稀释至200mL，并依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗溶液，清洗后有机层呈红棕色。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得黄色片状结晶的化合物5e(1.93g，73％)。

mp 185-186℃(lit.188-189℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.54(dd，J＝3.1，2.1Hz，2H，ArH)，6.64(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，6.84(t，J＝7.7Hz，1H，ArH)，7.26-7.28(m，2H，ArH，NH)，7.41-7.52(m，2H，ArH)，7.58-7.70(m，2H，ArH)，7.87(d，J＝7.9，1.2Hz，1HArH)，9.06(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ103.3，118.8，119.5，120.1，121.1，125.7，125.8，130.7，131.9，132.6，133.0，134.5；MS(EI)m/z 317(M⁺，37％)，206(M-111，58％)，131(M-186，100％)，104(M-213，79％)；

HRMS(m/z)for C₁₄H₁₁N₃O₄S(M⁺)：Calcd，317.0470；Found，317.0470.Anal.(C₁₄H₁₁N₃O₄S)：Calcd，C，52.99；H，3.49；N，13.24；Found，C，52.99；H，3.51；N，13.07.

实施例6：制备化合物5g(N-(1H-吲哚-7-基)-4-磺酰胺基苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)-4-sulfamoylbenzenesulfonamide)

(1)制备化合物10(4-硫酰苯磺酰氯，4-Sulfamoylbenzenesulfonylchloride)

反应流程式II

式II

如反应流程II所示，首先先制备化合物9的水溶液，取化合物8(6.4g，37.2mmol)在冰浴中加入水(12.5mL)及浓盐酸(6.30mL，205.68mmol)搅拌均匀，再加入由亚硝酸钠(2.65g，38.41mmol)与水(10mL)所组成的水溶液，待溶液由含白色固体转为黄色澄清时，化合物9水溶液制备完成。另取锥形瓶加入冰醋酸(35mL)通入二氧化硫气体40分钟，加入无水氯化铜(cupricchloride dehydrate，1.5g，13.74mmol)搅拌十分钟后，逐滴加入先前所配置化合物9水溶液，加入后立即有白色沉淀与气体产生。搅拌十分钟，将颜色呈苹果绿的溶液过滤，可得一乳白色固体。用水冲洗固体后取固体干燥。即可得纯的化合物10(4.37g，46％)。

mp 152-153℃(lit.⁷⁴153-156℃)；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ5.12(s，2H，NH2)，8.18(d，J＝0.6Hz，4H，ArH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ128.2，144.9；

MS(EI)m/z 220(M⁺，100％)，156(M-64，60％)，76(M-144，57％).

(2)制备例2：制备化合物5g(N-(1H-吲哚-7-基)-4-磺酰胺基苯磺酰胺)

将本实施例中制备例1的化合物4(2.00g，12.33mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(0.13g，2.43mmol)加水(9mL)所组成的氯化氨水溶液与铁粉(2.07g，37.20mmol)。于60℃加热一小时三十分后，经TLC确定反应完全，加入活性碳搅拌三分钟，再将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达150mL。随即依次加入化合物10(3.31g，13.3mmol)与吡啶(3.00mL，33.55mmol)。在室温下搅拌十小时后，经TLC确定反应完全，经乙酸乙酯稀释至250mL，再依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗溶液，洗后有机层呈红棕色。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得针状白色结晶的化合物5g(2.13g，66％)。

mp 215-216℃；

¹H NMR(200MHz，acetone-d₆)δ6.45(d，J＝4.2Hz，1H，ArH)，6.69(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，6.79(s，1H，NH)，6.83(t，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.34(t，J＝2.6Hz，1H，ArH)，7.42(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)，7.95(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，7.99(s，1H，NH)，8.98(s，1H，NH)，10.15(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ102.5，117.7，119.6，121.2，125.82，126.0，127.1，128.4，130.7，140.2，143.2，148.3；

MS(EI)m/z 351(M⁺，53％)，131(M-220，100％)，104(M-247，47％).

实施例7：制备化合物5h(N-(1H-吲哚-7-基)-2-硝基苯磺酰胺，N-(1H-Indol-7-yl)-2-nitrobenzenesulfonamide)

将实施例1中的化合物4(2.00g，12.33mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(0.13g，2.43mmol)加水(9mL)所组成的氯化氨水溶液与铁粉(2.07g，37.20mmol)。于60℃加热一小时三十分后，经TLC确定反应完全，加入活性碳搅拌三分钟，再将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质至滤液达150mL。随即加入2-硝基苯磺酰氯(2-nitrobenzenesulfonyl chloride，3.83g，17.26mmol)与吡啶(4.00mL，44.70mmol)。溶液颜色由淡黄褐色转变成深紫，在室温下搅拌三小时后，经TLC确定反应完全，溶液经乙酸乙酯稀释至250mL，再依次经1N的稀盐酸、纯水、饱和的碳酸氢钠水溶液与饱和食盐水清洗溶液，洗后有机层呈黑褐色。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，将滤液浓缩得一固体，取固体以乙醇作再结晶，即可得片状黄色结晶的化合物5h(1.61g，41％)。

mp 187-188℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.55(dd，J＝0.8，2.2Hz，1H，ArH)，6.62(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，6.84(t，J＝7.8Hz，1H，ArH)，7.26(s，1H，NH)，7.27(t，J＝3.0Hz，1H，ArH)，7.41-7.53(m，2H，ArH)，7.58-7.71(m，2H，ArH)，7.87(dd，J＝7.0，0.8Hz，1H，ArH)，9.04(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ103.3，118.8，119.4，120.1，121.1，125.7，125.8，130.7，131.9，132.6，132.9，134.5；

MS(EI)m/z 317(M⁺，35％)，131(M-186，88％)，104(M-213，100％)，77(M-240，26％)；

HRMS(m/z)for C₁₄H₁₁N₃O₄S(M⁺)：Calcd，317.0470；Found，317.0476.Anal.(C₁₄H₁₁N₃O₄S)：Calcd，C，52.99；H，3.49；N，13.24；Found，C，52.69；H，3.59；N，13.13.

实施例8：制备化合物6a(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)benzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5a(0.85g，3.12mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(p-toluene sulfonic acid，0.30g，1.56mmol)与2，5-己二酮(hexane-2，5-dione，0.71g，6.24mmol)。加热回流四小时三十分，经TLC确认起始物不再减少，将紫色的乙醇溶液抽干，加入乙酸乙酯以水萃取，取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体。以管柱层析法(硅胶；ψ4cmx16cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝7/5)进行分离。收集液体(R_f＝0.61，己烷/乙酸乙酯＝7/5)浓缩即可得白色固体的化合物6a(0.47g，43％)。

mp 237-238℃；

¹H NMR(200MHz，acetone-d₆)δ2.52(s，3H，CH₃)，2.76(s，3H，CH₃)，6.89(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，7.01-7.08(m，3H，ArH)，7.38-7.54(m，3H，ArH)，7.73-7.78(m，2H，ArH)，7.98(d，J＝3.8Hz，1H，ArH)，8.82(s，1H，NH)，9.83(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ17.0，20.8，118.3，118.8，119.4，119.8，121.6，122.3，122.6，127.2，127.3，127.9，129.3，129.7，131.2，136.6，139.6，140.3.

