CN102178126A - 一种秸秆微贮添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种秸秆微贮添加剂，其特征在于，采用乳酸菌、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌、放线菌、固氮菌、霉菌菌种按75300～10000∶73000～10000∶600～500∶70～50∶15～10∶1的配比发酵制得。其制备方法，包括菌种活化、种子液制备、发酵设备及培养基灭菌、接种、发酵参数设计、菌体收集、真空冷冻干燥和发酵剂的配制等步骤。具有配比科学，功能全面，秸秆处理性能高的优点。纤维分解菌和动物肠道有益菌科学配伍相互协调，能有效改善秸秆营养结构。秸秆加入添加剂于37℃发酵15天可使pH降到3.8，粗蛋白提高近8％，纤维素降解达15.05％，水分含量接近50％，腐败率低，色泽微黄，质地松软，气味醇香浓郁；而且，制备工艺简单实用。

Description

一种秸秆微贮添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及型微贮添加剂，属于微生物技术领域。

背景技术

秸杆微贮饲料是近年来发展迅速的一种秸杆加工新技术，它利用微生物在秸杆中密封发酵使秸杆变成带有酸、香、酒味的粗饲料，是节能环保高效的农牧业产品。微贮饲料因其具有成本低、效益高、适口性好、采食量高、饲料来源广、不受季节限制而得到了广泛应用。国家及地方政府大力倡导发展“节约型社会”，“环保型产业”和“资源利用型产业”，并出台了一系列鼓励政策。开发和推广微贮饲料产品，符合国家的产业政策导向，属于鼓励类产业。

动物从出生就有大量微生物进入宿主，经过长期的进化筛选会在其肠道内形成一个平衡的微生态系统，大量研究表明肠道内的益生菌主要是乳酸菌，与微生物饲料的生产及调制有关的有益微生物，主要有细菌、酵母菌、担子菌及部分单细胞藻类微生物等。1989年美国饲料公定协会(AAFCO，1990)公布了可以用作饲料添加剂、对人畜均无副作用的微生物，共有43种，其中乳酸菌28种(包括乳杆菌12种、双歧杆菌6种、链球菌6种、片球菌3种、明串珠菌1种)、芽孢杆菌5种、拟杆菌4种、曲霉2种、酵母菌2种等。

现阶段我国奶牛饲料主要依靠精饲料、作物秸秆及天然牧草，而奶牛精饲料中主要的能量饲料--玉米近几年都存在2000万吨以上的供应缺口。粗饲料方面，美国和加拿大主要以优质苜蓿干草和青贮料为主，通过青贮可以将饲料利用效率提高30％--50％，而且适口性好，消化率高。我国大多数农区粗饲料主要以秸秆为主，适口性差，消化率低。由于抗生素的负面效应，欧盟、美国、日本等发达国家相继禁止或限制在饲料中使用抗生素，我国还处于社会主义初级阶段，长期大量使用禁用药物粗放式发展，饲料工业积弊已久，急需一条新途径来解决目前的困境。为了改变这个现状，提高玉米秸杆微贮利用率，增加其适口性，降低成本，开发抗生素替代品，我单位研制了新型微贮添加剂。

我国牧草饲料年供应缺口达2.8亿吨，每年有6亿吨秸秆资源急待处理，而目前大量秸杆的不良处置，如焚烧，严重影响到空气质量和引发大量的交通事故；如直接填埋在田地里面，长期后会破坏土壤结构，减少土壤肥力并影响到农作物的生长。2005年，朱容 基总理拨专款1千万元，下达给科研部门，加强对秸秆的研究、开发，技术推广，温家宝总理也在互联网信息摘要中提到要为秸秆处综合理找到出路。微贮饲料添加剂为秸杆综合处理和发展生态农牧业提供了一条新途径。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种成本低，能高效处理秸秆生产营养价值高、适口性好的微贮饲料，同时调整动物消化道内环境，恢复和维持正常微生态平衡，产生非特异性免疫调节因子，增强动物免疫系统功能，防止有害物质的产生，改善动物内外环境，解决抗生素导致机体菌群失调，抗药株产生、降低动物免疫等问题的秸杆饲料添加剂；同时，还提供工艺简单实用的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：一种秸杆微贮添加剂，其特征在于，采用乳酸菌、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌、放线菌、固氮菌、霉菌菌种按75300～10000∶73000～10000∶600～500∶70～50∶15～10∶1的配比发酵制得。