实施例9：制备化合物6b(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-4-甲基苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-4-methylbenzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5b(1.00g，3.49mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(0.33g，1.75mmol)与2，5-己二酮(0.80g，6.98mmol)。加热回流三十六小时，经TLC确认反应完全后，将乙醇溶液抽干，加入乙酸乙酯以水萃取。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体，以管柱层析(硅胶；ψ4cmx13cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝7/5)进行分离，收集液体(R_f＝0.57，己烷/乙酸乙酯＝7/5)浓缩即可得白色固体的化合物6b(1.26g，99％)。

mp 185-186℃；

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ2.33(s，3H，CH₃)，2.52(s，3H，CH₃)，2.79(s，3H，CH₃)，6.71(d，J＝3.8Hz，1H，ArH)，6.92(d，J＝3.6Hz，1H，ArH)，6.97(t，J＝3.9Hz，1H，ArH)，7.01(s，1H，NH)，7.15(t，J＝4.1Hz，3H，ArH)，7.59(d，J＝4.1Hz，2H，ArH)，7.98(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，9.07(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ16.5，20.4，21.5，117.9，119.1，119.214，121.113，121.2，121.3，121.5，126.6，126.6，127.5，129.7，130.7，134.9，135.7，139.1，144.2；

MS(EI)m/z 364(M⁺，23％)，209(M-155，100％)，28(M-336，37％)；

HRMS(m/z)for C₂₁H₂₀N₂O₂S(M⁺)：Calcd，364.1245；Found，364.1247.Anal.(C₂₁H₂₀N₂O₂S)：Calcd，C，69.20；H，5.53；N，7.69；Found，C，69.23；H，5.53；N，7.56.

实施例10：制备化合物6c(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-4-甲氧基苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-4-methoxybenzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5c(0.70g，2.32mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(0.22g，1.16mmol)与2，5-己二酮(0.53g，4.63mmol)，加热回流六小时，经TLC确认起始物不再减少，将乙醇抽干，加入乙酸乙酯溶解并以水萃取。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体，以管柱层析(硅胶；ψ4cmx11cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝7/5)进行分离。收集液体(R_f＝0.56，己烷/乙酸乙酯＝7/5)浓缩即可得白色固体的化合物6c(0.20g，23％)。

mp 180.5-181℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ2.54(s，3H，CH₃)，2.80(s，3H，CH₃)，3.77(s，3H，OCH₃)，6.69(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.79(s，1H，ArH)，6.84(s，1H，ArH)，6.90(s，1H，NH)，6.96(dd，J＝7.6，7.8Hz，2H，ArH)，7.14(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，7.60(t，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.63(t，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.99(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，9.09(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ21.0，24.8，60.2，119.0，122.7，124.2，125.0，125.1，125.9，126.1，130.8，131.4，134.4，135.3，136.4，139.5，144.1，168.1；MS(EI)m/z 380(M⁺，55％)，209(M-171，100％).Anal.(C₂₁H₂₀N₂O₃S)：Calcd，C，66.29；H，5.30；N，7.36；Found，C，66.05；H，5.37；N，7.06.

实施例11：制备化合物6d(4-氯-N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)苯磺酰胺，4-Chloro-N-(5，8-dimethyl-9H-carbazol-1-yl)benzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5d(1.00g，3.26mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(0.30g，1.60mmol)与2，5-己二酮(0.74g，6.52mmol)。加热回流九小时，经TLC确认起始物不再减少，将乙醇溶液抽干，加入乙酸乙酯溶解并以水萃取。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体，以管柱层析(硅胶；ψ4cmx15cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝7/5)进行分离。收集液体(R_f＝0.57，己烷/乙酸乙酯＝7/5)浓缩即可得白色固体的化合物6d(0.67g，53.25％)。

mp 217-218℃；

¹H NMR(200MHz，acetone-d₆)δ2.52(s，3H，CH₃)，2.77(s，3H，CH₃)，6.90(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.05-7.17(m，3H，ArH)，7.46-7.53(m，2H，ArH)，7.72(t，J＝2.1Hz，1H，ArH)，7.75(m，1H，ArH)，7.89(dd，J＝7.3，1.6Hz，1H，ArH)，8.88(s，1H，NH)，9.84(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ16.8，20.5，118.5，120.0，121.2，121.5，121.8，122.0，126.7，127.3，128.1，129.8，131.2，133.7，135.6，139.9，140.6；

MS(EI)m/z 384(M⁺，27％)，209(M-175，100％)，28(M-356，60％)；

HRMS(m/z)for C₂₀H₁₇ClN₂O₂S(M⁺)：Calcd，384.0699；Found，384.0700.Anal.(C₂₀H₁₇ClN₂O₂S)：Calcd，C，62.41；H，4.45；N，7.28；Found，C，62.42；H，4.48；N，7.14.

实施例12：制备化合物6e(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-4-硝基苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-4-nitrobenzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5e(1.00g，3.15mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(0.30g，1.58mmol)与2，5-己二酮(0.72g，6.30mmol)。加热回流五小时，经TLC确认起始物不再减少且反应已达平衡，将乙醇溶液抽干，加入乙酸乙酯溶解并以水萃取，取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体，以管柱层析(硅胶；ψ4cmx10cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝3/1)进行分离，收集液体(R_f＝0.34，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩即可得黄色固体的化合物6e(0.31g，79％)，并回收液体(R_f＝0.26，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩即可得化合物5e(0.21g)。

mp 202-203℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ2.55(s，3H，CH₃)，2.79(s，3H，CH₃)，6.89(dd，J＝7.7，1.0Hz，1H，ArH)，6.92-7.03(m，2H，ArH)，7.16(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.31(s，1H，NH)，7.42(ddd，J＝1.2，7.4，7.9Hz，1H，ArH)，7.58(dd，J＝7.9，1.4Hz，1H，ArH)，7.66(ddd，J＝1.6，8.5，6.9Hz，1H，ArH)，7.87(dd，J＝8.0，1.2Hz，1H，ArH)，8.02(dd，J＝1.0，2.8Hz，1H，ArH)，8.88(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ17.0，20.8，118.3，118.5，119.8，121.6，121.8，122.3，122.9，125.6，127.3，131.2，131.9，132.6，132.9，134.6，136.7，139.5，148.6，161.8；

MS(EI)m/z 396(M+1，38％)，395(M⁺，12％)，209(M-186，100％).Anal.(C₂₀H₁₇N₃O₄S)：Calcd，C，60.75；H，4.33；N，10.63；Found，C，60.46；H，4.29；N，10.37.

实施例13：制备化合物6f(4-胺基-N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)苯磺酰胺，4-Amino-N-(5，8-dimethyl-9H-carbazol-1-yl)benzenesulfonamide)

将化合物6e(0.15g，0.38mmol)溶于异丙醇(25mL)中，再加入由氯化氨(4.1mg，0.07mmol)加水(0.5mL)所组成的氯化氨水溶液与铁粉(64mg，1.14mmol)。于60℃加热一小时后，经TLC确定反应完全，加入活性碳搅拌三分钟，将溶液过滤，用乙酸乙酯冲洗滤质，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体，以管柱层析(硅胶；ψ1.5cmx10cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝3/1)进行分离，收集液体(R_f＝0.24，己烷/乙酸乙酯＝2/1)浓缩即可得黄色固体的化合物6f(0.08g，58％)。

mp 254-255℃；

¹H NMR(200MHz，acetone-d₆)δ2.51(s，3H，CH₃)，2.74(s，3H，CH₃)，3.12(s，2H，NH₂)，6.87(d，J＝7.0Hz，1H，ArH)，7.04-7.17(m，3H，ArH)，7.97-8.01(m，3H，ArH)，8.24-8.28(m，2H，ArH)，9.14(s，1H，NH)，9.95(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ17.0，20.8，118.2，118.4，119.4，121.6，121.9，122.4，122.9，125.6，127.3，131.2，131.9，132.7，133.0，134.5，136.6，139.5，148.6，161.8.