进一步，所述秸杆微贮添加剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：菌种活化：

将保藏的啤酒酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、固氮菌、霉菌菌种分别置于灭菌的1％糖水中活化2h，再分别转接入已灭菌的豆芽汁、MRS(De Man，Rogosa and Sharpe medium)、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆斜面培养基；肉膏蛋白胨和MRS置于37℃，其它置于28℃下培养，待菌落长出后分别接入已灭菌的豆芽汁、MRS、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆试管培养基(25×200)中，在与对应斜面培养基相同温度(肉膏蛋白胨和MRS置于37℃，其它置于28℃下培养)的摇床中培养16～18h备用；

步骤2：种子液制备：

将已灭菌的500ml与试管培养基成分相同的6种锥形瓶培养基，摇瓶间于32-34℃空白培养48h，检查确认无杂菌后包扎，用紫外线照1h备用；将豆芽汁、MRS、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆试管斜面内的菌丝分别接入已灭菌的6种对应培养基锥形瓶中，MRS置于37℃，其它置于28℃下摇瓶培养24～48h，镜检无杂菌后制成种子液备用；

步骤3：发酵设备及培养基灭菌：

将配制好的锥形瓶培养基分别加入50L机械发酵罐中，打开搅拌器，通入蒸气将培养基与所用设备一起进行灭菌，灭菌过程中维持罐压约0.1MPa，温度121℃30min，冷却备用。

步骤4：接种：

将步骤1的各种活化菌种按以下比例进行接种：酵母菌，8.0％；乳酸菌，5％；放线菌10.0％；霉菌，10.0％；枯草芽孢杆菌，7％；固氮菌15％(％表示接种量，是种子液与接种后培养液的体积比。)；

步骤5：发酵参数设计：

步骤6：菌体收集：

为了提高冷冻存活率，放罐后将发酵液置于20℃冷激处理3h，6000r/min离心10min，弃去上清液收集菌泥；

步骤7：真空冷冻干燥：

按蔗糖10％、脱脂牛乳10％、谷氨酸钠5％配比制备冻干保护剂；向菌泥中加入与弃去上清液等体积的保护剂，使菌体重悬，于-70℃预冻1.5h，再冷冻干燥，干燥完毕后将产品密封于胶袋中于-20℃备用；

步骤8：发酵剂的配制：

1)冻干剂单位质量活菌数测定

取出保存的冷冻干燥剂若干克，迅速加入4℃预冷的无菌蒸馏水于22℃振荡10min，使菌体重悬，倍比稀释后活菌计数，确定冻干剂活菌数。活菌计算公式：

$\mathrm{\ω}=\frac{m}{\stackrel{\‾}{n}\×V_0/V_1}\·\·\·\·\·\·\left(1\right)$

ω——单位质量活菌数，cfu/g；

m——样品质量，g；

——菌落平均数，cfu；

V₀——菌液总体积，mL；

V₁——涂布用量，mL。

2)产品调制：

根据每种菌剂单位质量活菌数按下表配方均匀混合，密封低温保藏，定期测定活菌数绘制活性曲线。

发酵剂配方如下表所示：                                   单位：cfu；

相比现有技术，本发明具有如下优点：

1、配比科学，功能全面，秸秆处理性能高。纤维分解菌和动物肠道有益菌科学配伍相互协调，能有效改善秸秆营养结构。秸秆加入添加剂于37℃发酵15天可使pH降到3.8，粗蛋白提高近8％，纤维素降解达15.05％，水分含量接近50％，腐败率低，色泽微黄，质地松软，气味醇香浓郁。

2、经筛选的益生菌是自然界中本来就有微生物，安全稳定，抗逆性强，能在动物肠道内稳定存活，调整动物消化道内环境，恢复和维持正常微生态平衡，产生非特异性免疫调节因子，增强动物免疫系统功能，防止有害物质的产生，改善动物内外环境。

3、微贮添加剂环保安全，在一定程度上解决了抗生素导致机体菌群失调，抗药株产生、降低动物免疫等问题。

4、用途广泛，可处理含有大量纤维素的农牧产品和废弃物；根据处理原料和加工目的不同，可适当采取部分菌剂发酵，如用酵母发酵薯干生产单细胞蛋白，乳酸菌和枯草芽孢杆菌调节动物体内外微生态环境。

5、活菌量较高，用量少，发酵周期短，秸秆处理量大。3g混合菌剂夏季15d即可处理秸秆约1t。

6、制备工艺简单实用，常规实验室均可生产；采用粉剂包装，运输、储存、使用都很方便。

附图说明

图1为各发酵液OD值曲线；

图2为冻干发酵剂粗产品；

图3为冻干发酵剂的存活曲线。

具体实施方式：

1、材料：

SW-CJ-1CU型超净工作台，国产；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌器，国产；FD-1A-50冷冻干燥机，国产；BIOF-6050A50L型机械搅拌不锈钢智能发酵罐，国产；TGL型低温冷冻离心机，国产；L2800型显微镜，国产；UVD-3500型紫外分光光度计，美国Labomed；3000B 型电子天平，美国；菌种：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、固氮菌、霉菌，重庆理工大学药学与生物工程学院制药实验室保存。

2、方法：

2.1菌种活化：

将保藏的啤酒酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、固氮菌、霉菌菌种置于灭菌的1％糖水中活化2h，分别转接入已灭菌的豆芽汁、MRS、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆斜面培养基。肉膏蛋白胨和MRS置于37℃其它置于28℃下培养，待菌落长出后分别接入已灭菌的试管培养基(25×200)中，在与斜面培养基对应相同温度的摇床中培养16～18h备用。

2.2种子液制备：

将已灭菌的500ml锥形瓶培养基，摇瓶间于32-34℃空白培养48h，检查确认无杂菌后包扎，用紫外线照1h备用。小心将试管斜面内的菌丝接入已灭菌的培养基锥形瓶中，MRS置于37℃其它置于28℃下摇瓶培养24～48h，镜检无杂菌后制成种子液备用。

2.3发酵设备及培养基灭菌：

将配制好的培养基加入50L机械发酵罐中，打开搅拌器，通入蒸气将培养基与所用设备一起进行灭菌，灭菌过程中维持罐压约0.1MPa，温度121℃30min，冷却备用。

2.4接种：

本实验为了快速获得大量菌体，结合大量文献适当加大接种量，酵母菌，8.0％；乳酸菌，5％；放线菌、霉菌，10.0％；枯草芽孢杆菌，7％；固氮菌15％。接种过程中在进料口周围铺放一圈浸有足够多95％酒精的酒精棉保持明火直到接种完毕，以确保接种过程中不染杂菌。

2.5发酵参数设计：

根据菌种性质和前期实验结合相关文献设计出如下发酵过程控制参数。

表1各菌种发酵参数

2.6过程监控设计：

发酵过程中每3h收集少量发酵液于550nm波长下测定其吸光度绘制0D曲线，如遇到发酵液太粘稠则将其稀释适当倍数后再测定。确保在稳定期前期放罐以提高冷冻存活率降低发酵成本。

2.7菌体收集：

为了提高冷冻存活率，放罐后将发酵液置于20℃冷激处理3h。6000r/min离心10min，弃去上清液收集菌泥。

2.8真空冷冻干燥：

按蔗糖10％、脱脂牛乳10％、谷氨酸钠5％配比制备冻干保护剂。向菌泥中加入与弃去上清液等体积的保护剂，使菌体重悬，于-70℃预冻1.5h，再冷冻干燥，干燥完毕后将产品密封于胶袋中于-20℃备用。