实施例14：制备化合物6g(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-4-磺酰胺基苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-4-sulfamoylbenzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5g(1.00g，2.85mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(0.27g，1.43mmol)与2，5-己二酮(0.65g，5.70mmol)。加热回流五小时，经TLC确认反应完全，将乙醇溶液抽干，加入乙酸乙酯溶解并以水萃取，取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液抽干乙酸乙酯可得一固体，以管柱层析(硅胶；ψ4cmx7cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝3/1)进行分离。收集液体(R_f＝0.39，己烷/乙酸乙酯＝2/1)浓缩即可得白色固体的化合物6g(1.06g，86％)。

mp 290-291℃；

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ2.50(s，3H，CH₃)，2.69(s，3H，CH₃)，6.85(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.05(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.09(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.24(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.47(s，2H，NH₂)，7.84(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.90(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.87(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，8.00(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)，10.22(s，1H，NH)，10.63(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ16.5，20.3，116.2，117.4，119.5，120.1，120.3，124.8，126.3，126.6，127.9，129.1，138.6，147.7；

MS(EI)m/z 429(M⁺，55％)，209(M-220，100％)，28(M-401，50％)；

HRMS(m/z)for C₂₀H₁₉N₃O₄S(M⁺)：Calcd，429.0817；Found，429.0816.Anal.(C₂₀H₁₉N₃O₄S)：Calcd，C，55.93；H，4.46；N，9.78；Found，C，55.77；H，4.57；N，9.64.

实施例15：制备化合物6h(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-2-硝基苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-2-nitrobenzenesulfonamide)

取三颈瓶加入化合物5h(0.60g，1.89mmol)与乙醇(25mL)均匀混合后，再加入对甲苯磺酸(0.18g，0.95mmol)与2，5-己二酮(0.43g，3.78mmol)。加热回流三小时后，有乳黄色固体生成。反应二十小时，经TLC确认起始物不再减少且反应已达平衡，将乙醇溶液过滤，取滤液抽干，加入乙酸乙酯溶解并以水清洗。取有机层加入硫酸钠脱水后过滤，取滤液加入活性碳加热搅拌后过滤，将滤液抽干可得一绿色固体，以管柱层析(硅胶；ψ4cmx15cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝3/1)进行分离。收集液体(R_f＝0.67，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩即可得黄色固体的化合物6h(0.48g，65％)。

mp 202-203℃；

¹H NMR(200MHz，acetone-d₆)δ2.53(s，3H，CH₃)，2.76(s，3H，CH₃)，6.90(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.05-7.14(m，2H，ArH)，7.23(dd，J＝1.2，3.9Hz，1H，ArH)，7.31(s，1H，NH)，7.63(dt，J＝1.4，7.6Hz，1H，ArH)，7.76-7.85(m，2H，ArH)，7.95(dt，J＝1.2，8.2Hz，1H，ArH)，8.04(dd，J＝0.8，7.7Hz，1H，ArH)，9.10(s，1H，NH)，9.96(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ16.4，20.2，118.2，119.6，119.8，121.5，121.7，125.3，126.5，127.1，130.8，131.9，132.2，132.6，135.0，136.0，140.0，148.7；

MS(EI)m/z 395(M⁺，17％)，209(M-186，100％)；

HRMS(m/z)for C₂₀H₁₇N₃O₄S(M⁺)：Calcd，395.0940；Found，395.0941.Anal.(C₂₀H₁₇N₃O₄S)：Calcd，C，60.75；H，4.33；N，10.63；Found，C，60.66；H，4.41；N，10.40.

实施例16：制备化合物7a(4-氯-N-[3-(4-硝基苯偶氮)-1H-吲哚-7-基]苯磺酰胺，4-Chloro-N-[3-(4-nitrophenylazo)-1H-indol-7-yl]benzenesulfonamide)

反应流程式III

式III

如反应流程式III所示，首先先制备化合物12的水溶液，将化合物11(4-硝基苯胺，4-nitrophenylamine，1.15g，8.29mmol)于冰浴中加入浓盐酸(9.29mL)，加水稀释至100mL后。再逐滴加入由亚硝酸钠(0.95g，13.80mmol)与水(25mL)所组成的水溶液，待溶液变成黄色澄清状时，化合物12的水溶液即制备完成。另在冰浴中，将化合物5d(2g，6.52mmol)加入冰水(20g)搅拌，再加入由氢氧化钾(1.90g，33.90mmol)与水(280mL)所配置的氢氧化钾水溶液，待搅拌至溶液完全溶解呈澄清状后，逐滴加入先前所配置的化合物12的水溶液中。加入后立即有深红色沉淀生成，搅拌十分钟，将溶液过滤，取暗红色固体干燥。经管柱层析(硅胶；ψ4cmx18cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝7/5)分离。收集液体(R_f＝0.48，己烷/乙酸乙酯＝7/5)浓缩得红棕色的的化合物7a(0.63g，21％)。

mp 217-218℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.78(d，J＝7.9Hz，1H，ArH)，7.24-7.38(m，4H，ArH)，7.57-7.70(m，3H，ArH)，8.00(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，8.33(d，J＝8.1Hz，2H，ArH)，9.81(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，acetone-d₆)δ104.1，115.5，122.0，123.3，124.9，125.2，126.4，129.4，129.7，129.8，131.7，138.6，139.3，143.2，148.7，157.1；MS(EI)m/z 455(M⁺，44％)，280(M-175，85％)，234(M-221，66％)，130(M-325，52％)；

HRMS(m/z)for C₂₀H₁₄ClN₅O₄S(M⁺)：Calcd，455.0455；Found，455.0424.Anal.(C₂₀H₁₄ClN₅O₄S)：Calcd，C，52.69；H，3.10；N，15.36；Found，C，52.44；H，3.17；N，15.08.

实施例17：制备化合物7b(4-甲基-N-(3-苯偶氮-1H-吲哚-7-基)苯磺酰胺，4-Methyl-N-(3-phenylazo-1H-indol-7-yl)benzenesulfonamide)

反应流程式IV

式IV

如反应流程式IV所示，首先先制备化合物14的溶液，将化合物13(苯胺，phenylamine，0.15g，1.63mmol)于冰浴中加入浓盐酸(1.83mL)，并加水稀释至20mL。再逐滴加入由亚硝酸钠(0.19g，2.72mmol)与水(5mL)所组成的水溶液，待溶液变成黄色澄清状时，化合物14的溶液即制备完成。另在冰浴中，将化合物5b(0.36g，1.26mmol)加入冰水(5g)中搅拌，再加入由氢氧化钾(0.36g，6.42mmol)与水(54mL)所配置的氢氧化钾水溶液，搅拌至完全溶解呈澄清状后，逐滴加入先前所配置的化合物14溶液。加入后立即有深红色沉淀生成，搅拌十分钟后将溶液过滤，取暗红色固体干燥。固体经管柱层析(硅胶；ψ4cmx13cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝3/1)分离。收集液体(R_f＝0.56，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩得橘红色的24b(0.24g，55％)，回收液体(R_f＝0.39，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩得化合物7b(0.04g，0.14mmol)。

mp 212-213℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ2，30(s，3H，CH₃)，6.82(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.14(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.40-7.34(m，2H，ArH)，7.42-7.55(m，3H，ArH)，7.60(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.64(s，1H，ArH)，7.68(s，1H，ArH)，7.83(s，1H，NH)，7.93(t，J＝1.4Hz，1H，ArH)，7.96(t，J＝1.8Hz，1H，ArH)，9.65(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ22.0，104.0，116.9，121.2，122.8，123.0，123.5，127.8，128.8，129.48，130.3，130.9，132.4，135.2，143.8，145.0，153.8；MS(EI)m/z 390(M⁺，58％)，235(M-155，100％)，28(M-362，86％).