2.9发酵剂的配制：

2.9.1冻干剂单位质量活菌数测定：

取出保存的冷冻干燥剂若干克，迅速加入4℃预冷的无菌蒸馏水于22℃振荡10min，使菌体重悬，倍比稀释后活菌计数，确定冻干剂活菌数。活菌计算公式：

$\mathrm{\ω}=\frac{m}{\stackrel{\‾}{n}\×V_0/V_1}\·\·\·\·\·\·\left(1\right)$

ω——单位质量活菌数，cfu/g；

m——样品质量，g；

——菌落平均数，cfu；

V₀——菌液总体积，mL；

V₁——涂布用量，mL。

2.9.2产品调制：

根据每种冻干菌剂单位质量活菌数按下表比例均匀混合，密封低温保藏，定期测定活菌数绘制活性曲线。

表2发酵剂配方                                            单位：cfu

3、结果：

3.1发酵过程OD值曲线：

对发酵液定期取样测得其OD值，以确保对数期前期放罐。过于粘稠的发酵液采用稀释后的测量值，霉菌由于结团无法测量吸光度可采用活菌计数但时间较长因此意义不大。从图1可以看出乳酸菌和固氮菌在13～15hOD值最大，证明在15～20h放罐是比较合理的；枯草芽孢杆菌和酵母菌在45～48hOD值达最大值，故在此时间段放罐；放线菌生长周期较长，由于菌丝作用稀释后测得其OD值在57～60h达峰值，57h放罐较好。结果见图1。

3.2冻干剂单位质量活菌数：

等体积重悬菌液经有限梯度稀释活菌计数结果如下。

表3冻干剂单位质量活菌数                            单位：cfu/g；

3.3冻干剂配比成分：

根据各冻干剂单位质量活菌数按配方得出以下发酵剂成分表，可按使用量多少适当放缩比例。按此配方混合后理论活菌数约为800亿/g。

表4各冻干剂配比成分表                            单位：g

3.4冻干发酵剂的存活性能：

每隔一月对冻干发酵剂取样进行活性测定。结果表明，冻干发酵剂经浓缩冻干后活菌数能达到350亿/克冻干剂左右，在最初2个月的保藏期间活菌下降明显，一年后基本趋于107个/g冻干粉以上。结果如图2。

综上，各菌株在50L机械发酵罐中发酵结果达到预期目的，基本能满足生产需要。其中乳酸菌和固氮菌只需发酵18h左右即可放罐，其发酵液在550nm下OD值接近0.5；枯草芽孢杆菌和酵母菌45～48h放罐550nm下OD值也达0.5左右；放线菌60h左右OD值最大为0.43，可在57～60h期间放罐。冷冻干燥时间较长，一次处理量有限，但改变菌剂物化性质较少，加冷冻保护剂冷冻干燥后，酵母菌活菌数达7.5×10¹⁰cfu/g、乳酸菌8.3×10¹⁰cfu/g、枯草芽孢杆菌3.3×10¹¹cfu/g、放线菌6.5×10⁸cfu/g、固氮菌5.7× 10¹⁰cfu/g、霉菌4.6×10⁷cfu/g。冷冻干燥剂按发酵剂配方混合后理论活菌数在800亿/g干粉左右，实际活菌数在350亿/g干粉左右，其原因可能是保护剂或各菌剂成分混合不均匀造成理论活菌数与实际测得活菌数差异，还有可能是混合后各菌剂的相互影响和活菌计数条件差异所引起的。发酵剂经冷冻干燥保藏后，活菌数有所下降。在保藏的最初两个月，活性有明显下降，以后则下降缓慢，最后活菌数稳定在10⁷这个数量级左右，说明保藏的最初两个月是保证发酵剂活性的关键时期，需做进一步的保藏条件优化和加强保藏管理。本实验在估计菌体浓度时采用OD值法，由于放线菌菌丝作用，发酵液过于粘稠；霉菌菌体成团测量不便，可考虑显微镜直接计数法。微贮发酵剂市场需求量大，若要大量生产还需对发酵条件优化以适应自动化控制，开发廉价高效的培养基配方以降低成本。本实验对今后发酵剂工业化生产研究有一定的参考价值。

应用方法：

1、准备菌液：

取3～5g活干菌于500mL1％糖水中活化1～2h，向复活的菌液中加入0.9％的生理盐水补至1000L均匀混合，备用。菌液要当天用完，不可隔夜使用。菌液与处理秸秆用量见表1。

表1菌液配合比例：

2、秸秆收集与预处理：

收集成熟的黄玉米秸秆，弃去霉变、虫害严重的，风干后除去泥沙、石子、金属等颗粒杂物；用揉搓拉丝机将其切成3～5cm长的小段备用。

3、发酵储藏：

3.1袋贮：

用厚约1mm的塑料热压制得50×100cm的袋子留一端口装料，将已均匀喷洒菌液的秸秆装入袋中，装量约为2/3，封口时尽量将袋内气体排尽，袋口一定要封死。封好后集中堆放在草场，等发酵成熟取用很方便。此方式比较适合农户小规模生产，每次可取用一袋也方便。

3.2窖贮：

用清水将窖室冲洗干净，将与菌液混匀的秸秆一层层铺在窖室内，每层约30cm，注意铺放过程中尽量压实以排除秸秆空隙间的空气，直到高出窖口50cm即可封口。封口处 由于与空气有所接触，为防止霉变，可在最上层表面洒上一层食盐。这样层层铺放不仅提高了窖室的装载量还排出了大量的空气，为微生物创造了厌氧环境，可减少霉变。这种方式微贮量大，取用方便，适合牧场自产自用。

3.3打捆袋贮：

将切好的秸秆喷洒菌液后，用秸秆压捆机打捆成方块套上袋子密封即可贮存。用这种方法贮存的秸秆机械化生产，生产效率高，饲料运输方便，适合生产销售。

4、贮藏管理：

每天检查秸秆有无鼠害，是否漏气，雨水渗入及有无发霉情况。如发有局部漏气发霉要及时除去霉变部分重新洒上食盐密封好，雨水较多时要加强排水防止雨水渗入。

5、饲喂：

西南地区夏季一般15～20天即可取用，冬季30～45天取用合适。可根据腐熟程度合理确定取用时间，腐熟较好的秸秆呈金黄褐色，醇香浓郁带有山楂果香和弱酸味，手感松散质地柔软湿润。袋贮秸秆开袋后若未用完要打结密封；窖贮秸秆每次从同一角取料，取用时注意观察，若表面发霉要弃去，尽量保证当天取的当天用完，取完后注意密封防止空气进入；捆贮的秸秆要重新柔碎后方好饲喂。第一次饲喂时应控制用量，从少到多与原来饲喂的草料混合，成牛每天每只15～20kg为宜。

6、结果：

微贮45天后秸秆发酵效果明显，发酵基质有所收缩，色泽由微黄变为金黄褐色，有醇香酸香味，质地松散湿润，霉变率在1.5％以下。

微贮使玉米秸杆饲料中的粗蛋白和有机酸含量升高，使pH值下降到4.4以下，抑制了腐败菌的生长繁殖，同时使玉米秸杆得到了软化，不仅改变了玉米秸杆的组织结构和适口性，而且能够较长时间地贮存。

本发明对筛选和引进的酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、丝状真菌、放线菌类等30种微生物进行反复组合筛选，优化最佳配方，最终确定以纤维分解菌和动物肠道有益菌搭配的组合。该配方根据所处环境不同巧妙发挥功效，纤维分解菌在微贮前期利用残留氧气代谢，大量分解纤维素至氧气耗尽死亡或抑制，纤维素、木质素、半纤维素得到分解或蓬松为以后为肠道有益微生物厌氧发酵提供可溶性碳水化合物；这样不仅有力的解决了秸秆营养成分的转化问题，有效改善了营养结构、提高了适口性，同时秸秆饲料中大量益生菌进入动物肠道可在一定程度上调整动物消化道内环境，恢复和维持正常微生态平衡，产生非特异性免疫调节因子，增强动物免疫系统功能，防止有害物质的产生，改善动物内外环境。由此开辟出一条既能高效综合处理秸秆提高动物消化率又兼具抗生素功能的新途径。