实施例18：制备化合物7c(4-氯-N-(3-苯偶氮-1H-吲哚-7-基)苯磺酰胺，4-Chloro-N-(3-phenylazo-1H-indol-7-yl)benzenesulfonamide)

反应流程式V

式V

如反应流程式V所示，首先先制备化合物14的溶液，将化合物13(0.18g，1.91mmol)于冰浴中加入浓盐酸(2.14mL)，加水稀释至20mL后，再逐滴加入由亚硝酸钠(0.21g，3.05mmol)与水(5mL)所组成的水溶液，待溶液变成黄色澄清状时，化合物14溶液即制备完成。另在冰浴中，将化合物5d(0.45g，1.26mmol)加入冰水中(5g)搅拌，再加入由氢氧化钾(0.42g，7.49mmol)与水(63mL)所配置的氢氧化钾水溶液，搅拌至溶液完全溶解呈澄清状后，加入本制备例中先前所配置的化合物14溶液，加入后立即有棕红色沉淀生成，搅拌十分钟后将溶液过滤，取暗红色固体干燥，经管柱层析(硅胶；ψ4cmx21cm；冲提液：己烷/乙酸乙酯＝3/1)分离。收集液体(R_f＝0.40，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩得化合物7c(0.23g，54％)，回收液体(R_f＝0.31，己烷/乙酸乙酯＝3/1)浓缩得化合物5d(0.13g，0.42mmol)。

mp 110-111℃；

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ6.70(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.34(d，J＝8.6Hz，3H，ArH)，7.34-7.50(m，5H，ArH，NH)，7.62(d，J＝8.2Hz，3H，ArH)，7.94(d，J＝8.6Hz，2H，ArH)，9.42(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50MHz，CDCl₃)δ103.2，119.5，120.8，121.0，121.3，121.5，126.3，126.8，127.6，129.3，130.7，133.2，139.4，140.1，145.1，154.7；

MS(EI)m/z 410(M⁺，33％)，235(M-175，100％)，130(M-280，48％)，111(M-299，55％)；

HRMS(m/z)for C₂₀H₁₅ClN₄O₂S(M⁺)：Calcd，410.0604；Found，410.0607.

实施例19：制备化合物6i(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-3，4，5-三甲氧基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-3，4，5-trimethoxy-benzenesulfonamide)

于氢气氛下，将化合物4(0.5g，3.08mmol)及10％Pd/C(0.2g)混合物于甲醇(30mL)中搅拌1小时。过滤移除Pd/C后，将滤液于真空下干燥，可得油状物。将乙酸乙酯(30mL)及3，4，5-三甲氧基苯磺酰氯(3，4，5-trimethoxybenzene-sulfonyl chloride)(0.9g，3.38mmol)加至油状物中，并于50℃下搅拌1小时。将反应物通过填充有硅胶的漏斗进行粗过滤，而后以乙酸乙酯清洗的。于真空下干燥滤液后，将反应粗产物及己二酮(acetonylacetone)(0.5mL，4.38mmol)，在对甲苯磺酸(p-toluenesulfonicacd)(0.7g，4.06mmol)的存在下，以乙醇(20mL)回流3小时进行反应。最后，使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.20，己烷/乙酸乙酯＝4/1)，经由乙醇再结晶后，可得到一白色固体化合物6i(0.66g，48％)。

mp＝205-207℃；

ESI(M-H⁺)439.1；

¹H NMR(200Hz，DMSO-d₆)δ2.07(s，3H，CH₃)，2.68(s，3H，CH₃)，3.43(s，3H，OCH₃)，3.62(s，6H，OCH₃)，6.82(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，6.95(s，2H，ArH)，7.00-7.15(m，2H，ArH)，7.37(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.87(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.72(s，1H，NH)，10.51(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50Hz，DMSO-d₆)δ16.37，20.07，55.99，59.87，104.24，117.27，118.38，119.12，119.31，120.32，120.56，121.15，124.77，126.15，129.82，132.85，133.96，138.45，140.67，152.50.

Anal.(C₂₃H₂₄N₂O₅S)：Calcd，C，62.71；H，5.49；N，6.36；S，7.28；Found，C，62.75；H，5.69；N，6.59；S，7.10.

实施例20：制备化合物6j(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-3-三氟甲基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-3-trifluoromethyl-benzenesulfonamide)

于氢气氛下，将化合物4(0.5g，3.08mmol)及10％Pd/C(0.2g)混合物于甲醇(30mL)中搅拌1小时。过滤移除Pd/C后，将滤液于真空下干燥，可得油状物。将乙酸乙酯(30mL)及3-三氟甲基苯磺酰氯(3-trifluoromethylbenzenesulfonyl chloride)(0.8g，3.27mmol)加至油状物中，并于50℃下搅拌1小时。将反应物通过填充有硅胶的漏斗进行粗过滤，而后以乙酸乙酯清洗的。于真空下干燥滤液后，将反应粗产物及己二酮(acetonylacetone)(0.5mL，4.38mmol)，在对甲苯磺酸(p-toluenesulfonicacd)(0.7g，4.06mmol)的存在下，以乙醇(20mL)回流3小时进行反应。最后，使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.15，己烷/乙酸乙酯＝8/1)，可得到一白色固体化合物6j(2.01g，78％)。

mp＝217-218℃；

ESI(M-H⁺)417.1；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ2.43(s，3H，CH₃)，2.66(s，3H，CH₃)，6.82(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.05-7.11(m，2H，ArH)，7.27(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.62(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.86(t，J＝7.6Hz，2H，ArH)，7.92(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，8.13(s，1H，ArH)，9.97(s，1H，ArH)，10.50(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ16.28，19.98，111.40，118.71，119.07，119.73，120.18，120.32，120.60，121.88，123.39，123.43，123.47，124.59，124.96，126.20，129.49，129.60，129.64，129.77，129.82，130.56，130.80，132.99，138.56,140.52.

Anal.(C₂₁H₁₇F₃N₂O₂S)：Calcd，C，60.28；H，4.10；N，6.69；F，13.62；S，7.66；Found，C，75.89；H，5.88；N，12.76.

实施例21：制备化合物6k(5-氯-噻吩-2-磺酸(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-酰胺，5-Chloro-thiophene-2-sulfonic acid(5，8-dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-amide)

于氢气氛下，将化合物4(0.5g，3.08mmol)及10％Pd/C(0.2g)混合物于甲醇(30mL)中搅拌1小时。过滤移除Pd/C后，将滤液于真空下干燥，可得油状物。将乙酸乙酯(30mL)及5-氯-噻吩-2-磺酰氯(5-Chloro-thiophene-2-sulfonyl chloride)(0.7g，3.24mmol)加至油状物中，并于室温下搅拌1小时。将反应物通过填充有硅胶的漏斗进行粗过滤，而后以乙酸乙酯清洗的。于真空下干燥滤液后，将反应粗产物及己二酮(acetonylacetone)(0.5mL，4.38mmol)，在对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acd)(0.7g，4.06mmol)的存在下，以乙醇(20mL)回流3小时进行反应。最后，使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.33，己烷/乙酸乙酯＝8/1)，可得到一白色固体化合物6k(0.87g，72％)。

mp＝232-234℃；

ESI(M-H⁺)389.0；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ2.71(s，3H，CH₃)，6.86(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.07-7.16(m，3H，ArH)，7.31(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.37(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，10.20(s，1H，NH)，10.57(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ16.49，20.05，117.51，117.84，119.14，119.61，120.37，120.40，120.64，124.99，126.24，127.87，129.83，132.63，132.71，135.32，138.08，138.60.Anal.(C₁₈H₁₅ClN₂O₂S₂)：Calcd，C，55.31；H，3.87；N，7.17；S，16.41；Found，C，55.37；H，3.60；N，7.45；S，16.27.

实施例22：制备化合物6l(3，5-二氯-4-(2-氯-4-硝基-苯氧基)-N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-苯磺酰胺，3，5-Dichloro-4-(2-chloro-4-nitro-phenoxy)-N-(5，8-dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-benzenesul fonamide)

于氢气氛下，将化合物4(1.0g，6.16mmol)及10％Pd/C(0.2g)混合物于甲醇(30mL)中搅拌1小时。过滤移除Pd/C后，将滤液于真空下干燥，可得油状物。将CH₂Cl₂(30mL)及3，5-二氯-4-(2-氯-4-硝基-苯氧基)-苯磺酰氯(3，5-Dichloro-4-(2-chloro-4-nitro-phenoxy)-benzenesulfonyl chloride)(2.6g，6.26mmol)加至油状物中，并于室温下搅拌1小时。将反应物通过填充有硅胶的漏斗进行粗过滤，而后以乙酸乙酯清洗的。于真空下干燥滤液后，将反应粗产物及己二酮(acetonylacetone)(0.7mL，6.62mmol)，在对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)(1.10g，6.39mmol)的存在下，以乙醇(20mL)回流3小时进行反应。最后，使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.24，己烷/乙酸乙酯＝6/1)，经由乙醇再结晶后，可得到一白色固体化合物61(1.85g，51％)。

mp＝249℃；

ESI(M-H⁺)588.1；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ2.43(s，3H，CH₃)，2.71(s，3H，CH₃)，6.07(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，6.89(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.09(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.14(t，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.28(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.59(dd，J＝8.8Hz，2.4Hz，1H，ArH)，7.89(s，2H，ArH)，7.95(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，8.41(d，J＝2.4Hz，1H，ArH)，9.96(s，1H，NH)，10.56(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ16.49，20.07，113.74，117.58，119.35，119.70，120.43，120.50，120.84，122.06，124.14，125.05，126.42，126.60，128.35，128.66，129.97，133.94，138.62，139.25，143.13，138.05，155.27.

Anal.(C₂₆H₁₈Cl₃N₃O₅S)：Calcd，C，52.85；H，3.07；N，7.11；Cl，18.00；S，5.43；Found，C，53.10；H，3.27；N，7.36；S，5.68.

实施例23：制备化合物14a(1-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-3-苯基-尿素，1-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-3-phenyl-urea)

于氢气氛下，将化合物4(1.0g，6.16mmol)及10％Pd/C(0.2g)混合物于甲醇(30mL)中搅拌1小时。过滤移除Pd/C后，将滤液于真空下干燥，可得油状物。将CH₂Cl₂(30mL)及苯基异氰酸盐(phenylisocyanate)(0.7mL，6.42mmol)加至油状物中，并于室温下搅拌1小时。所得的悬浮液过滤，可得一灰色固体。反应粗产物及己二酮(acetonylacetone)(0.7mL，6.62mmol)，在对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)(1.10g，6.39mmol)的存在下，以乙醇(20mL)回流3小时进行反应。最后，使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.20，己烷/乙酸乙酯＝4/1)，经由乙醇再结晶后，可得到一白色固体化合物14a(1.12g，55％)。

mp 300-301℃；

ESI(M-H⁺)328.8；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ2.54(s，3H，CH₃)，2.74(s，3H，CH₃)，6.89(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，6.97(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.08-7.16(m，2H)，7.29(d，J＝7.7Hz，2H，ArH)，7.51(d，J＝8.3Hz，2H，ArH)，7.60(d，J＝7.7Hz，1H，ArH)，7.82(d，J＝7.84Hz，1H，ArH)，8.53(s，1H，NH)，8.82(s，1H，NH)，10.65(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ16.81，20.16，117.04，117.64，118.31，119.10，120.44，120.99，121.79，123.51，124.81，125.92，128.79，129.65，131.89，138.81，139.92，153.07.Anal.(C₂₁H₁₉N₃O·0.125C₂H₅OH)：Calcd，C，76.15；H，5.94；N，12.54；Found，C，75.89；H，5.88；N，12.76.

实施例24：制备化合物14b(1-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-3-(4-甲氧基-苯基)-尿素，1-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-3-(4-methoxy-phenyl)-urea)

于氢气氛下，将化合物4(1.0g，6.17mmol)及10％Pd/C(0.2g)混合物于甲醇(30mL)中搅拌1小时。过滤移除Pd/C后，将滤液于真空下干燥，可得油状物。将CH₂Cl₂(30mL)及4-甲氧基苯基异氰酸盐(4-methoxyphenylisocyanate)(0.8mL，6.17mmol)加至油状物中，并于室温下搅拌1小时。所得的悬浮液过滤，可得一灰色固体。反应粗产物及己二酮(acetonylacetone)(0.7mL，6.62mmol)，在对甲苯磺酸(p-toluenesulfonicacid)(1.10g，6.39mmol)的存在下，以乙醇(20mL)回流3小时进行反应。最后，使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.20，己烷/乙酸乙酯＝3/1)，经由乙醇再结晶后，可得到一白色固体化合物14b(0.83g，37％)。

mp 262-263℃；

ESI(M-H⁺)358.9；

¹H NMR(200Hz，DMSO-d₆)δ2.54(s，3H，CH₃)，2.74(s，3H，CH₃)，3.71(s，3H，CH₃)，6.80-6.91(m，3H)，7.07-7.16(m，2H)，7.42(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，7.60(d，J＝7.0Hz，1H，ArH)，7.80(d，J＝7.4Hz，1H，ArH)，8.50(s，1H，NH)，8.72(s，1H，NH)，10.68(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50Hz，DMSO-d₆)δ16.85，20.21，55.18，114.02，116.73，116.79，117.65，119.14，120.13，120.45，121.01，123.83，124.78，125.91，129.67，131.68，132.97，138.81，153.26，154.46，221.88.

Anal.(C₂₂H₂₁N₃O₂·0.125C₂H₅OH)：Calcd，C，73.18；H，6.00；N，11.51；Found，C，72.98；H，5.92；N，11.94.

实施例25：制备化合物15c(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-4-甲氧基-N-甲基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-4-methoxy-N-methyl-benzenesulfonamide)

将化合物6c(0.5g，1.315mmol)、KOH(1颗)、及乙醇(20mL)的溶液，于70℃下搅拌15分钟。添加甲基碘(methyliodide)(3.0mL)至溶液后，于70℃下搅拌1小时。使用管柱层析纯化混合溶液，并收集液体(R_f＝0.30，己烷/乙酸乙酯＝6/1)，可得到化合物15c(0.38g，73％)。

mp＝88-89℃；

ESI(M-H⁺)365.1；

¹H NMR(200Hz，acetone-d₆)δ2.60(s，3H，CH₃)，2.80(s，3H，CH₃)，3.29(s，3H，CH₃)，3.91(s，3H，CH₃)，6.64(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，6.92(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.03-7.18(m，4H，ArH)，7.59(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.10(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，10.23(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50Hz，acetone-d₆)δ17.14，20.65，39.86，56.15，114.92，118.87，119.58，119.58，121.68，122.82，122.90，126.85，126.90，126.97，127.50，129.57，131.09，131.14，139.22，140.21，164.21.

Anal.(C₂₂H₂₂N₂O₃S)：Calcd，C，66.98；H，5.62；N，7.10；S，8.13；Found，C，75.89；H，5.88；N，12.76.

实施例26：制备化合物15j(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-N-甲基-3-三氟甲基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-N-methyl-3-trifluoromethyl-benzenesulfonamide)

将化合物6j(0.5g，1.08mmol)、KOH(1颗)、及乙醇(20mL)的溶液，于70℃下搅拌15分钟。添加甲基碘(methyliodide)(3.0mL)至溶液后，于70℃下搅拌1小时。使用管柱层析纯化混合溶液，并收集液体(R_f＝0.20，己烷/乙酸乙酯＝5/1)，可得到化合物15j(0.37g，79％)。

mp＝192-194℃；

ESI(M-H⁺)431.1；

¹H NMR(200Hz，DMSO-d₆)δ2.57(s，3H，CH₃)，2.73(s，3H，CH₃)，3.33(s，3H，CH₃)，6.59(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，6.87(d，J＝7.3Hz，1H，ArH)，7.59(t，J＝7.8Hz，1H，ArH)，7.11(d，J＝7.3Hz，1H，ArH)，7.70-8.13(m，5H，ArH)，11.12(s，1H，NH)；

¹³C NMR(50Hz，DMSO-d₆)δ17.27，20.27，118.22，118.55，120.57，120.68，122.46，122.53，124.42，124.57，125.69，126.76，129.74，130.98，131.86，137.83，138.23，139.13.Anal.(C₂₂H₁₉FN₂O₂S)：Calcd，C，61.10；H，4.43；N，6.48；S，7.41；Found，C，61.39；H，4.49；N，6.97；S，7.42.