本发明利用微贮技术处理玉米秸秆生产微贮饲料操作简单，源料广泛，投资资金少，可以变废为宝，真正实现绿色农牧业、生态农牧业、循环农牧业。大力推广微贮饲料无疑会带来良好的经济和社会效益。

Claims (2)

1.一种秸杆微贮添加剂，其特征在于，采用乳酸菌、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌、放线菌、固氮菌、霉菌菌种按75300～10000∶73000～10000∶600～500∶70～50∶15～10∶1的配比发酵制得。

2.如权利要求1所述秸杆微贮添加剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：菌种活化：

将保藏的啤酒酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、固氮菌、霉菌菌种分别置于灭菌的1％糖水中活化2h，再分别转接入已灭菌的豆芽汁、MRS、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆斜面培养基；肉膏蛋白胨和MRS置于37℃，其它置于28℃下培养，待菌落长出后分别接入已灭菌的豆芽汁、MRS、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆试管培养基(25×200)中，在与对应斜面培养基相同温度的摇床中培养16～18h备用；

步骤2：种子液制备：

将已灭菌的500ml与试管培养基成分相同的6种锥形瓶培养基，摇瓶间于32-34℃空白培养48h，检查确认无杂菌后包扎，用紫外线照1h备用；将豆芽汁、MRS、肉膏蛋白胨、高氏一号、察氏一号、土豆试管斜面内的菌丝分别接入已灭菌的6种对应培养基锥形瓶中，MRS置于37℃，其它置于28℃下摇瓶培养24～48h，镜检无杂菌后制成种子液备用；

步骤3：发酵设备及培养基灭菌：

将配制好的锥形瓶培养基分别加入50L机械发酵罐中，打开搅拌器，通入蒸气将培养基与所用设备一起进行灭菌，灭菌过程中维持罐压约0.1MPa，温度121℃30min，冷却备用；

步骤4：接种：

将步骤2的各种种子液按以下接种量进行接种：酵母菌，8.0％；乳酸菌，5％；放线菌10.0％；霉菌，10.0％；枯草芽孢杆菌，7％；固氮菌15％；

步骤5：发酵参数设计：

步骤6：菌体收集：

为了提高冷冻存活率，放罐后将发酵液置于20℃冷激处理3h，6000r/min离心10min，弃去上清液收集菌泥；

步骤7：真空冷冻干燥：

按蔗糖10％、脱脂牛乳10％、谷氨酸钠5％配比制备冻干保护剂；向菌泥中加入与弃去上清液等体积的保护剂，使菌体重悬，于-70℃预冻1.5h，再冷冻干燥，干燥完毕后将产品密封于胶袋中于-20℃备用；

步骤8：发酵剂的配制：

1)冻干剂单位质量活菌数测定

取出保存的冷冻干燥剂若干克，迅速加入4℃预冷的无菌蒸馏水于22℃振荡10min，使菌体重悬，倍比稀释后活菌计数，确定冻干剂活菌数；活菌计算公式：

$\mathrm{\ω}=\frac{m}{\stackrel{\‾}{n}\×V_0/V_1}\·\·\·\·\·\·\left(1\right)$

ω——单位质量活菌数，cfu/g；

m——样品质量，g；

——菌落平均数，cfu；

V₀——菌液总体积，mL；

V₁——涂布用量，mL；

2)产品调制：

根据每种菌剂单位质量活菌数按下表配方均匀混合，密封低温保藏，定期测定活菌数绘制活性曲线；～

发酵剂配方                            单位：cfu

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