实施例27：制备化合物15k(5-氯-噻吩-2-磺酸(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-甲基-酰胺，5-Chloro-thiophene-2-sulfonic acid(5，8-dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-methyl-amide)

将化合物6k(0.25g，0.64mmol)、KOH(1颗)、及乙醇(20mL)的溶液，于70℃下搅拌15分钟。添加甲基碘(methyl iodide)(3.0mL)至溶液后，于70℃下搅拌1小时。使用管柱层析纯化混合溶液，并收集液体(R_f＝0.30，己烷/乙酸乙酯＝12/1)，可得到化合物15k(0.22g，84％)。

mp＝179-181℃；ESI(M-H⁺)403.1；¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ2.57(s，3H，CH₃)，2.74(s，3H，CH₃)，3.34(s，3H，CH₃)，6.83(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.88(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.07-7.13(m，2H，ArH)，7.36(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，7.47(d，J＝4.0Hz，1H，ArH)，8.08(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，11.11(s，1H，NH)；¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ17.20，20.18，118.11，118.67，120.50，120.55，121.93，122.36，124.60，125.55，126.62，128.43，129.61，133.12，135.54，137.79，139.04.Anal.(C₁₉H₁₇ClN₂O₂S₂)：Calcd，C，56.36；H，4.23；N，6.92；S，15.84；Found，C，56.26；H，4.35；N，7.06；S，15.49.

实施例28：制备化合物16c(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-N-乙基-4-甲氧基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-N-ethyl-4-methoxy-benzenesulfonamide)

将化合物6c(0.5g，1.31mmol)、KOH(1颗)、及乙醇(20mL)的溶液，于70℃下搅拌15分钟。添加乙基碘(ethyl iodide)(3.0mL)至溶液后，于70℃下搅拌1小时。使用管柱层析纯化混合溶液，并收集液体(R_f＝0.36，己烷/乙酸乙酯＝6/1)，可得到化合物16c(0.37g，69％)。

mp＝151-152℃；

ESI(M-H⁺)407.1；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ0.97(t，J＝6.8Hz，3H，CH₃)，2.58(s，3H，CH₃)，2.73(s，3H，CH₃)，3.82(s，3H，OCH₃)，6.56(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.87(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.01(t，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.06-7.11(m，3H，ArH)，7.58(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.04(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，10.91(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ13.21，17.33，20.22，46.06，55.67，114.24，118.09，118.47，120.49，120.56，122.06，122.39，123.28，125.26，126.57，129.62，129.83，139.01，139.42，162.60.

Anal.(C₂₃H₂₄N₂O₃S)：Calcd，C，67.62；H，5.92；N，6.86；Found，C，67.40；H，6.18；N，6.55.

实施例29：制备化合物17c(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-4-甲氧基-N-丙基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-4-methoxy-N-propyl-benzenesulfonamide)

将化合物6c(0.5g，1.31mmol)、KOH(1颗)、及乙醇(20mL)的溶液，于70℃下搅拌15分钟。添加溴丙烷(bromopropane)(2.0mL)至溶液后，于70℃下搅拌1小时。使用管柱层析纯化混合溶液，并收集液体(R_f＝0.44，己烷/乙酸乙酯＝8/1)，可得到化合物17c(0.28g，50％)。

mp＝60-62℃；

ESI(M-H⁺)421.1；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ0.79(t，J＝7.4Hz，3H，CH₃)，2.58(s，3H，CH₃)，2.73(s，3H，CH₃)，3.35(s，2H，CH₃)，3.81(s，3H，OCH₃)，6.60(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.87(d，J＝7.3Hz，1H，ArH)，7.01(t，J＝7.7Hz，1H，ArH)，7.09-7.11(m，3H，ArH)，7.57(d，J＝8.8Hz，2H，ArH)，8.04(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，10.76(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ11.07，17.28，20.21，21.12，52.89，55.64，114.21，118.06，118.51，120.52，120.56，121.99，122.89，123.35，125.33，126.58，129.60，129.69，129.85，138.97，139.05，162.60.

Anal.(C₂₄H₂₆N₂O₃S)：Calcd，C，68.22；H，6.20；N，6.63；S，7.59；Found，C，68.43；H，6.05；N，6.66；S，7.26.

实施例30：制备化合物18c(N-(5，8-二甲基-9H-咔唑-1-基)-N-异丙基-4-甲氧基-苯磺酰胺，N-(5，8-Dimethyl-9H-carbazol-1-yl)-N-isopropyl-4-methoxy-benzenesulfonamide)

将化合物6c(0.5g，1.31mmol)、KOH(1颗)、及乙醇(20mL)的溶液，于70℃下搅拌15分钟。添加2-溴丙烷(2-bromopropane)(3.0mL)至溶液后，于70℃下搅拌1小时。使用管柱层析纯化混合溶液，并收集液体(R_f＝0.39，己烷/乙酸乙酯＝8/1)，可得到化合物18c(0.22g，40％)。

mp＝222-224℃；ESI(M-H⁺)421.1；¹H NMR(400Hz，acetone-d₆)δ1.12(t，J＝6.6Hz，6H，CH₃)，2.56(s，3H，CH₃)，2.81(s，3H，CH₃)，2.85(s，2H，CH₂)，3.87(s，3H，OCH₃)，4.78(m，1H，CH)，6.79(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.92(d，J＝7.3Hz，1H，ArH)，7.03-7.15(m，4H，ArH)，7.66(d，J＝8.9Hz，2H，ArH)，8.18(d，J＝7.9Hz，1H，ArH)，10.02(s，1H，NH)；¹³C NMR(100Hz，acetone-d₆)δ17.15，20.64，21.86，22.20，23.32，53.17，56.09，114.83，118.77，119.18，120.27，121.74，122.06，123.69，126.90，127.49，128.51，130.73，131.08，133.77，140.06，141.98，163.87.Anal.(C₂₄H₂₆N₂O₃S)：Calcd，C，68.22；H，6.20；N，6.63；S，7.59；Found，C，68.12；H，6.43；N，6.45；S，7.25.

实施例31：制备化合物20(1-硝基-9H-咔唑，1-Nitro-9H-carbazole)

将化合物咔唑19(1g，5.98mmol)及乙酸(10mL)的混合物于70℃下搅拌20分钟。添加硝酸(0.3mL)至混合物后，于70℃下搅拌1小时。利用水将反应淬息，经过滤后得一黄色固体。使用管柱层析纯化粗产物，并收集液体(R_f＝0.5，己烷/乙酸乙酯＝12/1)，可得到黄色固体化合物20(0.45g，35％)。

mp 195-196℃；

ESI(M-H⁺)211.0；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ7.27-7.37(m，2H，ArH)，7.51(t，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.75(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，8.23(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，8.30(d，J＝7.7Hz，1H，ArH)，8.60(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，12.16(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ112.64，118.36，120.65，120.70，121.53，121.72，127.14，127.35，128.08，131.70，132.93，140.68.

Anal.(C₁₂H₈N₂O₂)：Calcd，C，67.92；H，3.80；N，13.20；Found，C，67.94；H，3.95；N，13.21.

实施例32：制备化合物21a(N-(9H-咔唑-1-基)-4-甲氧基-苯磺酰胺，N-(9H-Carbazol-1-yl)-4-methoxy-benzene-sulfonamide)

于氢气氛下，将化合物20(0.5g，2.35mmol)、Pd/C(0.1g)、甲醇(30mL)的混合溶液于室温下搅拌1小时。过滤移除Pd/C固体后，于真空下干燥溶剂，可得一油状物。添加4-甲氧基苯磺酰氯(4-methoxybenzenesulfonychloride)(0.5g，2.42mmol)、三乙基胺(triethylamine)(1.0mL)、及乙酸乙酯(50mL)至粗产物后，于50℃下搅拌2小时。使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.30，己烷/乙酸乙酯＝3/1)，可得到一白色固体化合物21a(0.43g，54％)。

mp 204-206℃；

ESI(M-H⁺)351.0；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ3.74(s，3H，OCH₃)，6.90-7.02(m，4H，ArH)，7.14(t，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.38(t，J＝7.6Hz，1H，ArH)，7.57(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.67(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.88(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，8.05(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，9.80(s，1H，NH)，10.94(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ55.58，111.50，114.22，117.77，118.64，118.88，119.91，120.20，121.00，122.27，123.99，125.85，129.12，131.14，134.59，139.49，162.40.

Anal.(C₁₉H₁₆N₂O₃S)：Calcd，C，64.76；H，4.58；N，7.95；S，9.10；Found，C，64.79；H，4.75；N，7.88；S，8.47.

实施例33：制备化合物21b(N-(9H-咔唑-1-基)-3-三氟甲基-苯磺酰胺，N-(9H-Carbazol-1-yl)-3-trifluoromethyl-benzene-sulfonamide)

于氢气氛下，将化合物20(0.5g，2.35mmol)、Pd/C(0.1g)、甲醇(30mL)的混合溶液于室温下搅拌1小时。过滤移除Pd/C固体后，于真空下干燥溶剂，可得一油状物。添加3-三氟甲基苯磺酰氯(3-trifluoromethylbenzenesulfony chloride)(0.6g，2.45mmol)、三乙基胺(triethylamine)(1.0mL)、及乙酸乙酯(50mL)至粗产物后，于50℃下搅拌2小时。使用管柱层析纯化混合物，并收集液体(R_f＝0.21，己烷/乙酸乙酯＝8/1)，可得到一白色固体化合物21b(0.54g，59％)。

mp 188-190℃；

ESI(M-H⁺)389.0；

¹H NMR(400Hz，DMSO-d₆)δ6.75(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，6.96(t，J＝7.7Hz，1H，ArH)，7.14(t，J＝7.5Hz，1H，ArH)，7.38(t，J＝7.7Hz，1H，ArH)，7.54(d，J＝8.1Hz，1H，ArH)，7.74(d，J＝7.7Hz，1H，ArH)，7.94-7.79(m，4H，ArH)，8.06(d，J＝7.7Hz，1H，ArH)，10.08(s，1H，NH)，11.02(s，1H，NH)；

¹³C NMR(100Hz，DMSO-d₆)δ111.51，118.61，118.93，119.02，119.82，120.32，121.49，122.22，123.60，124.30，124.73，126.07，129.66，129.89，130.79，131.01，135.65，139.69，140.62.

Anal.(C₁₉H₁₃F₃N₂O₂S)：Calcd，C，58.46；H，3.36；N，7.18；F，14.60；S，8.21；Found，C，72.98；H，5.92；N，11.94.

《药理活性研究》

将上述实施例所合成出来的苯磺酰胺衍生物化合物，进行苯磺酰胺衍生物对于TSGH(胃癌细胞)、Hepa G2(肝癌细胞)、HT 29(人类大肠癌细胞)、KB(鼻咽癌细胞)、AGS(人类胃癌细胞)、MCF-7(人类乳癌细胞)、A549(肺癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)等肿瘤细胞作体外毒性试验，以探讨肿瘤细胞生长抑制活性与化学结构的相关性。

MTT测试

将上述肿瘤细胞以10％胎牛血清的RPMI培养液培养于含有5％二氧化碳37℃培养箱内。而后，将细胞以苯磺酰胺衍生物化合物处理72小时，而后以0.4mg/mL的MTT试剂于37℃下培养2小时。移除培养基后，使用DMSO溶解MTT沉淀物。使用微量盘侦测系统(Thermomax microplayereader，Molecular devices，Sunnyvale，CA)侦测540nm处的吸光度，以得到细胞动态变化(cell proliferation)，并藉此计算出苯磺酰胺衍生物的IC₅₀。

SRB测试

将上述肿瘤细胞以10％胎牛血清的RPMI培养液培养于含有5％二氧化碳37℃培养箱内。24小时后，将部份槽中的细胞以10％三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)处理，以表示药物添加时间(T₀)。接着，将剩余的槽中细胞以苯磺酰胺衍生物化合物处理48小时后，以10％TCA终止反应(T_x)。以PBS缓冲液清洗并风干后，加入0.4％sulforhodamine B溶液(溶于1％乙酸中)，于室温下反应10中。而后，以1％乙酸将未进入细胞的sulforhodamine B移除，经风乾后，加入10mM的Tris-base(Trizma，Sigma)水溶液将固定细胞溶解。最后，使用微量盘侦测系统(Thermomaxmicroplaye reader，Molecular devices，Sunnyvale，CA)侦测515nm处的吸光度，以得到细胞动态变化(cell proliferation)。藉此，可计算出苯磺酰胺衍生物的半抑制浓度GI₅₀。

测试结果如下表1至表4所示。

表1：MTT测试结果

^a化合物浓度20μM时所抑制的肿瘤百分比

表2SRB测试结果

表3SRB测试结果

表4化合物6c对各种肿瘤细胞的体外测试结果

^aMCF-7/ADR：多抗药性乳癌细胞(multidrug-resistant breast cancer)

^bND：无法测得(Not determined)

由表1得知，化合物6a～6h几乎都比其相对应的5a～5h对各个肿瘤细胞有更强的生长抑制活性。例如6b对TSGH、HepaG2、HT-29及KB肿瘤细胞的IC₅₀各为2.1、1.7、1.1及2.5μM，而相对应5b的IC₅₀则为9.4、7.9、7.9及＞20μM。此外，在所有化合物中，尤以在苯环第四位置有甲氧基取代的6c抑制效果最好，其对TSGH、HepaG2、HT-29及KB肿瘤细胞的IC₅₀分别达到0.5、0.4、0.4及0.8M，然而根据文献所知(Owa et.al.，J.Med.Chem.1999，42，3789-3799)，目前进入临床实验阶段的E7070(卫采公司制造)药物，其对KB(鼻咽癌)、colon 38(结肠癌)及P388(小鼠白血病)肿瘤细胞的IC₅₀分别达到11.4、0.3及1.2μM。由此知本发明所设计的化合物6c对KB肿瘤细胞的抑制活性比E7070更佳。另因在对位位置上具有取代基的化合物6b-6g，都比无取代基的6a对各种肿瘤细胞更具抑制活性，因此，对位位置有一取代基的存在更有利于增强对肿瘤细胞的抑制活性。

另外，化合物7a-7c的初步活性试验也呈现有抑制肿瘤细胞的能力，且7a及7c与相对应的5d比较也有增强抑制肿瘤细胞活性的现象。例如7a对TSGH、HepaG2、HT-29、KB肿瘤细胞的IC₅₀各为3.6、9.1、5.9及4.5μM，而相对应5d的IC₅₀则为35.6、14、19.8及20μM。依据以上初步探讨，证明化合物7a-7c对肿瘤生长抑制亦有发展潜力。

由上述的药理活性研究结果可知，本发明的苯磺酰胺衍生物确实有抑制肿瘤细胞的功效。其中尤以化合物6c的效果最佳。此外，本发明知苯磺酰胺化合物，能确实利用细胞周期的特性，抑制肿瘤细胞使的凋亡，因此可进一步用于临床治疗固态瘤上。

接下来，将详细描述本发明的苯磺酰胺衍生物抗肿瘤活性的体外和活体试验评估结果。在此，系以化合物6c进行实验，且往后将称化合物6c为GM119。

A549细胞体外迁移试验

A549肺腺癌细胞(BCRC 60074；BCRC)以10％胎牛血清的RPMI培养液培养于含有5％二氧化碳37℃培养箱内。所有细胞株于每周进行两次继代培养。

在此，所谓的体外迁移分析试验，系在单层细胞层上机械性方式造成一直线细胞剥落的刮痕，此机械性刮痕可诱导产生创伤区域的细胞层进行愈合。

当单层A549细胞在细胞量达饱和后，以200微毫升的黄色微量吸管的尖端对细胞层进行细胞伤痕试验，以诱导细胞迁移的进行。进行细胞伤痕的细胞分别处理18小时的GM119，浓度分别为0、0.5或者10μM。经显微镜观察分析细胞迁移的作用，可发现当GM119浓度越高，对于A549细胞迁移的抑制能力越强。

同时，分别取以不同GM119浓度下处理的A549细胞的细胞质萃取物25微毫克，以西方点墨法进行分析。于经10％SDS-PAGE分离与转渍后，以anti-p53、anti-p-p53和anti-肌动蛋白的抗体辨识分析。

血管内皮细胞抑制测试

第一天将共同培养的脐静脉内皮细胞与人类纤维母细胞更换新的培养液并培养于含有5％二氧化碳37℃培养箱内。待稳定一天后，处理(25ng/ml)VEGF作为正控制组、使用(25nM)生长因子结抗剂(suramin)作为负控制组或处理GM119(0.1、1、或10μM)。分别于在药物处理后第3、6和8天更换含有不同药物的新培养液。在第11天，以anti-CD31的抗体辨识新生生成的脐静脉内皮细胞血管管样结构，并以软件分析脐静脉内皮细胞管样结构的面积。

利用位相差显微镜分析后，可发现GM119能有效地抑制经VEGF诱发脐静脉内皮细胞的新生血管的管样结构。同时，比较施予浓度为10μM的GM119以及浓度为10μM的生长因子结抗剂(suramin)的抑制结果，可发现GM119的效用与生长因子结抗剂相当。

对4T1乳腺癌细胞的体外细胞毒杀作用测试

在此，使用稳定带有表达生物性冷光酵素luciferase基因的4T1-Luc乳腺癌细胞细胞。将4T1乳腺癌细胞细胞在含有G418与10％胎牛血清的RPMI培养液，培养于含有5％二氧化碳37℃培养箱内。所有细胞株于每周进行两次继代培养。

在96-孔盘中每个槽(well)以2,500或5,000个细胞开始进行，癌细胞先培养于正常浓度血清(10％)或无血清的培养基中，再分别处理48小时的0、0.01、0.1、1或10μM GM119。其后细胞先以10％三氯乙酸固定，经水洗涤后，以sulforhodamine B进行染色，再以1％乙酸洗涤，并加入Tris缓冲液。以自动化的微量盘侦测系统侦测515毫微米处的吸光度，结果由四次独立实验组成，吸光度计量以无药物处理组别的吸光度作为百分的百的细胞存活率，细胞存活率以控制组的吸光度作为百分的百、经计算后以平均值±标准偏差的百分比来表示。

实验结果如图1所示。显示不论在正常浓度血清或无血清的培养基中，仅需0.01μM GM119即可达到抑制4T1乳腺癌细胞生长的效果。同时，当GM119为10μM时，抑制4T1乳腺癌细胞生长的效果更加显著。

体外细胞形态分析试验

GM119处理4T1-Luc乳腺癌细胞后，以位相差显微镜观察分析乳腺癌细胞的体外细胞形态改变。在6-孔盘中放入玻璃盖玻片，将每个well以50,000个细胞开始进行玻片培养，癌细胞先培养于正常浓度10％血清的培养基中，再分别处理36小时的0、0.01、0.1、1或10μM GM119。细胞以Giemsa染色方式(Giemsa溶液：0.38克Giemsa粉末、15％甲醇和5％甘油)处理。细胞玻片经洗涤脱水封片后，以位相差显微镜撷取影像。

由位相差显微镜的观察结果显示，仅需0.01μM GM119即可达到抑制4T1乳腺癌细胞生长的效果。同时，当GM119为10μM时，抑制4T1乳腺癌细胞生长的效果更加显著。

西方点墨法分析试验

以0、0.01、0.1、1或10μM GM119处理4T1-Luc乳腺癌细胞36小时后，将细胞经离心后收集，细胞以超音波震荡方式破碎(冰上15秒)，离心后收集上层细胞质萃取物。蛋白质浓度以Bradford dye-binding(BioRad，美国)的含量分析。取等量(25μg)的细胞质萃取物进行电泳与转渍、再以anti-p53、anti-p-p53和anti-肌动蛋白的抗体辨识分析各分子的变化量。

GM119活体试验评估

A、短期给予GM-119(25mg/kg)继以给予Taxol(10mg/kg)对具4T1乳腺癌细胞移植的小鼠的乳腺肿瘤的影响。

将在matrigel内的4T1乳腺癌细胞悬浮液透过手术直接注射在乳腺脂肪块上，以建立含有luciferase的肿瘤移植老鼠。肿瘤大小在给予GM119的前每天以NightOWL的活体影像分析装置分析。当肿瘤大小达到大约200-500毫米立方，肿瘤移植老鼠以每组(n≥5)的数量分别接受每天腹腔注射0或25mg/kg的GM119(GM119溶于cremophor中、每只老鼠给予50微毫升的注射体积)，GM119持续给予五天；接下来以每2天给予一次腹腔注射0或10mg/kg的Taxol、持续给予至老鼠牺牲。每天记录老鼠重量与数目，用以分析老鼠重量改变和老鼠存活时间；在给予药物后以每2天之间距分析肿瘤移植老鼠体内的生物性冷光以评估老鼠体内的肿瘤大小。

图2是短期给予药物对老鼠存活时间的统计结果图。由图2结果可知，单独使用GM119、或与Taxol合并使用，皆可达到与单独使用Taxol的相似效果，而可大幅提升老鼠存活率。此外，经生物性冷光以评估老鼠体内的肿瘤大小显示，无论是使用GM119、Taxol、或合并使用，均可达到抑制肿瘤大小成长的效果。

B、长期同时给予GM-119(25mg/kg)以及Taxol(10mg/kg)对具4T1乳腺癌细胞移植的小鼠的乳腺肿瘤的影响。

将在matrigel内的4T1乳腺癌细胞悬浮液透过手术直接注射在乳腺脂肪块上，以建立含有luciferase的肿瘤移植老鼠。肿瘤大小在给予GM119的前每天以NightOWL的活体影像分析装置分析。当肿瘤大小达到大约200-500毫米立方，肿瘤移植老鼠以每组(n≥5)的数量分别接受每天腹腔注射0/0或0/25或10/25或10/0mg/kg的Taxol/GM119(溶于cremophor中、每只老鼠给予50微毫升的注射体积)，以每2天给予一次腹腔注射、持续给予至老鼠牺牲。每天记录老鼠重量与数目，用以分析老鼠重量改变和老鼠存活时间；在给予药物后以每2天之间距分析肿瘤移植老鼠体内的生物性冷光以评估老鼠体内的肿瘤大小。

图3是长期给予药物对老鼠存活时间的统计结果图。由图3结果可知，虽长期给予Taxol已可达到提升老鼠存活率的效果，但同时并用Taxol及GM119更可进一步提升老鼠存活率。特别是，仅单独长期投予GM119，可使老鼠存活时间最长。此外，经生物性冷光以评估老鼠体内的肿瘤大小显示，无论是使用GM119、Taxol、或合并使用，均可达到抑制肿瘤大小成长的效果。

上述实施例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利要求范围自应以申请的权利要求范围所述为准，而非仅限于上述实施例。